Lecanemab

摘要 靶向清除脑部异常堆积的 β 淀粉样蛋白（Aβ），是阿尔茨海默病极具潜力的治疗突破口，不过目前针对 Aβ 的免疫治疗方案不良反应频发，安全风险突出。而胞外靶向蛋白降解技术（eTPD），可实现安全、高效地清除体内致病性蛋白。本研究团队搭建了新一代胞外靶向蛋白降解技术平台 —— 合成多肽介导溶酶体靶向嵌合体（SPYTACs），该平台完全依托人工合成的双特异性多肽进行构建。这类新型分子能够依托低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（LRP1），高效介导胞外致病蛋白的精准降解，同时具备穿透血脑屏障的能力，可顺利实现脑部靶向递送。动物模型实验表明，对 5×FAD 小鼠施用该靶向分子后，能显著减少外周组织与大脑内的 Aβ 沉积，修复受损突触；无论在疾病发病前期的隐匿阶段，还是已经出现典型病症的发病阶段，均可有效改善模型小鼠的认知功能。与传统抗 Aβ 免疫疗法相比，SPYTACs 治疗不易引发脑出血、脑组织炎症等不良反应，整体安全性优势显著。与此同时，该技术具备高度模块化特征，还支持基因编码改造，可灵活定制多款靶向不同致病蛋白的治疗方案，不仅能应用于阿尔茨海默病，在各类由异常致病蛋白驱动引发的疾病中，均拥有极大的临床转化价值与广阔的应用前景。 一、引言 目前全球罹患阿尔茨海默病（AD）的人群已达 5700 万左右，该病症也是临床上造成痴呆症状的最主要病因。疾病特征性的老年斑块与神经纤维缠结，会持续不断地造成患者认知功能一步步衰退。随着研究证实老年斑块的核心组成物质为 β 淀粉样蛋白（Aβ），淀粉样蛋白级联假说随之建立，业内普遍认为大脑内 Aβ 异常堆积，是诱发阿尔茨海默病的核心关键。基于这一结论，围绕 Aβ 开展靶向干预，一直是抗阿尔茨海默病新药研发的重中之重。 近几年多项抗 Aβ 免疫疗法的临床试验均证明，减少大脑内部 Aβ 沉积，能够延缓早期阿尔茨海默病的病情进展。但该类治疗手段存在明显短板：无论是患者还是实验小鼠模型，都容易出现脑部炎症以及淀粉样蛋白相关影像学异常（ARIA）；即便优化方案去减轻这类不良反应，又会直接削弱药物的治疗效果。因此，研发一种既能精准高效降解 Aβ、又能规避抗体类药物副作用的全新技术，已经成为行业迫切需求。 胞外靶向蛋白降解技术（eTPD），其代表性技术为溶酶体靶向嵌合体（LYTACs），是近些年新兴的技术方向，主要用于清除细胞外部以及细胞膜表面的致病异常蛋白。该技术依靠双特异性生物制剂或小分子化合物，依托受体介导的溶酶体转运通路，实现对有害靶蛋白的降解。凭借巨大的应用潜力，该领域衍生出多种新技术，包括糖蛋白受体突变介导胞外蛋白模块化降解技术、蛋白酶靶向抗体、细胞因子受体靶向嵌合体等。动物实验数据显示，现有 eTPD 药物可以加快外周组织中致病蛋白的清除速度。但这类药物普遍穿透血脑屏障的能力薄弱，极大限制了它们在阿尔茨海默病这类神经退行性疾病中的应用。 相较于抗体、融合蛋白、适配体和小分子 eTPD 药物，多肽类技术平台设计思路简单、合成制备便捷、生产成本更低，同时拥有更强的血脑屏障穿透能力。除此之外，抗体药物含有的 Fc 片段，会结合体内 Fc 受体，进而引发炎症反应、损伤突触结构；而多肽类体系不具备 Fc 结构，从根源上杜绝了 Fc 受体介导引发的免疫激活问题。 本研究团队搭建了全新的多肽型胞外靶向蛋白降解平台 —— 合成多肽可编程溶酶体靶向嵌合体（SPYTACs），专门针对阿尔茨海默病胞外的 Aβ 蛋白实现降解。研究选用低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（LRP1），借助该受体完成细胞内化摄取与跨血脑屏障转运。LRP1 具备循环表达特性，且广泛分布在肝脏、大脑等多种组织当中，可同步实现外周与脑部 Aβ 的协同降解。依托模块化设计与简易合成优势，我们将靶向 LRP1 的多肽与结合 Aβ 的多肽相融合，成功制备出定制化嵌合多肽。 结合 Aβ 在阿尔茨海默病发病机制里的核心地位，以及靶向清除 Aβ 已被验证的临床价值，我们针对性开发 SPYTACs 来干预疾病核心病理。后续在 5×FAD 模型小鼠上开展的实验证实：不管是疾病尚未显现症状的前驱隐匿阶段，还是已经出现典型病症的发病阶段，SPYTACs 都能安全降解 Aβ 并发挥疗效；既能显著提升模型小鼠的认知水平与学习记忆能力，还能有效降低脑淀粉样血管病带来的微量出血、脑部炎症等不良反应。综上而言，SPYTACs 是一款功能多元、可灵活编辑、支持基因编码改造的胞外蛋白降解新技术，在阿尔茨海默病的临床转化与实际落地应用层面，有着极高的研究价值与广阔的发展前景。 二、基于 LRP1 构建 SPYTAC 平台 SPYTAC 是一类基于合成多肽构建的程序化靶向蛋白降解（eTPD）体系，可借助细胞内源性溶酶体转运受体介导目标蛋白（POIs）内吞，并通过一条双特异性合成多肽将其靶向转运至溶酶体实现降解（图 1A）。该多肽作为双特异性连接分子，由三部分结构构成：N 端目标蛋白结合基序、C 端受体结合基序，以及用于提升结构柔性的 GSS 连接肽（图 1A；表 S1）。为便于实验示踪，研究人员在其 N 端分别标记了生物素或异硫氰酸荧光素（FITC）。 本研究最初构建的 SPYTAC 分子可同时识别并结合 Aβ 与溶酶体转运受体 LRP1。研究团队设计并合成了一系列对 Aβ 和 LRP1 具有不同结合亲和力的嵌合肽候选分子（表 S1），并采用表面等离子体共振（SPR）技术，系统检测了这些多肽与合成寡聚体 Aβ42 及 LRP1 重组亚结构域（簇 II、III、IV）的结合亲和力 27,28,29（图 S1A），最终选定 SPAβ-1 作为后续研究的核心分子（图 1B、1C 及图 S1A）。 实验设置了三组阴性对照突变体：SPAβ-m1（Aβ 结合基序突变，保留 LRP1 结合活性）、SPAβ-m2（LRP1 结合基序突变，保留 Aβ 结合活性），以及 SPAβ-m3（Aβ 与 LRP1 结合基序均发生突变）（图 1B、1C 及图 S1A）。 图1 （A）图示SPYTAC介导胞外蛋白降解的作用原理。（左）构建兼具LRP1结合基序与目标蛋白（POI）结合基序的双特异性多肽；（右）借助LRP1介导的内吞过程，目标蛋白被转运至溶酶体并完成降解。（B）展示SPYTAC分子的功能结构基序及其对应的氨基酸序列。（C）表面等离子体共振（SPR）传感曲线显示，各类合成多肽与固定化Aβ42寡聚体及LRP1簇结构域（II、III、IV）的结合具有浓度依赖性，图中已标注以平衡解离常数（KD）表征的结合能力，其中NA代表未检测到结合活性。（D）SPR传感曲线表明，SPAβ-1与固定化的Aβ42单体、寡聚体、纤维聚集体及Aβ40均存在浓度依赖性结合，各结合体系对应的KD值已在图中明确标注。（E）下拉实验结果验证，SPAβ-1与SPAβ-m2可特异性结合5×FAD小鼠脑裂解液中的内源性Aβ，而SPAβ-m1与SPAβ-m3无该结合活性，实验结果通过MOAB-2抗体检测确认；其中输入裂解液作为阳性对照，IgG组作为阴性对照（n=3）。（F）下拉实验结果显示，SPAβ-1与SPAβ-m1可特异性结合野生型（WT）小鼠肝裂解液中的内源性LRP1，而SPAβ-m2与SPAβ-m3无该结合能力，检测过程采用抗LRP1抗体；其中输入裂解液作为阳性对照，IgG组作为阴性对照（n=3）。 所有实验数据均以平均值±标准误（SEM）表示，统计学分析采用经图基校正的单因素方差分析；P < 0.0001。 图S1（图1补充实验）：SPYTAC体外结合LRP1与Aβ的验证。 （A）SPR动力学汇总，含ka、kd、KD值，NA为未检测到数值。（B）（C）点印实验：SPAβ-1、SPAβ-m1可结合LRP1，SPAβ-1、SPAβ-m2可结合Aβ，其余无结合；BSA为阴性对照。（D）Western blot检测shRNA敲低HepG2细胞中LRP1表达（n=3）。（E）免疫荧光显示，LRP1特异性shRNA组LRP1表达降低（比例尺10μm）。（F）免疫沉淀：SPAβ-1、SPAβ-m1可结合HepG2细胞LRP1，LRP1敲低后结合消失；设对应对照。（G）免疫沉淀：各SP均未结合HepG2细胞ASGPR1、CI-M6PR；设对应对照。（H）点印实验：SPAβ-1可结合LRP1、Aβ42，SPAβ-m1仅结合LRP1，SPAβ-m2仅结合Aβ42，SPAβ-m3无结合，且SP不结合ASGPR1/2；设对应对照。（I）点印及定量：LRP1敲低后，SPAβ-1与内源性LRP1结合减弱（n=3）；设对应对照。（J）点印实验：生物素-SPAβ-1可直接结合LRP1、Aβ42，生物素-SPAβ-m3不可结合；设对应检测抗体。 所有数据以平均值±SEM表示，D、I组采用未配对双尾t检验；P < 0.0001。 为确认 SPYTAC 与细胞内源性靶点的结合特性，我们采用生物素化合成肽（生物素 - SP），对 5×FAD 小鼠的脑与肝裂解液实施了下拉实验，并通过点印迹与蛋白质印迹法进行分析。结果与 SPR 数据一致：靶向 Aβ 的 SP 分子（SPAβ-1 与 SPAβ-m2）可特异性结合脑裂解液中的内源性 Aβ；而结合 LRP1 的 SP 分子（SPAβ-1 与 SPAβ-m1）能选择性识别肝裂解液中的内源性 LRP1。其中，SPAβ-1 可高效同时结合两种靶点，展现了其卓越的双重靶向活性（见图 1E、1F、S1B 及 S1C）。为验证 SPYTAC 对 LRP1 的结合特异性，我们利用 shRNA 技术构建了 LRP1 稳定敲低的 HepG2 细胞模型（LRP1 KD），其敲低效率经免疫印迹与免疫荧光验证（见图 S1D、S1E；表 S2；方法 S1）。下拉实验证实，与野生型细胞相比，LRP1 KD 细胞中 SP 与 LRP1 的相互作用显著减弱（图 S1F）。此外，通过细胞裂解液与重组蛋白的下拉分析，我们未检测到 SP 与另外两种经典内吞受体 ——ASGPR14,17 及 CI-M6PR13—— 的结合，这进一步凸显了 SPYTAC 对 LRP1 的选择性（见图 S1G、S1H）。 共免疫沉淀（coIP）结果亦支持此结论：与野生型细胞相比，LRP1 KD 细胞中 SPAβ-1 与 LRP1 的结合水平明显降低，说明 SPAβ-1 的结合依赖于细胞内 LRP1 的表达丰度（见图 S1I）。最后，为验证 SPYTAC 介导三元复合物（SP-Aβ-LRP1）的形成能力 33，我们在含合成 Aβ 肽与重组 LRP1 簇 II 蛋白的体系中进行下拉实验。结果显示，SPAβ-1 可同时共沉淀 Aβ 与 LRP1，确证了三元复合物的形成，从而验证了 SPYTAC 的双重靶向功能（图 S1J）。 三、SPYTAC可实现蛋白质的靶向性降解 接下来，我们深入探究SPYTACs是否能够以LRP1依赖的方式，介导哺乳动物细胞对胞外蛋白的内吞依赖性降解。