Nadofaragene firadenovec-vncg

肿瘤药物研究合作群 加入请联系小编 （备注：单位+姓名） 这里，我们回顾了迄今为止 FDA 批准的所有细胞和基因疗法。截至撰写本文时（2024/7/4），FDA已批准了 37 种不同的细胞和基因疗法。 仅 22023 年，FDA 批准了七种新的细胞和基因疗法，包括 2 种镰状细胞病 (SCD) 基因疗法、1种营养不良性大疱性表皮松解症基因疗法、一种 1 型糖尿病细胞疗法、和1种严重血友病基因疗法。 2024年，上半年已有4 款细胞和基因疗法正式获批,包括: 1. Vertex Pharmaceuticals 和 CRISPR Therapeutics 的 Casgevy，该药物于 1 月份获得 FDA 批准用于治疗输血依赖性 β 地中海贫血。 2月份，Iovance Biotherapeutics 的 Amtagvi，用于治疗患有一种皮肤癌的成人，这种皮肤癌无法通过手术切除或已扩散到身体其他部位，称为不可切除或转移性黑色素瘤。 3月份，FDA 批准了 Orchard Therapeutics 的 Lenmeldy，一种一次性基因疗法，用于治疗有症状的晚期婴儿期、有症状的早期青少年期和早期症状的早期青少年期儿童，称为早发型异染性脑白质营养不良 (MLD,metachromatic leukodystrophy)。MLD 是由芳基硫酸酯酶 A (ARSA) 基因缺陷引起的，导致体内产生的 ARSA 酶减少或不产生。LENMELDY 是专门为每个孩子制作的，使用孩子自己的血液干细胞，并将 ARSA 基因的功能基因添加到他们的细胞中。这使其产生足够的 ARSA 酶来阻止或减缓 MLD 症状的进展。 2024年4月26日，辉瑞的 BEQVEZ，获批治疗成人中度至重度血友病B。目前正在使用 凝血因子 IX (FIX，factor IX) 预防治疗，或者当前或历史上有危及生命的出血，或者有反复、严重的自发性出血事件，并且检测到不具有腺相关病毒血清型 Rh74var (AAVRh74var) 衣壳的中和抗体通过 FDA 批准的测试。BEQVEZ 是一种一次性治疗方法，旨在使 B 型血友病患者能够自行产生 FIX。 1 -2024年， AMTAGVI  细胞疗法（编辑），首款TIL疗法  Iovance Biotherapeutics, Inc. 工程化 T 细胞用于治疗先前接受过 PD-1 阻断抗体治疗的不可切除或转移性黑色素瘤的成年患者，如果 BRAF V600 突变呈阳性，则使用 BRAF 抑制剂联合或不联合 MEK 抑制剂。 2 -2024年，BEQVEZ AAVRh74var Pfizer, Inc. AAV 介导的基因治疗，用于治疗患有中度至重度 B 型血友病（先天性 IX 因子缺乏症）的成人，这些患者目前正在使用 IX 因子预防治疗，当前或历史上有危及生命的出血，或有反复严重的自发性出血发作，并且不具有腺相关病毒血清型 Rh74var (AAVRh74var) 衣壳的中和抗体。 3 -2024年，LENMELDY 基因（离体、自体） Orchard Therapeutics (Europe) Limited 离体基因治疗，用于治疗患有症状前晚期婴儿期 (PSLI)、症状前青少年早期 (PSEJ) 或早期症状早期青少年 (ESEJ) 异染性脑白质营养不良 (MLD) 的儿童。MLD 是由芳基硫酸酯酶 A  ( ARSA ) 基因突变引起的 ，导致硫苷脂在大脑和身体其他部位（包括肝脏、胆囊、肾脏和/或脾脏）积聚。随着时间的推移，神经系统受到损害，导致神经系统问题，如运动、行为和认知退化、严重痉挛和癫痫发作。该款基因疗法定价达425万美元。 4 -2023年，CASGEVY 细胞（自体、修饰） Vertex Pharmaceuticals, Inc. 通过电穿孔 CRISPR/Cas9 RNP 复合物对 CD34+ 造血干细胞进行改造，降低 BCL11A 的表达，从而增加胎儿血红蛋白的产生。治疗患有某些镰状细胞病的患者。 5 -2023年，ELEVIDYS AAVrh74 Sarepta Therapeutics, Inc. 重组 AAVrh74 提供微肌营养不良蛋白基因，用于治疗某些类型的杜氏肌营养不良症患者。 6-2023年，LANTIDRA  细胞（同种异体） CellTrans Inc. 来自已故捐赠者的胰岛细胞被移植来治疗某些类型的 I 型糖尿病患者。 