Enfortumab Vedotin-ejfv

-01- 引言 ADC是模块化生物制剂，由三个主要组成部分构成，每个部分为最终治疗药物贡献不同的功能特性。单克隆抗体（通常是人源化或全人IgG1或IgG4）定义靶标选择性并提供药代动力学（PK）框架。载荷是一种小分子药物，通常从充分表征的化学型类别中选择，如微管破坏剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA烷化剂，经工程改造后在保持适合偶联的物理和化学性质的同时对肿瘤细胞表现出亚纳摩尔效力。最后是连接子，构成连接抗体和载荷的化学键。 连接子的组成和反应性直接影响载荷释放的位置和方式，结构特征决定血浆稳定性和对特定裂解机制的敏感性。连接子通常较短，范围从简单脂肪链到具有酶不稳定基序、亲水间隔基和自消除触发元件的复杂合成支架。关键的是，连接子需要与抗体上的化学官能团兼容，但不应显著损害抗体结合或生物物理性质。它们还必须耐受制造过程和系统循环足够长时间以允许有效肿瘤摄取，而不在血流中过早释放载荷。 连接子的结构影响ADC处置和功能的几乎所有阶段。它影响抗体和载荷之间的空间关系，改变肿瘤穿透和细胞内运输。例如，早期DM1-ADC掺入环己基SMCC连接子，所得连接子-载荷构建体的疏水性质导致聚集增加和细胞内运输受损，导致肝清除加速。相比之下，SPP或sulfoSMCC等更灵活的连接子改善了溶解性和内化效率。连接子支架的生物物理性质——疏水性、长度和刚性——促成偶联物的整体生物物理概况，影响清除动力学、组织分布和形成高分子量聚集体的倾向。MMAE-ADC中使用的疏水性连接子增加了聚集和肝脏摄取，促使PEG化连接子的开发。它决定不同细胞区室中载荷释放的途径和动力学，并可改变抗体表位的呈现、Fc结构域相互作用和脱靶药理学。因此，连接子工程是促进ADC可开发性和治疗指数的巨大机会，独立于靶标选择和载荷优化。 -02- 一、药物抗体比、偶联策略与异质性 DAR是ADC组成的定量描述符，定义为共价连接到每个抗体分子的药物分子的平均数量。靶向多个赖氨酸残基或链间二硫键半胱氨酸的传统偶联方法通常产生异质混合物，包含DAR值从0（未偶联抗体）到8或更高（重载分子）的物种，每个亚群呈现不同的稳定性、清除和效力。 例如Trastuzumab-DM1，其赖氨酸基偶联产生宽DAR 0–8分布，每个亚群表现出不同的稳定性、清除和效力。虽然高DAR物种可以递送更多载荷，但它们通常表现出增加的疏水性、更大的聚集倾向、更快的血浆清除和更高的脱靶摄取。相反，低DAR物种常表现出优异的血浆稳定性和延长的半衰期，但可能没有足够载荷杀死所有接触的肿瘤细胞。这种DAR在群体内的异质分布可导致“混合群体”，其平均行为可能不能准确反映任何单一物种的性质，并使结果解释复杂化。 连接子化学和偶联策略密不可分，因为偶联位点的数量和位置，结合连接子本身的物理化学性质，确定潜在的DAR分布和ADC的整体生物物理特征。在Brentuximab vedotin的情况下，疏水性MMAE载荷与连接子组合将可制造的DAR限制在约4，因为更高DAR物种聚集并快速清除。相反，亲水性连接子可以支持更高的DAR值：Trastuzumab-deruxtecan由于其高度亲水的四肽基连接子实现DAR 8，该连接子抵消了载荷的疏水性并防止聚集。使用多糖或PEG基连接子的临床前研究进一步证明，亲水性支架可以在不损害溶解性或稳定性的情况下维持6–10的DAR值。 位点特异性偶联方法，如工程半胱氨酸（THIOMABs）、聚糖重塑、酶标签或生物正交点击手柄，实现了具有确定DAR值（通常为2或4）和固定偶联位点的ADC生产，产生具有改善PK可预测性的更均质产品。在这些策略中，连接子设计需要调校以抵消多种载荷引入的疏水负担，因为疏水性连接子可通过促进聚集和快速清除损害位点特异性连接的益处，而亲水性连接子可以在不损害溶解性或稳定性的情况下实现更高DAR的位点特异性ADC。新兴计算方法进一步强调DAR、疏水性和连接子结构是紧密耦合的设计维度，可以一起优化。 -03- 二、连接子的分类与机制 从机制角度来看，连接子通常分为两大类：不可裂解和可裂解，对载荷活化的位置和方式具有不同影响。 不可裂解连接子设计为在整个系统循环和细胞外处理过程中保持完整，载荷释放仅在内部化ADC在溶酶体区室中经历抗体支架的完全蛋白水解降解后发生。载荷释放发生在抗体支架的溶酶体蛋白水解后，产生带电荷的药物-氨基酸分解代谢物，这可能损害膜通透性并限制旁观者效应，以及活性药物从靶细胞向邻近肿瘤细胞的扩散。这种设计提供血浆稳定性和化学稳健性，并依赖溶酶体降解作为天然、选择性激活机制。 相比之下，可裂解连接子被工程改造为在细胞内或肿瘤微环境（TME）的特定化学或酶促条件下经历特异性断裂，如蛋白水解活性、低pH或氧化还原变化，释放更疏水、可膜通透的药物，能够有效扩散并杀死邻近细胞。亚型包括： pH敏感连接子，如腙或酰腙，在中性pH下稳定，但在内体和溶酶体的酸性环境中有效水解，释放游离药物用于通过溶酶体膜扩散。这类连接子在早期ADC中很突出，但由于在轻度酸性组织中过早释放的问题以及不同pH范围内不可预测的稳定性，现在较少使用。 氧化还原响应连接子通常掺入二硫键，在细胞质中通过谷胱甘肽或蛋白二硫键异构酶还原，但在氧化的细胞外和血浆环境中保持完整。尽管在一些临床mAb中使用，但关于正常组织中谷胱甘肽（GSH）水平导致的非选择性还原的担忧已减少其突出地位。 酶可裂解连接子，通常是肽基基序，如Val-Cit或GGFG，被溶酶体组织蛋白酶（组织蛋白酶B、L和S）在ADC内化后识别和水解。这些连接子利用肿瘤细胞溶酶体区室中半胱氨酸蛋白酶的高活性，同时在血浆和正常组织中保持相对稳定。酶响应性连接子的其他替代方案包括具有糖苷基序的连接子（被β-半乳糖苷酶裂解）或围绕肿瘤微环境中活跃的基质金属蛋白酶（MMP）敏感序列设计的连接子，提供替代或互补的酶触发机制。 在可裂解设计中，酶可裂解肽连接子已成为药物研发的主要焦点，因为它们提供了高血浆稳定性、高效细胞内裂解以及通过底物设计和蛋白酶谱分析进一步优化增强肿瘤选择性的潜力的有吸引力组合。机制和结构数据表明，氨基酸身份和连接子长度可以调节组织蛋白酶特异性和裂解动力学，为合理设计具有改善肿瘤相关蛋白酶选择性和减少脱靶激活的第二代和第三代肽连接子提供路线图。因此，连接子选择不是局部化学细节，而是中心设计决策，必须与抗体架构、抗原生物学、内化动力学、载荷性质和偶联方法一起优化，以实现临床意义上疗效和安全性的改善。 -04- 三、肿瘤相关酶作为连接子裂解的触发机制 与正常组织相比，许多实体瘤和血液肿瘤表现出蛋白水解和溶酶体机制的重塑，多个酶家族持续过表达或过度激活。这些酶集中在增大的溶酶体、侵袭足和TME中，在肿瘤中它们促成ECM降解、生长因子激活、侵袭、转移、血管生成和治疗抵抗。关键的是，这导致肿瘤中比健康组织更高且空间聚焦的酶活性，创造与系统循环截然不同的生化生态位。这种失调活性也可被利用为生化触发器，使肿瘤相关酶成为ADC连接子选择性过滤器的极具吸引力的选择。 溶酶体蛋白酶 溶酶体是蛋白质周转和信号传导的中心枢纽，许多实体瘤和血液肿瘤表现出增加的溶酶体生物发生和蛋白酶含量。溶酶体蛋白酶存在于肿瘤细胞溶酶体中，有时存在于细胞周空间，其活性在高转移性肿瘤变体中显著升高，如B16F10黑色素瘤模型或侵袭性乳腺癌模型，相比低侵袭性者。最近，这一观察扩展到多种癌症类型，其中上调的溶酶体蛋白酶促进ECM降解、生长因子激活和细胞死亡途径调节。 由于内部化ADC通过内体运输至溶酶体，这种区室化的蛋白水解活性富集已被直接利用于溶酶体可裂解肽连接子。具有被溶酶体蛋白酶识别基序的连接子被设计为在血浆和细胞外液中保持完整，但在酸性、酶丰富的溶酶体腔中有效水解，触发自消除和载荷释放。肿瘤中升高的溶酶体蛋白酶活性相比正常组织促进了连接子设计的功能选择性窗口。 组织蛋白酶 组织蛋白酶是溶酶体蛋白酶亚家族，包括半胱氨酸组织蛋白酶、天冬氨酸组织蛋白酶和丝氨酸组织蛋白酶，是蛋白质周转和抗原处理的核心。其中，组织蛋白酶B在肿瘤学中受到特别关注，因为其表达和活性在多种肿瘤中升高，包括乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌和黑色素瘤。 