COVID-19 Vaccine (ChAdOx1-S [recombinant])(AstraZeneca Plc)

HEK293细胞系的诞生，是20世纪分子生物学与病毒学交叉研究中的一次偶然突破，却最终演变为现代生物医学研究中最核心的工具性细胞系之一。其历史可追溯至1973年，当时荷兰莱顿大学的Alex Van der Eb博士与加拿大麦克马斯特大学的Frank Graham博士正在研究人类腺病毒（Adenovirus）的转化机制。他们尝试将5型腺病毒（Ad5）的DNA片段导入人胚胎肾细胞，以观察病毒基因如何影响宿主细胞的增殖与存活。在一系列反复实验中，第293号实验样本中的细胞表现出异常稳定的生长特性——它们不仅未因病毒侵染而死亡，反而获得了持续分裂的能力，成为一种永生化细胞群。这一细胞克隆被命名为“HEK293”，其中“HEK”代表“Human Embryonic Kidney”（人胚胎肾），而“293”则直接源于Graham博士实验笔记本中记录的第293次转染实验编号。尽管最初该细胞系的来源存在争议——原始肾组织样本来自一个父母谱系不明的流产胚胎，且其细胞组成具有异质性（可能包含上皮、内皮甚至神经元样细胞），但经过单克隆筛选与扩增，Graham于1977年成功建立了一个遗传稳定的HEK293细胞株，并将其整合的腺病毒基因片段定位在19号染色体上，长度约为4.35 kb，包含腺病毒E1A和E1B基因。这一整合事件是HEK293细胞永生化的分子基础：E1A蛋白可抑制宿主细胞的抑癌基因p53和Rb通路，而E1B蛋白则阻断细胞凋亡，二者协同作用使细胞突破了正常的复制衰老极限。HEK293细胞系的全球标准化进程始于其被权威生物资源中心收录。1977年后，该细胞系先后由麦克马斯特大学细胞保藏中心、美国典型培养物保藏中心（ATCC）及欧洲细胞保藏中心（ECACC）正式接收并分发。ATCC将其编号为CRL-1573，ECACC编号为85050302，这标志着HEK293从一个实验室产物转变为全球科研界可追溯、可复用的“标准品”。如今，所有商业化销售的HEK293细胞，无论其品牌或产地，其遗传谱系均可追溯至Graham博士1977年建立的原始细胞株，确保了全球研究数据的可比性与可重复性。这种标准化不仅提升了科研效率，也为后续衍生株的开发奠定了统一的遗传背景。值得注意的是，HEK293细胞系的建立并非孤立事件，它代表了当时病毒载体技术与细胞永生化策略的前沿探索。腺病毒作为基因递送工具的潜力，正是通过HEK293细胞的稳定表达能力得以验证，从而为后来的基因治疗、病毒疫苗开发铺平了道路。可以说，HEK293细胞不仅是“第293次实验”的产物，更是现代生物制药工业的基石之一。1.2 核心生物学特性剖析：形态、遗传与功能HEK293细胞之所以能成为全球生物医学研究的“明星细胞”，源于其一系列独特且高度实用的生物学特性，这些特性共同构成了其作为高效表达平台的不可替代性。在形态学上，HEK293细胞呈现典型的上皮样形态，细胞体扁平、边缘清晰，常呈多角形或颗粒状，贴壁生长能力强，但其贴附强度较弱，易在传代过程中因操作不当而脱落或漂浮。在悬浮培养条件下，细胞则呈圆形，适应性良好。其细胞直径约为11–15 µm，生长过程中倾向于形成小簇聚集，而非均匀单层，这一特性在高密度培养时需特别注意以避免营养竞争与代谢废物积累。其遗传特性是理解其功能优势的核心。HEK293细胞为亚三倍体人源细胞系，其染色体数目异于正常二倍体（46条），模态染色体数为64条，约30%的细胞具有此数目，另有4.2%的细胞染色体数更高，表明其基因组存在显著的非整倍性。核型分析显示，其染色体存在多个结构重排，如der(1)t(1;15)(q42;q13)、der(19)t(3;19)(q12;q13)等标记染色体，且多数细胞含有三条X染色体（两条Xq+，一条Xp+）。这种遗传不稳定性虽在长期传代中可能引发表型漂变，但在早期传代（通常<30代）中仍保持高度一致性，足以满足大多数实验需求。