MUROMONAB-CD3

注：文章内容源自书籍Antibody Drug Conjugates-Design, Discovery, and Development第"Considerations for Antibody-Drug Conjugate Design: Stability and Formulation"章内容的翻译，仅供个人学习用，如有不当敬请原谅。 摘要：ADCs是一类具有肿瘤特异性靶向能力的复合物，通常由单克隆抗体（mAbs）通过化学连接子与细胞毒性载荷（payload）共价连接构成。ADCs基于精准靶向的能力，为癌症治疗领域带来了革命性变革。目前，已有13种ADCs获得美国FDA批准，其中大部分针对各类癌症获得了突破性疗法或加速批准资格。全球范围内，处于研究、测试或临床试验阶段的候选药物已超过400种。设计“理想的”ADCs面临独特挑战，因为单个组件（抗体、连接子、载荷）的生产与偶联过程需要极高的精准度和控制力。无论是已获批的ADCs，还是处于研究阶段的ADCs，其制剂设计均需严格遵循特定原则：既要维持抗体-抗原的有效靶向性及连接子-载荷的兼容性，又要确保ADCs在血液循环中的稳定性；同时需实现载荷到达靶部位后的特异性释放，从而保障最佳治疗效果。这些复杂性体现在多个维度：抗体层面（结构及翻译后修饰）、连接子层面（位点、大小、长度及疏水性）、载荷层面（细胞毒性、免疫原性及溶解性）。本文综述了自首个FDA批准ADCs至今，已获批ADCs所采用的设计与制剂策略，探讨了在维持ADCs稳定性的同时，可提升临床疗效和治疗指数的生物工程修饰技术。 关键词：抗体药物偶联物；靶向治疗；化学生物学；单克隆抗体；连接子；载荷；联合治疗；免疫治疗；抗体工程 引言 ADCs结合了单克隆抗体的靶向特异性、小分子物质的特性及细胞毒性药物的杀伤能力，能够靶向并清除癌细胞。二十多年前，ADCs首次进入临床试验，随后迅速成为传统癌症治疗方法（如激进的手术组织切除、放疗及毒性化疗）的极具潜力的替代方案。然而，靶向疾病治疗的理念并非全新概念。早在首个以ADCs为重点的临床试验开展前近一个世纪，德国免疫学家Paul Ehrlich就为如今的精准医学奠定了基础。Ehrlich将其 “Zauberkugel理论”（魔法子弹理论）命名为“magic bullet”（魔法子弹），描述了一种可精准根除疾病且不损伤健康组织的药物。 20世纪中期的单克隆抗体研究，为多克隆血清中抗原结合片段（Fabs）的组合与重组提供了概念验证。Köhler和Milstein建立的杂交瘤技术，是将产生抗体的B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，以大量生产单克隆抗体的成熟方法。该技术极大地推动了抗体的生产与发现，至今仍广泛应用于抗体研发领域。首个被报道的抗体-毒素偶联物（称为免疫毒素），是将IL-2小鼠抗体的可变结构域与截短的铜绿假单胞菌内毒素融合而成。1986年，用于减轻器官移植排斥反应的抗体--muromonab-CD3，（商品名Orthoclone OKT3™），成为首个获FDA批准用于临床的单克隆抗体。目前，市场上已有超过150种获FDA批准的单克隆抗体，用于治疗各类疾病。 2000年是ADCs发展的重要里程碑：靶向CD33的gemtuzumab ozogamicin（商品名Mylotarg）获批用于治疗成人急性髓系白血病（AML），并获得 FDA加速批准。2013年，ado-trastuzumab emtansine（商品名Kadcyla/T-DM1）成为首个获批用于实体瘤治疗的ADCs，其特异性靶向HER2阳性转移性乳腺癌。截至目前，自2000年以来已有13种ADCs获FDA批准，其中11种目前仍在市场上流通（表1）。第一代ADCs为靶向治疗奠定了基础，而后续每一代ADCs均在前辈的基础上改进了缺陷。第一代ADCs面临肝毒性和疗效低下的问题；第二代ADCs通过优化策略（如改变IgG亚型、提高原位可切割连接子的稳定性、采用早期位点特异性偶联技术）解决了这些缺陷，但仍存在治疗窗口窄、因异质性增加及药物-抗体比率（DAR）范围过大导致的脱靶毒性等问题；第三代ADCs通过更可控的位点特异性偶联技术，改善了DAR和物种异质性相关问题。目前，8种第三代ADCs中有7种采用基于半胱氨酸的偶联技术，可生成具有可预测、可控制DAR的可重复且均一的ADCs。新型连接子化学技术和抗体工程技术正不断涌现，为下一代ADCs的研发提供支持。本章将评估过去及当前ADCs在组成方面的创新与发展，阐述ADCs设计与制剂的考量因素，并重点介绍ADCs发展历程中的里程碑事件。 表1 FDA批准的ADCs列表 ADCs的核心组成要素 典型的ADCs由三个核心部分组成：（1）靶向实体瘤或血液肿瘤蛋白的单克隆抗体（mAb）；（2）细胞毒性小分子或药物（载荷）；（3）连接两者的连接子（图1）。ADCs识别并结合其靶抗原（通常为表面受体）后，会被细胞内化，随后在细胞的内体或溶酶体中通过化学或酶促作用与抗体“载体”分离；释放后的药物进而诱导细胞死亡。