7 -2023年，LYFGENIA 细胞（自体、修饰） bluebird bio, Inc. 用慢病毒 BB305 改造的造血干细胞，表达修饰的 ß A -珠蛋白基因。治疗患有某些镰状细胞病的患者。 8 -2023年，OMISIRGE  细胞（同种异体，改良） Gamida Cell Ltd. 从人脐带血中移植烟酰胺修饰的 HPC。 9-2023年，ROCTAVIAN AAV5 BioMarin Pharmaceutical Inc. 重组 AAV5 提供 B 结构域删除的 SQ 形式的 F8，用于治疗某些类型的 A 型血友病患者。 10-2023年，VYJUVEK  HSV-1  Krystal Biotech, Inc. 重组 HSV-1 传递 VII 型胶原蛋白基因 (COL7)，用于治疗 COL7A1 基因突变的营养不良性大疱性表皮松解症患者的某些伤口。 11-2022年，ADSTILADRIN  腺病毒 Ferring Pharmaceuticals  A/S 重组腺病毒 (rAd-IFNa/Syn3) 将人干扰素 alfa-2b cDNA 递送至膀胱上皮。治疗患有某些类型膀胱癌的患者。 12-2022年，CARVYKTI 细胞（自体、修饰） Janssen Biotech, Inc. 用慢病毒改造的 CAR T 细胞可攻击表达 BCMA 的肿瘤细胞。治疗患有某些类型的复发性或难治性多发性骨髓瘤的患者。 13-2022年，HEMGENIX AAV5 CSL Behring LLC,  UniQure 重组 AAV5 递送 F9基因 来治疗某些 B 型血友病患者。 14-2022年，SKYSONA 细胞（自体、修饰） bluebird bio, Inc. 使用表达 ABCD1 基因的 Lenti-D 载体改造的造血干细胞。治疗患有一种脑性肾上腺脑白质营养不良的患者。 15-2022年，ZYNTEGLO 细胞（自体、修饰） bluebird bio, Inc. 使用慢病毒 LentiGlobin BB305 改造造血干细胞，以表达 HBB。治疗患有某些类型 β 地中海贫血的患者。 16-2021年，ABECMA 细胞（自体、修饰） Celgene Corporation, Bristol-Myers Squibb Company CAR T 细胞识别 B 细胞成熟抗原 (BCMA) 并杀死表达 BCMA 的肿瘤细胞。Bluebird Bio 开发的慢病毒载体用于改造 CAR T 细胞。 17-2021年，BREYANZI 细胞（自体、修饰） Juno Therapeutics, Inc., Bristol-Myers Squibb Company  用慢病毒改造的 CAR T 细胞可攻击表达 CD19 的肿瘤细胞。治疗患有某些类型的大 B 细胞淋巴瘤的患者。 18-2021年，RETHYMIC  细胞（同种异体） Enzyvant Therapeutics GmbH 胸腺组织植入可改善某些类型先天性无胸腺症患者的免疫功能。 19-2021年，STRATAGRAFT  细胞（同种异体） Stratatech Corporation 鼠胶原蛋白中的角质形成细胞和真皮成纤维细胞的细胞支架，用于治疗某些类型的热烧伤患者。 20-2020年，TECARTUS 细胞（自体、修饰） Kite Pharma, Inc. 用伽马逆转录病毒改造的 CAR T 细胞可攻击表达 CD19 的肿瘤细胞。治疗某些类型的复发性或难治性套细胞淋巴瘤患者。与 YESCARTA 的不同之处在于，工程化 T 细胞针对某些 B 细胞的活性得到了富集。 21-2019年，ZOLGENSMA AAV9 Novartis Gene Therapies, Inc. 重组 AAV9 提供 SMN1 来治疗些类型的脊髓性肌萎缩症患者。 22-2018年，HPC, Cord Blood - MD Anderson Cord Blood Bank  细胞（同种异体） MD Anderson Cord Blood Bank 从人类脐带血中移植 HPC。 23-2017年，KYMRIAH 细胞（自体、修饰） Novartis Pharmaceuticals Corporation 用慢病毒改造的 CAR T 细胞可攻击表达 CD19 的肿瘤细胞。治疗患有某些类型的复发性或难治性滤泡性淋巴瘤的患者。 24-2017年，LUXTURNA AAV2 Spark Therapeutics, Inc. 