这些酶与侵袭和转移表型相关，促成ECM重塑、上皮-间质转化（EMT）以及凋亡和自噬途径的调节。这些酶的表达和活性在肿瘤内表现出“斑片状”表达和活性，具有可能驱动局部侵袭和转移的局部热点。 从药物递送的角度来看，组织蛋白酶是利用组织蛋白酶可裂解ADC连接子的主要酶触发器。肽基序，如Val-Cit和GGFG，已被证明可被溶酶体组织蛋白酶有效裂解，许多获批ADC，如Brentuximab vedotin、Polatuzumab vedotin、Enfortumab vedotin和Trastuzumab-deruxtecan，依赖这些反应在内化后释放其载荷。药物化学设计，辅以蛋白酶底物谱分析，证明P1-P4残基的仔细选择可以将裂解偏向特定组织蛋白酶，并跨物种调节稳定性与激活。 然而，组织蛋白酶并非肿瘤专属。它们在正常溶酶体中活跃，并可在炎症条件下分泌到细胞外空间。因此，肿瘤选择性来自活性水平、定位和运输的差异，而非表达本身。 TME中的MMPs MMP是锌依赖性内肽酶，在ECM重塑、血管生成和免疫细胞运输中发挥重要作用。MMP-2、MMP-9和MMP-14的表达在肿瘤细胞、基质成纤维细胞和浸润免疫细胞中经常上调，特别是在乳腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌和黑色素瘤中。其蛋白水解活性使癌细胞能够突破基底膜、降解间质胶原、脱落粘附分子并释放ECM结合的生长因子和细胞因子，从而促进侵袭和转移扩散。 MMP活性通常集中在肿瘤侵袭前沿和血管周围生态位，局部ECM降解与增加的转移潜力相关。这种空间和肿瘤偏向的活性过表达激发了广泛探索MMP可裂解肽作为前药和纳米载体触发器的努力，TME中的裂解在肿瘤细胞附近去掩蔽或释放活性药物。 MMP敏感基序已成功部署在肽-药物偶联物和聚合物药物递送系统（DDSs）中，强调富含MMP的微环境可用于肿瘤局部药物激活。然而，由于一些MMP在炎症和重塑过程中也上调，需要对肿瘤与正常组织中的MMP表达和活性进行仔细谱分析，以避免脱靶激活。 糖苷酶 糖苷酶是参与糖胺聚糖和糖蛋白降解的溶酶体外切糖苷酶。在几种类型的肿瘤中，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结直肠癌，β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶在肿瘤组织和相关细胞外液中发现水平升高，特别是在坏死区域，其中溶酶体内容物因细胞死亡而释放。 这种生物学已被利用于糖苷酶响应前药，其中活性药物被糖部分掩蔽，直到肿瘤环境中酶促裂解。例如，多柔比星和喜树碱的β-葡萄糖醛酸苷前药在高β-葡萄糖醛酸酶活性异种移植模型中显示增强的肿瘤选择性，激活优先发生在坏死肿瘤核心。这一原理已扩展到生物偶联物和ADC样构建体，其中糖苷酶可裂解连接子在酶促去除糖和随后间隔基自消除后仅释放载荷。 糖苷酶触发释放对靶向坏死丰富肿瘤特别有吸引力，其中细胞外酶水平最高。然而，糖苷酶并非肿瘤专属。它们在炎症病变、组织重塑部位和某些具有高溶酶体周转的正常器官中可能升高。其活性在肿瘤内高度异质，强烈依赖于坏死和缺氧程度。因此，肿瘤选择性来自局部酶活性和微环境背景，而非表达本身。 -05- 四、酶可裂解连接子的设计原则 酶可裂解连接子的设计原则围绕实现循环中的稳定性与肿瘤或溶酶体区室中高效选择性裂解之间的高差异，同时保持有利的物理化学性质和稳健的治疗指数。酶响应性通常包含三个模块化元素：识别基序——通常是肽或糖苷单元——被肿瘤相关酶选择性裂解；自消除间隔基——最常见的是对氨基苄基氨基甲酸酯（PABC）——将裂解事件传递给游离药物释放；以及调节疏水性、位阻和整体稳定性的侧翼结构特征。其中，自消除间隔基代表这些连接子的主要临床策略，其优化在过去十年中一直是广泛构效关系（SAR）工作的焦点。 肽连接子优化 Val-Cit型二肽连接子，通常与PABC间隔基偶联，是最常见的酶可裂解基序，使用在几种获批ADC中，包括Brentuximab vedotin、Polatuzumab vedotin和Enfortumab vedotin。