抗体的分子量较大（约150 kDa），占ADCs总质量的90%以上；相比之下，许多常用细胞毒性载荷的结构简单，分子量极低。ADCs的每个组件（连接子、单克隆抗体、载荷）都会影响其稳定性、疗效、安全性及毒性。因此，在进行ADCs设计与制剂研究时，需采用全面审慎的方法，对每个组件进行评估。 图1 抗体药物偶联物的组成：单克隆抗体+连接子+细胞毒性载荷 抗体的选择 选择“合适的”抗体作为细胞毒性载荷的“载体”，需考虑多个因素：抗原特异性、抗原在癌细胞中高表达而在健康细胞中低表达或不表达、低宿主免疫原性。此外，所选抗体还应具备高效的细胞内化能力和较长的血浆半衰期（t1/2）。抗体的生物利用度和血浆半衰期对确保剂量浓度至关重要，而剂量浓度与维持治疗疗效直接相关。在ADCs制剂设计中，单克隆抗体部分的制剂应尽可能遵循其未偶联状态下的原始制剂配方，仅进行最小程度的修饰，以保留抗体的天然特性。 抗体（即免疫球蛋白，Immunoglobulins）的经典结构为Y形蛋白质，由两条轻链和两条重链二聚体构成。抗体的重链（或可结晶片段，Fc区）构成Y形结构的“基部”，主要负责与补体系统的蛋白质发生特异性相互作用（图2a）。轻链（或抗原结合片段，Fab区）包含恒定结构域（CH1和CH2）和可变结构域（VH和VL），其中恒定结构域负责招募宿主免疫系统，可变结构域则负责识别体内的外来抗原。Fab区的可变结构域含有抗原结合基序，可促进抗体进入细胞。 早期获批的免疫治疗药物采用鼠源单克隆抗体（mAbs），这类抗体具有肿瘤特异性强、清除效率高的特点。然而，其非人类来源的特性引发了担忧：在临床试验中，长期重复使用鼠源抗体会诱导人体产生快速的原发性和继发性人抗鼠免疫球蛋白（HAMA）免疫反应；尽管未观察到临床毒性，但有报道称其治疗效果会降低。例如，一项I期临床试验评估了鼠源单克隆抗体KS1/4的安全性和疗效，该抗体由肺腺癌细胞产生。研究中，KS1/4既作为单独抗体使用，也与抗代谢药物甲氨蝶呤偶联形成治疗药物，用于治疗IIIB期和IV期非小细胞肺癌（NSCLC）。尽管在试验过程中，偶联型和非偶联型抗体均具有良好的耐受性，但KS1/4-甲氨蝶呤偶联物在健康组织中表现出交叉反应性，这为后续临床试验带来了顾虑。 图2 抗体结构与设计。（A）单克隆抗体的区域。（B）嵌合抗体和人源化抗体设计 抗体工程 与第一代治疗性抗体设计相比，后续的抗体类治疗药物逐渐向工程化嵌合抗体和人源化抗体方向发展。嵌合抗体的设计理念于1984年首次提出，其将一个物种的Fab可变区与另一个物种的恒定Fc区融合；在大多数情况下，采用的是鼠源Fab可变区与人源Fc恒定区的组合（图2b）。这种结构组合解决了早期鼠源ADCs中观察到的抗人抗体免疫反应问题。首个获批用于肿瘤治疗的嵌合单克隆抗体是Rituximab，这是一种靶向CD20的抗体，自1997年以来一直用于治疗非霍奇金淋巴瘤。 人源化抗体的制备方法是将非人类抗体（如鼠源抗体）的互补决定区（CD区）移植到人类抗体的框架上（图2b）。通过这种组合，人源化抗体既能保留鼠源抗体的高效肿瘤靶向能力，又能凭借人源抗体框架维持较低的免疫原性。因此，人源化技术在很大程度上（甚至完全）降低了人抗人抗体（HAHA）反应的风险。一项针对ADCs与已获批单克隆抗体治疗药物免疫原性的对比研究，调查了11项临床试验中的8种分子，结果发现ADCs引发的免疫原性效应并不高于现有单克隆抗体的已知效应。抗体人源化移植技术在很大程度上推动了后续单克隆抗体的加速批准。 免疫球蛋白亚型对生物制剂的血浆稳定性和作用机制具有重要影响。Ko等在食蟹猴中开展的Fc结构域突变研究发现，Q311R和M428L位点的突变可显著提高抗体的血清半衰期（t1/2）和效应功能。在人类所有免疫球蛋白中，IgG含量最丰富，占血液循环中免疫球蛋白总量的75%，占血浆总蛋白的10%-20%，因此成为治疗性抗体的理想选择。值得注意的是，IgG是唯一能够通过胎盘屏障的免疫球蛋白亚型。IgG可进一步分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。尽管这四个亚类的序列同源性极高，但在结构、功能和抗原结合特性上存在显著差异。其中，IgG1在血清中含量最高，也是下一代ADCs抗体部分最常用的亚型。IgG1还能强效诱导Fc介导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），并能与所有Fcγ受体（FcγRs）高亲和力结合（图3）。IgG4的独特之处在于其Fc结构域稳定性较低，铰链区的二硫键易被还原；这种不稳定性会导致IgG4分解为两个半分子，因此IgG4非常适合用于双特异性抗体的制备。此外，由于IgG4对FcγRI具有高亲和力，其在靶向程序性死亡配体 1（PD-L1）相关通路中表现出色--PD-L1是一种在多种癌细胞表面高表达的蛋白质。获FDA批准的ADCs中，用于治疗急性髓系白血病（AML）的Mylotarg，以及用于治疗复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病的lintuzumab ozogamicin（商品名Besponsa），均采用了IgG4亚型设计。 