Afatinib Dimaleate

关注小药说药，一起成长！ 前言 人类表皮生长因子受体（HER）家族的成员，包括HER1（EGFR）、HER2、HER3和HER4，在调节细胞增殖、存活、分化和迁移方面发挥了核心作用。EGFR家族的过表达被认为是和多种肿瘤类型相关的最常见的细胞失调之一。 抗体偶联药物（ADC）是一类新的、有前途的抗癌治疗药物，它将抗体的癌症特异性与化疗药物的细胞毒性结合起来。美国食品和药物管理局（FDA）分别于2013年和2019年批准了两种HER2导向的ADC，即trastuzumane-emtansine（T-DM1）和trastuzumab-deruxtecan（DS-8201a），用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌。 2021，中国国家医药产品管理局（NMPA）批准了第三种HER2导向的ADC，即disitamab vedotin（RC48），用于局部晚期或转移性胃或胃食管交界癌。目前，有多个针对HER家族受体（EGFR、HER2或HER3）的ADC正在进行临床试验。这些药物的成功改变了HER阳性癌症的治疗，并为ADC发展领域注入了新的活力。 针对HER的靶向药物 由于HER家族在致癌过程中的关键作用，在过去二十年中开发了两种主要的靶向疗法来阻断HER驱动的通路，其中包括抑制细胞内结构域酪氨酸激酶活性的小分子化合物，以及针对受体细胞外结构域（ECD）的单克隆抗体。 八种酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已被批准用于临床，它们与HER家族的激酶结构域紧密结合。HER家族的第一代TKI包括厄洛替尼、吉非替尼和拉帕替尼。厄洛替尼和吉非替尼选择性结合EGFR的ATP结合位点，是迄今为止仅有的两种单一靶点TKI，而拉帕替尼是第一种被批准用于乳腺癌的TKI，对EGFR和HER2表现出同等的活性。下一代TKI包括阿法替尼、达科替尼和奈拉替尼是不可逆的pan-HER2抑制剂（EGFR、HER2和HER4），阿法替尼和达科替尼被批准用于非小细胞肺癌（NSCLC），而奈拉替尼被批准用于乳腺癌。在上述六种TKI中，厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼目前仍是非小细胞肺癌的一线治疗药物。最后，奥西米替尼是第三代EGFR TKI，对具有EGFR激活突变和EGFR T790M突变的NSCLC患者具有显著疗效。 与TKIs不同，单克隆抗体与受体的细胞外结构域结合，从而阻止受体与配体结合或其二聚化。迄今为止，多个针对HER受体的单克隆抗体已被批准用于临床。目前市场上有两种HER2靶向单抗，包括曲妥珠单抗（Herceptin®）和帕妥珠单抗（Perjeta®）。曲妥珠单抗于1998年首次获得批准，已广泛用于治疗HER2阳性乳腺癌和胃癌，而帕妥珠单抗于2012年获得批准，自2012年以来一直用于治疗HER2阳性乳腺癌。 用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双重阻断HER2已成为转移性乳腺癌患者的一线治疗方法。迄今为止，已有五种EGFR靶向单克隆抗体被批准用于临床，即cetuximab（Erbitux®）、panitumumab（Vectibix®）、nimotuzumab（BIOMAB-EGFR®）、necitumumab（Portrazza®）和amivantamab（Rybrevant®）。Cetuximab和panitumumab均被批准用于转移性结直肠癌（CRC），而cetuximab也被批准用于治疗KARS野生型CRC和晚期鳞状细胞癌。Nimotuzumab被批准用于治疗头颈部鳞状细胞癌，Necitumumab被批准用于治疗难治性转移性鳞状非小细胞肺癌。