重组 AAV2 提供 RPE65 来治疗 RPE65 突变相关的视网膜营养不良患者。 25-2017年，YESCARTA 细胞（自体、修饰）  Kite Pharma, Inc. 用伽马逆转录病毒改造的 CAR T 细胞可攻击表达 CD19 的肿瘤细胞。治疗某些类型的复发性或难治性大 B 细胞淋巴瘤患者。 26-2016年，CLEVECORD  细胞（同种异体）  Cleveland Cord Blood Center 从人类脐带血中移植造血祖细胞 (HPC)。 27-2016年，HPC, Cord Blood - LifeSouth  细胞（同种异体） LifeSouth Community Blood Centers, Inc. 从人类脐带血中移植 HPC。 28-2016年，HPC, Cord Blood - Bloodworks  细胞（同种异体） Bloodworks 从人类脐带血中移植 HPC。 29-2016年， MACI 细胞（自体、扩增）  Vericel Corp. 用于修复膝关节软骨缺损的细胞支架。 30-2015年，IMLYGIC HSV-1 BioVex, Inc., a subsidiary of Amgen Inc. 重组 HSV-1 输送 GM-CSF 来治疗患有某些不可切除黑色素瘤病变的患者。 31-2013年，ALLOCORD  细胞（同种异体） SSM Cardinal Glennon Children's Medical Center 来自脐带和胎盘的血细胞移植。 32-2012年，DUCORD  细胞（同种异体）  Duke University School of Medicine  从人类脐带血中移植 HPC。 33-2012年，GINTUIT  细胞（同种异体）  Organogenesis Inc. 用于局部应用于手术创建的伤口床以治疗某些粘膜牙龈疾病的细胞支架。 34-2012年，HPC, Cord Blood  细胞（同种异体） Clinimmune Labs, University of Colorado Cord Blood Bank 从人类脐带血中移植 HPC。 35-2011年，HEMACORD  细胞（同种异体） New York Blood Center 从人类脐带血中移植 HPC。 36-2011年，LAVIV 细胞（自体、扩增） Fibrocell Technologies 成纤维细胞可改善中度至重度鼻唇沟皱纹的外观。 37-2010年，PROVENGE 细胞（自体、活化/扩增）  Dendreon Corp. 抗原呈递细胞被激活并用于治疗某些类型的前列腺癌。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要：腺病毒载体，包括溶瘤病毒和基因传递载体，是最早获批和商业化的基因治疗载体之一。腺病毒具有高细胞毒性和免疫原性。因此，最近人们开始关注慢病毒或腺相关病毒作为病毒载体，以及单纯疱疹病毒作为溶瘤病毒。因此，腺病毒载体通常被认为是相对过时的。然而，它们高载货量和转导效率是它们相对于新型病毒载体的重要优势。这篇综述提供了新一代腺病毒载体的概述。此外，我们描述了纤维结区域的修饰，这种修饰增强了腺病毒载体对癌细胞的亲和力，以及使用癌细胞特异性启动子来抑制非恶性组织中不需要的转基因表达。 1.引言 腺病毒是具有非包膜二十面体颗粒的DNA病毒，直径大约为90纳米。目前，已经鉴定并分类了88种人类腺病毒（1-88），并分为七个血清型（A-G），其中许多病毒会导致人类各种疾病。然而，在1993年，有报道称使用腺病毒载体将基因转移到神经元中，此后腺病毒开始作为能够将基因转移到非分裂细胞的高效载体而受到关注。尽管腺病毒是最常见的人类病毒病原体之一，但它们也是基因治疗研究中最广泛使用的病毒载体之一。腺病毒载体的使用占全球基于载体的基因治疗临床试验的15.5%。此外，由于腺病毒被用作针对2019冠状病毒病的病毒载体疫苗的基础材料，因此也引起了人们的关注。目前，68.2%的临床基因治疗试验旨在治疗癌症。癌症病毒治疗使用基因修饰病毒作为治疗基因的载体，或将其作为溶瘤病毒使用。近年来，病毒免疫疗法已被广泛研究。在基因治疗研究中使用的腺病毒载体，包括病毒治疗研究，大多基于腺病毒血清型5（Ad5）。这可能是因为Ad5是第一个被分析基因功能的病毒，关于Ad5的知识已经积累，并且可以轻松生产高滴度的病毒颗粒。