图3 展示了IgG1在ADCC、ADCP以及CDC途径中的作用，这些途径构成了IgG1介导的靶向肿瘤破坏的作用机制 靶抗原基序对ADCs的定向递送至关重要。抗原需在癌细胞表面特异性高表达（或显著高表达），而在正常组织中低表达或不表达，这是降低脱靶毒性的关键。Ritchie等提出的抗原特异性内吞作用，是第一代至第三代ADCs进入细胞并在细胞内递送“弹头”（载荷）的主要机制。过去10年间，ADCs的受体介导递送机制已得到越来越多的表征，其溶酶体通路具有可预测性。网格蛋白介导和小窝蛋白介导的内吞作用，是细胞膜上两种特征明确的细胞内化通路，已被用于基础药物递送平台；然而，在ADCs领域，这两种通路的相关研究仍存在较多未知。在已获批用于实体瘤和血液肿瘤治疗的ADCs中，绝大多数（甚至全部）均采用受体驱动的内化方式，其中以网格蛋白介导的内吞作用最为常见。 通过工程化改造Fc结构域，以优化靶标结合能力、提高血浆稳定性并诱导免疫原性反应，是下一代ADCs研发中日益受到关注的方法。其中一种策略是通过糖基化工程微调Fc效应功能。糖基化是单克隆抗体的一种翻译后修饰，可改善药物的药代动力学参数，包括提高生物利用度、延长血液循环半衰期（t1/2）及延长ADCs的治疗效应持续时间。例如，结构研究表明，IgG1恒定区的保守糖基化修饰可维持Fc区的构象，从而促进其与受体的介导结合。如前所述，ADCs抗肿瘤疗效相关的主要细胞毒性效应功能包括CDC、ADCC和ADCP通路：CDC通路的激活机制为-补体经典途径的起始分子C1q与抗体的IgG-Fc区结合，触发补体经典级联反应，最终导致细胞裂解；ADCC通路的机制为-自然杀伤细胞（NK细胞）和单核细胞表面高表达的IgG-Fc受体RIIIa（FcγIIIa/CD16a），与ADCs中抗体组分的Fc区相互作用，从而有效清除靶向癌细胞；ADCP通路则由CD16a和IgG-Fc 受体RIIIb（FcγIIIb/CD16b）共同介导。在药代动力学参数方面，单独的抗体具有相对较长的半衰期，通常可在体内循环并被回收利用，半衰期最长可达4周。事实上，多项基于单克隆抗体技术的研究证实，非糖基化IgG对抗体的清除无显著影响，仍可维持正常的半衰期；然而，Fc区的N-糖基化修饰已被证明可提高抗体的稳定性，对抗体起到抗降解、抗热变性和抗聚集的保护作用。因此，在ADCs设计中，通过表达不同糖型的单克隆抗体来提高治疗效果，具有明显优势。 IgG分子的Fc结构域上连接有多种聚糖结构，其四个亚类的重链恒定区均含有N-糖基化位点，但糖基化模式存在差异。该区域的主要N-聚糖为双天线型，多为核心岩藻糖基化、部分截短型，且可能携带唾液酸或平分型N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）。通过去岩藻糖基化（去除Fc区的N-聚糖）对抗体Fc区进行糖基化工程改造，可增强抗体与FcγRIIIa的结合能力及激活作用，从而使ADCC活性显著高于高岩藻糖基化抗体。这一策略此前已应用于抗癌单克隆抗体药物obinutuzumab（商品名Gazyva）和mogamulizumab（商品名Poteligeo），并显著提升了这些药物的体内疗效。近期的体外和体内模型研究表明，人IgG重链中高度糖基化且保守的N-连接糖基化位点（Asn 297）的岩藻糖基化程度，对补体和FcγR介导的效应功能具有关键调控作用。事实上，Asn 297位点的IgG-Fc聚糖（由GlcNAc和甘露糖双天线核心结构组成）发生变化，会进一步影响抗体与抗原的亲和力。迄今为止，Belantamab mafodotin-blmf（商品名Blenrep）是唯一一种获FDA批准的采用去岩藻糖基化人源化IgG1单克隆抗体制备的ADCs。该药物为单药疗法，用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤（RRMM），其抗体通过不可切割的马来酰亚胺己酰基（maleimidocaproyl）连接子与MMAF偶联。研究表明，Blenrep单克隆抗体的去岩藻糖基化修饰可增强其与FcγRIIIa受体的结合能力，从而增加免疫效应细胞的招募与激活。然而，2022年，Blenrep在III期确证性试验（DREAMM-3）中未能达到改善无进展生存期（PFS）的主要终点，因此退出市场（表2）。 表2 FDA已批准ADC的化学特征表 此外，Fc区的糖基化模式还会影响ADCs的免疫原性、生物利用度和药代动力学。该区域的变化可能引发针对ADCs的免疫反应，不仅包括效应功能的激活，还包括抗药物抗体（ADAs）的产生。ADAs可分为中和性抗体和非中和性抗体：中和性抗体会与ADCs中抗体组分的独特型结合，导致药物-靶标结合能力降低；非中和性抗体则会加速ADCs的清除。糖基化介导的免疫原性主要源于两个原因：（i）非人类糖基化修饰；（ii）聚糖异质性。非人类糖基化修饰的问题尤为突出，因为大多数抗体来源于非人类细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或鼠源骨髓瘤细胞（NSO细胞、SP2/0细胞）。 