Human rotavirus, live attenuated(GlaxoSmithKline Plc)

今天为大家分享4月10日在《Virologica Sinica》上发表的《Generation of G9 genotype porcine rotavirus using reverse genetics system and its application for antiviral screen and vaccine development》，本研究以 G9 型 PoRV AHFY2022 株为对象，成功拯救重组病毒，构建两种报告病毒并用于药物筛选；同时构建 G5‑VP7 重配病毒，经小鼠实验验证其免疫原性，为抗病毒药物研发与流行毒株疫苗制备提供平台。 研究方法与结果 1. G9 型猪轮状病毒 AHFY2022 株反向遗传系统建立 本研究以 AHFY2022 株（G9P）构建反向遗传系统：将病毒 11 个全长 cDNA 片段克隆至 pT7 载体，共转染 BHK‑T7 细胞并辅以 3 种辅助质粒，24h 后加入 MA104 细胞支持病毒复制，72h 后收获并接种 MA104 细胞，出现典型细胞病变（CPE），证明重组病毒 rAHFY2022‑WT 拯救成功。 为提升拯救效率，新增 3 种辅助质粒并使用胰酶代替传统胰蛋白酶，显著提升病毒复制与拯救效率。在 NSP1 基因引入同义突变（T→C）构建 EcoRI 酶切位点作为遗传标记，测序与酶切验证重组病毒来源；连续传代（P3–P7）标记稳定，基因组电泳、IFA、Western blot、生长曲线、空斑实验均显示，重组病毒与野生型生物学特性基本一致。 2. 表达 UnaG 荧光蛋白的重组猪轮状病毒构建 本研究将 UnaG 基因融合至 NSP3 C 端，插入自剪切肽与 3×Flag 标签，成功拯救 rAHFY2022‑NSP3‑UnaG。感染细胞可见绿色荧光与典型 CPE；基因组电泳显示第 7 片段因插入 UnaG 迁移变慢；IFA、Western blot 证实 VP6 与 UnaG 表达；生长曲线显示复制力略低于野生型，空斑大小无差异；连续传 7 代，报告基因稳定。 3. 表达纳米荧光素酶（ NLuc） 的猪轮状病毒报告病毒拯救将NLuc 插入 NSP3，获得 rAHFY2022‑NSP3‑NLuc。感染细胞荧光素酶活性显著升高；基因组第 7 片段迁移变慢；IFA、Western blot 证实 VP6 与 NLuc 表达；但 NLuc 插入显著削弱病毒复制力；连续传 7 代，荧光素酶活性与基因组均稳定。 4. 报告病毒在抗病毒药物筛选中的应用 目前无高效抗猪轮状病毒药物，本研究选用UnaG 报告病毒（复制影响更小）进行高通量筛选。对 10 种小分子化合物（C1–C10）进行筛选，发现齐墩果酸衍生物 C8、C9可显著降低荧光信号。 细胞毒性检测显示：C8 的 CC₅₀=103.3μM，C9 的 CC₅₀=39.2μM；抗病毒活性显示：C8 的 EC₅₀=3.2μM（SI=32.3），C9 的 EC₅₀=2.2μM（SI=17.8），均为高选择性候选药物。RT‑qPCR、TCID₅₀、Western blot 验证其可抑制野生型病毒复制。 机制研究显示：C8 作用于病毒结合与复制阶段；C9 作用于病毒复制全周期，以早期阶段为主。分子对接与生物层干涉术（BLI）证实，C9 可直接结合病毒外衣壳蛋白 VP4（亲和力更高）与 VP7，阻断病毒入侵。同时，C8、C9 可下调病毒诱导的炎症因子（TNF‑α、IL‑6、IL‑8、IL‑1β），兼具抗炎活性。 5. 以 AHFY2022 为骨架构建 G5 型 VP7 单基因重配病毒 当前 PoRV 基因型复杂，G5 型为第二优势基因型，传统疫苗难以覆盖。本研究从临床样本直接扩增 G5‑VP7 全长片段，以 rAHFY2022‑WT 为骨架，拯救重配病毒 rAHFY2022‑G5‑VP7。RT‑PCR 鉴定基因型正确；基因组、蛋白表达、空斑大小与野生型无显著差异；复制力略高于野生型；连续传代遗传稳定。 6. 重配病毒 rAHFY2022‑G5‑VP7 在小鼠体内诱导强免疫应答 将 4 周龄 Balb/c 小鼠分为 4 组（PBS、野生型、重配株、联合免疫），经口免疫 3 次（0、14、28d），35d 检测免疫指标： 体液免疫：联合免疫组血清 IgG、粪便 IgA 水平最高；重配株与野生型均可诱导针对 G9/G5 型的交叉中和抗体，对临床分离株 NJ2012、NJHS2024均有中和效果。 细胞免疫：重配株诱导的淋巴细胞增殖、IFN‑γ/IL‑4 分泌、CD4⁺/CD8⁺ T 细胞与 B 细胞比例均显著高于对照组，与野生型相当，且 B 细胞诱导能力更优。 结论 本研究成功建立并优化 G9 型猪轮状病毒 AHFY2022 株反向遗传系统，构建 UnaG、NLuc 两种报告病毒；利用 UnaG 报告病毒筛选出两种抗 PoRV 候选化合物；构建 G5‑VP7 重配病毒，可在小鼠体内诱导强免疫应答。该系统为抗猪轮状病毒药物筛选、流行毒株疫苗快速研发提供核心技术平台。 心得体会 当前我国猪场猪轮状病毒流行率持续攀升，G9 型已成为优势基因型，现有疫苗保护力不足，严重制约生猪养殖健康发展。该研究建立的G9 型猪轮状病毒反向遗传系统，填补了国内相关技术空白，同时更为病毒机制研究、药物筛选和疫苗创制提供了核心平台。文中构建的荧光报告病毒实现了抗病毒药物的快速高通量筛选，成功获得 C8、C9 两种高效候选化合物，为临床用药提供了新方向。快速构建的 G5-G9 型重配病毒，在小鼠体内展现出良好免疫原性，为多价疫苗研发提供了可行思路。 推送作者：张源（2025级兽医专业） 全文链接：Generation of G9 genotype porcine rotavirus using reverse genetics system and its application for antiviral screen and vaccine development - PubMed 声明：本文内容仅用于学术交流，若有侵权，请联系删除。