实验选取了LRP1呈阳性表达的细胞系（HepG2、Huh-7、SH-SY5Y、AML12、bEnd3）和LRP1阴性表达的HeLa细胞（见图S2A），同时采用LRP1稳定敲低（LRP1 KD）及LRP1基因敲除（LRP1 KO）细胞系，旨在明确该降解过程对LRP1的特异性需求。我们将各类细胞系分别与生物素化SP分子（生物素-SPAβ-1、生物素-SPAβ-m1、生物素-SPAβ-m2、生物素-SPAβ-m3）共培养，并添加荧光标记链霉亲和素（FITC-SA），通过这一手段实现SPYTACs介导的细胞摄取过程的可视化观察。共孵育10分钟后检测发现，经SPAβ-1和SPAβ-m1处理的HepG2细胞内，可观察到清晰的斑点状FITC-SA荧光信号，且该荧光信号与溶酶体示踪剂LysoTracker存在共定位现象；而经SPAβ-m2和SPAβ-m3处理的细胞，其荧光信号强度显著降低（图2A）。Huh-7、AML12、SH-SY5Y等其他LRP1阳性细胞系中，也呈现出与HepG2细胞一致的细胞摄取特征（见图S2B、S2C）。与此不同的是，在LRP1敲低（LRP1 KD）的HepG2细胞和LRP1阴性的HeLa细胞中，无论使用何种SP分子处理，均仅能检测到极其微弱的斑点状FITC-SA信号（见图2A、S2B），这一结果充分证明了该过程对LRP1的依赖性。 图2 :SPYTACs对LRP1表达细胞中胞外及膜蛋白降解的促进作用 （A）运用免疫荧光染色技术，检测HepG2、Huh-7、SH-SY5Y、AML12、bEnd.3及HeLa各细胞系中LRP1的表达情况（红色荧光标记）；细胞核采用DAPI（蓝色）进行染色，标尺设定为10微米。（B）活细胞成像检测结果表明，在37℃条件下孵育10分钟后，经生物素化SP处理的Huh-7和AML12细胞中，FITC-SA（绿色）在SPAβ-1/m1处理组的溶酶体（LysoTracker标记，红色）内出现优先富集现象，生物素化SPAβ-m2/m3处理组则未观察到该情况；在相同实验条件下，HeLa细胞对所有生物素化SP均仅呈现出背景水平的FITC-SA（绿色）信号，标尺为10微米。（C）SH-SY5Y细胞的活细胞成像结果显示，37℃孵育10分钟后，AF647-SA（黄色）与生物素化SPAβ-1/m1结合形成的复合物，会优先在溶酶体（LysoTracker标记，红色）中积累，而生物素化SPAβ-m2/m3处理组未呈现该特征，标尺为10微米。（D）采用流式细胞术对pHrodo、亲和素及红色荧光信号实施定量检测，结果显示，SH-SY5Y细胞中，生物素化SPAβ-1/m1介导的溶酶体递送效率，显著高于生物素化SPAβ-m2/m3处理组的背景水平（n=3）。（E）Huh-7和AML12细胞的活细胞成像结果表明，37℃孵育10分钟后，SPAβ-1处理组中可观察到FITC-Aβ42（绿色）在溶酶体（LysoTracker标记，红色）内的选择性积累，SPAβ-m1/m2/m3处理组则无此现象；HeLa细胞经所有SP变体处理后，均仅出现FITC-Aβ42的弥漫性分布，标尺为10微米。（F）SH-SY5Y细胞的活细胞成像检测显示，37℃孵育10分钟后，生物素化SPAβ-1和SPAβ-m1可与AF647-SA（黄色）形成复合物，并被高效转运至溶酶体（LysoTracker标记，红色），生物素化SPAβ-m2和SPAβ-m3则不具备该转运能力；且仅有生物素化SPAβ-1能够介导FITC-Aβ42（绿色）向溶酶体的递送，标尺为10微米。（G）流式细胞术检测结果表明，SH-SY5Y细胞中，生物素化SPAβ-1介导的pHrodo-Aβ42向溶酶体的递送量，显著高于生物素化SPAβ-m1/m2/m3处理组的背景摄取量（n=3）。（H）利用共聚焦显微镜观察，明确HepG2细胞及稳定表达csAβ的HeLa细胞（HepG2csAβ、HeLacsAβ），经12μM SPAβ-1、37℃处理24小时后csAβ的降解状态；细胞膜通过DiD（紫色）进行标记，细胞核经DAPI（蓝色）复染，标尺为10微米。（I）通过流式细胞术检测，分析HepG2csAβ细胞与12μM SPAβ-1或SPAβ-m3共培养后，csAβ表达水平随时间的动态变化规律（n=3）。（J）HepG2细胞的活细胞成像结果显示，表达分泌型SPAβ-1（sSPAβ-1）的细胞，可在37℃条件下、10分钟内将胞外FITC-Aβ42（绿色）高效转运至溶酶体（LysoTracker标记，红色），而表达sSPMyc-1对照的细胞不具备该功能，标尺为10微米。（K）定量分析结果表明，转染sSPAβ-1的HepG2细胞中，内化的FITC-Aβ42信号强度，显著高于转染sSPMyc-1的细胞（n=3个独立实验，每个实验选取30个细胞）。（L）HepG2细胞的活细胞成像显示，表达分泌型sSPMyc-1或sSPAβ-1的细胞，经1μM Cy5-抗Myc-Tag抗体37℃孵育10分钟后，荧光分布的具体情况，标尺为10微米。（M）定量分析结果显示，表达sSPMyc-1的HepG2细胞中，内吞的Cy5-抗Myc-Tag抗体信号强度，显著高于表达sSPAβ-1的细胞（n=3个独立实验，每个实验选取30个细胞）。 图S2、SPYTAC介导LRP1依赖的内吞作用和降解 （A）将野生型HepG2细胞与LRP1敲低（LRP1 KD）HepG2细胞，置于37℃环境中，与1μM FITC-SA及12μM生物素化SP共同孵育10分钟，所得活细胞成像图像如下，标尺设定为10微米。（B）采用流式细胞术检测方法，对经生物素化SP处理后的野生型（WT）HepG2细胞和LRP1敲低（LRP1 KD）HepG2细胞，开展内化pHrodo亲和素红色荧光信号的定量分析，实验重复3次（n=3）。（C）将野生型HepG2细胞与LRP1敲低（LRP1 KD）HepG2细胞，在37℃条件下，与1μM FITC-Aβ42、1μM AF647-SA及12μM生物素化SP共同孵育10分钟，获取活细胞成像结果，标尺为10微米。（D）运用流式细胞术，对经生物素化SP处理的野生型（WT）HepG2细胞与LRP1敲低（LRP1 KD）HepG2细胞，进行内化pHrodo-Aβ42红色荧光信号的定量检测，实验重复3次（n=3）。（E、F）（E）HepG2细胞与SPMyc-1或SPMyc-m1在37℃条件下共孵育10分钟后，内吞的Cy5-抗Myc-标签抗体的活细胞成像结果；（F）对上述荧光信号进行定量分析所得数据（共开展3个独立实验，每个实验选取30个细胞），标尺为10微米。（G）HepG2细胞经不同抑制剂处理后，采用流式细胞术对其内化生物素化SPAβ-1/pHrodo亲和素红色荧光信号进行定量分析，实验重复3次（n=3）。 为实现对SPYTACs诱导胞吞过程的精准量化，我们采用pHrodo Red标记的链霉亲和素（pHrodo Red Avidin）对生物素化SP进行标记示踪。该荧光染料的核心特性在于，其荧光强度会在内体与溶酶体的酸性微环境中发生急剧提升，进而为特异性胞吞过程提供了精准可靠的量化指标34,35。活细胞流式细胞术检测结果明确显示，在HepG2和SH-SY5Y两种细胞中，SPAβ-1与SPAβ-m1处理组均表现出高效的pHrodo荧光信号摄取能力，而SPAβ-m2与SPAβ-m3处理组仅能检测到微弱的背景荧光信号（图2B、S2D）。尤为关键的是，在LRP1敲低（LRP1 KD）的HepG2细胞中，该荧光信号出现显著下降（图2B），这一结果直接印证了SPYTACs对胞吞过程的介导作用高度依赖于LRP1的表达水平。 随后，我们将研究重点转向可溶性Aβ42肽的细胞摄取特性探究。实验中，我们将HepG2、Huh-7、AML12、SH-SY5Y等LRP1阳性细胞系，分别与FITC标记的Aβ42（FITC-Aβ42）及不同类型的生物素化SP进行共孵育处理。活细胞荧光显微镜观察结果清晰表明，仅有SPAβ-1处理组能够显著促进FITC-Aβ42在细胞内的积累，且其荧光信号与溶酶体示踪剂LysoTracker呈现出高度共定位特征；与之相反，在LRP1敲低（LRP1 KD）的HepG2细胞及LRP1阴性的HeLa细胞中，无论采用何种SP变体处理，FITC-Aβ42信号始终维持在背景水平（图2C、S2E、S2F）。为进一步验证上述结论的可靠性，我们采用pHrodo Red荧光标记的Aβ42（pHrodo-Aβ42 Red）开展流式细胞术定量分析，结果再次确认，SPAβ-1可高效介导LRP1阳性细胞对Aβ42的摄取，而该摄取过程在LRP1敲低细胞中会显著减弱（图2D、S2G）。这一系列实验证据充分证明，SPYTACs介导的可溶性Aβ42肽胞吞过程对LRP1具有严格的依赖性。 为直观观察SPYTACs介导的Aβ降解过程，我们成功构建了可稳定表达细胞表面结合型Aβ42（csAβ）的HepG2csAβ和HeLacsAβ细胞系（方法S1；STAR方法）。共聚焦显微镜与流式细胞术的动态监测结果显示，经SPAβ-1处理后，细胞膜表面的csAβ荧光信号会随时间推移逐渐减弱直至消失，在处理24小时后，HepG2csAβ细胞中csAβ的表达水平下降约50%（图S2H、S2I）。 SPYTACs的模块化结构设计使其具备极高的可编程性，进而拥有降解多种致病蛋白的潜在应用价值。为验证这一设计理念的可行性，我们通过将Aβ结合基序替换为Myc标签序列，成功将SPYTACs的靶向特异性从Aβ重新导向至Myc标签抗体（表S1）。实验结果显示，在HepG2细胞中，Cy5标记的抗Myc标签抗体可被SPMyc-m1高效靶向，并转运至溶酶体中完成降解，这一过程可通过Cy5荧光信号与LysoTracker的共定位现象得到直观验证（图2E、2F）。此外，为证实SPYTACs的遗传编码特性，我们构建了分泌型SP的表达载体，并将其转染至HepG2细胞中（方法S1；STAR方法）。检测结果表明，细胞分泌的SPAβ-1能够选择性降解胞外环境中的Aβ42及Myc标签抗体（图S2J-S2M）。综合上述所有实验结果，我们确立了SPYTACs作为一种多功能、可编程且可遗传编码的技术平台，其能够驱动多种胞外蛋白通过受体特异性途径实现细胞内化及靶向溶酶体降解。 在明确SPYTACs可在多种细胞系中介导胞吞作用后，我们进一步深入探究了其内在的分子机制。实验中，我们采用受体相关蛋白1（RAP）——一种已被证实的LRP1拮抗剂36,37——进行竞争抑制处理，结果显示SPAβ-1的细胞摄取效率被显著抑制（图2G、S3A），这与SPYTACs通过LRP1途径介导胞吞的结论高度吻合。为进一步明确具体的胞吞途径，我们使用多种抑制剂处理细胞，以阻断网格蛋白介导的胞吞（CME）途径，所采用的抑制剂包括蔗糖17,38、甲基-β-环糊精（MβCD）39以及Pitstop 240。实验结果表明，所有抑制剂处理均能显著抑制生物素-SPAβ-1/pHrodo Avidin Red的细胞内化过程（图2G、S3A），这一发现明确揭示，SPYTACs进入细胞的过程是通过经典的LRP1/网格蛋白介导的胞吞通路完成的。 