上述细胞系通常产生的常见非人类聚糖，是唾液酸的非人类版本：N-羟乙酰神经氨酸（Neu5GC）和α-1,3-半乳糖（Galα1-3Galβ1-4GlcNac延伸链）。一个因对含这些聚糖的抗体过敏而引发严重过敏性休克的案例，与Cetuximab（商品名Erbitux）有关。西妥昔单抗是一种由小鼠SP2/0细胞生产的嵌合型鼠-人IgG1单克隆抗体，研究人员在人类血清中检测到抗聚糖IgE抗体，且证实该抗体对重链Fc段上的α-1,3-半乳糖具有特异性。相比之下，在Fab段缺失α-1,3-半乳糖糖基化修饰的Cetuximab，其免疫原性更低。另一个免疫原性来源可能是甘露聚糖糖基化，因此，去除IgG的Fab段Asp 297位点的甘露糖含量，或许能减少免疫原性事件的发生。为避免此类情况，研究人员采用与人类内源性蛋白质表达模式和系统高度相似的体系来研发单克隆抗体。 连接子与偶联策略 连接子是ADC中具有多重功能的关键组成部分。除了将靶向特异性抗体与细胞毒性载荷以共价键连接外，连接子还直接影响ADC的疗效、稳定性，并可能对其整体安全性产生作用--因为连接子不稳定会导致载荷提前释放。理想的连接子在血浆中应具备高稳定性，其循环半衰期（t1/2）需比ADC中抗体部分的半衰期长10倍；连接子的组成、长度、疏水性等因素，会通过影响或降低生物利用度（对于疏水性连接子，还会降低整体溶解度并促进ADC聚集），来增加或降低ADC的稳定性。例如，更长的连接子长度可能提高ADC的灵活性，但也会增加空间位阻；连接子的化学性质和疏水性均会对半衰期（t1/2）产生影响。连接子不稳定导致的药物提前释放，是ADC研发过程中的主要障碍之一；因此，优化的连接子设计需在运输过程中维持ADC的稳定性，同时又不丧失在特定条件下释放载荷所需的敏感性。设计具有长半衰期（t1/2）的连接子，可确保抗体与载荷之间连接稳定，进而保证ADC的稳定性。同样，可控的偶联与释放化学作用（可裂解型和不可裂解型），对均一的DAR和靶向递送也有重要影响。目前临床应用及研发中的ADC连接子化学技术，同时采用不可裂解型和可裂解型连接子；不过，可裂解型连接子更受青睐，在已获批的13种ADC中，有9种使用了可裂解型连接子。 不可裂解型连接子 不可裂解型连接子依赖ADC被细胞内化后，通过溶酶体的完全降解来实现载荷释放。在受体介导的内吞作用后，ADC被摄入溶酶体，溶酶体内的完全分解代谢或水解作用会促使载荷在靶细胞内释放。第二代不可裂解型ADC--Kadcyla，其作用机制为：通过受体介导的内吞作用进入细胞，随后经溶酶体降解在靶细胞内释放药物。Kadcyla采用硫醚连接子，该连接子在循环中稳定性更高，仅能通过溶酶体内ADC的完全降解而断裂。正是由于这种稳定性，硫醚类和马来酰亚胺己酰基（MC）类连接子，成为下一代ADC中不可裂解型连接子化学技术的常用选择。其他第二代连接子（如用于Adcetris、Zynlonta等ADC的连接子），则同时结合了不可裂解型和可裂解型两种连接子类型。 与之相反，可裂解型连接子利用已知的细胞内蛋白质或细胞微环境来触发载荷释放。可裂解型连接子分为两类：化学可裂解型和酶可裂解型。化学不稳定型连接子利用细胞内环境的变化来触发药物释放，例如，酸敏感型连接子在细胞内化后，会被溶酶体的低pH环境激活。第一代ADC药物Gemtuzumab Ozogamicin（商品名Myelotarg）采用的是腙键连接子，这种连接子对酸敏感，但在循环中稳定性相对较低。Myelotarg的腙键连接子在循环中易发生提前断裂，在最初48 h内会释放50%的药物；这种非预期释放会导致脱靶毒性，表现为严重的肝损伤。相比之下，谷胱甘肽敏感型（或可还原二硫键型）连接子在循环中能维持偶联物的完整性，仅在还原性环境中才释放载荷。大多数癌细胞中还原性物质谷胱甘肽的水平会升高，这通常会促进肿瘤进展，并可能导致癌细胞对特定抗癌药物产生耐药性。通过这种方式，可还原二硫键型连接子能利用癌细胞中难以靶向的特定环境来递送载荷。 可裂解型连接子 第二类可裂解型连接子利用细胞内的酶促反应（尤其是蛋白酶的作用）来促进载荷释放。Adcetris和Zynlonta是第二代ADC中首批采用蛋白水解可裂解型连接子技术的药物。二肽连接子策略的设计初衷，是利用癌细胞溶酶体中特有的蛋白酶--这类连接子包含仅能被肿瘤特异性蛋白酶识别的序列，蛋白酶随后会在这些序列处切割连接子。最常用的二肽连接子策略之一，是利用溶酶体中的β-葡萄糖醛酸苷酶（组织蛋白酶B，Cathepsin B）--这种蛋白酶能切割ADC的载荷与连接子之间由疏水性氨基酸残基构成的二肽或三肽序列。可裂解型二肽策略的另一个例子是糖苷酶敏感型连接子：该策略利用肿瘤细胞溶酶体中过量存在的β-半乳糖苷酶的特异性，切割β-半乳糖苷基团，进而触发载荷释放。依赖组织蛋白酶B的连接子，要求二肽基序的第一个位置为可水解残基，最常见的是苯丙氨酸（Phenylalanine）和缬氨酸（Valine）；不过，在第二个肽位置添加亲脂性残基，可提高连接子在人血浆中的稳定性。 