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点击蓝字，关注我们 奥科生物 新型疫苗佐剂CpG-ODN的作用机制及应用 CpG ODN简介 CpG寡核苷酸（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs，CpG ODN）是人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸，直链型，长度通常为十几至二十几个碱基不等，具有与细菌DNA相似的免疫刺激作用，可激活先天性和适应性免疫应答。 近年来，CpG ODN作为免疫佐剂受到了广泛的关注，自2000年以来，已有20种以上CpG ODNs佐剂疫苗陆续进入临床研究。这些研究涉及肿瘤、传染性疾病和过敏性疾病等的预防性和治疗性疫苗，使用的疫苗抗原主要为重组蛋白和合成多肽。 2017年11月，Dynavax新型乙肝疫苗HEPLISAV-B获FDA批准，该药物作为世界首个CpG佐剂获批的疫苗，也是美国25年来首次批准的两针免疫的新型乙型肝炎疫苗，显示出了巨大潜力和应用前景。 CpG ODN结构图解 免疫佐剂的机理是主要通过诱导机体的免疫系统，使机体对外界抗原产生体液免疫或细胞免疫反应，其主要应用是提高抗原的免疫原性和免疫反应的可持续性。 入侵的微生物之所以能够被宿主机体识别是基于病原体的特定分子结构模式，在漫长的生命过程中，病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）的结构发展成为能够被宿主体免疫细胞的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRR）所识别，从而产生免疫应答。研究发现脊椎动物中80%的胞嘧啶的第5位碳原子是甲基化的，而未甲基化的CpG ODN基序广泛存在于细菌或病毒的基因组DNA中，在细菌、病毒基因组中的出现频率远远高于脊椎动物。这种显著的差异使来自细菌及病毒的DNA在进化的过程中成为病原体相关分子模型，可被哺乳动物免疫系统视作“危险信号”而引起机体免疫应答反应，而得以清除入侵的病原。 因此，CpG ODN可作为疫苗佐剂来提高疫苗的免疫效果，并且其突破了传统佐剂主要是仓储、缓释的作用机理，具有很大的开发和应用前景。人工合成的CpG ODN可作为有效的免疫治疗工具。CpG ODN作为一种核酸药物，通过进入血液循环系统和淋巴系统，继而被其中的免疫细胞摄取并进入细胞的内吞小体上。将CpG ODN与其他疫苗联合使用，CpG也可以起到免疫佐剂的作用，通过引发机体的免疫反应，使机体对疫苗的特异性免疫应答增强，从而强化疫苗的效用，具有用量低、作用强、副作用小，应用范围广等优点。 目前，CpG ODN在机体抵抗病原入侵和抗肿瘤等方面起到免疫增强剂的作用，在抗感染免疫、癌症治疗、过敏性疾病、传染性疾病以及免疫佐剂等领域具有重要的应用价值，已经用于黑色素瘤、非小细胞癌、乳腺癌及其它恶性肿瘤的治疗。 CpG ODN发展史 机体的免疫功能可分为固有免疫和适应性免疫两部分。其中固有免疫是机体抵抗病原入侵的第一道防线，它包括皮肤、黏膜的天然屏障作用，巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬功能和补体系统的功能等。除了这些，机体还能够通过识别病原在进化上相对保守的分子结构即PAMP，产生某些具有免疫增效作用的细胞因子来提高自身对抗病原的能力。这就提示我们可以利用固有免疫的这一机制在人工主动免疫时有针对性的增强机体免疫应答的强度。识别病原相关分子模式的PRR，包括Toll样受体、Nod样受体、RIG-I样受体等，其中Toll样受体是人们广泛研究的一类模式识别受体。Toll样受体受到刺激以后所产生的固有免疫应答主要表现为产生促炎因子、趋化因子、Ⅰ类干扰素和抗菌肽等。 早在十八世纪就有人注意到，一些肿瘤得以自动消失的病人往往伴随着细菌感染。十八世纪九十年代，纽约外科医生Coley用细菌使肿瘤发生退行性变，当时人们把此疗效归因于内毒素。直到上世纪八十年代，日本学者Tokunaga等人在研究卡介苗的实验中发现，细菌DNA才是介导这种抗肿瘤效应的物质。进一步实验证明，细菌DNA具有诱导干扰素产生、刺激NK细胞活化和抗肿瘤的作用，而细菌DNA的刺激活性源于未甲基化的CpG二核苷酸片段。 