与上述抗EGFR单抗不同，amivantamab是一种双特异性抗体，可同时结合EGFR和MET的细胞外结构域，最近已被批准用于治疗具有EGFR外显子20插入突变的晚期或转移性NSCLC成年患者。 靶向EGFR的ADC EGFR在多种肿瘤类型中扩增或过表达，已被证实为重要的肿瘤靶点。然而，目前还没有靶向EGFR的ADC被批准用于癌症的治疗。目前，有三种针对EGFR的ADC正在进行临床研究，包括depatuxizumabmafodotin（ABT-414）、MRG003和M1231。ABT-414是迄今为止最领先的EGFR靶向ADC，已进入III期临床试验。  Depatuxizumab-Mafodotin（ABT-414） ABT-414由一种EGFR特异性人源化抗体（ABT-806）、一种不可切割的马来酰亚胺己基（mc）连接子和一甲基金司他丁F（MMAF）组成，与每个单克隆抗体结合的MMAF的平均数量约为4个。ABT-806与EGFR富含半胱氨酸的结构域（CR1）中的一个隐蔽表位结合，与其他EGFR靶向抗体相比，ABT-806在正常组织中与EGFR的结合活性最低，ABT-414保留了ABT-806的优良结合和功能特性。 在一项I期临床试验（NCT01800695）中，探索了ABT-414作为单一疗法或与替莫唑胺联合治疗胶质母细胞瘤患者的安全性、药代动力学和抗肿瘤疗效。ABT-414在I期试验中证明了可管理的安全性和可接受的药代动力学特征。然而，在二期临床研究（NCT02343406）中未达到总生存率的主要终点。目前，一项II/III期研究（NCT02573324）正在对新诊断的具有EGFR扩增的胶质母细胞瘤的参与者进行研究。然而，由于缺乏生存益处，该试验自2019年终止。 MRG003 MRG003由一种全人源EGFR特异性IgG1抗体、一种蛋白酶可切割缬氨酸瓜氨酸（vc）连接子和一甲基auristatin E（MMAE）组成。MRG003已经进行了I期临床试验（CTR20180310，NCT04868344），以评估MRG003作为单一药物治疗复发或难治性实体瘤患者的安全性、药代动力学和疗效。令人鼓舞的是，MRG003显示出可接受的安全性和潜在的抗肿瘤活性。目前，针对复发或转移性鼻咽癌、头颈部鳞状细胞癌、晚期转移性胆道癌和晚期非小细胞肺癌患者的MRG003（NCT05126719、NCT04868162、NCT04838964和NCT04838548）的多项II期研究正在进行中。 M1231 M1231是一种探索性ADC，半星霉素相关有效载荷与同时针对MUC1和EGFR的双特异性抗体结合。半星霉素是一种三肽，通过与微管蛋白结合发挥其细胞毒性，从而破坏正常的微管动力学。M1231的详细结构信息和临床前数据尚未公布。目前正在进行I期临床研究（NCT04695847），作为转移性实体瘤、食管癌和NSCLC患者的单一疗法。 靶向HER2的ADC HER2是HER家族癌症治疗的另一个重要靶标。到目前为止，市场上已经有三种HER2靶向ADC，T-DM1（Kadcyla）是第一个被FDA批准用于治疗晚期HER2+乳腺癌的Her2靶向ADC药物，同时也被批准用于新辅助治疗后残存病灶的早期高危患者。2019年，T-DXd（DS-8201；ENHERTU) 成为第二个获批的新型Her2靶向ADC药物，它在治疗难治性Her2+转移性乳腺癌患者中显示出显著的抗肿瘤活性。另外，2021年荣昌生物的RC48在中国获准上市，用于治疗至少接受过2种系统化疗的Her2过表达局部晚期或转移性胃癌患者。 目前，许多下一代HER2靶向ADC目前正在临床试验中进行研究。这些新型药物采用不同的有效载荷和连接技术进行设计，以进一步提高其疗效和耐受性。