在这些构建体中，组织蛋白酶B和其他溶酶体半胱氨酸蛋白酶裂解瓜氨酸残基（P1）和PABC单元（P1'）之间的酰胺键，启动间隔基的自消除和附载荷的释放。早期研究表明，这些构建体在血浆稳定性和溶酶体可裂解性之间达到较好平衡，但它们也可能显示出对物种特异性酶的敏感性，使临床前评估困难。 为解决这些限制，连接子设计已超越简单二肽扩展到三肽和四肽基序，以及具有改变侧链的修饰二肽，以微调组织蛋白酶特异性和稳定性。系统SAR研究已显示，修饰P1-P4位置的氨基酸身份可以显著改变溶酶体蛋白酶裂解的速率和特异性。例如，用更大或构象约束的残基替换P2位置的缬氨酸，或在P3/P4引入β-分支氨基酸，可以调节肽对组织蛋白酶S与组织蛋白酶B的适配性，同时减少对脱靶蛋白酶和酯酶的识别。一个突出的实例是Trastuzumab-deruxtecan中使用的GGFG四肽连接子，其特征在于高血浆稳定性和溶酶体组织蛋白酶的高效裂解，实现DAR 8而不损害PK。 这些变异也用于通过将连接子基序与特定肿瘤中富集的蛋白酶底物偏好相匹配，来工程化更大的肿瘤与正常组织选择性。底物谱分析和位置扫描文库已识别出优先被肿瘤相关组织蛋白酶和溶酶体蛋白酶裂解的肽序列，允许设计在肿瘤环境中比正常细胞中处理更快的连接子。 关键的是，肽连接子需要与载荷和整体ADC架构一起优化和调整：重疏水载荷需要更亲水或更长的连接子以避免聚集，而较少亲脂的药物可以耐受更短的连接子而不损害整体架构。 自消除间隔基与载荷释放 自消除间隔基代表许多酶可裂解ADC连接子的关键特征，因为它们将初始酶裂解与最终活性载荷释放解耦，实现不同识别基序与多种药物的模块化组合。有几种类型的间隔基，从对氨基苄基（PAB）支架的变体到基于环化的间隔基甚至肽和杂环间隔基，但在获批ADC中最常见和最广泛使用的是PABC。 在正常条件下，蛋白酶识别并裂解间隔基上游的肽键，产生苯胺或相关中间体，经过重排以原生形式释放载荷，这对保持效力和可预测药理学至关重要。这一两步过程允许相同的肽触发器和间隔基架构与多种载荷模块化组合，只要后者可以通过自消除连接附着。 自消除间隔基的电子和取代模式强烈影响药物释放速率并减少不良副反应，如过早水解或制造和循环期间的载荷修饰。已经探索使用更复杂的自消除系统以在严格定义的生化条件下实现载荷的条件释放。 最后，为确保可预测的临床行为，设计必须同时考虑酶促步骤和随后间隔基在生理条件下的自发碎片化。 物理化学影响 载荷疏水性、连接子组成和整体ADC架构之间的相互作用是决定聚集、清除和脱靶效应的关键决定因素。几种临床使用的载荷，如auristatins和maytansinoids，是高度亲脂的，通过短或疏水性连接子直接附着可显著增加抗体的疏水表面积，导致聚集、非特异性结合、快速肝清除和正常组织中更高的摄取。 连接子设计提供了尝试缓解这些负担的强大工具；然而，它们不能消除聚集、快速清除或肝摄取的风险，因为每个ADC架构必须单独看待。将亲水元素（如短PEG链、带电氨基酸或极性间隔基）掺入肽连接子可以减少聚集，实现更高的DAR值并改善暴露，而不损害酶可及性或裂解。例如，在Val-Cit-PABC基序中引入PEG7间隔基或带电残基已被证明可以增加溶解性并支持6–8的DAR，同时仍保持可接受的PK和效力。相反，截短连接子或引入更多疏水残基通常导致聚集增加和清除更快，导致连接子长度、组成和可开发性之间的精细平衡。 亲水性不仅对可制造性和PK至关重要，而且对维持配体结合和靶标参与也至关重要。过度疏水的连接子和高DAR可刺激非靶组织中的抗体-抗原相互作用或肝脏和脾脏中的Fc介导摄取，增加脱靶毒性，而亲水性连接子可以帮助保留未偶联抗体的天然分布。 位阻屏蔽与非天然氨基酸 除序列优化外，切割键周围的位阻和构象屏蔽提供了增强肿瘤选择性和抑制通过非预期蛋白酶或血清酶脱靶裂解的额外杠杆。策略包括在切割位点附近的非关键位置引入大体积侧链、D-氨基酸或非规范残基，以及使用维持与特定肿瘤相关蛋白酶识别但被血浆或正常组织中更广泛特异性蛋白酶耐受不良的非规范残基。