图S3  SPYTAC对LRP1介导的胞外蛋白溶酶体降解过程的促进效应 A、运用流式细胞术检测手段，对C8-D1A、N2A、BV2和U251四种细胞系，在经不同抑制剂处理后，其对生物素化SPAβ的摄取水平进行定量检测（实验重复3次，n=3）。B、展示SPYTAC靶向蛋白降解途径的模式图，该模式图所对应的实验结果相对量化数据，可参考本图（A）及图2E。 所有实验所得数据均以平均值±标准误（SEM）呈现；统计学分析方法为：A组实验采用单因素方差分析结合图基校正；其中P < 0.0001。 四、SPYTACs可实现外周靶向蛋白质降解 在利用小鼠模型评估SPYTACs介导的靶向蛋白降解（TPD）效果之前，我们首先对其体内生物分布特征及生物稳定性进行了系统分析。近红外成像技术检测结果显示45，经静脉注射的生物素-SPAβ-1/Cy5.5-SA复合物主要在肝脏部位富集，而单独给予Cy5.5-SA处理则未出现这一富集现象（见图S4A–S4C）。 此外，与SPAβ-m3/Cy5.5-Aβ42处理组或单独Cy5.5-Aβ42处理组相比，SPAβ-1/Cy5.5-Aβ42处理组能够更高效、更具靶向性地将Aβ输送至肝脏（图3A、图3B）。同时，大脑部位的荧光信号显示，SPAβ-1在脑内的积累量显著高于突变型对照SP（SPAβ-m3）（图3A、图3B），这一结果与LRP1在介导受体依赖性跨胞转运过程中已被证实的功能相一致。 图 S4  SPYTACs 在体内对肝脏蛋白的靶向作用（作为图 3 的补充实验说明） (A)以示意图形式呈现用于检测小鼠体内 SPYTAC 生物分布的实验操作流程，清晰展示整个实验的实施步骤。（B、C）在 SPYTAC 注射 15 分钟后，采用近红外成像技术观察各器官中 Cy5.5 标记链霉亲和素（Cy5.5-SA）的分布情况（B），并通过定量分析明确其在各器官中的富集水平（C），实验选用 3 只小鼠作为样本（n=3）。（D）SPYTAC 处理后，通过共聚焦显微镜观察到 EGFP 小鼠各器官中 Cy5.5-SA 信号（红色）的分布特征，细胞核经 DAPI（蓝色）染色标记，标尺为 800 微米。（E）展示 SPYTAC 处理后 EGFP 小鼠体内 Cy5.5 标记信号（红色）与溶酶体示踪信号的共定位情况，呈斑点状的 Cy5.5 信号以白色箭头标注，标尺为 20 微米。 图 3  SPYTACs 在体内通过劫持肝脏实现胞外靶向蛋白降解（eTPD） （A）  将 Cy5.5 标记的 Aβ₄₂（Cy5.5-Aβ₄₂）与 SPAβ-1 或 SPAβ-m3 共同注射后，采用近红外成像技术观察其在小鼠各器官中的分布情况。（B）  对（A）中各器官内 Cy5.5-Aβ₄₂的荧光强度进行定量分析，结果显示肝脏和脑内的荧光信号显著高于其他器官（n=3 只小鼠）。（C）  选取 3 只 EGFP 小鼠，通过体内共聚焦成像技术，观察生物素化 SPAβ-1（Cy5-SA 标记）在肝脏中的亚细胞定位，可见其与溶酶体标记物（Lamp1，白色）存在共定位。（D）  对 HepG2 细胞中 SPAβ-1 介导的 Aβ₄₂内吞过程进行动态追踪，发现其在 15 分钟时即可检测到明显的 Aβ₄₂内吞信号，且信号强度随时间延长而逐渐增强。（E）  采用流式细胞术对 HepG2 细胞内 Aβ₄₂的内吞效率进行定量分析，结果显示 SPAβ-1 组的内吞效率显著高于 SPAβ-m3 组（n=3）。（F）  对 HepG2 细胞中 SPAβ-1 介导的 Aβ₄₂降解过程进行追踪，发现 24 小时内 Aβ₄₂的降解率可达 50% 以上（n=3）。 为探究 SPYTAC 分子在生物体内的组织分布规律，研究人员向表达 GFP 的小鼠体内分别注射生物素 - SPAβ-1/Cy5.5-SA 及生物素 - SPAβ-m3/Cy5.5-SA 复合物，并对离体新鲜脏器开展显微成像观测。成像结果显示，SPAβ-1 主要集中在肝脏组织，同时在肾脏与脑部也可检测到相应分布（图 S4D）。通过活体激光共聚焦显微镜对肝脏组织进行观察发现，在 Aβ 模型小鼠体内，SPAβ-1 介导的荧光信号主要定位于肝细胞内部，而 SPAβ-m3 产生的信号则主要分布在细胞间隙（图 3C）。对肾脏组织的进一步检测表明，生物素 - SPAβ-1/Cy5.5-SA 的荧光信号大多滞留于血管内部（图 S4E）。 为解析 SPYTAC 介导 Aβ 在细胞内的转运机制，本研究向野生型小鼠给予 FITC-Aβ42，同时设置联用与不联用生物素化 SPYTACs 的对照，利用共聚焦显微镜对新鲜肝组织切片进行成像分析。结果显示，仅 SPAβ-1 能够显著提升 FITC-Aβ42 的荧光强度，并与溶酶体标志物 LAMP1（溶酶体相关膜蛋白 1）呈现明显共定位，SPAβ-m3 则无此作用（图 3D、3E），证明 SPAβ-1 可有效介导 Aβ 向溶酶体转运。实验中观察到的 Aβ 快速向溶酶体转运的现象，与既往相关研究结果一致。综合上述结果表明，SPYTACs 可在体内促进肝脏对 Aβ 的高效摄取，并通过溶酶体途径实现对 Aβ 的降解清除。 天然未修饰多肽在体内易被机体快速代谢清除，导致其有效治疗窗口显著缩短。为评价 SPYTAC 分子的稳定性，本研究采用液相色谱 - 串联质谱技术（LC-MS/MS）分别检测 SPAβ-1 在体内外的半衰期（t₁/₂）。体外孵育实验显示，SPAβ-1 在大鼠新鲜血浆及脑脊液中具备中等稳定性，其中血浆中 t₁/₂约 331 分钟，脑脊液中 t₁/₂约 265 分钟，而在肝脏及脑组织匀浆中因蛋白水解作用被快速降解（表 S3）。在大鼠与小鼠体内进行全身给药后，SPAβ-1 在血浆与脑脊液中均被快速清除，半衰期仅为数分钟级别（表 S3），提示吸收、分布、代谢及排泄等多重生理过程共同加快了该多肽在体内的清除速率。 五、SPYTACs 可使脑内细胞外蛋白的降解 为明确SPYTACs的体内分布，向表达GFP的小鼠注射生物素-SPAβ-1/Cy5.5-SA或生物素-SPAβ-m3/Cy5.5-SA，对新鲜器官显微成像显示，SPAβ-1主要富集于肝脏，同时分布于肾脏和大脑（图S4D）。活体肝组织观察表明，Aβ小鼠中SPAβ-1介导的信号定位于肝细胞内，而SPAβ-m3信号分布于细胞间隙（图3C）；肾脏中生物素-SPAβ-1/Cy5.5-SA的荧光信号主要滞留于血管内（图S4E）。 为探究SPYTAC介导Aβ的细胞内转运，向WT小鼠给予FITC-Aβ42（联用或不联用生物素化SPYTACs），共聚焦显微镜分析新鲜肝脏切片显示，SPAβ-1可显著增强FITC-Aβ42荧光信号，并与溶酶体标志物LAMP1（溶酶体相关膜蛋白1）高度共定位，SPAβ-m3无此效应（图3D、3E），证实SPAβ-1驱动Aβ向溶酶体转运，此快速转运现象与既往报道一致。综上，SPYTACs可促进肝脏对Aβ的高效摄取及溶酶体降解。 为评估SPYTACs的稳定性，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定SPAβ-1的体内外半衰期（t₁/₂）。体外实验显示，SPAβ-1在新鲜分离的大鼠血浆（t₁/₂≈331分钟）和脑脊液（t₁/₂≈265分钟）中具中等稳定性，在肝、脑组织匀浆中因蛋白水解作用快速清除（表S3）；体内全身给药后，SPAβ-1在大鼠和小鼠的血浆、脑脊液中快速清除，半衰期仅为数分钟（表S3），提示吸收、分布、代谢及排泄等复杂生理过程加速其体内清除。 SPYTACs可穿透血脑屏障并促进脑内细胞外蛋白降解，这是其直接靶向降解脑内Aβ的关键。本研究设计的SPYTAC含选择性靶向LRP1的肽基序（图1A、1B），该受体表达于脑内皮细胞，已知可介导受体依赖性跨血脑屏障转运；前期生物分布研究已在大脑检测到SPYTAC的荧光信号（图3A、3B），提示其具备BBB通透性。 进一步体内实验显示，5×FAD小鼠经生物素-SPAβ-1或生物素-SPAβ-m3处理后，脑组织切片高分辨率共聚焦成像显示，生物素-SPAβ-1处理组可观察到明显Cy5.5-SA荧光信号，且与Aβ沉积物部分共定位（图4A、4B）；与FITC-SPAβ-m3相比，FITC-SPAβ-1处理显著提升脑内Aβ与溶酶体的共定位水平（图4C、4D）。WT小鼠腹腔注射FITC-SPYTAC/HF555-Aβ42后，FITC-SPAβ-1/HF555-Aβ42组脑内溶酶体中信号显著强于FITC-SPAβ-m3/HF555-Aβ42组（图4C、S5A）；细胞定位显示，FITC-SPAβ-1信号存在于小胶质细胞、星形胶质细胞及神经元内（图S5B），证实SPYTAC可穿透BBB并促进脑内靶蛋白降解。 图4.SPYTACs穿过BBB，促进大脑Aβ降解 （A）（左侧）全脑荧光成像结果显示，与生物素-SPAβ-m3处理的5×FAD小鼠相比，生物素-SPAβ-1处理组小鼠脑部呈现出更强的Cy3-SA（红色）荧光信号。比例尺为500微米。（右侧）高倍共聚焦图像显示，在5×FAD小鼠大脑中，生物素-SPAβ-1可在Aβ斑块（MOAB-2标记，绿色）周围富集，而生物素-SPAβ-m3（Cy3-SA标记，红色）仅表现出模糊的背景荧光。图中CTX代表皮层，CC代表胼胝体，HIP代表海马体，比例尺为20微米。（B）对SPYTAC与Aβ的共定位比例进行定量分析（每组n=3只小鼠）。（C）代表性图像显示，FITC-SPAβ-1（绿色）可与Aβ（MOAB-2标记，红色）及溶酶体（Lamp1标记，白色）共定位，而FITC-SPAβ-m3无此共定位现象；该结果分别在SPYTAC处理的5×FAD小鼠脑切片，以及经FITC-SPYTAC与Cy3-Aβ共同处理的WT小鼠脑切片中得到验证。比例尺为3微米。（D）对5×FAD小鼠脑部注射SPYTAC后，Lamp1阳性溶酶体中SPYTAC信号强度进行定量分析（n=4只小鼠）。（E）在小鼠脑内皮细胞（bEnd.3细胞）中，采用生物素-SPYTAC处理后加入pHrodo Avidin Red（10 μg/mL），通过流式细胞术检测细胞胞吞作用水平。（F）基于（E）中的实验，通过流式细胞术测定不同时间点的平均荧光强度（MFI），实验重复3次（n=3）。（G）（上层）体外血脑屏障（BBB）模型示意图，该模型顶端接种bEnd.3细胞、基底侧接种U251细胞，图示为SPYTAC从顶端腔室向基底侧运输并被U251细胞摄取的过程。（下层）活细胞成像显示，SPYTAC介导U251细胞摄取FITC-SA，且FITC-SA定位于溶酶体（LysoTracker标记，红色）。比例尺为10微米。（H）（上层）分别用生物素-SPAβ-1和生物素-SPAβ-m3处理体外BBB模型的示意图，图示为pHrodo Avidin Red向U251细胞靶向递送并发生溶酶体降解的过程。（下层）通过流式细胞术测定平均荧光强度（MFI），实验重复3次（n=3）。