这些研究展现了治疗HER2阳性实体瘤患者的未来发展方向。                 此外，有七个Her2靶向的ADC被宣布终止临床试验。 这些数据显示，靶向Her2的 ADC的临床失败率相对较低（23.3%），表明Her2是ADC非常理想的靶点。 Trastuzumab duocarmazine Trastuzumab duocarmazine（SYD985）是一种HER2靶向 ADC，由曲妥珠单抗的主体与可切割连接子以及杜卡霉素有效载荷偶联而成。有效载荷是膜可渗透的，因此无论HER2表达如何，都有可能进入邻近细胞。该ADC的1期研究显示，在HER2阳性和HER2低表达乳腺癌中具有可接受的毒性和抗肿瘤活性。在这项针对HER2阳性MBC患者的扩展研究中，33%的患者（16/48）获得了客观响应。 这些结果构成了III期TULIP试验（NCT03262935）的基础，纳入了经T-DM1治疗的HER2阳性MBC患者，主要终点为评估PFS，结果尚未报告。SYD985目前也正在与紫杉醇（NCT04602117）和niraparib（NCT04235101）联合进行研究。SYD985与阿霉素和环磷酰胺的联合应用也正在I-SPY试验（NCT01042379）中进行研究，这是一项大型适应性新辅助试验，旨在评估不同生物制剂联合化疗的病理完全应答（pCR）率。 A166 A166由曲妥珠单抗与duostatin-5（一种auristatin衍生物）偶联而成。2020年，对27名可评估患者进行的I期试验（NCT03602079）结果显示DCR为59%，在3.6mg/kg和4.8mg/kg的剂量水平下，7名患者（26%）观察到PR。该研究正在进行中。 XMT-1522 XMT-1522是由HT-19抗体骨架构成的ADC，HT-19是一种人IgG1抗HER2单克隆抗体，与HER2的结构域IV结合，形成一个不同于曲妥珠单抗结合位点的表位，有效载荷为auristatin衍生物（AF-HPA）。临床前数据显示XMT-1522对HER2阳性的BC和胃癌细胞系以及对T-DM1耐药的异种移植模型有效。一项I期研究（NCT02952729）的初步结果显示，在剂量为16和21.3mg/m2组中，总体DCR为83%（5/6），有1例 PR，在剂量低于16 mg/m2的患者中，DCR为25%（3/12）。 ALT-P7（HM2/MMAE） ALT-P7是一种新型的HER2靶向ADC，由曲妥珠单抗变体与MMAE偶联而成。首次人体研究的结果显示，在可测量的患者中，DCR为77.3%（17/22），有2例PR。在经过中位既往治疗为6的患者中，中位PFS为6.2个月，目前，第二阶段的研究正在计划中。 ARX788 ARX788是一种位点特异性ADC，由抗HER2抗体与一种高效微管蛋白抑制剂AS269偶联而成，使用一种独特的非天然氨基酸偶联技术和不可切割的连接子。第一阶段试验的结果显示在HER2阳性BC中具有抗肿瘤活性，在48名可评估患者中，1.3mg/kg剂量组的ORR为56%，剂量为1.5mg/kg时ORR提高到63%。因此FDA于2021年1月授予了快速通道认定。目前ARX788正在对HER2阳性实体瘤患者进行一项两部分的1期剂量递增试验（NCT03255070）。 PF-06804103 PF-06804103由曲妥珠单抗衍生抗体通过可切割连接子与AUR-06380101（一种新型有效的auristatin衍生物）偶联而成。PF-06804103在低HER2表达的乳腺、胃和肺肿瘤模型中显示出有效性。剂量递增1期研究（NCT03284723）的初步结果显示，在≥3.mg/kg的剂量下，ORR为52.4%（11/21）。所有患者均曾接受过HER2靶向治疗，既往治疗中位数为6。 