然而，最近使用慢病毒和腺相关病毒（AAV）作为病毒治疗的研究有所增加，与这些“新来者”病毒载体相比，一些研究者认为腺病毒载体“过时”。 在本文中，我们简要描述了腺病毒作为载体或溶瘤病毒的特性以及使用它们进行研究的现状。 2.病毒载体的趋势 目前，全球基因治疗临床试验中使用的前五种载体是腺病毒、逆转录病毒、质粒、慢病毒载体和AAV载体。腺病毒载体是基因治疗历史上最早使用的载体之一，截至2022年，将占全球基因治疗临床试验中使用的载体的最大份额（表1）。尽管腺病毒在它们使用的总案例百分比中仍然排名第一，但过去10年中腺病毒载体的份额有所下降。然而，慢病毒和AAV载体的使用显著增加。比较2012年至2017年的案例数量，慢病毒载体排名第一，腺病毒载体排名第三，而2017年至2022年的数据显示腺病毒载体在表1中列出的所有载体中排名最低。考虑到这一点，腺病毒似乎是“过时”的载体。然而，它们仍然提供几个优势。此外，在已知的许多腺病毒血清型中，可以想象可能会发现一种完全适合人类临床应用的全新腺病毒载体。 表1. 过去十年基因治疗临床试验中使用的载体的变化。 基因治疗临床试验中使用的前五种载体的特征在表2中展示。 表2. 基因治疗临床试验中使用的前五种基因载体的特征。 第三代腺病毒载体在特定条件下是“稳定的”。AAV：腺相关病毒。 本文的主要讨论对象是腺病毒，它们在临床试验中占有最大份额，并将在下一章中讨论。以下是表1和表2中列出的其他病毒载体的总结。 2.1逆转录病毒载体 逆转录病毒载体通常指的是主要源自Moloney小鼠白血病病毒的载体，这是一种γ-逆转录病毒，与慢病毒载体（一种逆转录病毒）不同。逆转录病毒载体因其低细胞毒性而常用于基因治疗。长期稳定的基因表达也是逆转录病毒载体的优势；然而，它们无法将基因转移到非分裂细胞是一个主要缺点。此外，随机突变影响染色体并激活附近原癌基因引起癌症的潜在问题不容忽视。逆转录病毒载体的载货量限制在9-10 kb，虽然适中但不如新一代腺病毒载体。 2.2 慢病毒载体 慢病毒载体是基于HIV-1开发的逆转录病毒载体的一个亚型，能够将基因转导到几乎所有哺乳动物细胞中，包括无法用逆转录病毒载体转导的非分裂细胞。与逆转录病毒载体类似，慢病毒载体可以维持稳定的基因表达。慢病毒载体已被广泛用于通过使用嵌合抗原受体的T细胞研究体外癌症免疫疗法[9]。由于安全性的改进，第三代慢病毒已获得低免疫原性和细胞毒性。然而，由于慢病毒载体基于HIV-1，需要一些HIV-1基因来生产载体，其在基因治疗中的使用仍然存在安全问题。此外，慢病毒不能用作溶瘤病毒，因为它们缺乏复制能力。它们的载货量限制在9-10 kb，看起来足够，但仍然不如新一代腺病毒。 2.3 腺相关病毒（AAV）载体 AAV是一种单链DNA细小病毒，只能在存在其他“辅助病毒”（如腺病毒或人乳头瘤病毒）的情况下复制。已经鉴定出11种AAV血清型（1-11），它们在感染细胞的类型上有不同的趋向性。因此，AAV载体对于特定细胞类型的优先转导非常有用。AAV2是最知名和最常用的AAV载体。尽管AAV的免疫原性和高剂量AAV载体引起的肝毒性经常被报道，但AAV在人类中没有已知的感染，其致病性被认为几乎可以忽略不计。总的来说，AAV载体安全且具有高转导效率，是很有前途的病毒载体。使用AAV载体的基因治疗研究包括治疗各种棘手的疾病，如血友病和帕金森病。关于癌症治疗，有报道称一种基因工程化的AAV载体能够选择性地结合肿瘤抗原Her2/neu，并且只能感染癌细胞。此外，Onasemnogene abeparvovec（Zolgensma），一种基于AAV9的用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的基因治疗药物已经上市。这种药物非常昂贵，但显示出显著的治疗功效。 然而，AAV有明显的缺点。AAV的载货量限制（4.7-5 kb）太小，无法容纳将来基因治疗发展可能出现的大型治疗基因。AAV载体允许转导基因的稳定表达；然而，由于各种原因，转导基因的稳定表达并不总是可能的。此外，高滴度AAV载体的纯化相对困难。 3.腺病毒作为载体 腺病毒载体的优势包括大载货量和高感染效率。高细胞毒性是腺病毒载体的主要缺点；然而，当用作溶瘤病毒时，这一特性证明是强大且有利的。短暂的基因表达也是一个缺点，但这导致更好的安全性，因为当作用于非目标时，基因表达不会持续很长时间。 3.1 第一代腺病毒载体 腺病毒载体根据其遗传设计被分类为第一代至第三代。