（I）（上层）分别用SPAβ-1和SPAβ-m3处理体外BBB模型的示意图，图示为pHrodo Avidin Red/生物素-Aβ42向U251细胞靶向递送并发生溶酶体降解的过程。（下层）通过流式细胞术测定平均荧光强度（MFI），实验重复3次（n=3）。（J）（上层）示意图显示，生物素-SPYTAC通过LRP1受体穿越血脑屏障，并将pHrodo Avidin Red递送至U251细胞。（下层）流式细胞术定量结果显示，LRP1敲低（KD）的bEnd.3细胞中，SPYTAC的转胞作用显著减少（n=3）。（K和L）（上层）示意图显示，生物素-SPYTAC穿越血脑屏障后，通过LRP1受体被U251细胞内吞。（下层）流式细胞术分析结果显示，在LRP1敲低（KD）的U251细胞（K）和LRP1敲除（KO）的U251细胞（L）中，SPYTAC的内吞作用均显著减少（n=3）。 （A）免疫荧光染色检测表明，将SPYTAC与Aβ联合腹腔注射后，SPAβ-1能够成功将Cy3标记的Aβ（红色荧光）转运至小鼠脑组织内的Lamp1阳性溶酶体（白色荧光）中，SPAβ-m3则未表现出该种Aβ递送能力。比例尺为10微米。（B）观察FITC标记SPβ-1/m3（绿色荧光）在小鼠大脑不同细胞中的亚细胞定位情况，涵盖小胶质细胞（Iba1标记，白色荧光）、星形胶质细胞（GFAP标记，白色荧光）和神经元（NeuN标记，白色荧光）；溶酶体通过LAMP1进行标记（红色荧光），细胞核利用DAPI染色（蓝色荧光）。比例尺为5微米。（C–F）检测生物素标记SP对FITC标记链霉亲和素（FITC-SA）在U251（C）、C8-D1A（D）、BV2（E）及N2A（F）四种细胞内吞过程的介导作用。采用活细胞成像技术观察，四种细胞均在37°C条件下，经12微米生物素-SP与1微米FITC-SA共同孵育10分钟，之后用LysoTracker（红色荧光）对溶酶体进行染色标记。比例尺为10微米。（G–J）对U251（G）、C8-D1A（H）、BV2（I）和N2A（J）细胞的平均荧光强度（MFI）进行定量分析。将细胞置于37°C环境中，与生物素-SP和pHrodo Red Avidin共孵育30分钟后，运用流式细胞术测定各细胞的MFI值（n=3）。（K）（上）图示为体外跨孔BBB模型的构建方式，bEnd.3细胞接种于模型顶端腔室，U251细胞接种于基底外侧腔室；（下）展示透孔系统中bEnd.3细胞的典型显微成像图，以及跨上皮电阻（TEER）的检测数据（n=3）。（L）（上）通过免疫荧光染色观察野生型（WT）和LRP1敲低（LRP1KD）bEnd.3细胞中LRP1的表达分布；（下）检测SPYTAC介导的生物素-SPβ-1/pHrodo Red Avidin在WT与LRP1KDbEnd.3细胞中的摄取效率，以MFI值进行量化，检测方法为流式细胞术（n=3）。（M）（上）采用免疫荧光染色法观察野生型（WT）、LRP1敲低（LRP1KD）及LRP1敲除（LRP1KO）U251细胞中LRP1的表达情况；（下）分析SPYTAC介导的生物素-SPβ-1/pHrodo Red Avidin在上述三种U251细胞中的摄取水平，以MFI值量化，采用流式细胞术检测（n=3）。 六、小鼠模型中 SPYTAC 的治疗效果 接下来，我们进一步探究了SPYTAC在5月龄（前驱期）5×FAD小鼠体内的治疗效能。结合药物动力学实验结果可知，SPYTAC在体内存在快速系统清除的特性（具体数据参见表S3），据此我们设计了高频给药方案：对实验小鼠实施腹腔注射SPAβ-1，给药剂量为20 mg/kg，连续给药30天，以此构建5×FADSP实验组。同时设立两个对照体系：接受lecanemab治疗的5×FAD小鼠作为阳性对照（5×FAD勒卡姆组），以及接受载体免疫球蛋白G1（IgG1）处理的5×FAD小鼠作为阴性对照（5×FADVeh组），详细实验操作流程参照STAR方法。 实验检测结果表明，经SPYTAC处理后，小鼠血浆中总Aβ水平较5×FADVeh对照组显著下降，降幅达50%左右；与5×FAD勒卡姆阳性对照组相比，SPYTAC处理组的血浆Aβ水平同样呈现下降趋势，该降幅虽较为温和，但具有明确的统计学显著性（图5A）。这些实验数据进一步提示，SPYTAC介导的Aβ清除作用，可能为揭示阿尔茨海默病的发病机制提供新的研究方向和实验支撑。 图 5. SPYTAC 处理能够改善前驱期 5×FAD 小鼠的 AD 病理表现 （A）经SPYTAC或lecanemab处理后，5×FAD小鼠血浆中Aβ42的表达水平检测结果（n=4只小鼠/组）。（B和C）（B）5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠脑组织的代表性Thio-S染色图像；（C）上述三组小鼠大脑内Aβ斑块的数量与面积定量分析结果（每组n=5只小鼠）。比例尺：左侧图像为500微米，右侧图像为250微米。（D）采用DEA法与甲酸提取法对小鼠脑匀浆进行处理后的相关检测结果（n=6只小鼠/组）。（E）对每组小鼠脑内不同类型Aβ斑块的比例进行定量统计（n=5只小鼠/组，每只小鼠分析100个斑块）。（F）经不同处理的野生型（WT）及5×FAD小鼠海马体切片的代表性免疫荧光图像，其中神经元以NeuN标记（红色荧光），Aβ斑块以MOAB-2标记（绿色荧光）。比例尺为200微米。（G）对各组小鼠海马体细胞层厚度的定量分析结果（n=3只小鼠，每只小鼠检测6张切片）。（H和I）莫里斯水迷宫实验结果显示，5×FADSP组小鼠的平台定位潜伏期显著缩短（H），目标象限穿越次数明显增加（I），而小鼠的游动速度未发生显著变化（每组n=9-11只小鼠）。（J）实验第6天探针测试中，各组小鼠的代表性运动轨迹图像。（K和L）（K）新物体识别（NOR）实验中各组小鼠的代表性运动轨迹追踪图像；（L）各组小鼠用于探索熟悉物体与新颖物体的时间占比定量分析结果（每组n=9-11只小鼠）。 我们采用硫黄素-S（Thio-S）染色与抗β淀粉样蛋白抗体（MOAB-2）染色相结合的方法，对Aβ斑块进行系统分析，结果发现，5×FADSP小鼠海马体（HIP）和大脑皮层（CTX）区域内Aβ斑块的数量与面积均出现显著下降，平均减少幅度超过40%（相关结果详见图5B、5C、S6A及S6B）。 值得关注的是，5×FADSP小鼠脑内二乙胺（DEA）可溶性和甲酸可溶性两种Aβ组分均发生显著降低；而在5×FAD勒卡姆组小鼠中，仅DEA提取的Aβ40出现下降趋势（图5D）。上述实验结果提示，在本次检测体系中，SPYTAC去除Aβ负荷的能力略优于lecanemab（具体数据参见图5A–5D、S6A及S6B）。 在补充开展的体外实验中（相关文献参考63,64,65），SPYTAC可有效促进多种脑细胞类型（包括小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元及内皮细胞）对Aβ的摄取与清除，这与lecanemab主要偏向于小胶质细胞摄取Aβ的特点形成明显差异（见图S6C–S6F）。 图S6：SPYTAC对早期5×FAD小鼠的有效治疗作用（相关结果参见图5） （A）采用MOAB-2抗体染色后，5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠脑组织的代表性共聚焦成像图（n=5只小鼠/组）。比例尺为800微米。（B）对上述三组小鼠脑内Aβ斑块的数量及面积进行定量分析，每组实验样本量为4只小鼠。（C）小鼠原代小胶质细胞、神经元、人类星形胶质细胞及人类脑微血管内皮细胞，经PBS、lecanemab或SPβ-1处理后，摄取HF555标记Aβ42的代表性共聚焦图像。比例尺为20微米。（D）对（C）中各组细胞摄取HF555-Aβ42的水平进行相对定量分析，每组统计22个细胞。（E）细胞与Aβ42共孵育3小时后，检测各组细胞培养上清液中残余Aβ42的含量。分别采用PBS、lecanemab或SPβ-1处理细胞，孵育结束后收集培养上清液，通过ELISA法进行检测（每组6个重复样本）。（F）细胞经Aβ42处理后继续培养3小时；培养结束后，一部分细胞直接收集用于ELISA分析（记为t=0时相），另一部分细胞经洗涤后转移至无Aβ培养基中继续孵育3小时，再进行ELISA分析（记为t=3小时时相）。实验结果显示，与未处理组相比，经lecanemab或SPβ-1处理后，小胶质细胞对Aβ42的摄取水平显著升高；而星形胶质细胞、神经元及内皮细胞仅在SPβ-1处理后，Aβ42摄取水平出现明显升高（每组6个重复样本）。 通过组织病理学检测发现，5×FAD小鼠接受SPYTACs或lecanemab干预后，其脑组织内Aβ斑块的形态特征与干预前存在明显差异。基于这一发现，我们对各实验组小鼠脑内Aβ斑块的形态类型进行了分类界定：其中，5×FADVeh组小鼠脑内观察到的典型Aβ斑块形态被划定为I型，5×FAD勒卡姆组与5×FADSP组小鼠脑内出现的形态异常斑块，则分别被命名为II型和III型（相关图示及实验方法详见图S7A、方法S1）。 检测数据表明，两种干预方案均能显著降低脑内I型斑块的比例（图5E）。进一步分析显示，相较于5×FADVeh组小鼠，5×FADSP组小鼠的神经元退化现象得到明显缓解（图5F、5G及S7B–S7E），同时树突棘密度维持在正常水平（图S7F及S7G），这一结果充分说明SPYTAC对小鼠神经组织损伤及突触损伤具有显著的保护作用。 综合以上实验结果可以得出，SPYTAC治疗能够通过特异性清除具有致病活性的Aβ，有效阻止Aβ在小鼠大脑组织内的异常蓄积。 图S7.早期5×FAD小鼠SPYTAC有效治疗 （A）三种不同形态类型Aβ斑块的典型显微成像图，比例尺为6微米。（B和C）（B）野生型（WT）、5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠大脑皮层神经元的代表性NeuN染色图像；（C）上述各组小鼠大脑皮层神经元死亡情况的定量分析结果（每组n=4只小鼠）。比例尺为50微米。（D和E）（D）Western blot（蛋白质印迹）检测结果，展示经不同处理后，WT组与5×FAD组小鼠海马体中NeuN、MAP2、Vglut1及突触体蛋白（Syp）的表达水平；（E）对上述四种蛋白表达水平的定量分析结果（每组n=3只小鼠）。（F和G）（F）采用高尔基染色法对各组小鼠海马体树突棘数量进行染色的代表性图像；（G）基于高尔基染色结果的海马体树突棘数量定量分析（n=3只小鼠）。比例尺：左侧图像为200微米，右侧图像为10微米。（H和I）旷场实验检测结果显示，三组小鼠的移动速度无明显组间差异（每组n=8-11只小鼠）。 七、SPYTAC 可降低 Aβ 抗体所产生的副作用 已有研究证实，抗Aβ免疫治疗可能会提高脑血管淀粉样变性（CAA）、微出血以及炎症反应的发生风险（相关文献参考11,26,66,67,68,69）。