MRG002和ZW49 MRG002和ZW49是两种ADC，它们都使用auristatin作为有效载荷与不同的HER2单克隆抗体偶联，前者使用人源化抗HER2 IgG1单克隆抗体，后者使用ZW25，一种分别识别trastuzumab和pertuzumab结合位点的抗HER2双特异性抗体。目前两种ADC正在进行第一阶段临床试验（CTR20181778、NCT04492488、NCT04742153、NCT03821233）。 BDC-1001 BDC-1001由曲妥珠单抗的生物类似物与TLR 7/8激动剂通过不可切割的连接子偶联而成。BDC-1001能够激活抗原呈递细胞，同时保留抗体介导的效应器功能，如ADCC。临床前数据显示BDC-1001在异种移植模型中诱导有效的免疫介导的抗肿瘤作用，并且首次在人类研究中证明了其安全性。BDC-1001单独或与抗PD1联合使用的疗效结果仍在等待中（NCT04278144）。 最后，一种新型设计的基于pertuzumab的ADC在酸性内体pH下对HER2亲和力变低，这样的设计在HER2低表达异种移植模型中显示出溶酶体输送和细胞毒性增加，预计将进入进一步的临床试验。 靶向HER3的ADC HER3在多种癌症类型中过表达，并被认为可预测不良预后。尽管缺乏显著的激酶活性，但HER3通过HER3同源二聚化或HER2/HER3异源二聚化发挥其功能，从而激活下行信号通路以促进细胞存活和增殖。重要的是，HER3信号已被证明与抗EGFR/HER2疗法的耐药机制有关，并且正在成为EGFR突变NSCLC的一个有希望的治疗靶点。Patritumab deruxtecan（U3-1402）是目前唯一一个正在进行临床研究的ADC。 U3-1402由抗HER3单克隆抗体（Patritumab）、可切割的GGFG连接体和拓扑异构酶I抑制剂Dxd组成。U3-1402的DAR为8，U3-1402在其他人类HER家族受体（包括EGFR、HER2和HER4）中显示出较高的HER3特异性结合亲和力，并且在患者来源的异种移植模型中也显示出强大的抗肿瘤活性，具有可接受的安全性。目前，针对HER3阳性转移性乳腺癌的U3-1402 I/II期研究（NCT02980341）正在进行中。该试验的早期报告表明，U3-1402具有良好的抗肿瘤活性，且具有可耐受的安全性。同时，U3-1402正在进行一项I期临床研究（NCT03260491），以探索在转移性或不可切除的非小细胞肺癌中的疗效和安全性。 ADC开发的挑战和展望 作为发展最快的抗癌药物之一，ADCs目前面临三大挑战： 1）如何提高癌细胞对ADCs的摄取一直是ADCs发展的主要挑战。目前，ADC依赖于癌细胞表面高水平的靶抗原表达，以确保有效的内吞作用释放细胞毒性有效载荷。研究表明，HER2靶向ADC的有效细胞杀伤通常与细胞表面的HER2表达水平相关，通常需要相当高的表面HER2表达水平。靶抗原在肿瘤表面的表达水平显著限制了现有ADC的治疗效果。因此，提高ADC对癌细胞的摄取量有可能满足更多市场需求，尤其是对于抗原表达水平较低的患者。 2）系统毒性仍然是导致ADC临床试验失败的主要因素之一。毒性效应与多种因素有关，包括抗体、有效载荷药物、连接子和靶抗原。 3）对ADC治疗的新抵抗是另一个需要克服的障碍。研究表明，ADC的无效内化和溶酶体运输或降解可能是T-DM1耐药性的主要机制。此外，与抗体相关的耐药机制也可能导致T-DM1耐药，包括HER2表达减少、HER2截短形式的表达或ERBB2基因突变。 为了克服上述挑战，ADC的未来发展方向可能包括： 1）可以探索重组抗体方法，以改善ADC的癌细胞输送和溶酶体运输。如双特异性抗体和结合细胞穿透肽的抗体，以改善ADC的癌症靶向性和溶酶体递送。 2）对ADC设计的改进需求仍然很大。在下一代ADC中，有必要开发新的有效载荷平台、连接子技术和偶联策略，以最大限度地提高治疗效果并将ADC的毒性降至最低。 