2000年，Hemmi等发现CpG ODN的免疫刺激作用是由Toll样受体9(Toll like receptor 9，TLR9)介导的，学者们将这一类富含CpG基序的ODN称为CpG ODN。TLR9是CpG DNA发挥免疫激活性所必需的介体，是CpG DNA的细胞内受体。TLR9属于PRR受体家族，在人类等哺乳动物的B淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cells)、单核细胞和自然杀伤细胞(NKs)等免疫细胞的内吞小体膜上，是TLR9的主要表达场所。当机体受到CpG ODN刺激后，激活免疫细胞的TLR9受体，继而通过TLR9募集衔接蛋白髓样分化因子(MyD88)，使IL-1相关激酶4(IRAK-4)磷酸化，同时与肿瘤坏死因子相关受6(TRAF6)相互作用，激活细胞内MAPK和核因子-κB (NF-κB)等信号通路，诱导产生Th1型细胞因子，包括白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、I型干扰素(type I IFNs)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。这些细胞因子通过引发B淋巴细胞分化为分泌抗体的浆细胞，进而激活自然杀伤细胞(NK)、促进CD8+细胞、毒性T淋巴细胞应答等，从而诱导机体建立Th1型免疫反应，最终完成一系列先天的或适应性的免疫应答过程。 CpG ODN的分型 根据CpG ODN的结构和免疫活性，可将其分为A型（D型）、B型（K型）和C型，不同类型的CpG ODN的结构特点、功能和主要应用方向也各有不同。 目前，除已上市应用于乙肝疫苗的B类CpG 1018外，由葛兰素史克（GSK）公司研发的同时含有单磷酰脂质A（MPL）、皂苷（QS-21）和CpG 7909的脂质体佐剂系统——AS15作为疫苗候选佐剂，与MAGE-A3抗原蛋白联用治疗黑色素瘤和人非小细胞肺癌已进入临床阶段，有望成为一款肿瘤治疗性疫苗。 1. A型CpG ODN A型CpG ODN序列的中间为未被磷酸化修饰的核苷酸，其两侧为磷酸化修饰的核苷酸。A型CpG ODN只有一个CG序列，且两侧均为回文序列，并在3’和5’端含有poly G尾。这样的结构使A型CpG ODN更容易形成多联体，增强自身稳定性。正是由于A型CpG ODN复杂的空间结构，使其与TLR9结合后，使其不能从早期内体迅速移行至晚期内体，所以会在早期内体停留较长时间，充分活化早期内体上的MyD88/IRF7信号通路，促进IFN-α的产生。因此A型CpG ODN可以促进pDC分泌IFN-α，但却不能激活B细胞。 James等在研究CpG ODN对一种人类多发性硬化（MS）的理想动物模型—实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）的治疗效果时发现，CpG-A ODN组可以显著减轻小鼠的病情。Krug等通过使用CpG-A ODN和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor, GM-GSF）分别刺激PBMC，体外培养3天后，发现CpG-A ODN可明显诱导PBMC向DCs表型分化并自主上调IL-15的表达。 2. B型CpG ODN B型CpG ODN含有多个CG序列，并且所有核苷酸均含有磷酸化修饰。全磷酸化修饰可以保护人工合成的CpG ODN不被DNA酶水解，延长其在体内的半衰期。B型CpG ODN的活性受序列长度、CG数量、CG位置、CG周边碱基的影响。在B型CpG ODN进入细胞后，能够迅速地从早期内体移行至晚期内体中，活化MyD88/NF-κB信号通路，增强促炎因子的产生，进而刺激TNF-α的分泌、促进B细胞增殖活化、分泌IgM。因此，B型CpG ODN可以有效地活化B细胞，但却不能促进pDC分泌IFN-I。 由Dynavax公司开发的CpG 1018通过临床实验已应用于乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）疫苗免疫佐剂，临床结果证实其可以诱导较高的抗体水平。