在本研究中，通过Thio-S与CD31共染色检测发现，约20%的5×FAD勒卡姆组小鼠出现了血管周围Aβ蓄积现象（图6A），这与以往研究中关于抗体治疗可能加剧CAA发生的报道结论相一致（文献69）。 与之形成鲜明对比的是，5×FADSP组小鼠仅表现出与血管相关的背景水平Aβ沉积，其蓄积程度与5×FADVeh组小鼠基本相当（图6A）。为进一步评估CAA相关的微出血风险，我们采用向8月龄5×FAD小鼠侧脑室注射APP/PS1小鼠脑匀浆的方法，诱导CAA模型的建立（图6B）。待CAA诱导成功后（具体验证结果见图S8A），将5×FAD小鼠随机分为三组，分别腹腔注射SPβ-1、lecanemab或IgG，每日给药一次，持续治疗1个月（图6B；详细实验流程参见STAR方法）。 采用Perl普鲁士蓝染色法，通过检测大脑皮层和海马体区域的含铁血黄素沉积情况，对各组小鼠的微出血程度进行评估。实验结果显示，SPYTAC治疗组小鼠的背景微出血水平与对照组无明显差异，而lecanemab治疗组小鼠的微出血发生率则显著升高（图6C）。以上研究结果表明，SPYTAC能够有效规避传统抗Aβ抗体治疗所伴随的CAA发生及微出血风险。 图6.SPYTAC为5FAD小鼠提供安全的治疗 （A）经不同处理的5×FAD小鼠脑内CAA（Thio-S/CD31阳性）的典型成像图（左侧）及定量分析结果（右侧），每组实验样本量为5只小鼠。比例尺为20微米。（B）图示为8月龄5×FAD小鼠脑血管淀粉样变性（CAA）的诱导流程，以及诱导后腹腔给药治疗的具体方案示意图。（C）（左侧）经治疗处理的CAA诱导型5×FAD小鼠脑内普鲁士蓝染色的代表性共聚焦图像（黑色箭头指示阳性信号）；（右侧）各组小鼠微出血发生频率的定量统计结果，每组n=5只小鼠。比例尺为200微米。（D）经不同治疗处理后，5×FAD小鼠脑组织中促炎蛋白的表达水平检测结果（n=5只小鼠/组）。（E）不同处理组小鼠海马体中促炎基因表达情况的点图，图中点的大小对应基因表达阳性细胞的百分比，颜色深浅对应标准化后的平均表达水平。（F）小提琴图展示不同处理组小鼠海马体中Tnf和Il6基因的mRNA表达水平。（G）对参与炎症相关NF-κB信号通路及炎症小体信号通路的基因表达量进行标准化处理，分别展示其在全小胶质细胞、稳态小胶质细胞、1期疾病相关小胶质细胞（DAM-1）及DAM-2中的表达情况；点的大小代表基因表达细胞的百分比，颜色代表标准化后的平均表达水平。（H）不同处理组小鼠小胶质细胞中差异表达基因（DEGs）的热图，该基因集可识别出一种具有疾病保护作用的小胶质细胞状态（每组n=3只小鼠）。（I）点图展示不同处理组小鼠海马体中DAA基因的比例表达水平，点的大小对应基因表达细胞的百分比，颜色对应标准化后的平均表达水平。（J）不同处理组小鼠星形胶质细胞中差异表达基因（DEGs）的热图，该基因集可识别出一种具有疾病保护作用的星形胶质细胞状态（每组n=3只小鼠；P<0.05）。 图S8.SPYTAC治疗5×FAD小鼠的安全性 （A）（左侧）代表性共聚焦图像，展示9月龄假对照组与CAA诱导型5×FAD小鼠脑组织中的CAA阳性区域（Thio-S/CD31双阳性，红色箭头标注），比例尺为20微米；（右侧）条形图定量分析假对照组与CAA诱导型5×FAD小鼠脑内CAA区域的分布情况，每组纳入5只小鼠。（B）（左侧）典型共聚焦图像，呈现5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠脑组织内小胶质细胞（Iba1标记，红色荧光）的异常激活状态，比例尺为20微米；（右侧）定量分析不同处理后5×FAD小鼠小胶质细胞胞体的缩小程度，结果以任意单位（a.u.）表示，每组n=5只小鼠。（C）统一流形近似与投影（UMAP）分析图谱，清晰呈现5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠海马体中脑细胞的整体聚类特征及各细胞类型的注释结果。（D）以特征基因集为参照，绘制15个不同细胞聚类的基因表达热图，明确各细胞聚类的基因表达差异特征。（E）（上方）甜甜圈图，直观展示5×FAD小鼠海马体中各脑细胞总聚类的分布频率；（下方）条形图，对比5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠海马体中所有细胞聚类的相对分布比例。（F）点图呈现不同处理组小鼠海马体中，参与炎症小体信号传导及程序性细胞死亡相关基因的表达情况，其中点的大小反映基因表达阳性细胞的百分比，颜色代表标准化后的平均表达水平。（G）小胶质细胞单独UMAP聚类图谱，展示不同处理组小鼠体内炎症调节因子（Nfkb2和Fos）的标准化表达水平及分布特征。（H）对参与炎症细胞因子与趋化因子信号传导通路的基因表达量进行标准化处理，通过点图呈现其在各处理组中的表达差异，点的大小对应基因表达细胞的占比，颜色对应标准化后的平均表达水平。（I）热图展示5×FADVeh组、5×FAD勒卡姆组及5×FADSP组小鼠海马体中小胶质细胞的差异表达基因（DEGs），该基因集可有效识别出具有炎症表型的小胶质细胞状态（每组n=3只小鼠；P<0.05）。（J）热图呈现从5×FADSP组与5×FAD勒卡姆组小鼠中分离的小胶质细胞差异表达基因（DEGs），该基因集能够识别出具有疾病保护功能的小胶质细胞状态（每组n=3只小鼠；P<0.05）。（K）（上方）点图展示不同处理组星形胶质细胞中参与炎症反应相关基因的比例表达特征，点的大小反映基因表达细胞的百分比，颜色代表标准化后的平均表达水平；（下方）火山图呈现从5×FADSP组与5×FAD勒卡姆组小鼠中分离的星形胶质细胞差异表达基因（DEGs），筛选条件为|log2倍变化| > 0.25且P<0.05。 抗体治疗中，Fc受体（FcR）介导的促炎反应及非特异性免疫激活是主要担忧[10,26]。我们对比评估了SPYTAC与lecanemab在5×FAD小鼠模型中的作用，发现SPYTAC处理组小鼠脑内Iba1标记的小胶质细胞激活水平、TNF及IL-6等炎症细胞因子水平均显著低于lecanemab组（图6D、S8B），且神经元损伤、突触丢失程度更轻（图5G、S7C、S7G）。 为明确二者对炎症调控的差异，我们对小鼠海马组织进行scRNA-seq分析（16,943个有效单细胞），识别出15个细胞类群[71,72]。结果显示，SPYTAC组炎症相关细胞因子（Tnf、Il6）、趋化因子（Ccl9、Cxcl16）及NF-κB信号激活因子（Nfkb2等）的表达显著下调，还可上调NF-κB负调控因子Nfkbia，抑制炎症小体及程序性细胞死亡相关通路（图6E、6F、S8F）。 聚焦小胶质细胞（聚类0、2、3）和星形胶质细胞（聚类9）发现[73-77]，SPYTAC可抑制NF-κB、AP-1介导的炎症反应，减少炎症小体成分（Casp-8、Casp-1）及炎症因子表达，同时增强小胶质细胞疾病保护表型相关基因表达[78-82]；而lecanemab组则呈现相反趋势，且星形胶质细胞中疾病相关基因及炎症因子表达显著升高（图6G、6I、S8G-S8L）。 综上，SPYTAC可有效抑制神经炎症，促进小胶质细胞、星形胶质细胞向保护表型转化，相较于传统抗体治疗，能显著降低神经炎症及神经毒性副作用，安全性更具优势。 八、SPYTAC可有效改善AD症状期的病理异常 随后，我们就SPYTAC在AD症状期的治疗效果展开了系统评估。在9月龄的5×FAD小鼠模型中，通过连续1个月每日给予SPYTAC干预后，小鼠大脑内Aβ蛋白水平得到显著降低（见图7A）。进一步检测分析表明，小鼠全脑Aβ负荷呈现明显下降趋势，具体表现为海马体与大脑皮层区域的Aβ斑块数量显著减少（相关结果详见图7B、7C及S9A）。 值得注意的是，与5×FAD Veh组小鼠相比，5×FAD SP组小鼠的神经损伤程度明显减轻，树突棘与突触结构得到有效保护，同时小胶质细胞与星形胶质细胞的过度激活现象也有所缓解（相关结果见图7D、7E及S9B、S9C）。上述研究结果表明，SPYTAC通过对Aβ的特异性靶向降解，能够有效降低脑内Aβ沉积负荷，减轻神经炎症反应，同时缓解神经退行性病变的进展。 图7.SPYTAC可有效改善有症状5×FAD小鼠的AD病理状态 (A) 经不同处理后，5×FAD小鼠大脑内Aβ42与Aβ40水平的定量分析（n=6只小鼠/组）。(B, C) 5×FAD小鼠大脑中Aβ斑块的代表性图像。图B展示了Thio-S染色结果，图C则对Aβ斑块的数量和面积进行了量化分析（n=5或6只小鼠/组）。比例尺：上图500 μm，下图10 μm。(D, E) 海马体树突棘密度的高尔基染色图像（图D）及其定量分析结果（图E）（n=3只小鼠/组）。比例尺：上图500 μm，下图5 μm。(F, G) 莫里斯水迷宫实验结果。与对照组相比，5×FADSP小鼠在寻找隐藏平台的潜伏期显著缩短（图F），穿越原平台位置的次数明显增多（图G），而游泳速度无显著差异（图G）（n=8-10只小鼠/组）。(H) 第6天探测试验中，各组小鼠游泳轨迹的代表性图像。(I) 新物体识别（NOR）实验结果。上图为小鼠运动的代表性轨迹图，下图为小鼠探索熟悉物体与新物体所花费时间的百分比（n=8-10只小鼠/组）。 图S9.SPYTAC有效减轻晚期5×FAD小鼠的AD样病变并改善了其认知障碍。 （A）采用MOAB-2抗体对Veh组及5×FADSP组小鼠（n = 5）脑切片进行Aβ免疫荧光染色。比例尺：500 μm（上），10 μm（下）。（B）通过Western Blot检测并定量SPYTAC处理小鼠的AD病理相关蛋白（如突触素Syp）表达水平，并以GAPDH为内参进行标准化（n = 3）。（C）代表性免疫组化（IHC）图像展示了Veh组与5×FADSP组小鼠（n = 5）脑中星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba1）的活化情况。比例尺：20 μm。（D）Y型迷宫实验示意图（左）、臂进入次数（中）及自发交替百分比（右）。交替百分比计算公式为（实际交替次数 / (最大交替次数 - 2)）× 100%（每组n = 8-10）。（E和F）旷场实验结果显示，Veh组与5×FADSP组小鼠（每组n = 8-10）的运动速度无显著差异。（G）对图7所示各组小鼠（每组n = 3）的血清生化指标，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）及总蛋白（TP）进行了评估。（H）H&E染色结果表明，SPYTAC治疗4周后，小鼠主要器官（肝、脾、肺、心）未出现明显组织学差异（n = 3）。 九、结论 综上所述，SPYTAC（合成肽编程溶酶体靶向嵌合体）平台，是一种基于合成肽的新型双特异性分子工具，专门用于细胞外及膜蛋白的靶向降解。该平台通过诱导靶点与LRP1受体在细胞表面形成三元复合物，有效介导了受体介导的内吞作用及后续的溶酶体降解过程。