第一代腺病毒载体设计为删除早期1（E1）和早期3（E3）区域（图1）。E1区域编码对腺病毒生存和复制至关重要的遗传信息；然而，这个区域在第一代腺病毒中被删除，因为它可以防止不受控制的腺病毒复制，并且可以用包装细胞的内容来替代。E3区域编码一种保护感染细胞免受免疫反应的蛋白。它通常在第一代中被删除以增加载货能力，因为它对复制不是必需的。通过删除E1和E3，可以确保5-6 kbp的载货能力。第一代腺病毒载体无法自我复制，需要一个表达E1蛋白的包装细胞系来生产它们。人类胚胎肾293细胞是最常用的包装细胞。 图1. 各代腺病毒载体的基因组概览。E1~E4，早期区域1至4；L1~L5，晚期区域1至5；Ad5，腺病毒血清型5；ITR，反向末端重复；ψ，包装信号。 3.2 第二代腺病毒载体 由于几种人类细胞表达E1A样因子，即使是删除了E1区域的第一代腺病毒载体也能在转导的宿主细胞中诱导强烈的宿主免疫反应和慢性细胞毒性。为了减弱宿主细胞对载体的免疫反应，开发了带有E2和E4删除的第二代腺病毒（图1）。E2区域包含腺病毒复制所需的基因，E4区域编码DNA转录的调节蛋白。删除这些区域可以提供大约14 kb的空闲空间，并显著减少原生腺病毒蛋白的合成。然而，第二代腺病毒仍然通过剩余基因表达的腺病毒蛋白诱导宿主免疫反应，导致目标细胞中转基因表达减少。 3.3 第三代腺病毒载体 尽管删除了E1-E4区域，但第一代和第二代腺病毒载体仍然具有相当的免疫原性和细胞毒性。此外，在21世纪初，超出传统腺病毒载体容量限制的基因被认为是治疗基因；因此，开发了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体除了反向末端重复序列和ψ包装信号外，其整个原生腺病毒基因组被移除，从而将载货量增加到36 kb。这种第三代特征，也称为“无肠腺病毒载体”，允许在宿主细胞中高水平表达，不表达病毒蛋白，很少诱导免疫反应。 由于缺乏自我组装所需的基因，生产第三代腺病毒载体时，必须将携带复制所需基因的“辅助腺病毒”共同引入包装细胞中，这也被称为“辅助依赖载体”。然而，人们担心辅助腺病毒会污染第三代腺病毒的最终产品，辅助病毒和包装细胞之间的同源重组将导致自我传播的腺病毒。因此，已经研究了作为辅助病毒使用的腺病毒的遗传修饰或使用非腺病毒作为辅助的方法；然而，病毒方法并没有解决污染的担忧。尽管如此，已经开发出了一种无污染的第三代腺病毒载体生产方法，使用编码所需基因的质粒作为“辅助”。 对于第三代腺病毒，为了有效包装，有必要在目标基因以外的区域放置其他基因（填充DNA）。然而，填充DNA对载体基因转移效率的影响仍然不清楚。一些报告称填充DNA影响转导效率，而另一些则声称它不会。 3.4 腺病毒载体的现状 目前（2023年6月），Nadofaragene firadenovec（商品名：Adstiladrin，也称为rAd-IFNa/Syn3）是唯一获批的腺病毒载体基因治疗药物。Nadofaragene firadenovec是一种基于Ad5的E1删除、复制缺陷型腺病毒载体，包含人类IFN-α2b基因。它于2022年12月在美国获批用于治疗非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）。目前，大多数使用非增殖腺病毒载体的临床试验是COVID19疫苗研究。与此同时，在癌症治疗研究中，使用腺病毒胸苷激酶（ADV-Tk）治疗肝细胞癌的试验正在进行III期（NCT03313596）。 4.腺病毒作为溶瘤病毒 手术、放疗和抗癌药物是癌症治疗的三大支柱，癌症免疫疗法最近被纳入标准癌症治疗。然而，手术对身体的负担很重，并不总是适用于所有癌症患者。其他标准治疗有副作用，显著损害患者的生活质量（QOL）。在这方面，溶瘤病毒疗法作为一种很少恶化QOL的治疗方法引起了关注。 溶瘤病毒的基本概念是它优先感染并在癌细胞中增殖，从而溶解和破坏它们。当时释放的病毒也感染周围的癌细胞，导致肿瘤组织中的破坏链。溶瘤病毒概念的起源可以追溯到病毒的发现。在19世纪末和20世纪初，当病毒开始被发现时，报告了病毒感染与暂时性癌症缓解之间的关系。在20世纪20年代，动物实验中证实了病毒诱导的溶瘤作用。从20世纪40年代末到60年代，广泛进行了使用黄热病或西尼罗河病毒等野生型病毒的溶瘤病毒疗法的临床研究，但这些研究的结果表明缺乏安全性或有效性。因此，溶瘤病毒疗法的研究被放弃。然而，随着1990年代基因工程技术的确立，只有在癌细胞中复制的高度安全的病毒成为现实，溶瘤病毒疗法再次成为关注的焦点。 