最核心的遗传特征是其基因组中稳定整合的约4 kbp腺病毒5型（Ad5）DNA片段，主要位于19号染色体上，包含E1A和E1B基因。这一整合赋予了HEK293细胞两大关键功能：永生化与高效转染能力。E1A/E1B的持续表达使细胞绕过细胞周期检查点，实现无限增殖；同时，该细胞系缺乏大多数细胞外配体所需的内源性受体，使其背景信号极低，成为表达外源基因的理想“空白画布”。此外，其人源基因组背景使其具备完整的翻译后修饰系统，如糖基化、磷酸化、折叠与分泌机制，相较于昆虫或酵母系统，能更真实地模拟人类蛋白的结构与功能。在功能表现上，HEK293细胞展现出卓越的高转染效率。无论是磷酸钙共沉淀法、脂质体介导转染，还是电穿孔法，其转染效率普遍可达80%–95%，部分优化条件下甚至接近100%。这一特性使其成为瞬时表达实验的首选，研究人员可在转染后24–72小时内获得高丰度的目标蛋白表达。其快速增殖能力同样突出，倍增时间约为34–36小时，远快于许多原代细胞或CHO细胞（倍增时间约20–24小时），显著缩短了实验周期。在培养适应性方面，HEK293细胞既可在传统贴壁培养中使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM或MEM培养基（37°C，5% CO₂，pH 6.9–7.1），也可通过长期驯化适应无血清、无蛋白的悬浮培养体系，为大规模生物制药生产提供了灵活的平台选择。特性类别具体表现实验/生产意义形态上皮样，贴壁生长，易成簇，贴附较弱易观察，但传代需轻柔操作，避免细胞流失核型亚三倍体，模态染色体数64，含三条X染色体遗传不稳定性需控制传代次数，建议<30代遗传基础整合Ad5 E1A/E1B基因（~4.35 kb）于19号染色体永生化、高转染效率、低背景表达的分子根源转染效率磷酸钙法>90%，脂质体法>85%适用于瞬时表达、基因功能筛选、蛋白生产增殖速度倍增时间34–36小时缩短实验周期，提高通量培养适应性支持贴壁（含血清）与悬浮（无血清）可灵活适配实验室研究与工业化生产需求翻译后修饰人源化糖基化、折叠、分泌系统适用于生产结构复杂、需正确修饰的治疗性蛋白这些特性共同构成了HEK293细胞的“黄金标准”地位，使其成为从基础基因功能研究到高端生物药生产的通用型细胞平台。1.3 家族谱系：主要衍生细胞系（293T、293F等）及其特性比较随着生物医学研究需求的日益精细化，原始HEK293细胞系已无法满足所有应用场景，由此催生了多个功能特化的衍生株。这些衍生株通过基因工程手段引入特定外源基因，显著增强了其在特定领域的应用能力，形成了一个庞大而有序的“293家族”。293T细胞是最为广泛使用的衍生株之一。它由HEK293细胞通过稳定转染SV40大T抗原（SV40 Large T-antigen）基因构建而成。SV40大T抗原能识别并结合含有SV40复制起点（ori）的质粒，激活其在细胞内的高效复制，从而将外源基因拷贝数提升数十至数百倍，最终实现目标蛋白表达水平的显著增强。这一特性使293T成为病毒载体包装（如慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒AAV）的首选宿主，因为病毒包装需要大量质粒共转染与高蛋白表达。293T的转染效率与HEK293相当，但其蛋白产量可高出数倍。其亚系293T/17（G418抗性）和293T/17 SF（EBV基因修饰）进一步优化了筛选与表达稳定性。293F细胞是专为无血清悬浮培养设计的衍生株。通过长期适应性驯化，293F细胞能够在无动物源成分的化学成分确定培养基（CDM）中高效生长并表达蛋白。这一特性极大提升了生物制药生产的安全性（避免外源病毒或朊蛋白污染）与经济性（降低血清成本，适配生物反应器大规模生产）。293F细胞广泛用于重组蛋白、单克隆抗体及病毒载体的工业化生产，是当前生物制药领域最主流的生产平台之一。