3）临床和转化方法也将在改善ADC治疗窗口方面发挥关键作用。联合疗法被认为具有提高药物疗效和降低ADC耐药性的能力。此外，优化患者选择和监测反应信号的临床生物标记物也可以提高ADC的治疗指数。 小结 HER靶向ADC正在成为HER阳性癌症患者非常有希望的治疗方法，三种抗HER2 ADC（T-DM1、DS-8201a和RC48）被批准用于HER2阳性癌症，11种HER靶向ADC目前正在临床试验中。 创新的分子结构，结合抗原特异性和强大的细胞毒性作用，赋予ADC治疗独特的药效学和药代动力学特性。下一代ADC对HER2低分化肿瘤的疗效有可能改变HER靶向治疗的历史模式。随着T-DM1、T-DXd和RC48的成功，目前有大量具有良好活性的新型HER 靶向ADC正在研究中，这些药物将为HER+癌症的治疗带来新的希望。 参考文献： 1.Antibody-Drug Conjugates Targeting theHuman Epidermal Growth Factor Receptor Family in Cancers. Front Mol Biosci. 2022;9: 847835. 2. Implementing antibody-drugconjugates (ADCs) in HER2-positive breast cancer: state of the art and futuredirections. Breast Cancer Res. 2021; 23: 84. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

DOI: 10.1016/j.bmcl.2024.130067 共价蛋白靶向是蛋白质表征、鉴定、和活性调节的有利工具。共价治疗的脱靶及导致的潜在的毒性是长久以来困扰着人们的重大问题。然而，最近的研究表明，许多共价结合物是安全、有效、长效的治疗方法。共价治疗也能在高度相似的蛋白质之间实现选择性靶向，并克服了突变诱导的抗性，与非共价结合物相比具有更高的效力。 选择性靶向POI特定的位点，是由结合口袋残基的几何和物理化学性质的差异，以及共价修饰剂“弹头”的几何和活性驱动的。根据共价弹头的反应性，和结合区域的性质，共价结合物可以破坏获锁定POI的构象，并抑制其活性增强。 近日，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters从共价结合物能够作用的靶标结合位点的角度出发，进行了分类分析和经验总结。原文开源，末尾点击“阅读原文”直达文献地址。 蛋白可结合位点与可共价标记位点 01 1.1、蛋白质“结合口袋” 蛋白质折叠成三级结构后，其内部或表面会形成各种动态的空腔。其中，适合配体结合的空腔即为“结合口袋”。这些口袋在与特定的配体结合时完成不同信号的转导。而蛋白质则可以通过打开、关闭、或引起结合口袋的构象变化，控制配体的可及性，从而自动调节其活性，实现特定的功能。 结合口袋周围氨基酸残基的理化性质，可以决定位点的特异性结合，以完成各种生化功能。而蛋白质的功能可以通过与外源因子的结合来调节，这也是蛋白质靶向治疗的前体，促使了大多数药物获批用于疾病治疗。 对于给定的蛋白质，有很多可能类型的结合物，每种结合物都可以结合蛋白质上不同类型的位点。鉴定蛋白质结合口袋是开发选择性、高效性结合物的第一步；这些结合物可以通过筛选化合物文库进行探索；实际上，可以利用蛋白质的三维结构，亦或是在某些情况下，基于结构预测口袋。 已经有许多类型的结合口袋被鉴定，并用于研究蛋白质靶向。 1、活性位点，也称之为正构位点，是激动剂或拮抗剂分别靶向增强或抑制蛋白质活性的常见位点。在配体结合和非结合态下，活性位点的特征都很明显。具有类似功能的结合口袋在蛋白质家族中高度保守，如激酶的ATP结合口袋，因此，使用这类结合口袋位点，选择性靶向其中一个特定异构体通常认为是不可靠的。 