值得注意的是，LRP1结合基序不仅介导了内吞，还赋予了该分子独特的跨血脑屏障（BBB）转胞吞能力。利用这一特性，我们在5×FAD小鼠模型中成功实现了外周与大脑Aβ的协同清除，为阿尔茨海默病（AD）治疗提供了强有力的临床前验证。 SPYTAC技术展现出卓越的可编程性与遗传编码潜力。作为一种完全化学合成的分子，相较于化学偶联嵌合体、抗体类药物或纳米颗粒，其生产工艺更为简便且成本效益更高。这种模块化设计允许我们灵活替换N端的靶点结合域以识别不同的致病蛋白，或替换C端的受体结合域以利用ASGPR、CI-M6PR等不同的内吞受体通路。与依赖转谷氨酰胺酶2（TG2）的平台不同，SPYTAC采用直接结合机制，且其合成肽特性使其具备遗传编码能力，适用于工程化细胞治疗与基因治疗策略。此外，相比基于DNA的适配体，合成肽给药策略在安全性上更具优势，规避了基因组整合或重组的风险。 随着抗Aβ免疫疗法在临床上取得突破，降低脑内Aβ已成为公认的AD治疗策略。本研究提出的策略不仅局限于大脑，而是通过同时靶向血浆和脑组织中的Aβ进行降解，实现了双重清除效应。这一方法在5×FAD小鼠的前驱期和症状期均显著减轻了病理负担，并挽救了认知功能缺陷。在有症状的AD阶段，虽然外周清除贡献了部分疗效，但SPYTAC穿透血脑屏障直接清除脑内既有的Aβ斑块的能力无疑是治疗的关键。 更为重要的是，SPYTAC在安全性上展现出显著优势。它利用特定的内吞-溶酶体途径降解Aβ，避免了传统抗体疗法常见的FcR介导的炎症反应及免疫细胞异常激活。这种机制上的差异直接转化为更少的脑淀粉样血管病变（CAA）及相关微出血风险。此外，通过阻断FcR信号并抑制胶质细胞的过度激活，SPYTAC能够诱导小胶质细胞和星形胶质细胞向神经保护性表型转变，从而改善神经微环境。 参考文献 Efficient amyloid-β degradation in alzheimer’s disease using spytacs. 原文链接 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867426001625 如需获取更多关于胞外靶向蛋白降解技术的研究信息，欢迎相关科研工作者与我们进一步交流与合作。 电话:022-86386788 企业官网:http://biocoupling.com 邮箱：info@biocoupling.com 关于我们 天津偶联生物医药技术有限公司（Tianjin Coupling Biomedical Technology Co.,Ltd 简称：偶联生物），是一家集研发、生产、技术服务及销售为一体的生物高科技企业，公司坐落于天津市津南区双港产业园区。偶联生物自成立以来与驻津高校紧密合作，一直致力于纳米医学的基础研究，始终坚持自主创新,将研发作为推动企业持续发展的核心驱动力。 在国家鼓励基础学科科技创新的背景下，公司面向医疗健康领域，积极推动临床医学-分子生物学-纳米医学-转化医学相结合的多学科交叉系统性研究。同时公司致力于建设具有历史使命的前沿学科交叉研究机构，开展多种疾病的诊疗医学研究，并协助多个科研团队开展IIT研究，在医药研发领域具有丰富的经验。 版权及免责声明 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2026年, 第21卷, 第2期 数据观察 阿尔茨海默病治疗药物的专利技术创新分析与对策 洪培歆1，窦路遥2 1武汉市第九医院，武汉 430081 2中国科学院武汉文献情报中心，武汉 430071 DOI: 10.15978/j.cnki.1673-5668.20250820 识别查看全文 摘 要 [目的/意义] 在专利视角下，揭示阿尔茨海默病治疗药物的技术创新态势和核心技术路径，对优化阿尔茨海默病治疗药物的技术创新生态具有积极意义。[方法/过程] 基于专利计量和技术生命周期理论，系统解构检索出的4976项阿尔茨海默病治疗药物技术专利，并评估技术创新趋势与技术周期、技术保护布局与创新主体，结合实际转化数据进一步识别重点技术分布和核心路径。[结果/结论] 研究表明，阿尔茨海默病治疗药物的技术创新态势较为活跃，并呈现出全球化竞争格局，其专利申请数量整体呈现出先缓慢增长、后高速发展，再到近年波动调整的趋势。阿尔茨海默病治疗药物专利技术保护布局呈现出“大企业主导+学术机构助推+中小创新企业突破”形式，其研发范式正由单靶点向多靶点协同治疗转变。为此，建议建立多靶点协同创新的国际专利布局、完善以专利可共享性为核心的知识治理机制、构建知识产权保护与监管科学耦合的政策体系。 关键词 阿尔茨海默病；专利分析；专利布局；治疗药物； 技术趋势 引 言 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年人最常见的脑部神经退行性疾病。据国际阿尔茨海默病协会（Alzheimer’s Disease International, ADI）2024年10月发布的《2024年世界阿尔茨海默病报告》，全球AD患者人数在2024年约为5500万人，预计到2050年将增至1.52亿人；同时，全球AD相关的年度总费用在2023年约为1.3万亿美元，预计到2030年将升至2.1万亿美元。从病理机制层面来看，该疾病涉及β-淀粉样蛋白（Aβ）异常沉积形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结、慢性神经炎症反应以及突触可塑性障碍等多重病理生理过程。鉴于其发病机制的复杂性和异质性，目前临床治疗选择极为有限，乙酰胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐、卡巴拉汀）和NMDA受体拮抗剂（如美金刚）仅能提供症状缓解作用；而近年来获批的靶向Aβ单克隆抗体（如aducanumab、donanemab）虽在病理改善方面取得突破，但其长期疗效仍有待验证。因此，AD治疗药物的研发引起全球高校、科研院所、医院和药企的共同关注。 在AD治疗药物的研发进程中，专利分析既能揭示技术发展趋势，更能为产业决策提供关键支撑。从技术维度看，专利数据可系统解析不同治疗策略的演进路径，识别创新热点，优化研发方向。从产业维度看，专利布局分析可精准评估企业的核心竞争力和市场壁垒，指导知识产权战略制定，助力企业构建技术壁垒。基于专利导航的深度研究还能降低重复研发风险，加速突破性疗法的孵化，增强企业在全球市场中的话语权。因此，本研究以专利分析为切入点，旨在为AD药物研发提供科学决策依据，推动跨学科技术融合与创新转化。 1  数据来源与预处理 数据来源于智慧芽专利数据库，检索领域为阿尔茨海默病治疗药物，公开日期限定为1977年1月—2025年3月，检索国家为所有国家，剔除部分重复专利和数值缺失专利，共获得4976项用于分析的专利，其中，发明申请型专利3720项、授权发明型专利1215项、实用新型专利41项。检索式为：(TTL:(“Alzheimer” OR “AD” OR “阿尔茨海默病” OR “老年痴呆” OR “认知障碍” OR “Dementia” OR “memory loss” OR “cognitive impairment”)) AND (TTL:(“drug” OR “treatment” OR “therapy” OR “therapeutic” OR “inhibitor” OR “antibody” OR “vaccine” OR “small molecule” OR “monoclonal antibody” OR “mAb” OR “biologic” OR “gene therapy” OR “cell therapy” OR “cholinesterase inhibitor” OR “NMDA receptor antagonist” OR “免疫治疗” OR “抗体” OR “疫苗” OR “小分子药物” OR “基因疗法” OR “干细胞治疗” OR “胆碱酯酶抑制剂” OR “NMDA 受体拮抗剂”)) NOT (TTL:(“diagnosis” OR “biomarker” OR “imaging” OR “screening” OR “nursing” OR “护理” OR “诊断” OR “生物标志物” OR “影像学” OR “筛查”))。 2   专利技术分析结果 2.1  基于专利的技术创新态势分析 AD治疗药物领域的专利技术创新呈现明显的阶段性发展特征。从专利申请趋势来看，该领域经历了初期探索、高速增长以及调整优化这3个阶段。专利法律状态分析结果显示，虽然授权专利数量可观，但存在较高的专利流失率，表现为大量专利因撤回、未缴年费或权利终止等原因失效。从地域分布看，欧洲、中国和美国构成全球专利申请的核心区域，合计占比超过75%。 2.1.1  专利申请时间 AD治疗药物专利的申请数量整体呈现出先缓慢增长、后高速发展，再到近年波动调整的趋势（专利申请时间与专利数量的关系见图1）。从专利申请时间看，1990年前相关专利较少，技术处于探索阶段。2000年后，专利数量稳步上升，2006年（282项）和2015年（243项）达到高峰，表明该时期技术创新活跃，药物研发进入快速发展阶段。2016—2021年，专利申请数量持续保持较高水平，2021年达到267项。2022年后，专利申请数量呈现下降态势，2023年申请131项、2024年申请68项，截至2025年3月，仅申请1项。需说明的是，因以专利申请日为检索基准，2023—2024年，申请量的统计结果受数据检索截止时间及专利申请录入周期影响，部分近期提交的专利申请可能尚未完成系统录入，因此该阶段的申请量回落不能直接等同于实际申请量的真实减少。 图1  AD治疗药物的专利申请时间与专利数量的关系 2.1.2  专利法律状态 在4976项AD治疗的药物相关专利中，授权专利达1178项（占比23.7%），表明相当比例的核心技术已通过专利审查并获得法律保护，具备产业化基础。同时，撤回（982项）、未缴年费（507项）及权利终止（420项）等情况较为常见，反映出技术迭代加速背景下专利维护成本与价值评估的失衡。进一步分析发现，申请终止（195项）、放弃（123项）及驳回（265项）等情形占比达11.7%，表明部分技术在创新性或实用性方面可能存在缺陷。在国际布局方面，PCT专利中未进入指定国的案例达116项（包括指定期满90项和指定期内26项），而成功进入指定国的仅293项，国际专利布局成功率仅为71.6%，凸显出全球专利战略实施中的挑战。其余法律状态如实质审查中291项（5.8%）、公开261项（5.2%）等，则体现了技术创新的持续活跃态势。专利详细法律状态与专利数量的关系见表1。 