293H细胞同样为无血清培养适应株，但其与293F的关键区别在于贴壁性更强。293H细胞在无血清条件下仍能牢固贴壁，不易脱落，因此特别适用于需要高密度贴壁培养的工艺，如噬菌斑检测、重组蛋白的优化表达与小规模生产。其表达的蛋白（如重组凝血因子VIIIFc）已成功用于临床治疗，证明了其在高质量蛋白生产中的可靠性。293S细胞则专注于糖基化研究。该细胞系通过基因编辑或筛选，降低了其内源性糖基转移酶的活性，从而产生具有更均一、更简化糖链结构的重组蛋白。这对于研究糖基化对蛋白功能的影响、开发糖工程化药物具有重要价值。此外，还有293E（表达EBNA-1蛋白，用于EBV衍生质粒复制）、293-6E（截短EBNA-1，优化悬浮表达）、293FT（293T与293F的复合型，兼具高表达与悬浮能力）等衍生株，共同构成了一个功能完备的细胞工具箱。下表系统比较了HEK293及其四大主流衍生株的核心特性：细胞系核心改造主要优势典型应用场景培养方式HEK293无（原始株）高转染效率、人源化修饰、基础研究通用基因功能研究、瞬时表达、病毒包装（基础）贴壁（含血清）293T稳定表达SV40 Large T抗原质粒高效复制，蛋白表达量极高慢病毒/逆转录病毒包装、高表达蛋白生产贴壁（含血清）293F无血清悬浮驯化无动物源成分、适配生物反应器、规模化生产重组蛋白、AAV、疫苗工业化生产悬浮（无血清）293H无血清贴壁驯化贴壁牢固、高表达、适合精细工艺重组蛋白优化、噬菌斑检测、高质量蛋白生产贴壁（无血清）293S糖基化通路修饰产生简化/均一糖链蛋白糖生物学研究、糖工程化药物开发贴壁或悬浮这些衍生株的出现，标志着HEK293细胞系从单一工具演变为一个可定制、可扩展的“细胞工程平台”，极大拓展了其在生物医学研究与产业转化中的边界。1.4 应用全景：在基础研究与生物制药中的核心角色HEK293细胞系的应用已渗透至现代生物医学的几乎所有核心领域，从基础的基因功能解析到前沿的基因治疗与疫苗开发，其身影无处不在。其核心价值在于，它提供了一个高效、稳定、人源化的表达系统，能够将复杂的生物学问题转化为可量化、可重复的实验操作。在基础研究层面，HEK293细胞是研究基因功能与信号通路的“黄金标准”。研究人员可将目标基因（如G蛋白偶联受体、离子通道、转录因子）通过瞬时转染导入HEK293细胞，利用荧光报告系统、Western blot、流式细胞术或电生理技术，实时监测基因表达、蛋白定位、相互作用及下游信号激活。例如，对神经递质受体（如NMDA受体、5-HT受体）的功能研究，绝大多数发表于《Nature》《Cell》等顶级期刊的论文均使用HEK293细胞作为异源表达系统。其低内源受体背景确保了实验信号的特异性，而高转染效率则允许快速筛选大量突变体或药物候选物。在重组蛋白生产领域，HEK293细胞因其人源化翻译后修饰能力，成为生产复杂治疗性蛋白的首选。与CHO细胞相比，HEK293细胞生产的蛋白在糖基化模式上更接近天然人类蛋白，尤其适用于对糖链结构敏感的生物药，如促红细胞生成素（EPO）、凝血因子、抗体融合蛋白（如rFVIIIFc）等。293H与293F细胞系的无血清悬浮培养工艺，已成功应用于商业化生产，显著降低了生产成本并提升了批次一致性。在病毒载体包装方面，HEK293细胞是基因治疗与疫苗开发的“引擎”。腺相关病毒（AAV）和慢病毒（Lentivirus）的生产均依赖于HEK293细胞的高效共转染能力。以AAV为例，生产过程需同时转染三个质粒：携带目的基因的AAV载体质粒、编码AAV Rep/Cap蛋白的辅助质粒，以及提供腺病毒辅助功能的腺病毒辅助质粒（通常含E1A/E1B）。HEK293细胞自身表达的E1蛋白可替代部分辅助功能，而293T细胞则通过SV40 T抗原进一步提升质粒复制效率，使AAV滴度提升10–100倍。这一技术路线已成为FDA批准的基因治疗产品（如Zolgensma、Luxturna）的生产标准。在疫苗开发中，HEK293细胞同样扮演关键角色。