2、“隐形口袋”，由配体结合产生的隐形疏水口袋，不存在明显的配体非结合状态。这类口袋结合位点特别重要，尤其是当不能通过底物结合位点实现特异性结合，或者需要这种靶向性促使不同需求的蛋白质功能。 3、变构位点，也正称之为别构位点，是一类明显的效应结合口袋，在调节活性位点的构象变化中起关键作用。这类位点可分别被正调节剂或负调节剂靶向，以增强或阻止配体结合活性位点。 4、蛋白质-蛋白质界面可药物口袋，是蛋白质中可用于类药性小分子结合的空隙，一度被认为是不可药物的，因为涉及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的界面一般宽而浅，缺乏可结合的凹槽，用小分子靶向具有挑战性。“热点”在PPI界面上降低伴侣蛋白的结合自由能中起关键作用，是可靶向的关键残基，广泛分布在PPI界面，其氨基酸组成不同。 通常，这种蛋白质结合以非共价方式发生，相互作用主要通过氢键、盐桥、范德华力等发生在结合中，在蛋白质与结合物的结合与非结合状态之间建立平衡。这种可逆结合物具有良好的安全性，然而，可能因为结合时间短而使治疗效果低效。 1.2、蛋白质共价结合位点 共价药物通过共价弹头靶向蛋白质共价结合位点，共价弹头的结合时间延长，从而提高治疗效率，以及减少药物使用剂量。此外，共价药物在蛋白质同源异构体之间提供选择性靶向独特的亲核性残基，并克服突变诱导的对非共价抑制剂的抗性。然而，结合高反应性或非选择性共价探针可能导致潜在的特异性反应和免疫毒性。 常用的共价弹头如α,β-不饱和羰基、醛、芳基氟磺酸、磺酰氟、乙烯基砜、腈等。蛋白质可共价标记的亲核性残基如Cys、Ser、Thr、Tyr、Lys、His、Asp、Glu等。其中Cys是共价修饰最多的，因为它具有高亲核性，并且在蛋白质中含量比其它残基少，容易实现选择性靶向。 蛋白质不同位点亲核残基pKa值变化增强了共价靶向的选择性。如，Lys的ε-NH2残基pKa在生理pH值条件下为10.4，但如果Lys被其它碱性残基（如Arg、His）掩埋或包围，其pKa会降低5个单位，从而增强其对共价修饰的敏感性。同样，当Cys的巯基残基引入催化位点时，其pKa从8.5急剧下降到2.5。这些分子内反应性差异赋予了共价弹头结合的选择性。 与靶标亲核残基的成功和选择性共价结合取决于共价弹头的立体空间和活性，以及共价弹头结合位点附近的亲核残基的存在、立体空间、和活性。 共价标记可能发生在适合配体结合功能蛋白的任何位点，包括活性位点、蛋白-蛋白界面、辅因子结合位点、变构位点、或非催化位点。 共价靶向蛋白位点 02 2.1、靶向活性位点 蛋白质活性位点的共价靶向是阻碍蛋白质与配体/底物结合，并提供长时间接触，从而实现蛋白质活性抑制的直接途径。蛋白酶是共价抑制的成熟靶标，其催化位点含有Cys、Ser残基。以下是两种针对SARS-CoV主要蛋白酶和人中性粒细胞弹性酶的共价抑制剂，分别作为针对靶向半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶的例子。 主蛋白酶（Mpro或3CLpro） 一种半胱氨酸蛋白酶，含有一对催化半胱氨酸硫代阴离子与组氨酸咪唑阳离子，在冠状病毒复制中起关键作用。Mpro活性位点有4个主要底物结合口袋组成：S1'、S1、S2、S4。其中，催化Cys位于S1'口袋中，在冠状病毒之间保守。 Mpro对底物蛋白水解的特异性由底物相应的识别基序（P1'、P1、P2、P3）决定，P1在冠状病毒主蛋白酶中是保守的谷氨酰胺（Gln），但在人类其它蛋白酶中没有此保守方式。因此，P1位置加入Gln或其模拟物是开发Mpro肽模拟抑制剂的先决条件，如下图中a、b、c、d。 