表1  AD治疗药物的专利详细法律状态与专利数量的关系 在专利稳定性与法律挑战方面，复审（102起）、异议（42起）及无效程序（4起）表明部分专利的有效性和授权合理性受到质疑，而诉讼（15起）进一步显示出专利权人在维权或竞争中的法律冲突。此外，部分专利涉及许可（21起），显示技术成果的市场化应用，但数量相对较少，可能表明AD治疗药物领域的技术壁垒较高，或企业在专利许可策略上较为谨慎。在专利商业化与融资方面，质押（14起）说明部分专利已作为融资抵押物，反映了专利资产化趋势。此外，期限延长（72起）说明部分专利因市场价值或研发需求而申请了保护期延长，法律事件情况见图2。 图2  AD治疗药物的法律事件情况 2.1.3  专利地域分布 AD治疗药物专利的地域分布呈现出明显的多极化格局。欧洲（1190项）在AD治疗药物专利申请中占据主导地位，表明该地区在该领域的研究与技术创新具有专利成果最多及较强竞争力（专利受理国家与专利数量关系见图3）。中国（803项）和美国（652项）紧随其后，显示出两国在该领域的研发产出较多。同时，世界知识产权组织（World Intellectual Property Organization, WIPO）通过《专利合作条约》（PCT）接收了409项相关申请，说明有相当一部分申请人期望在全球布局专利。韩国（289项）、澳大利亚（255项）等国也在该领域保持一定的专利布局。整体来看，该领域的技术创新态势呈现出全球化竞争格局，欧洲、美国和中国仍然是主要专利布局地，其他国家和地区的技术参与度也在逐步增强。 图3  AD治疗药物的专利受理国家（地区）与专利数量的关系 2.2  基于专利技术创新的生命周期分析 技术生命周期是指一项技术从萌芽到成熟，再到衰退的完整发展过程，包括萌芽期、成长期、成熟期和衰退期。在技术创新的不同阶段，研发投入、市场接受度、专利申请量和技术竞争格局都会发生显著变化。萌芽期的特点是基础研究和探索，成长期则伴随专利数量的快速增长和技术突破，成熟期体现为技术应用的普及和市场扩张，而衰退期往往因市场饱和或技术替代导致创新活力下降。AD治疗药物的专利生命周期可明确划分为4个阶段（图4）。 图4  AD治疗药物的技术生命周期划分 2.2.1  萌芽期（1979—1996年） 萌芽期以基础研究为主，专利数量较少。1993年，美国食品与药品监督管理局（U.S. food and drug administration, FDA）批准首个AD治疗药物和首个乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）Tacrine（他克林），但因副作用限制了推广；随后，多奈哌齐（donepezil）作为后来批准的AChEI之一，标志着AD药物研发进入临床应用阶段。 2.2.2  成长期（1997—2006年） 成长期的专利申请量迅速增长，2000年，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）将AD列为全球公共健康问题，推动各国加大研发投入，AChEI类药物和NMDA受体拮抗剂的相继问世丰富了治疗手段。 2.2.3  成熟期（2007—2019年） 成熟期是专利创新的高峰期，每年专利数量保持在150~250项，研究重点从传统神经递质调节拓展至Aβ、Tau蛋白和神经炎症靶点，单克隆抗体等生物制剂成为研发热点；2019年，Biogen的aducanumab获FDA“突破性疗法”认证，标志着生物药物逐步进入临床应用。 2.2.4  行业调整期（2020—2025年） 进入行业调整期后，专利数量明显下降，多个单抗药物因临床试验失败而受挫，2021年，aduhelm获批但备受争议；2023年，lecanemab成为首个正式获批减少Aβ斑块的药物，但2024年多家企业缩减AD药物研发投入，专利申请锐减，行业进入调整期。 2.3  重要专利申请人的技术保护布局分析 从AD治疗药物的专利申请人分布（表2）来看，全球领先的制药企业和研究机构在该领域形成了多层次的技术保护布局。默沙东药厂（171项）、H.隆德贝克有限公司（112项）和卫材R&D管理有限公司（105项）位列前3，反映出这些企业在AD治疗药物研发中的核心竞争力（三者的技术保护布局分布见图5）。从整体格局看，AD治疗专利申请主要集中在跨国制药巨头，如阿斯特拉zeneca（98项）、武田药品（81项）、法奈科斯公司（70项），这些企业在AD创新药物领域持续深耕，形成较为稳固的专利壁垒。学术机构和中小型生物制药公司亦发挥重要作用，例如利兰斯坦福初级大学董事会（50项）、约翰霍普金斯大学（38项）等机构的专利布局显示，大学和科研机构在早期药物靶点发现和基础研究方面贡献突出。此外，美国联合生物医学公司（51项）、阿文尼尔药品公司（47项）等中小型生物制药公司，凭借精准靶点和新型生物技术，推动AD治疗策略的创新。 表2  AD治疗药物的专利申请人情况（专利数量前18） 图5  AD治疗药物的重要专利申请人的技术保护布局分布 2.3.1  默沙东药厂 默沙东药厂（含默克夏普道姆公司）在1987—1990年聚焦化学药物分子的结构设计与合成工艺，IPC分类中A61K（医用配制品）与C07D（杂环化合物）专利占比超90%。1991—2000年的专利申请量阶段性下降但技术探索维度拓宽，首次出现G01N（物理/化学分析方法）相关专利。2001—2005年的专利申请量显著回升并聚焦医药核心领域，C07D类专利达33项，同时平均IPC分类数量降至7.6个。2006年以来，其有机活性成分专利占比升至51.3%（39项），反映药物研发向功能活性聚焦的演进，并首次出现神经系统疾病领域专利（4项），实现特定治疗领域精准突破。以2024年获批的亚胺西瑞为代表，公司通过“化合物结构改进（C07D487/04）+抗菌联用策略（A61K31/407）+微生物耐药监测（C12Q1/02）”的专利组合，构建了贯穿研发全链条的技术保护体系。其下专利EP2231558B1（3,4-取代吡咯烷类β-分泌酶抑制剂用于治疗AD）则进一步拓展该策略，将核心衍生物技术与检测方法整合，推动抗感染类药物向精准应用方向升级。 2.3.2  H.隆德贝克有限公司 H.隆德贝克有限公司在2001—2005年的专利申请量为8件，聚焦有机化学与药物分子基础研究，应用领域以神经系统疾病（14.3%）为初步探索方向。2006—2010年的专利申请量增长至47项，技术方向全面聚焦神经系统疾病治疗，例如专利US20100297240A1（含2,4-二甲基苯硫基苯基的哌嗪类化合物）通过特定杂环衍生物技术实现神经疾病治疗效果突破。2011—2015年的专利申请量保持31项，技术向精细化方向升级，神经系统疾病领域专利占比达9.1%，例如专利US9227946B2（1-[2-(2,4-二甲基苯硫基)-苯基]哌嗪类化合物）通过药物剂型优化提升药物有效性，推动技术从分子设计向临床应用转化。2016年以来的专利申请量21项，授权专利占比达85.7%。以2017年申请的US20170360777A1（1-[2-(2,4-二甲基苯硫基)-苯基]哌嗪类化合物）为代表，公司通过“杂环化合物结构优化（C07D295/096）+医用配制品开发（A61K31/495）+神经系统疾病精准治疗（A61P25/00）”的专利组合，进一步将核心杂环技术与多剂型技术整合，推动神经系统疾病治疗药物向精准化方向升级。 2.3.3  卫材R&D管理有限公司 卫材R&D管理有限公司在2001—2005年聚焦药物分子结构设计与多剂型开发，IPC分类中A61K（医用配制品）与C07D（杂环化合物）专利占比分别达83.3%、6.4%，应用领域以杂环化合物有效成分与神经系统疾病为核心，例如专利US20080213368A1奠定杂环化合物与痴呆治疗结合的技术基础。2006—2010年的专利申请量小幅降至30项但技术方向加速转型，C07D类专利占比降至0%，A61P（治疗特定疾病）占比升至22.1%，例如专利US20100152164A1通过增加酯类有效成分技术实现药物稳定性迭代升级。2011—2015年进入技术战略调整期，专利申请量骤降至3项。2016年以来的专利申请量显著回升至38项，神经系统疾病领域专利占比达45.8%。以2018年申请的US20200129488A1（吡唑并喹啉衍生物与美金刚联用的痴呆治疗剂）为代表，公司通过“胺类有效成分开发（A61K31/4375）+药物联用策略（A61K31/13）+痴呆精准治疗（A61P25/28）”的专利组合，推动神经系统疾病治疗药物向高效化方向升级。 2.4  重点技术领域分析 IPC作为国际通用的标准化专利分类体系，能反映专利的技术信息，通过分析IPC分类号可体现专利申请所集中的技术领域和研发重点。当前研究主要集中在神经递质调节、免疫干预及基因靶向治疗3大技术领域，AD治疗药物的重点技术情况见表3。 表3  AD治疗药物的重点技术情况（专利数量前10） 从IPC分类号看，A61P25/28（神经变性疾病治疗）专利数量最多。该分类号的技术主题对应阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗干预，通过分析该分类下核心专利的技术方案可见，其保护内容主要聚焦于胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐、利伐斯的明）及NMDA受体拮抗剂（如美金刚）相关技术，包括药物制剂优化、给药方式改进等，这反映出上述2类药物仍是当前AD治疗的主要干预手段。随着β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积和Tau蛋白聚集的致病机制得到深入研究，A61K39/395（抗体与免疫球蛋白类药物）专利数量显著增长，代表性技术包括Aβ靶向单克隆抗体（如阿杜那单抗）以及Tau蛋白抑制剂。此外，A61K45/00（新型药物组合）和A61P43/00（特殊用途药物）类别中，BACE1抑制剂、RNA干扰及基因编辑（CRISPR）等疗法成为关注点。 2.5  专利核心技术路径分析 近年来，全球生物制药企业围绕Aβ清除、Tau相关神经保护、BACE1抑制、炎症调节以及突触功能修复等方向开展系统化研发，并在专利布局中形成多项技术热点（表4）。在全球布局中，美国在上述核心技术方向整体保持领先。Biogen、Eli lilly、Merck、Pfizer和Johnson&Johnson等企业在Aβ靶向抗体、Tau干预及BACE1抑制领域具有显著优势，并主导相应的临床研究进展。欧洲在BACE1抑制与神经炎症调控方面实力突出。Glaxosmithkline、Novartis、Astrazeneca和Roche等公司在小分子抑制剂开发、精准抗炎策略和专利积累方面形成深厚技术基础。日本以卫材公司为核心，通过与Biogen等国际企业协作，在Aβ靶向抗体及神经递质调节领域占据重要地位，专利布局覆盖全球主要市场。