新冠疫情期间，多款腺病毒载体疫苗（如阿斯利康ChAdOx1、强生Ad26.COV2.S）均使用HEK293细胞系进行病毒生产。此外，基于HEK293细胞的病毒样颗粒（VLP）疫苗、mRNA疫苗的体外验证系统，也广泛依赖该细胞系进行抗原表达与免疫原性评估。在药物筛选与毒性测试中，HEK293细胞被用于构建高通量筛选平台，评估候选药物对特定靶点（如GPCR、激酶）的活性与选择性。其易于转染的特性允许构建稳定表达靶标的细胞株，实现自动化、规模化筛选。综上所述，HEK293细胞已从一个实验室的偶然发现，成长为支撑现代生命科学与生物制药产业的“基础设施”。其应用广度与深度，使其成为连接基础研究与临床转化的桥梁，其价值远超一个简单的细胞系，而是一个推动人类健康进步的核心技术平台。 （AI生成）第二章：专业细胞库的建立标准与国际质量控制体系2.1 细胞库系统的核心价值与分级管理（PCB、MCB、WCB）在现代生物制药与基因治疗产业中，细胞资源的稳定性、可追溯性与一致性是保障产品质量与临床安全的基石。为系统性解决细胞传代过程中可能出现的遗传漂变、污染风险与批次间差异，专业细胞库系统（Cell Bank System, CBS）应运而生。该体系通过建立层级化、标准化的细胞保存与管理架构，将原本脆弱、易变的细胞培养过程转化为可控制、可复现的工业流程，从而为疫苗、重组蛋白、病毒载体及细胞治疗产品提供“源头可控”的细胞原料。细胞库系统的核心价值体现在“三可”原则：可追溯、可重复与可控制。可追溯性确保每一支冻存细胞均可回溯至其原始来源，包括细胞系的建立者、传代历史、检定记录与操作人员；可重复性保障不同批次、不同时间、不同地点生产的生物制品具有相同的细胞基质背景，使临床疗效与安全性数据具备统计学意义；可控制性则通过严格的代次限制与环境管理，最大限度降低细胞在扩增过程中因遗传不稳定或外源污染导致的质量波动风险。为实现上述目标，国际通行的细胞库管理体系采用三级结构：初级细胞库（Primary Cell Bank, PCB）、主细胞库（Master Cell Bank, MCB）与工作细胞库（Working Cell Bank, WCB）。这三级体系并非简单的数量递增，而是功能与风险控制层级的逐级递进。初级细胞库（PCB），又称“细胞种子”（Cell Seed），是细胞库体系的起点。它由原始细胞群体经有限传代（通常≤5代）后，筛选出的均一、稳定、无污染的细胞群体构成。PCB的建立需在严格无菌的B级背景A级洁净环境中完成，细胞活力要求≥90%，并需完成初步的身份鉴定与基本污染筛查。对于外源引进的细胞系（如ATCC提供的HEK293），其首次冻存的少量细胞即可作为PCB，作为后续建库的唯一原始来源。PCB的冻存量通常较少，仅用于建立MCB，严禁直接用于生产，其核心作用是“保存原始遗传本底”。层级名称功能定位代次限制检定强度使用权限第一级初级细胞库（PCB）保存原始细胞本底≤5代初步鉴定，低频检定仅用于建立MCB第二级主细胞库（MCB）建立质量基准≤2–5代（从PCB起）全面、强制性全检仅用于建立WCB第三级工作细胞库（WCB）直接用于生产≤5代（从MCB起）与MCB一致性验证可用于生产，开瓶即用，不可回存该三级体系通过“分层隔离、代次控制、逐级验证”的机制，构建了一道坚固的“质量防火墙”。任何一级的异常（如支原体污染、遗传漂变）均可在早期被发现并阻断，避免污染扩散至生产环节。这种结构化管理不仅符合ICH Q5D、FDA和《中国药典》的法规要求，更是实现生物制品“质量源于设计”（QbD）理念的关键实践。2.2 国际权威标准：ATCC等机构的保藏与质控规范在全球生物资源管理领域，美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）作为历史最悠久、权威性最高的非营利性生物资源中心，其建立的细胞保藏与质量控制规范已成为国际公认的“金标准”。