这些策略可以限制广谱蛋白酶的可及性，同时保留目标溶酶体组织蛋白酶或肿瘤相关蛋白酶的有效处理。 P1'位置的取代（切割位点后的残基）或侧翼位置的取代可减少血清蛋白酶的脱靶裂解，而不显著损害组织蛋白酶B或legumain活性。在P1'掺入位阻需求残基如环己基丙氨酸（Cha）或正亮氨酸（Nle）可减少血清蛋白酶的脱靶裂解，而不显著损害组织蛋白酶B或legumain的处理。类似地，在酶识别不太关键的位置掺入D-氨基酸也已用于减少脱靶蛋白酶的裂解并延长血浆稳定性。 最近的肽连接子设计已开始使用非规范氨基酸和肽模拟物来修饰切割位点周围的局部环境，使仅预期肿瘤相关蛋白酶可以有效结合和处理连接子。这些方法利用蛋白酶亚型之间S1-S4口袋拓扑的小差异，使用侧链大小、极性和构象约束来增强选择性。这种设计通常产生具有显著改善的人血浆稳定性、减少的种间变异性和保留的溶酶体处理的连接子，支持其作为下一代临床连接子的潜力。 多触发连接子 新兴设计超越了单酶触发系统，掺入多刺激或“基于逻辑”的架构，将酶识别与其他TME线索（如pH、氧化还原状态或活性氧）整合。在这些系统中，药物释放可能需要顺序或并发激活步骤，如初始酶裂解和次级触发（如酸性pH、还原条件或活性氧），有效实现和/或逻辑以进一步减少正常组织中载荷释放的概率。 尽管大多数这些多触发系统已在聚合物或纳米颗粒药物递送系统（而非经典ADC）的背景下开发，但其基本原理直接可转移到连接子设计。例如，ADC连接子可以被工程化为首先被组织蛋白酶B裂解，暴露第二段掩蔽肽段，然后通过不同的溶酶体酶处理，或具有蛋白酶裂解生成仅在酸性pH下碎片化的自消除间隔基，从而确保载荷仅在溶酶体区室中完全释放。同样，双触发连接子可能需要蛋白酶活性和高谷胱甘肽浓度来完成自消除，减少在细胞外或弱还原环境中载荷释放的概率。 设计这些基于逻辑的系统需要仔细考虑触发层级、动力学、空间定位、关于肿瘤蛋白酶和糖苷酶谱分析的知识、pH作图和氧化还原状态表征，以及利用位点特异性偶联和计算引导的连接子设计。随着这些工具的发展，多触发酶响应连接子获得提供超出抗原表达和单酶激活的特异性额外层的潜力，允许下一代ADC中更精确和稳健的肿瘤选择性载荷释放。 计算工程 计算工程正在成为生成肿瘤选择性连接子的重要工具，补充实验谱分析方法。计算工程方法通常基于机器学习和优化技术。来自N端组学、PICS型特异性测定和生化裂解研究的数据提供了已知蛋白酶底物集，可用于训练机器学习模型，预测特定蛋白酶中候选P1-P4序列的裂解概率。 最近关于人工智能（AI）辅助设计的工作证明，这些模型可以提出具有改善预测稳定性和酶选择性的新肽基序和完整连接子支架，包括疏水性和长度约束。结合来自大规模分子数据集的迁移学习和强化学习，可迭代细化分子连接子性质。并行地，分子对接和分子动力学模拟有助于合理化候选物如何适应肿瘤相关蛋白酶的袋状结构，指导聚焦修饰以增强对靶酶的结合，同时丢弃脱靶酶。 -06- 五、肿瘤特异性策略 酶可裂解连接子的肿瘤特异性不仅取决于选择正确的底物，还要求将连接子序列和架构与给定肿瘤类型的特定蛋白酶活性景观和裂解精确类型匹配。实现这种特异性有三个关键方式：（i）深度蛋白酶谱分析，以定义基于肿瘤的底物偏好；（ii）使用三肽和四肽代替简单二肽，以更好地利用这些偏好；（iii）控制裂解模式（外切或内切）。 深度谱分析（TAILS及相关方法） 深度谱分析策略旨在从猜测转向特定组织和条件下蛋白酶特异性和活性的定量图谱，随后用于设计肿瘤偏向连接子序列。 N端组学方法，如TAILS，可以捕获和富集复杂样品中新形成的N端，允许质谱（MS）鉴定其天然背景中的内源蛋白酶裂解位点。这些策略已应用于多种系统，包括人组织和细胞模型，以在生理或疾病条件下谱分析MMP和其他蛋白酶的底物和裂解基序。在癌症和炎症性疾病中，TAILS揭示了疾病与健康组织不同的N端和底物特征，证明疾病相关蛋白酶可以重塑蛋白水解模式，其方式可用于挖掘选择性底物。 这些策略补充了PICS和相关全局特异性测定，后者使用蛋白质组衍生的肽库来定义蛋白酶活性位点的P4-P4'偏好。