1997年，报道了第一个溶瘤病毒，名为ONYX-015。这种溶瘤病毒是一种缺乏E1B 55-千道尔顿相关蛋白的腺病毒，该蛋白使肿瘤抑制基因p53失活，并选择性地感染并溶解p53基因非功能性的人类癌细胞。 使用ONYX-015进行了治疗头颈癌的临床试验。然而，ONYX-015必须直接注入肿瘤，因为它静脉注射时毒性很高。因此，它只能应用于大型肿瘤。因为它没有显示出预期的抗肿瘤效果，ONYX-015项目在2000年被中止。然而，基于ONYX-015的基因修饰腺病毒H101株（Oncorine）在2005年被中华人民共和国食品药品监督管理局批准用于治疗头颈癌。它是全球首个获批的溶瘤病毒，除了在拉脱维亚共和国获批但疗效不明确的Rigvir。 最近，单纯疱疹病毒作为溶瘤病毒似乎比腺病毒更受关注，T-VEC、G47Δ（Teserpaturev）和C-REV（最初为HF10）已经获批或正在进行临床试验。此外，也在研究基于腺病毒的新型溶瘤病毒。目前，OBP-301（suratadenotureb）正在进行II期临床试验，用于治疗头颈癌（NCT04685499），而CG0070腺病毒载体正在进行II/III期（NCT01438112）。 尽管溶瘤病毒对癌细胞的感染特异性有所提高，但它们仍能感染非恶性细胞。因此，开发新一代溶瘤病毒需要进一步改进以增强其特异性。 对于基于腺病毒的溶瘤病毒，用其他腺病毒血清型的纤维结替代Ad5纤维结已被证明可以增加癌细胞的感染性。最初，开发了一个将腺病毒35型（Ad35）纤维结区域引入Ad5的载体。目前，也在研究Ad3和Ad37纤维结。 Ad5通过柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）进入细胞。然而，癌细胞中CAR的表达通常较低，尽管在某些癌细胞中报告了其上调。因此，对腺病毒与其受体结合的纤维结区域进行遗传修饰是解决CAR介导的基因转移至癌细胞效率降低的主要方法。 分化群46（CD46）作为B型腺病毒的受体，在几乎所有人类细胞中都有表达。属于B型腺病毒的Ad35不与CAR相互作用，而腺病毒血清型5 F35（Ad5F35）载体，其中Ad5载体的纤维结区域被Ad35衍生的区域替换，与CD46结合（图2）。因此，它在缺乏CAR的细胞中有效。几个研究小组已经研究了Ad5F35在开发转导效率方面的应用。2021年，有报道称Ad35是一种溶瘤病毒。Ad35不被许多成年人拥有的Ad5抗体抑制，并显示出高水平的抗肿瘤效果。然而，Ad35的物理效力不到Ad5的十分之一，考虑到当前的生产/纯化效率，Ad35可能不优于Ad5F35。 图 2. 嵌合型腺病毒载体的概念，腺病毒血清型5 F35（Ad5F35）。Ad5通过柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）感染细胞，但CAR在癌细胞中表达较差。Ad35通过广泛表达的分化群46（CD46）感染。Ad5和Ad35分别对CD46和CAR没有亲和力。因此，当Ad5的纤维结区域转换为Ad35的纤维结时，腺病毒载体就有可能通过CD46感染。 ONYX-015 是一种经过基因改造的腺病毒，通过删除 E1B 区域，使其只能在 p53 缺陷的癌细胞中生长；然而，这种方法并不只限于在癌细胞中传播腺病毒。使用肿瘤特异性基因的启动子的策略更为有效。在控制腺病毒复制相关基因表达的位置插入在癌细胞中高度活跃的基因的启动子区域，如人类端粒酶逆转录酶和环氧合酶 2，允许溶瘤病毒只在癌细胞中复制。此外，特别是对于基于腺病毒的溶瘤病毒的开发，因为一半的人口对腺病毒有免疫力，病毒的效果被认为在短时间内会下降，“武装”它们以增强抗肿瘤效果的治疗基因也很重要。正在研究添加到溶瘤病毒中的治疗基因包括肿瘤抑制基因（p53 和 p16）、细胞因子诱导的和免疫刺激基因。与其它溶瘤病毒相比，基于腺病毒的溶瘤病毒理论上有能力“重武装”携带多个治疗基因，因为它们的容量限制更大。 Ad5-yCD/mutTKSR39rep-ADP 是“重武装”溶瘤病毒之一。酵母胞嘧啶脱氨酶催化前药 5-氟胞嘧啶的脱氨作用，形成 5-氟尿嘧啶。单纯疱疹病毒胸苷激酶是一种与更昔洛韦结合的自杀基因。ADP 促进宿主细胞的裂解和死亡。最近，含有酵母胞嘧啶脱氨酶（yCD）、突变 SR39 单纯疱疹病毒胸苷激酶和腺病毒死亡蛋白（ADP）基因的第二代复制型腺病毒载体 Ad5-yCD/mutTKSR39rep-ADP 正在进行 I 期试验（NCT03281382）。 