自1925年成立以来，ATCC不仅承担着模式菌株、细胞系与病毒的采集、鉴定与分发职能，更通过其严谨的质控流程，为全球科研与产业界提供了可信赖的“参考物质”（Reference Materials）。ATCC对细胞系的管理远不止于“冷冻保存”。其核心价值在于身份确认、纯度保障与遗传稳定性维护。每一份ATCC编号的细胞系（如HEK293, CRL-1573）均附有完整的“细胞档案”（Cell Line Profile），包括：原始来源（如“人胚胎肾组织，1973年，Frank Graham实验室”）、传代历史、培养条件、形态学描述、核型分析结果、STR图谱、支原体检测报告及病毒筛查记录。这些信息不仅公开可查，且随技术进步持续更新，确保使用者获得的是“经过验证的、无污染的、可重复的”细胞资源。ATCC的质控体系建立在多维度交叉验证的基础上。其首要任务是细胞身份鉴定（Cell Line Authentication）。ATCC采用短串联重复序列分析（Short Tandem Repeat, STR）作为金标准。STR是一种基于PCR的DNA指纹技术，通过检测细胞基因组中多个高度多态性位点（如D5S818、D13S317、TH01等）的重复次数，生成独特的“STR图谱”。该图谱如同细胞的“DNA身份证”，可精确区分不同来源的细胞系，并有效识别交叉污染（如HeLa细胞污染）。ATCC要求所有分发的细胞系必须提供STR图谱，并与国际细胞系鉴定委员会（ICLAC）数据库比对，确保无误。在纯度检测方面，ATCC执行严格的“无菌-支原体-病毒”三级筛查。无菌检测采用培养法与分子法（如16S rRNA PCR）结合，确保无细菌、真菌污染；支原体检测采用培养法、DNA染色法及PCR法，灵敏度可达10 CFU/mL；病毒筛查则涵盖内源性病毒（如小鼠源性病毒）与外源性病毒（如HIV、HBV、HCV），使用细胞培养法、电子显微镜观察及高通量测序（NGS）进行综合评估。对于HEK293等腺病毒转化细胞系，ATCC特别关注其是否携带残留的腺病毒序列或重组病毒颗粒。遗传稳定性是ATCC长期保藏的核心挑战。为评估细胞在长期冻存与复苏后的遗传完整性，ATCC定期对库存细胞进行核型分析（Karyotyping）与荧光原位杂交（FISH），监测染色体数目与结构变化。对于HEK293等亚三倍体细胞系，ATCC会记录其模态染色体数（如64条）及特征性标记染色体（如der(1)t(1;15)）的稳定性，确保其在不同批次间保持一致。ATCC的规范不仅影响科研，更深刻塑造了产业标准。其操作流程被ICH Q5D、USP <1046>及FDA《Cell and Gene Therapy Products》指南直接引用。例如，ICH Q5D明确要求：“用于生物制品生产的细胞基质，其来源必须可追溯，且应通过适当的方法（如STR）进行身份鉴定。”而USP <1046>则细化了细胞库建立、冻存、复苏与检定的具体技术参数，如冻存速率应控制在1℃/min，复苏后细胞活力应≥80%。此外，ATCC还推动了全球细胞系认证网络的建立。其与欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC）等机构形成联盟，共享STR数据库与质控方法。CCTCC作为ICLAC认证的权威机构，其自2010年以来对1373例中国细胞系的STR鉴定数据，证明了国际标准在中国的落地与认可。这种跨国协作，使“使用ATCC标准细胞”成为国际论文发表、新药申报与临床试验的“隐形门槛”。2.3 质量控制核心：身份鉴定、无菌检测与遗传稳定性评估在专业细胞库的全生命周期管理中，质量控制（QC）是贯穿始终的生命线。其核心目标是确保细胞资源的身份真实、无外源污染与遗传稳定。这三大支柱构成了细胞库合规性的技术基石，任何一项的缺失或疏漏，均可能导致整个生物制品批次的失败，甚至引发严重的临床安全事件。细胞身份鉴定（Cell Line Authentication）是质量控制的首要环节。