将PICS型特异性数据与TAILS衍生的组织内裂解位点结合，可以识别既被特定蛋白酶内在偏好又在疾病背景下被证明裂解的基序。就ADC连接子设计而言，这产生应在肿瘤溶酶体或TME中有效裂解但在正常组织中较少裂解的候选P1-P4序列，增加肿瘤偏向激活的可能性。  三肽/四肽与二肽对比 大多数具有酶可裂解连接子的获批ADC仍依赖短二肽基序，如Val-Cit与PABC间隔基偶联，被溶酶体组织蛋白酶识别。这些连接子提供良好的基线性能；然而，它们对多种组织蛋白酶以及有时对非靶酶呈现相对广泛的敏感性，这可降低稳定性并使转化困难。 最近，研究人员开始关注提供更大肿瘤特异性设计空间的三肽和四肽。延长肽序列允许参与蛋白酶的完整S1-S4亚位点架构，并掺入特定残基以利用蛋白酶亚型之间或肿瘤与正常组织之间口袋拓扑的细微差异。一些ADC已开始使用这些类型的连接子，如Trastuzumab deruxtecan，使用四肽GGFG，并促成ADC在实体瘤中的强旁观者效应。其他类型的四肽基序，如EVCit或EEVCit，相对于经典Val-Cit二肽呈现增强的稳定性和调校的特异性。 三肽和四肽连接子还允许掺入通过底物谱分析识别的肿瘤偏向基序。例如，通过TAILS或MSP-MS在实体瘤中富集的序列可以放置在P3-P4，同时维持组织蛋白酶偏好的P1残基，以创建在肿瘤溶酶体中比正常细胞中裂解更快的连接子。拥有超越简单二肽的连接子对于利用组织蛋白酶B对其他组织蛋白酶和脱靶蛋白酶的完全区分潜力至关重要。 另一个重要方面是物种选择性，一些工程化三肽/四肽，通常包含酸性残基或非规范侧链，对啮齿动物酯酶敏感性较低，同时仍保留人组织蛋白酶B或L裂解，改善临床前模型的预测价值。将延伸四肽重新定位到更多溶剂暴露位置的外切连接子平台通过减少与脱靶酶的不期望相互作用进一步增强这种效应。总的来说，从二肽转向三肽/四肽使酶选择性、血浆稳定性和肿瘤与正常裂解谱的控制比最小二肽基序更细致。 外切与内切裂解 最近，连接子工程的进展已将ADC设计的焦点从连接子稳定性本身扩展到蛋白酶介导裂解的精确拓扑结构。经典的内切可裂解连接子被蛋白酶处理，这些蛋白酶裂解P1和P1'之间的内部键，而新的“外切可裂解”连接子将切割键和肽段相对于自消除间隔基重新定位。 在经典Val-Cit-PABC连接子中，组织蛋白酶裂解Cit和PABC之间的肽键，形成自消除以释放载荷的苯胺中间体。这种设计工作正常，但可能遭受一些负担：切割位点相对可被多种组织蛋白酶接近，切割位点周围的局部环境受到保持酶识别和有效自消除需求的约束。 相比之下，外切可裂解连接子呈现替代结构，其中可裂解肽被重新定位在相对于PABC基序的“外切”位置。这种结构旨在更好地将肽暴露于溶酶体组织蛋白酶，同时屏蔽血浆酶并减少自消除步骤上的位阻约束。这些类型的连接子已被报道具有增加的血浆稳定性和减少的中性粒细胞弹性蛋白酶介导裂解，同时仍保留有效的细胞内处理和载荷释放。这些连接子似乎还维持或甚至改善抗肿瘤效力，减少脱靶激活，并通过缓解局部疏水聚类支持更高DAR与疏水性载荷。 “外切”和“内切”裂解之间的区别不仅是几何的，而且具有特异性含义。通过将裂解基序远离紧密堆积的PABC-载荷连接处重新定位并改变其呈现，外切连接子可以改变哪些蛋白酶可以物理接近并有效处理肽。这为肿瘤特异性创造了另一个可调参数：外切定位的四肽可以被优化为肿瘤细胞中特定酶的理想底物，但却是细胞外蛋白酶或血浆酶的不良底物。此外，由于外切连接子可以利用更长、更亲水的序列而不损害自消除，它们非常适合掺入通过深度谱分析定义的肿瘤偏向基序，同时保持有利的ADC开发。 总而言之，酶可裂解连接子的肿瘤特异性策略现在在多个层面上运作，当它们汇聚时，提供了一条超越通用Val-Cit基 -07- 结语 在过去二十年中，对ADC开发的深入研究已明确连接子不仅仅是载荷和抗体之间的单纯连接，而是整个偶联物的中央控制元件。从简单的腙和二硫键连接子开始，现已成熟为酶可裂解肽、自消除间隔基、亲水平衡支架和多触发架构的复杂设计空间，共同控制载荷何时、何地以及如何释放。 酶可裂解连接子是这一进展的中心。