在组织蛋白酶B切割策略中，最常用的二肽是苯丙氨酸-精氨酸（Phe-Arg），此外，苯丙氨酸-赖氨酸（Phe-Lys）和缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）也有应用。尽管缬氨酸-瓜氨酸连接子在人血浆中稳定，但在小鼠血浆中却不稳定，这是因为小鼠血浆中的胞外羧酸酯酶（尤其是羧酸酯酶1C，Carboxylesterase 1C）会使其降解。这一问题随后通过添加谷氨酸得到解决--形成的谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸连接子能抵抗羧酸酯酶的切割，避免在小鼠血浆中发生提前降解。组织蛋白酶B是二肽可裂解型连接子的理想作用靶点：它在多种癌症的溶酶体中过量产生，且已知会促进肿瘤的侵袭与进展。但组织蛋白酶B也存在缺点：它在正常细胞中也有非特异性表达，已知会导致脱靶毒性。通常，由于药物的空间位阻作用，二肽连接子需要间隔基序来帮助稳定ADC。在这种情况下，间隔基序能确保蛋白酶可接触到肽序列，从而实现有效的体内切割。对氨基苄基氨基甲酸酯（PABC）连接就是一个例子：在连接子与药物的酶促切割后，PABC连接能通过直接自降解实现药物的彻底释放。 第三代ADC以Trastuzumab Deruxtecan（商品名Enhertu）、Inotuzumab Ozogamicin（商品名Besponsa）和Enfortumab Vedotin（商品名Padcev）为代表。与第一代和第二代ADC相比，第三代ADC的主要差异不在于连接子类型，而在于偶联策略。第三代ADC与前代产品的核心区别，是位点特异性偶联策略的发展--该策略能够生产出均一的ADC群体。位点特异性偶联不仅能确定抗体上连接的载荷数量，还能明确载荷与抗体的连接位置；这一优势使得偶联设计可实现最优结合与递送，同时不影响抗体的抗原结合基序。 偶联方法与药物抗体比率（DAR） 理想情况下，在与连接子偶联后，偶联方法应保留抗体的天然特性，以确保ADC的最佳性能和靶向活性。最常见的化学偶联方法包括：针对表面赖氨酸残基的偶联、针对带有功能基团的半胱氨酸残基的偶联、位点特异性糖基化偶联，以及非天然氨基酸（如对乙酰苯丙氨酸）替换偶联。对抗体表面赖氨酸残基进行修饰，可能会中和这些残基上的正电荷，尤其是在灵活性高且易与溶剂接触的区域。尽管由于随机偶联化学作用，赖氨酸修饰的异质性更高，但实际上，与半胱氨酸连接的ADC相比，赖氨酸修饰的ADC能保留更多单克隆抗体（mAb）的天然特性。 抗体与连接子（进而与载荷）的连接方式，是ADC设计的关键环节--因为偶联化学性质会显著影响DAR，DAR即平均每个抗体分子所连接的载荷分子数量。ADC的最佳DAR值在2至4之间：DAR值过低会降低药物疗效；而DAR值过高虽可能提高药效，但也会对抗体的抗原结合结构/功能、稳定性（如导致聚集）产生负面影响，还会加速ADC的清除，并降低整体临床活性与疗效。偶联策略在很大程度上决定了ADC中 DAR的异质性。非特异性偶联方法会产生多种DAR的ADC物种，这是因为抗体上存在大量可反应残基。相反，位点特异性化学技术将连接子与载荷的连接限制在抗体的特定位点，能更有效地获得DAR明确且可重复的均一ADC群体。 尽管DAR代表了平均每个抗体连接的载荷数量，但连接子类型在两个方面都起着关键作用：一是在偶联过程中确保药物与单克隆抗体的结合，二是在肿瘤部位实现载荷的有效释放。当ADC复合物处于循环中时，连接子必须足够稳定，以维持抗体-连接子-载荷这一三元复合物的完整性和无活性状态，防止细胞毒性载荷提前释放，从而减少“旁观者效应”。上述条件通过前文提及的两种连接子（不可裂解型和可裂解型连接子，如SMCC连接子、马来酰亚胺己酰基连接子、肽基连接子、β-葡萄糖醛酸苷连接子、酸敏感型连接子和二硫键连接子）来实现。 酰胺偶联是一种随机偶联技术：抗体表面的可用赖氨酸残基，会与连接子上的羧酸酯发生反应（图4）。抗体表面存在大量赖氨酸残基（约80个），因此，酰胺偶联化学会显著增加ADC物种的异质性（即不同DAR的偶联物群体）。基于赖氨酸的偶联需要后续纯化步骤来获得均一的ADC群体，这可能会成为生产过程中的限速步骤。此外，载荷在不同赖氨酸位点的分布，会给酰胺偶联ADC带来额外的异质性。 图4 偶联类型：随机酰胺偶联、常规半胱氨酸偶联和工程化半胱氨酸偶联（如硫基抗体，ThioMab） Kadcyla采用两步法实现连接子与载荷的连接：首先通过酰胺偶联连接连接子，然后通过马来酰亚胺偶联连接载荷。这种连续反应会产生异质性较高的ADC混合物--每个抗体连接的载荷数量在0至10之间，平均DAR值为3.5。广泛的酰胺偶联方法还可能修饰抗体上对受体介导内吞作用至关重要的赖氨酸残基，从而降低ADC的内化效率。第二代ADC在整体稳定性上有了显著提升，但仍存在疗效低、治疗窗口窄的问题；这在很大程度上是由于ADC群体中DAR的异质性--若DAR控制不佳，会降低ADC的疗效。 位点特异性偶联化学技术的优势在于，DAR值可控且可重复，能产生DAR明确的高度均一ADC群体。位点特异性化学技术利用抗体的天然残基和工程化残基来连接连接子与载荷。