5.腺病毒用于膀胱癌的应用 我们一直在研究使用腺病毒的病毒疗法，以开发尿路系统癌症的新治疗方法。 尿路系统的癌症是难以治疗的。大约 70% 的膀胱癌病例是非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），它经常发展成为复发性肿瘤，并进展到更高的阶段或等级。目前，卡介苗疗法被认为是 NMIBC 最有效的治疗方法；然而，其严重的副作用导致患者生活质量显著降低。Nadofaragene firadenovec 已经在美国获批用于 NMIBC 的基因治疗，NMIBC 也是 CG0070 临床试验的对象之一。肾细胞癌（RCC）占所有肾癌病例的 90% 以上。化疗和分子免疫疗法对 RCC 的效果并不显著，手术是最常见的治疗方法。然而，在某些情况下手术是困难的。因此，我们专注于腺病毒，为这些癌症开发新的治疗方法，设计了嵌合腺病毒载体，并检验了它们的有效性。 第一代腺病毒载体的安全性已在临床试验中得到确认；然而，腺病毒引起的相对较高的炎症仍然是一个主要问题。此外，使用腺病毒载体的癌症病毒疗法的主要问题是基因转移或溶瘤效应的效力有限，因为在高度恶性的癌细胞中 CAR 表达较低。Ad5F35 通过 CD46 感染，但 CD46 在几乎所有人类细胞中都有表达；因此，应该防止它对非恶性组织的副作用。条件复制腺病毒（CRAD）载体是减少副作用的有效解决方案。因此，我们设计了一种使用在癌细胞中大量表达的蛋白质的启动子区域来控制腺病毒载体的方法。Midkine 是一种在胚胎癌细胞中由视黄酸诱导的肝素结合生长因子，参与有丝分裂、血管生成、抗凋亡、纤维蛋白溶解和转化。Midkine 的表达在几种癌症中增强，而在非恶性细胞中的表达相对有限。因此，midkine 基因的启动子区域（图 3A）可以用来控制腺病毒复制所需的基因表达，将引入的基因表达限制在癌细胞中。因此，我们构建了一个 Ad5F35-Mkp-E1 CRAD 载体，编码 E1 受 midkine 启动子（Mkp；图 3A）的控制。作为溶瘤病毒，CRAD Ad5F35-Mkp-E1 载体在通过二次感染和复制对邻近主要感染细胞的癌细胞表现出显著的溶瘤效应（图 3B）。 我们检验了 Ad5F35/Mkp-E1 在各种癌细胞系中的溶瘤效应。在膀胱癌细胞系（图 4）中，观察到所有实验细胞系中都有 midkine mRNA 表达，其中 UMUC-3 细胞中表达最低（图 4A）。在 253J 和 KK47 中，CAR mRNA 表达远低于 CD46 mRNA（图 4A）。相反，UMUC-3 中的 CAR mRNA 表达高于 CD46。在 253J 细胞系中，Ad5F35/MKp-E1 以 PFU 依赖的方式降低了细胞活性（图 4B），但与 Ad5 的抗肿瘤效应相比没有观察到统计学上的显著差异。相反，尽管 CD46 mRNA 表达高于 CAR mRNA，Ad5F35/Mkp-E1 对 KK47 细胞几乎没有影响（图 4C）。在 UMUC3 细胞中，CAR mRNA 表达低于 CD46（图 4A），Ad5F35/Mkp-E1 在抑制活性方面效果较差（图 4D）。 图 3. 嵌合型腺病毒载体与 midkine 启动子的结合。由于分化群46（CD46）也在非恶性细胞中表达，因此需要一个安全装置来防止这些细胞被腺病毒血清型5 F35（AD5F35）载体感染后基因表达。通过在 midkine 启动子区域调控腺病毒复制所需基因的条件复制腺病毒（CRAD）确保了安全性（A）。作为溶瘤病毒的 CRAD Ad5F35 载体通过二次感染和复制对邻近主要感染细胞的癌细胞表现出显著的溶瘤效应（B）。(A) 是根据 Nagaya 等人在《抗癌研究》2012 年发表的数据改编的。 这些结果表明，Ad5F35/MKp-E1 对人膀胱癌细胞的溶瘤效应不仅取决于 CD46 mRNA 的表达水平，还依赖于一些 Ad5F35/MKp-E1 靶向的与凋亡相关的分子。 与膀胱癌细胞系不同，在 RCC 细胞系中只观察到低水平的 CAR mRNA 表达（图 5）。相反，CD46 mRNA 表达显著高于 CAR mRNA（图 5A）。在比较抗肿瘤效应时，只有 Ad5F35/Mkp-E1 降低了 RCC 细胞系的细胞活性；然而，Ad5/Mkp-E1 几乎没有或没有观察到效果（图 5B–D）。