此外，上图e中的化合物5、6、7是FDA批准的具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、和细胞保护活性的药物或候选药物，显示出与Cys145的共价结合，并抑制SARS-CoV Mro。 人中性粒细胞弹性蛋白酶（hNE） 一种丝氨酸蛋白酶，在免疫反应、弹性蛋白水解和炎症的调节中起重要作用。hNE通过催化活性位点的三联体（Ser195、Aspect102、His57）实现蛋白水解活性。 如下图，共价化合物8、9通过芳基磺酰氟靶向POI共价结合位点。其中，化合物8与催化活性位点Ser195的结合可以通过X射线线晶体学观察到。 化合物9同时兼有磺酰氟和O-氟硫酸酯，其活性最佳，具有亚微摩尔级抑制活性，并对结构相似的蛋白酶如hCG具有高选择性。 2.2、靶向蛋白-蛋白界面 靶向PPI界面非常具有挑战性，即使针对其中的“热点”，非共价结合的可逆结合在干扰二元蛋白之间的高亲和力相互作用时通常也不是很有效。而靶向共价抑制剂则成为了一种非常有潜力的靶向PPI的策略。 BCL-2家族蛋白 通过抑制促凋亡蛋白活性的抗凋亡蛋白（如BFL-1）控制细胞凋亡，包含有4个结构域，而BCL-2成员NOXA和BIM仅包含第三个结构域（BH3结构域）。抗凋亡蛋白通过与促凋亡蛋白的α-螺旋BH3结构域结合，抑制癌细胞凋亡。 模拟PPI界面上“热点”的二级结构元素，是高效调节PPI的策略。通过钉接使肽段刚化成α-螺旋构象，以模拟相互作用的氨基酸在界面上的排列。通过分子内交联实现钉接，最常见的使为i与i+4或i与i+7残基交联。如下图。 凋亡蛋白抑制因子（IAPs） 与半光天冬酶结合，抑制细胞凋亡，与许多疾病，如癌症、神经退行病、自身免疫性疾病有关。线粒体源性半胱天冬酶激活剂（SMAC）通过与半胱天冬酶竞争来调节IAP结合和抑制IAP功能。其成员之一，XIAP，通过第三BIR3结构域（BIR3）的N端肽（AVPF）与SMAC结合，代表着SMAC结合位点。 针对该位点开发共价抑制剂的策略之一是通过模拟AVPF肽序列，并在合适的位置安装共价弹头，如下图，通过磺酰氟或氟磺酸酯靶向BIR3结构域的Lys311残基。 2.3、靶向活性位点附近的残基（非催化位点） 蛋白亚族和异构体之间的催化位点通常高度保守，而非催化残基则不保守。因此，靶向非催化亲核残基的共价靶向是一种很有前景的方法，可以在具有高度结构相似性的蛋白质之间实现选择性靶向，并克服对催化位点结合物的突变驱动抗性。 组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDMs） 通过抑制蛋白尾部的单、二、三甲基化赖氨酸残基的去甲基化，对组蛋白功能的调节具有关键作用。KDMs家族一个包含20个酶亚族KDM2-7，与不同类型的癌症和发育障碍相关。其中，KDM5具有独特的Cys残基，Cys480仅在KDM5B中发现，其它亚族还有Cys497。 如下图，通过对非共价抑制的改造，在合适的位置安装共价弹头，提高了抑制剂的选择性。 HCV NS3/4A 一种病毒丝氨酸蛋白酶，可以切割HCV多蛋白，生成病毒复制所需的非结构蛋白（NS），是开发HCV抑制剂的重要靶点。 如下图，化合物18是一种可逆共价α-酮酰胺抑制剂，在催化位点Ser139形成半缩醛，然而，Ser139在人类蛋白酶中保守，因此造成脱靶。化合物19安装了不可逆共价弹头，增强了化合物18的选择性和安全性。化合物19靶向非催化位点Cys159，对HCV蛋白酶表现出更高的效价和选择性。 如下图，是人类疱疹病毒（HHV）家族蛋白酶的共价抑制剂，不可逆靶向Cys161。二硫化合物具有中等抑制活性，改造后，以不可逆的方式获得了化合物21，活性增强。 2.4、靶向辅因子结合位点 辅助因子协助许多蛋白的功能并促进它们的生物活性、稳定蛋白结构。一些辅助因子如氧化镁聚合酶、铁血红素、丙酮酰吲哚羧化酶和三磷酸腺苷（ATP）酶。