与酰胺基偶联相比，半胱氨酸偶联具有明显优势：抗体中的半胱氨酸数量较少（共16个位点，包括4个链间半胱氨酸和12个链内半胱氨酸）。半胱氨酸偶联策略针对抗体表面的天然或工程化半胱氨酸残基，通过半胱氨酸与连接子上的巯基反应性官能团发生反应，可得到DAR值在0至8之间的ADC。 载荷疏水性与稳定性考量 细胞毒性载荷是ADC到达靶部位后成为高效治疗药物的关键因素。目前使用的ADC载荷大多是源自蛋白质或天然产物的小分子，最常见的两类药物为DNA损伤剂（如Calicheamicins，例如CalichDMH，和PBD二聚体，例如SG3199烷化剂）和微管抑制剂（如Maytansinoids，例如DM1、DM4，和Auristatins，例如MMAE、MMAF）。由于到达靶部位的ADC比例很低，因此载荷在到达靶部位前，必须在体内内源性分子存在的情况下保持惰性，同时又要具备高杀伤肿瘤细胞的效力（需>10 个分子/细胞）。下一代ADC正在拓展细胞毒性载荷的种类，纳入拓扑异构酶I/II抑制剂（如喜树碱衍生物和依沙替康提取物，例如DXd和SN-38），且这些ADC的DAR值更高--例如，Sacituzumab Govitecan（商品名Trodelvy）和Fam-Trastuzumab Deruxtecan（商品名Enhertu）的DAR值分别为7.6和8。 理想载荷的标志是：低浓度下具有高活性，IC50处于亚纳摩尔范围。许多早期及目前使用的ADC载荷都具有很强的疏水性，这使得它们容易聚集，并导致ADC不稳定。临床应用中的单克隆抗体大多为疏水性抗体，当这类抗体与疏水性载荷结合时，ADC聚集和不稳定的可能性会显著增加。Buecheler等人采用动态光散射（DLS）和差示荧光法，对多种DAR值相近的ADC进行了分析，结果直接证实：ADC中天然单克隆抗体的稳定性下降，与载荷疏水性的增加相关。然而，疏水性对许多成熟及研发中的细胞毒性药物的抗癌活性至关重要。例如，在新兴的聚合物基化疗药物中添加疏水性残基，可增强阳离子物种的抗癌效果--而这些阳离子物种本身并无抗癌活性。 烯二炔类DNA损伤药物Calicheamicin具有很强的疏水性，被用作Myelotarg和Besponsa的载荷。2021年，研究人员设计并评估了一种工程化半胱氨酸方法，用于生产均一的基于刺孢霉素的ADC--该方法旨在改进Myelotarg和Besponsa所采用的随机偶联策略。在这项研究中，抗CD22抗体和抗Ly6E抗体在轻链的K149C位点直接与刺孢霉素偶联（形成mAb-drug），得到的平均DAR值为1.7。这种无连接子的刺孢霉素偶联方法，不仅比Myelotarg和Besponsa产生的聚集显著减少，还提高了体内稳定性（清除率更低、半衰期更长），在体内表现与未偶联抗体更接近，且在大鼠中的耐受性优于Myelotarg。 ADC构建中所选载荷的固有电荷，也可能影响偶联物的理化稳定性。以奥利斯他汀类载荷为例，该类载荷包含不同电荷的物种：MMAE不带电荷，而MMAF则通过其C端羧基携带负电荷。Johann等人评估了两种ADC（具有相同的抗体温和偶联化学方法（链间半胱氨酸偶联）和相同DAR值）在热应激条件下的电荷异质性、聚集情况，以及疏水性变化。研究结果表明，与中性的MMAE相比，与带负电荷的MMAF偶联会导致ADC的聚集显著增加，同时ADC的净电荷降低，整体电荷异质性也下降。该研究结果提示，在影响ADC稳定性的因素中，还需考虑细胞毒性载荷的电荷差异。目前，下一代ADC构建中已采用新的策略--通过提高连接子的亲水性设计来遮蔽细胞毒性载荷，以克服带电载荷带来的挑战。 位点特异性偶联策略的出现，使得ADC可使用毒性相对较低的载荷。例如，Trodelvy和Enhertu采用的TOP1抑制剂，以及Adcetris、Kadcyla、Tidivac、Blenrep、Padcev和Polivy采用的微管抑制剂，均属于此类载荷。除了拓展下一代ADC的载荷选择范围外，位点特异性偶联化学技术还为构建DAR均一的ADC物种提供了可能--这对于ADC的体内清除至关重要。Sun等人分析了可裂解型和不可裂解型美坦辛偶联ADC的药代动力学，结果显示：平均DAR值低于6的偶联物，其药效更高。然而，平均DAR值为9-10的美坦辛偶联ADC，其清除率增加，且在肝脏中快速蓄积，导致疗效下降。同样，连接子的多样化也拓展了ADC的设计--例如，亲水性聚乙二醇（PEG）基连接子的研发，为遮蔽细胞毒性药物的疏水性提供了途径，同时还能延长半衰期（t1/2）、降低细胞毒性，并减少偶联过程中的聚集现象。对PEG连接子的优化（例如，增加PEG化连接子的数量，最多可达24个，并结合自降解葡萄糖醛酸苷连接子），可减缓药物清除速度，为MMAE偶联ADC提供更宽的治疗窗口。 位点特异性半胱氨酸化学技术是药物Adcetris以及许多处于临床试验阶段的ADC的主要偶联选择。目前，已获批的13种ADC中，有超过8种采用了位点特异性半胱氨酸化学技术。2008年，研究人员首次报道了用于抗体选择性连接的半胱氨酸工程化技术，该技术在不同物种中均能提高ADC的疗效和治疗窗口。