这些结果证明了传统腺病毒对 RCC 的无效性和 Ad5F35 的有效性。嵌合型 Ad5F35 与 Mkp 的结合可以应用于开发溶瘤病毒和基因传递载体，以癌症细胞特异性方式表达治疗基因。 图 4. 人类膀胱癌细胞系中 midkine、柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）以及分化群46（CD46）的表达（A），以及腺病毒血清型5 F35（Ad5F35）/Mkp-E1 对膀胱癌细胞系的溶瘤效应（B–D）。这张图是根据 Gotoh 等人在《泌尿学》2013 年发表的数据改编的。 成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（CRISPR-Cas9）技术是一种多功能的基因编辑工具，在癌症治疗领域具有出色的临床潜力。然而，CRISPR-Cas9系统的非目标效应是其临床应用的主要关注点。因此，我们构建了一个包含由 Mkp 调控的 Cas9 的嵌合型 Ad5F35 载体，以限制癌细胞中的基因表达。使用 midkine 基因的上游调控区域作为启动子。人类密码子优化的化脓链球菌 Cas9 基因（hCas9）被放置在 Mkp 下游，并在其旁边插入一个增强型绿色荧光蛋白基因作为表达标记（图 6A）。在 PNT1A 细胞，一种非恶性细胞系中，即使感染了 Ad5F35-Mkp-hCas9，也没有表达 hCas9。另一方面，在膀胱癌细胞系中，感染 Ad5F35-Mkp-hCas9 后确认了 hCas9 蛋白的表达（图 6B）。已经确认了膀胱癌细胞系中 CD46 和 midkine 的表达。 图 5. 肾细胞癌（RCC）细胞系中柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）以及分化群46（CD46）的表达（A），以及 Ad5F35/Mkp-E1 对这些细胞的溶瘤效应（B–D）。发现 CAR mRNA 表达水平很低，Ad5F35/Mkp-E1 降低了 RCC 细胞系的细胞活性。然而，Ad5/Mkp-E1 几乎没有或没有观察到效果（B–D）。这张图是根据 Nagaya 等人在《抗癌研究》2012 年发表的数据改编的。p < 0.05: *, p < 0.01: **, p < 0.001: ***。 图 6. 人类密码子优化的化脓链球菌 Cas9 基因（hCas9）被放置在 midkine 启动子（Mkp）下游，并且增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入其旁边作为表达标记（A）。在 PNT1A，一种非恶性细胞系中，hCas9 的表达被抑制。在膀胱癌细胞系中，在 Ad5F35-Mkp-hCas9 感染后确认了 hCas9 蛋白的表达（B）。这张图是根据 Matsunaga 等人在《抗癌研究》2021 年发表的数据改编的。 6.讨论 腺病毒载体，包括溶瘤病毒，在现在被认为是相对“过时”的，但它们仍然在临床试验中使用的载体中占有最大份额。它们高基因转移效率、易于制造和大的载货量是相对于“新来者”载体的主要优势。尽管它们的高细胞毒性是一个缺点，但将腺病毒作为溶瘤病毒使用是有优势的。腺病毒的缺点包括它们的高免疫原性和短暂的基因表达。然而，这也是有利的，因为可以防止溶瘤腺病毒载体的过度增殖和异常基因表达。此外，由于已经发现了几种感染人类的病毒，预计也会发现比 Ad5 更适合作为载体的腺病毒。因此，应进行未来的腺病毒载体病毒治疗研究。 然而，日本在包括使用病毒载体的研究在内的基因治疗开发方面，落后于其他发达国家。日本的研究仅占全球进行的临床基因治疗试验的 1.5%。 在日本，针对基因治疗研究的政府法规非常严格。在日本启动基因治疗的临床研究时，《临床研究法》要求向厚生劳动省进行审查和报告。此外，根据“包括基因治疗的临床研究指南”规定的委员会审查，还需要厚生劳动大臣的批准。《卡塔赫纳生物安全议定书》不规范医学研究。然而，与议定书相对应的日本法律，即所谓的“卡塔赫纳法”，规范了医学研究，基因治疗的临床研究需要主管大臣的批准。这些法规涉及复杂且耗时的程序。我们的目标是在日本使用腺病毒进行临床研究。然而，除非严格的法规有所改变，否则无论是否使用腺病毒载体，基因治疗研究的发展都将受到阻碍。我们希望日本政府能够尽快放宽对基因治疗研究的限制。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。