其本质是通过分子生物学手段，为细胞系建立独一无二的“生物指纹”，以排除交叉污染与误标风险。在所有方法中，短串联重复序列分析（STR）被国际监管机构（FDA、EMA、NMPA）及顶级期刊（Nature、Science、Cell）一致推荐为金标准。STR分析通过扩增细胞基因组中13–20个核心位点（如D3S1358、D16S539、Amelogenin等），生成一个由峰高与峰宽构成的数字图谱。该图谱具有极高的个体特异性——即使两个细胞系同属人源，其STR谱型差异也足以明确区分。例如，HEK293细胞的STR图谱与HeLa、CHO-K1、U2OS等常用细胞系存在显著差异，可有效识别“HeLa污染”这一长期困扰生物医学界的难题。ATCC与CCTCC等权威机构要求，所有用于生产或发表研究的细胞系，必须提供与标准参考谱型匹配度≥80%的STR报告。近年来，随着高通量测序技术的发展，全基因组测序（WGS）与SNP芯片分析正逐步成为STR的补充手段，尤其在识别复杂遗传背景或近缘细胞系时更具优势。无菌检测与支原体检测是防止外源污染的“双保险”。无菌检测旨在排除细菌、真菌等微生物污染，通常采用培养法（如需氧/厌氧肉汤培养、真菌琼脂培养）与分子法（如16S/18S rRNA PCR）联合进行。培养法耗时较长（7–14天），但可分离活菌；PCR法快速灵敏，可检测低丰度污染。支原体污染则更为隐蔽，因其体积小、无细胞壁、不引起明显培养基浑浊，常导致实验结果异常却难以察觉。ATCC与《中国药典》均要求采用多重检测策略：包括DNA染色法（如Hoechst 33258染色观察细胞核外荧光）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及PCR法（靶向支原体16S rRNA基因）。其中，PCR法灵敏度最高，可检测至10 CFU/mL，是当前主流方法。值得注意的是，支原体污染具有“传播性”，一旦MCB或WCB被污染，将导致整个生产链的系统性污染，因此必须在每级细胞库建立时进行强制检测。遗传稳定性评估是保障长期生产一致性的关键。细胞在体外传代过程中，因复制压力、氧化应激或表观遗传改变，可能发生染色体数目异常（非整倍体）、基因扩增或缺失、表型漂变等现象。对于HEK293等亚三倍体细胞系，其核型本就具有异质性，因此评估重点在于稳定性而非“正常性”。ATCC与《中国药典》要求，MCB与WCB需定期进行核型分析（G显带技术）与荧光原位杂交（FISH），监测关键染色体标记（如der(1)t(1;15)、der(19)t(3;19)）的出现频率是否稳定。此外，功能性稳定性评估同样重要：需检测细胞在不同代次下，其关键功能指标（如HEK293的转染效率、293F的蛋白表达量、293T的病毒滴度）是否保持在可接受范围内。例如，若293T细胞在第25代后，其SV40 T抗原表达水平下降30%，则表明其质粒复制能力已衰退，该批次WCB应被废弃。质控维度检测方法检测频率合格标准风险后果身份鉴定STR分析（金标准）、SNP芯片、WGSMCB建立时全检，WCB建立时复核与标准谱型匹配度≥80%交叉污染导致实验不可重复、产品无效或免疫原性异常无菌检测培养法、16S/18S rRNA PCR每级库建立时全检无细菌、真菌生长生物制品污染，引发患者感染风险支原体检测PCR法、DNA染色法、ELISA每级库建立时全检，WCB使用前复检无支原体DNA或抗原信号隐性污染，干扰细胞代谢、蛋白表达，导致临床试验失败遗传稳定性核型分析、FISH、qPCR（关键基因拷贝数）MCB建立时全检，WCB每5代抽检标记染色体频率波动≤10%，功能指标下降≤20%表型漂变，生产效率下降，产品质量批次间差异大这些检测项目并非孤立存在，而是构成一个闭环质控网络。例如，若STR鉴定发现某WCB与MCB不匹配，应立即追溯其是否在扩增过程中被HeLa污染；若支原体检测阳性，则需排查是否因操作人员未规范使用生物安全柜所致。这种系统性思维，正是专业细胞库区别于普通细胞培养的核心所在。