这项研究中开发的化学技术（现称为 THIOMAB，由Genentech授权），采用定点突变将抗体的内源性残基替换为未配对的半胱氨酸；这些半胱氨酸可被还原，随后通过二硫键与连接子和载荷连接（图4）。由PolyTherics研究小组（现归属于Abenza公司）开发的ThioBridge技术，通过还原链间半胱氨酸，与连接子 - 载荷形成稳定的共价键，最终得到DAR值为4的特异性ADC物种。类似地，可通过在抗体中引入非天然氨基酸，实现ADC的位点特异性偶联。例如，经优化的非天然氨基酸对叠氮甲基-L-苯丙氨酸（pAMF），被位点特异性地引入HER2抗原中，从而提高了药物的活性和疗效。 ADC位点特异性偶联的另一种方法，是对抗体中天然存在的聚糖残基进行工程化改造或重塑：先在抗原的N-聚糖上添加反应性基团，然后让该基团与连接子-载荷上对应的反应性基团发生偶联。短肽标签也被用于ADC偶联的位点特异性策略中。最近，ADC偶联化学技术的进步使得双载荷ADC的研发成为可能--通过增加每个抗原所携带的载荷种类，解决了因肿瘤细胞异质性和药物耐药性导致的癌细胞对化疗药物敏感性差异的问题。 药物递送与稳定性 除了利用Fc段的位点特异性游离巯基进行药物递送外，另一种抗体药物递送方法是采用脂质基纳米颗粒（LNPs）--通过马来酰亚胺活化的氨基将抗体与LNPs偶联。为实现抗体与LNPs的连接，LNPs-ADC载体需通过已知化学反应（需1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和N- 羟基琥珀酰亚胺（NHS）参与），使载体表面的羧基与抗体的伯氨基偶联，从而实现偶联复合物的有效递送。目前，这些递送方法仍在进行临床评估，尚未应用于新获批的ADC中。将聚乙二醇（PEG）聚合物与单克隆抗体结合，可遮蔽抗体表面的表位，避免引发免疫反应。这种PEG化修饰能提高抗体的水溶性、延长半衰期（t1/2），并降低免疫原性。然而，单克隆抗体的PEG化也存在缺点，包括PEG在器官中的蓄积、诱发或加重已存在的抗PEG抗体反应，以及改变或降低抗体的生物活性。为克服这些潜在障碍，研究人员开发了PEG化的替代技术，其中包括PAS化技术。PAS化技术采用由脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和丝氨酸（Ser）组成的小分子生物合成残基多肽链（PAS链）。PAS链是不带电荷的生物聚合物，其生物物理特性与PEG相似，且无免疫原性，不会影响药物成分的药理活性。PAS多肽具有延长药代动力学的优势，包括在血浆中稳定性高、肾脏滤过减少，且在细胞摄取后能被快速代谢降解。 迄今为止，几乎所有已获批的ADC均以冻干形式制备和研发--这种形式可最大限度地减少连接子在储存和运输过程中的降解和不稳定（在送达患者手中之前）。所有获批的ADC均以注射用水溶液形式给药，该溶液中含有药用惰性辅料和成分，以方便静脉给药（表3）。由于ADC具有独特的“抗体-连接子-载荷”结构，其稳定制剂的研发面临诸多挑战，常规的单克隆抗体制剂平台可能并不适用。ADC的聚集风险始终存在：尽管靶向性单克隆抗体部分允许较低的治疗浓度，但连接子-载荷部分可能会增加ADC复合物的疏水性--这虽然会降低聚集形成的风险（原文此处表述可能存在笔误，结合上下文推测应为 “增加聚集形成的风险”），但仍带来了需要克服的挑战，同时其优势也需得到重视。总体而言，成功研发ADC需要明确的基础生物学理论，以及对所涉及的（生物）化学机制的理解。与单独的单克隆抗体相比，ADC的分析复杂性显著增加。因此，解决ADC的生产和监管问题，需要同时考虑生物治疗药物和小分子生物药剂的视角。在此背景下，ADC设计和研发中对药物产品生物物理和化学稳定性的关注也同样至关重要。ADC设计的基础原理、ADC结构各组成部分的要求，必须同时纳入考量。ADC的结构对其理化稳定性有显著影响，因此，制剂研发和分析过程中面临的挑战是相互关联的。从质量角度来看，与ADC相关的质量考量及关键监管问题正变得越来越重要。 药物撤市、研发失败与待审批情况 自2014年以来，已有多种ADC获得美国FDA的有条件批准或完全批准，用于治疗实体瘤和循环系统肿瘤（表1）。然而，也有部分ADC面临美国市场撤市的情况，这凸显了ADC研发的复杂性。一个典型例子是Mylotarg：尽管该药物于2000年获FDA批准，用于治疗复发的CD33阳性急性髓系白血病（AML）老年患者，但由于安全性和疗效问题，于2010年自愿撤市。在上市后监测期间，一项验证性研究表明，当前给药方案（4周为一个周期，第1天和第15天给药，剂量为9 mg/m²）未显示出临床获益；此外，该药物还新增了致命性肝毒性和静脉闭塞性疾病的黑框警告。为解决上述问题，研究人员调整了给药方案（4周为一个周期，第1天、第4天和第7天给药，剂量为3 mg/m²）；此后，Mylotarg 于2017年获FDA重新批准，用于治疗2岁及以上复发或难治性（R/R）CD33阳性AML患者，并于2020年进一步获批用于治疗新诊断的CD33阳性AML患者（包括1个月及以上的儿科患者）。2022年，由于一项必需的验证性研究未达到无进展生存期（PFS）的主要终点，FDA要求将Blenrep撤市；2023年初，FDA正式撤销了该药物的美国生产许可。