中国在神经炎症调节和Tau磷酸化抑制等领域快速崛起，以天津医科大学、绿谷医药等机构为代表，通过基础研究突破与专利布局的持续深化，成为全球AD治疗版图中的关键新兴力量。 表4  AD治疗药物的专利核心技术路径情况 2.5.1  Aβ靶向清除与抗体疗法 早期Aβ靶向疗法的研发核心集中于广谱清除脑内沉积的Aβ斑块，代表性探索包括罗氏的gantenerumab（早期核心专利WO2005077961A2），其设计思路为通过高亲和力结合Aβ斑块诱导吞噬细胞清除，但因缺乏靶点特异性导致认知改善不足及ARIA-E副作用，在III期试验终止。这一阶段的技术焦点在于“斑块清除效率”，对Aβ不同存在形式的选择性区分不足。近年来，技术方向的核心是针对Aβ病理的特异性形式及疾病早期阶段开发药物。目前已有3款抗Aβ单抗获得FDA批准，均聚焦于早期AD患者。渤健公司的aducanumab（2021年加速批准），相关专利有US20250059584A1、US20240425573A1、EP4426349A2等，通过选择性结合可溶性寡聚体及纤维体实现精准斑块清除，成为首个证明清除Aβ可延缓认知衰退的里程碑药物；卫材公司和渤健公司的lecanemab（2023年常规批准）及礼来（EliLilly）公司的donanemab（2023年获批，相关专利有TW202325728A等），分别靶向原纤维和N3pG修饰的Aβ斑块，临床试验显示可使早期AD患者脑淀粉样斑块负荷降低65%左右，显著延缓疾病进展。 2.5.2  Tau介导的神经保护与聚集干预 Tau蛋白的异常磷酸化及病理性聚集是AD的核心病理特征之一，且被证实是认知功能下降和神经退化的直接驱动因素。正常生理状态下，Tau蛋白通过稳定微管结构维持神经元轴突运输和细胞骨架完整性。在AD进程中，Tau蛋白发生过度磷酸化，导致其与微管解离并形成可溶性寡聚体及神经原纤维缠结，引发神经元毒性、轴突运输障碍及突触功能损伤。早期干预策略以“抑制Tau异常磷酸化”为核心，技术焦点集中于调控激酶与磷酸酶的活性平衡，通过小分子抑制剂阻断激酶活性减少Tau磷酸化；硒酸钠作为早期代表性PP2A激活剂，通过增强磷酸酶活性降低病理性磷酸化Tau水平，但临床效果有限。 近年来，AD治疗已进入“Tau时代”，围绕Tau的治疗策略逐渐从单一抑制磷酸化发展为多维度干预，主要集中在3个方向。其一，通过阻断Tau聚集并促进清除来减轻病理扩展，包括利用小分子抑制剂阻断Tau-Tau相互作用以防止纤维形成，以及使用针对细胞外Tau片段的单克隆抗体抑制病理Tau在神经元间传播并减轻神经炎症。其二，从基因层面减少Tau表达，如反义寡核苷酸BIIB080通过靶向MAPT mRNA降低Tau蛋白生成。其三，应用新型蛋白降解技术以直接消除异常Tau，包括PROTAC类双功能分子通过招募E3泛素连接酶促使Tau经泛素-蛋白酶体途径降解，临床前研究证实其可降低AD模型小鼠的Tau负荷并改善学习与记忆功能。且Aprinoia开发出能高效清除可溶性Tau寡聚体的PROTAC降解剂并在动物实验中显示显著效果。 2.5.3  BACE1抑制剂与β-分泌酶调控 β-分泌酶1（BACE1）通过抑制其活性可减少β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成，BACE1在Aβ生成途径中发挥限速作用，且其基因敲除动物模型证实了抑制该酶可显著降低大脑Aβ水平。早期研发聚焦于“强效抑制”策略，核心目标是最大化降低脑内Aβ生成，代表药物包括默克公司的verubecestat（MK-8931，核心专利WO2010115998A1）和礼来与阿斯利康（astrazeneca）联合开发的lanabecestat（AZD3293）（表5）。这一阶段的技术设计未充分考虑BACE1的生理功能多样性，导致长期强效抑制引发神经生长因子加工异常、钠离子通道调控紊乱等问题，最终因认知副作用未能进入市场。 表5  BACE1抑制剂与β-分泌酶调控的代表性药物 近年来，技术方向转向“安全窗优化”，核心是开发低剂量干预方案及选择性BACE1抑制剂，在降低Aβ生成的同时避免影响正常生理功能。目前处于临床阶段的候选药物均采用“适度抑制”设计，通过优化分子结构提高对BACE1的特异性结合，减少对其他分泌酶的交叉影响，但尚未有药物获批上市。 2.5.4  神经炎症调节与小胶质细胞靶向疗法 神经炎症被认为是AD进展的重要推手，小胶质细胞的过度活化及促炎因子的释放可加剧神经元损伤。早期技术以“广谱抗炎”为核心，多借用其他自身免疫性疾病的抗炎药物进行适应症拓展，临床效果不显著且安全性风险较高。近年技术焦点集中于小胶质细胞特异性调控，形成2大方向。一是增强小胶质细胞的吞噬功能，通过激活小胶质细胞表面的TREM2受体，提升其对Aβ斑块的清除能力，并改善脑内炎症微环境。葛兰素史克开发的TREM2激动剂（相关专利包括CN114870018A、CN114832241A等）正是基于这一策略。临床前研究显示，TREM2激动剂能够促进小胶质细胞向斑块周围聚集并增强其吞噬活性，从而减轻Aβ沉积。二是阻断特异性促炎通路，如诺华的canakinumab（抗IL-1β单克隆抗体）可抑制神经炎症反应，在研究中展现出潜在应用价值。 2.5.5  突触功能修复与神经递质调控 突触功能障碍与神经递质失衡是AD患者认知功能衰退的重要机制，技术研发从早期症状缓解逐步转向长期神经保护。早期技术核心是“症状改善”，通过调节神经递质水平缓解认知衰退，代表药物包括多奈哌齐（donepezil，专利US5744461A）等乙酰胆碱酯酶抑制剂，以及美金刚（memantine）等NMDA受体拮抗剂。这类药物仅能暂时改善认知功能，无法逆转突触损伤或阻止疾病进展，药物的代表性专利见表6。近年来，研发趋势转向突触修复与功能增强，目标是实现长期神经保护。技术方向主要包括神经突触生长因子（NGF）激活剂和突触可塑性增强因子，通过促进突触再生、改善突触连接稳定性发挥作用。目前相关药物多处于临床前或早期临床阶段，尚未有突破性进展，但已成为专利布局的重要方向。 表6  突触功能修复与神经递质调控的药物类别和代表专利 3  结论与建议 3.1  研究结论 基于专利计量学对AD治疗药物的技术创新态势、技术生命周期、重要申请人的专利技术布局、重点技术领域以及专利核心技术路径的系统性分析，研究得出以下结论。 第一，AD治疗药物的技术创新已呈现明确的生命周期轨迹。相关技术从萌芽期、成长期逐步迈入成熟期，当前正处在以临床转化验证、技术整合与策略优化为特征的结构性调整阶段。全球专利布局呈现多中心态势，欧洲、中国与美国为主要区域，显示出技术创新的全球扩散与竞争加剧。 第二，AD治疗药物专利呈现失效比例较高、可查证许可数量有限的特征。该领域因未缴年费、主动撤回或权利终止导致的失效专利比例较为突出，专利质押等权属变更活动较为活跃，但基于现有主要专利数据库的可查证记录，明确登记的许可案例数量相对有限。 第三，AD治疗药物的技术创新主体结构呈现“大企业主导、学术机构支撑、中小企业参与”的协同格局。跨国制药企业凭借系统化的专利组合构建技术壁垒，是产业化的主要推动力。高校及科研机构在早期靶点发现与基础研究方面贡献显著，而中小型生物技术公司则在特定技术路径上实现突破。 第四，AD治疗药物的技术研发范式正经历从单一靶点干预向多靶点协同的精准化、生物制剂驱动的战略转型。技术路径集中于Aβ靶向抗体、Tau蛋白干预、BACE1抑制、神经炎症调节与突触功能修复5大方向。专利布局从传统的广谱神经递质调节，转向以单克隆抗体、基因编辑、PROTAC蛋白降解等为代表的新型生物技术，强调对特定病理机制与疾病阶段的精准干预。 3.2  建 议 基于前述专利分析结论，为促进我国AD治疗药物领域的技术创新与产业发展，提出以下建议： （1）建立面向多靶点协同创新的系统性专利布局。鉴于AD多病理机制并存的复杂性以及研发向联合疗法演进的趋势，建议创新主体在Aβ、Tau、神经炎症等核心路径上构建覆盖化合物、制剂工艺、联合用药方案及特定适应症的专利组合。对于涉及生物标志物检测的伴随诊断方法，可探索通过“检测试剂盒+数据处理装置”等产品权利要求形式进行保护，以规避方法专利授权的局限性，形成与治疗药物专利互补的保护网络。 （2）构建促进产业链上下游高效衔接的协作机制。在操作层面，建议推动组建由政府引导、龙头企业牵头、学术机构及中小企业共同参与的产业创新联盟，保障中小型研发主体在早期技术贡献中的合法权益。鼓励跨国药企向联盟内的学术机构及中小企业开放研发平台、释放合同研发需求，从而将学术机构的源头创新与中小企业的技术专长，更有效地导入以大型药企为主导的产业化通道，加速形成优势互补、风险共担的开放式创新生态。 （3）构建促进基础专利转化与知识共享机制。建议由政府或产业联盟牵头，搭建非营利性的早期研发数据与平台技术共享库。通过建立合理的贡献认定与许可费分享机制，鼓励高校、科研机构及企业共享已验证失败的研发路径、基础靶点数据及通用技术平台，降低后续研发的试错成本与重复投入，提升整体创新效率。 （4）推动知识产权保护制度与药物研发产业特性的适配。建议在现有专利制度框架下，积极研究并推动适用于AD等重大慢性病创新药物的专利期限补偿制度的细化与落地。补偿应重点向具有显著临床价值且研发耗时长的药物倾斜。同时，加强临床试验数据保护，为核心创新成果在专利保护之外提供额外的市场独占期，形成复合型保护体系，以保障创新的可持续投入。 【参考文献略】 期刊介绍 《科学观察》是由中国科学院主管、中国科学院文献情报中心主办的综合类学术期刊，旨在对世界科学发展态势和科学前沿发展动态进行观察，为科学家提供视野更加宽阔的世界科学面面观，为国家科技决策机构和科技管理部门提供科技战略决策理论支撑和参考信息。 主要内容： ■ 用科学计量学方法研究当今科学技术发展的规律及其与社会发展的关系； ■ 报道世界重大科学成就、重要科研规划以及重大科技项目等面向战略决策需求的信息； ■ 用定量方法遴选前沿科学领域的重要方向，用数据展现各国的学术影响力； ■ 依据科学家的经验判断，对科学热点和重要领域展开讨论，发表述评。 主要栏目: 前沿观察、数据观察、政策观察、科学焦点、专题分析、中国热点论文分析等。科睿唯安独家授权《科学观察》出版Clarivate Analytics中文版专栏。 收录情况： 《科学观察》被《中国科技核心期刊目录》（2024年版）、《中国科学引文数据库（CSCD）》和《中国学术期刊网络出版总库》收录。 编辑部联系方式 地址：北京北四环西路33号 中国科学院文献情报中心 《科学观察》编辑部 电话：010-82621675 E-mail: sciencefocus@mail.las.ac.cn 更多内容请查看网站和扫描下方二维码： http://www.sciencefocus.ac.cn/ 提 示 本文刊载于《科学观察》2026年第21卷第2期P66-79。© 版权所有中国科学院文献情报中心《科学观察》编辑部。 未经许可，不得转载。