而激酶ATP结合口袋是最丰富的辅助因子结合靶标，可以用于激酶的选择性靶向。 致癌BCR-ABL酪氨酸激酶 由BCR基因和ABL1基因异常融合形成的激酶，是慢性髓性白血病（CML）的主要病因，并且被竞争性ATP抑制剂靶向。BCR-ALK激酶结构域突变，将产生对竞争非共价抑制剂的抗性，特别是“守门人”T315I的突变。 下图，化合物22安装有邻硼酸苯甲醛作为共价弹头，选择性靶向致癌BCR-ABL野生型和突变型结合位点上的保守催化位点Lys271，然而，却没有细胞活性。随后，通过改造，筛选不同的共价弹头，产生了不同的可逆共价和不可逆共价抑制剂。其中化合物具有很好的细胞活性，24不具备细胞渗透性，25具有细胞内的稳定性和渗透性，但氟硫酸酯弹头的过弱的反应性也影响了其细胞活性。 BTK 具有独特的Cys481残基，促使BTK的ATP结合的选择性抑制。如下图，通过对非共价抑制剂26修饰，安装共价弹头获得共价抑制剂27，对BTK的选择性比其它酪氨酸激酶高。此外也有研究将BTK共价抑制剂与E3连接酶配体结合，构建了BTK-PROTAC。 表皮生长因子受体（EGFR) 如下图，Gefitinib是第一代EGFR可逆抑制剂。然而，守门人T790M突变导致催化结构域构象变化，在空间上阻碍了一代EGFR可逆抑制剂结合。为了解决这个问题，开发出了第二代EGFR共价抑制剂，如Afatinib。这种抑制剂的共价弹头靶向非催化性的Cys797结合位点，恢复了抗T790M突变的活性，并提供了对EGFR信号传导的长期抑制。然而，二代抑制剂对突变型与野生型选择性较差，因此，具有剂量依赖性毒性。为了解决这个问题，又开发出了三代共价抑制剂，如Osimertinib，用吡嘧啶支架代替喹唑林，提高了亲和力，同时保留共价探头。 “亲核”弹头靶向辅助因子 亲电基团在蛋白质中并不常见；然而，当它们存在时，它们在蛋白质功能中起着至关重要的作用。亲电性辅因子可以通过蛋白质的翻译后修饰（PTMs）获得，也可以从外源（外源辅因子）获得，在某些情况下，它们的来源和功能是未知的。如下图，s-腺苷-L-蛋氨酸脱羧酶（AMD1）含有一个N端Pyvl辅助因子，通过与底物胺形成希夫碱中间体来催化脱羧反应。 2.5、靶向变构位点 变构是指配体与变构位点的结合引起构象和/或动态变化，从而调节蛋白质活性的一种异型蛋白调节。配体和变构位点内原子之间的物理相互作用通过各种途径扰乱蛋白质结构。到达配体结合位点的扰动可诱导刚性或松弛构象，从而导致蛋白质活性的降低或增加。因此，虽然两个配体可能具有相似的亲和力，但随之产生的变构效应可能因不同的繁殖途径而异。 相对于正构抑制剂，变构调剂剂作为候选药物具有理想的优势。变构位点的低保守性为潜在的选择性增加提供了一个途径，也减少了脱靶结合毒性。当变构配体结合远离内源性配体的位点时，即使内源性配体被结合，它们对蛋白质活性的影响也可以被利用。如下图。 AKT1激酶抑制剂 KRAS G12C抑制剂 总结与展望 03 共价靶向并不局限于蛋白质-配体结合的位点。设计带有共价弹头的抑制剂来靶向蛋白质与蛋白质的相互作用，这是对抗不可药物蛋白质的一种有希望的方法。换句话说，与位于膨胀蛋白界面的“热点”的共价结合延长了抑制剂-蛋白的接触，并确保了伙伴相互作用的中断；与非共价竞争性抑制剂相比，共价靶向辅助因子结合位点能够识别未表征的蛋白质，并增强抑制效果；共价靶向非催化残基（在蛋白质同工异构体中较不保守）导致具有高度结构相似性的蛋白质之间的特异性靶向。 共价抑制剂通过锁定非活性构象的蛋白质与异位结合而显示出有效性，这反过来克服了抑制剂与正位结合位点结合的耐药性。蛋白质表面的许多结合凹穴具有独特的物理化学性质，可用于选择性共价修饰，为将共价结合应用于药物发现提供了机会。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