此外，Lumoxiti于2018年获FDA批准，但AstraZeneca公司于2023年因临床使用率低，自愿将其从美国市场撤市。Lumoxiti的案例表明，除了常见的疗效和毒性问题外，外部因素也可能影响ADC的市场地位。 表3 FDA批准的ADC制剂与给药考量 已有超过200种ADC进入临床试验阶段，但其中许多都以失败告终。2017年6月，Seattle Genetics终止了vadastuximab talirine（SGN-CD33A）用于治疗新诊断老年AML患者的III期临床试验--研究发现，SGN-CD33A联合低甲基化药物治疗的死亡率，高于单独使用低甲基化药物治疗的死亡率。此前在2016年，由于4名患者死亡，该药物的I期临床试验已被暂停。2018年7月，Mersana Therapeutics研发的ADC药物XMT-1522（用于治疗HER2表达阳性肿瘤）的I期临床试验，因一名患者死亡而被部分暂停；2018年9月，在调整试验方案（如加强监测、排除晚期肝功能损害患者）后，该暂停令被解除。2018年12月，AbbVie终止了rovalpituzumab tesirine（Rova-T）用于治疗晚期小细胞肺癌（SCLC）的研发--其III期临床试验未显示出生存获益。 截至2024年，在全球范围内已获上市批准的15种ADC中，有2种尚未获得FDA批准。其中，Aidixi于2021年获中国NMPA批准，用于治疗至少接受过两种系统化疗的HER2过表达局部晚期或转移性胃癌（包括胃食管结合部腺癌）患者；值得注意的是，Aidixi于2020年获FDA突破性疗法认定，用于治疗接受过铂类化疗的HER2阳性局部晚期或转移性尿路上皮癌患者。另一种ADC药物Akalux于2020年获日本PMDA批准，用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈部癌症。 数种处于研究阶段的ADC即将获得肺癌治疗的监管批准，这凸显了该治疗领域的重大进展。其中值得关注的包括：AstraZeneca与Daiichi Sankyo联合研发的datopotamab deruxtecan（Dato-DXd）、Daiichi Sankyo与Merck联合研发的patritumab deruxtecan（HER3-DXd），以及AbbVie研发的telisotuzumab vedotin（ABBV-399）。HER3-DXd于2021年获突破性疗法认定，并于2023年获优先审评资格，用于治疗接受过两种或两种以上系统治疗的局部晚期或转移性EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）成年患者。ABBV-399于2022年获突破性疗法认定，用于治疗在铂类药物治疗后疾病进展的c-Met过表达晚期或转移性NSCLC患者。此外，部分已获FDA批准的ADC正在探索新的适应症。例如，Trodelvy目前正处于治疗NSCLC、结直肠癌和子宫内膜癌的III期临床试验阶段，同时还在进行治疗其他多种疾病的II期临床试验；Enhertu则处于治疗胆道系统癌症的III期临床试验阶段。生物类似药在扩大ADC可及性方面发挥着关键作用--它们能提供具有成本效益的替代方案，同时不影响安全性和疗效。目前，针对曲妥珠单抗（Trastuzumab，商品名Herceptin，用于制备Kadcyla的单克隆抗体），已有5种FDA批准的生物类似药：Ogivri、Herzuma、Ontruzant、Kanjinti和Trazimera。由Zydus Cadila公司研发的Kadcyla 生物类似药Ujvira™，于2021年获印度DCGI批准。 结论 ADC为许多治疗选择有限的适应症，彻底改变了传统癌症治疗方式。它们能将细胞毒性载荷靶向递送至肿瘤部位，与癌细胞表面的特定蛋白质结合。这种方法为下一代ADC设计提供了方向--未来可靶向新的表面受体蛋白，将治疗领域拓展至癌症以外的疾病（例如，针对自身免疫性疾病相关的表面受体）。目前美国市场上近70%的ADC，是通过突破性疗法认定和优先审评程序获得FDA批准的（表1）；且根据早期临床证据，许多ADC技术已显示出提供更优或显著改进治疗方案的巨大潜力。ADC治疗具有诸多优势，其中之一是所需浓度较低（≤20 mg/mL；见表3），而传统抗体制剂的浓度可高达50 mg/mL--这主要得益于ADC中药物成分的靶向递送。目前已上市的ADC均通过静脉注射给药，且以冻干形式存在，以提高稳定性（即防止连接子降解和随之而来的游离药物释放）；未来，若能在提高给药浓度的同时改善ADC的疏水性和溶解度，或许能实现ADC的皮下注射给药。 然而，ADC设计中仍有许多方面有待优化，例如，许多细胞毒性载荷具有疏水性，这给下一代ADC复合物的制剂研发带来了额外挑战。此外，作为输注类治疗药物，使用0.9%氯化钠溶液或5%葡萄糖溶液稀释ADC，可能会导致静电电荷遮蔽，进而增强蛋白质间的相互作用--这会增加ADC的聚集风险，尤其是对于DAR值较高的ADC。