凭借其利用溶酶体蛋白酶、组织蛋白酶、MMPs和糖苷酶（在肿瘤中过表达或错误定位）的能力，这些连接子编码了补充抗原靶向的生化选择性层。现代肽连接子超越通用二肽基序到三肽和四肽，允许根据特定蛋白酶的S1-S4偏好进行调整，改善血浆稳定性并将裂解偏向肿瘤溶酶体或微环境。自消除间隔基将酶识别与载荷释放解耦，促进多种药物的模块化附着，同时保持对碎片化和分解代谢物结构的紧密控制。同时，对连接子疏水性和电荷如何控制聚集、DAR分布和清除的更好理解，推动了更亲水连接子的采用，使其能够为疏水性载荷支持更高DAR而不损害可开发性。 参考文献： Linker Design in Antibody-Drug Conjugates: Balancing Stability and Drug Release. Pharmaceutics 2026 Aug 3;18(8):954.

2020年3月，笔者曾写过一篇《2020年全球ADC药物研发报告》。当时全球活跃项目约311个，获批产品只有个位数。Enhertu刚刚上市，Trodelvy尚未获批，Padcev也只是尿路上皮癌后线的一名新兵。 六年后的变化，已经不能只用“管线更多了”概括。 Enhertu从挑战Kadcyla，走到HER2低表达、超低表达、泛瘤种，并进入晚期一线和早期乳腺癌； Padcev联合帕博利珠单抗，将晚期尿路上皮癌中位总生存期从16.1个月提高到31.5个月； TROP2成为最拥挤的实体瘤靶点之一，但Trodelvy在肺癌和尿路上皮癌的受挫说明，广泛表达并不等于广泛有效； 双抗ADC、双载荷ADC和新型连接子陆续进入临床，竞争焦点从“能否递送”转向“能否扩大治疗窗”。 截至2026年8月31日，按包含区域性产品、撤市产品及部分广义偶联药物的口径，全球已有23款产品获得过至少一个主要市场批准，活跃ADC临床试验约711项。数字固然亮眼，但真正决定行业价值的，是ADC开始改写治疗顺序。一、从7款到23款：数字背后的临床位置更重要 ADC由抗体、连接子和有效载荷三部分组成。抗体决定“去哪里”，连接子决定“何时释放”，载荷决定“如何杀伤”。可透膜载荷还可以扩散至邻近细胞，产生旁观者效应，从而覆盖抗原表达不均一的肿瘤。 2020年前后的主流载荷以MMAE、MMAF、DM1和DM4等微管抑制剂为主。今天，拓扑异构酶I（TOP1）抑制剂已成为实体瘤ADC的主流路线。与此同时，定点偶联、双表位或双靶点抗体、双载荷以及NMT抑制剂等新机制载荷开始进入临床与交易视野。 如果只保留最能代表行业转折的产品，可以看到ADC经历了三次跨越。 二、Enhertu：真正的突破，是拓宽HER2的边界 2020年，市场关心Enhertu能否挑战Kadcyla。今天看，这场竞争早已不只是同靶点产品之间的替代。 Enhertu由HER2抗体、可裂解四肽连接子和DXd载荷组成，药物抗体比约为8。较高载药量、可透膜载荷和旁观者效应，使其能在HER2表达不均一的肿瘤中发挥作用。它由此从“更强的HER2阳性ADC”，变成了“利用微量HER2完成递送的平台”。 其关键里程碑包括： 在DESTINY-Breast03中击败T-DM1，确立HER2阳性晚期乳腺癌二线地位； 在DESTINY-Breast04中把HER2-low变成可治疗人群； 2024年获得HER2 IHC 3+泛瘤种加速批准； 2025年覆盖HR阳性、HER2低表达或超低表达晚期乳腺癌，并进入HER2阳性晚期一线； 2026年又走向早期乳腺癌的新辅助和残留病灶辅助治疗。 这款药改变的不只是治疗，也改变了诊断。过去被笼统归入“HER2阴性”的患者，需要更精细地识别低表达和超低表达。 但Enhertu同样提醒行业，强旁观者效应并非只有收益。间质性肺病、骨髓抑制和胃肠道毒性需要严格管理。后来者如果只拿出更高ORR，并不足以建立优势；更低的ILD风险、更稳定的剂量强度、脑转移控制以及ADC序贯治疗后的活性，才可能形成真正差异化。三、Padcev：ADC+IO第一次真正改写实体瘤一线 Padcev靶向Nectin-4，采用可裂解连接子和MMAE载荷。它最初凭借尿路上皮癌中的高表达，从铂类和PD-1/PD-L1治疗后的后线人群切入。 真正的转折来自EV-302。Padcev联合帕博利珠单抗对比铂类加吉西他滨，中位总生存期为31.5个月对16.1个月，死亡风险下降53%；中位无进展生存期为12.5个月对6.3个月。获益跨顺铂适用性和PD-L1状态存在。 这不是后线多了一个选择，而是ADC首次在常见实体瘤中成为一线联合骨架。此后方案进一步进入不适合顺铂的肌层浸润性膀胱癌围手术期，临床目标也从“延长晚期生存”转向“提高治愈概率”。 越走向早期，安全性门槛越高。周围神经病变、皮肤反应、高血糖和眼部不良反应，都会影响长期治疗。四、TROP2的冷热两面：表达广，不代表处处有效 Trodelvy率先在TNBC中验证TROP2价值，并扩展至HR阳性/HER2阴性乳腺癌。但它在二线及以后NSCLC的EVOKE-01、经铂类和免疫治疗后的尿路上皮癌TROPiCS-04中均未达到OS主要终点；一线PD-L1高表达NSCLC的EVOKE-03也因成功概率较低而停止。 这组结果说明，靶点表达、内吞效率、肿瘤对载荷的敏感性、既往治疗和耐药机制必须一并考虑。乳腺癌的成功，不能凭借一张TROP2表达图谱复制到所有实体瘤。 Datroway同样靶向TROP2，但连接DXd载荷。在HR阳性/HER2阴性乳腺癌中，它改善PFS但未显著改善OS；在不适合免疫治疗的初治晚期TNBC中，中位PFS达到10.8个月，对照化疗为5.6个月，并于2026年获批一线治疗。 因此，TROP2赛道不会简单决出一款“靶点之王”，而会围绕乳腺癌亚型、线次、免疫治疗适用性、既往TOP1 ADC暴露以及毒性管理继续切分。五、临床管线下一站：解决现有ADC的问题 截至目前，全球约有711项活跃ADC临床试验，其中105项为III期。这个数字统计的是试验而不是独立药物，一款成熟产品往往同时开展多项适应症和联合研究。 未来ADC增长主要来自四个方向： 治疗线次继续前移； 从高表达走向低表达和动态检测； 成为免疫或靶向治疗的联合骨架； 解决“ADC after ADC”的序贯问题。 其中最后一点尤其重要。随着同一患者可能先后接受HER2 ADC、TROP2 ADC甚至不同载荷ADC，靶点下调、内吞改变、溶酶体功能、药物外排及载荷交叉耐药，将成为临床设计和BD尽调的新变量。六、市场空间：250亿还是400亿美元，取决于四个乘数 全球ADC销售额在2023年首次突破100亿美元，2025年主要产品公开销售额合计约160亿—170亿美元。不同机构对2030年市场的预测从约258亿美元到400亿美元以上不等，差异来自管线成功率、适应症前移、定价、联合疗法以及中国市场放量等假设。 笔者更愿意用四个乘数理解市场： 可检测患者数 × 相对标准治疗的临床获益 × 可持续用药时间 × 支付可及性。 任何一项接近零，所谓百亿美元靶点都可能停留在PPT里。尤其进入早期治疗后，疗程、治愈增益、长期毒性和药物经济学，会比后线ORR更加重要。结语：ADC的下半场，把治疗窗进一步拉大 ADC常被称为“生物导弹”，但它并不是没有化疗毒性的靶向药。更准确地说，它是被生物标志物和抗体分布重新塑形的"系统性化疗"。 过去六年，Enhertu证明优秀ADC可以重新定义生物标志物，Padcev证明ADC+IO可以替代一线化疗，Elahere证明失败后通过正确筛选人群仍能翻盘；Trodelvy的跨瘤种受挫也提醒我们，高ORR、热门靶点和漂亮的早期数据，不能替代随机对照研究中的真实临床获益。 ADC的上半场，是把毒素送进肿瘤；下半场，则是用更好的靶点、载荷、连接子、剂量和患者选择，把疗效与毒性之间的窗口真正拉开。 下一篇，我们暂时离开临床现场，沿着过去二十年的交易回看：为什么ADC从早年的技术授权，走到430亿美元收购Seagen和220亿美元打包合作？那些令人眼花缭乱的“百亿美元交易”，买方究竟在为什么付钱？ 注：本文仅用于医药产业研究与BD交流，不构成临床诊疗或投资建议。 本文作者的职业为医药BD，欢迎志同道合的朋友添加个人微信交流，同时欢迎关注“小马说药”公众号（长按识别下方二维码）。