另一B型CpG 7909在2002年被批准用于肿瘤疫苗开发后，其在炭疽疫苗、疟疾疫苗等多种疫苗中均有应用，且部分已进入临床试验。 3. C型CpG ODN C型CpG ODN同时具有A型和B型CpG ODN的特点，既与B型CpG ODN一样，含有完全磷酸化的骨架，又与A型CpG ODN一样，含有回文结构，可以形成茎环或二聚体等二级结构。C型CpG ODN既可存在于早期内体，也可以在晚期内体停留，进而激活MyD88/IRF7和MyD88/NF-κB信号通路，刺激B细胞分泌IL-6等细胞因子，刺激pDC分泌IFN-α，因此同时具有A型和B型CpG ODN的特点。此外，C型CpG ODN还有独立于A型与B型CpG ODN的另一特点，C型CpG ODN可以刺激B细胞、T细胞、中性粒等细胞向胞外释放线粒体，所释放出的线粒体可以进一步刺激细胞产生大量的I型干扰素。最近C型CpG ODN还被报道通过促进人皮肤成纤维细胞的增殖和I型胶原蛋白的产生进而促进伤口愈合的功能。 Anshu等使用CpG-CODN 2395或Poly（I: C）作为佐剂，发现经皮下（SC）和肌肉（IM）注射所诱导的体液免疫应答高于腹腔注射，对炭疽杆菌感染的保护效果可高达83%。 CpG-ODN的分型 作用机制 关于CpG ODN发挥疫苗佐剂的机制（如下图）被解释为通过TLR9的识别和结合引起下游MyD88/IRAK1/TRAF6信号通路的活化，促进转录因子NF-κB和AP-1的活化并转位入核，进而上调包括B细胞在内的免疫细胞MHC II分子和协同共刺激分子的表达、促进促炎细胞因子的分泌。被上调的MHC II分子、协同共刺激分子和细胞因子增强了T细胞活化需要的第一信号、第二信号和第三信号，促进T细胞向Th1细胞分化，进而促进B细胞分化为浆细胞和记忆B细胞及抗体的产生。由此可见，CpG ODN可以协助抗原引起强烈的抗原特异的体液反应和细胞反应。 临床实验中的应用 目前，有100多个CpG ODN佐剂临床试验正在进行或者已经完成，可将这些临床试验分为以下几大类，针对传染性病原体、过敏原和肿瘤的疫苗。 1. 针对感染性病原体的疫苗 临床试验已经评估了CpG ODN佐剂结合疟疾，乙型肝炎（HBV）、肺炎球菌、流感、炭疽等相应疫苗的效用。HEPLISAV是第一个CpG ODN佐剂联合乙型肝炎病毒疫苗的III期临床试验。明矾是目前批准在乙肝疫苗上的佐剂，在三次免疫和超过6个月的免疫周期，机体才能产生具有保护水平的抗体滴度。用这种疫苗按照接种流程免疫后，仍然有5-10%的接种者产生维持时间较短的保护抗体。此外，一个大的部分免疫功能低下的病人注射乙肝疫苗就不能刺激机体产生具有保护性的抗体。 在动物实验中，CpG ODN联合获批的人用炭疽疫苗显著增加了所得到的抗体产生快速、大量和持久的免疫应答。感染后保护实验中，与单独使用获批的炭疽疫苗（AVA）相比加入CpG ODN疫苗接种的动物明显更好的保护率（P＜0.001）。 目前CpG ODN作为免疫佐剂添加在人用乙型肝炎疫苗中的研究已经通过了三期临床阶段，添加进入其他人用疫苗的研究也已经在二期、三期临床实验阶段。作为人用疫苗佐剂具有提升免疫性能明显，与疫苗中抗原物质不发生冲突的提升非特异性的适应性免疫应答的方式，能够有效的提高机体对于病原物质的免疫作用以及抗肿瘤作用，生产成本低，贮存、缓释等方面具有比目前市面上一些常用的佐剂更加优秀。有研究显示，CpG ODN在猪的抗细菌感染方面有着良好的免疫辅助效果。在禽病防治方面，有实验证实了CpG ODN可以增强ALV-J亚单位疫苗的免疫活性，但目前大多数兽用疫苗佐剂的应用均还停留在实验室数据阶段，因此具有广泛的市场前景。 2. 针对过敏原的疫苗 嗜酸性粒细胞增多和血清IgE水平增高是过敏性炎症的指标。Th1细胞分泌的Th1型细胞因子（如IFN-γ）抑制Th2细胞介导的嗜酸性粒细胞增多。事实上，具有相同的抗原特异性Th1和Th2细胞相互抑制。在动物模型中，CpG ODN联合药物或疫苗能使过敏原产生Th1反应从而抑制诱导过敏性炎症。的确，CpG ODN可以偏离Th2反应，起到被抗过敏的效果。这些发现最初评估在临床试验中用来治疗对花粉过敏。研究发现CpG ODN与花粉过敏原（TOLAMBA）结合能降低鼻粘膜免疫细胞对过敏原刺激反应，由Th2反应向Th1反应转变。最近，一个A/D类型的CpG ODN结合屋尘螨变应原QbG10的免疫治疗。10周免疫治疗后，所有患者几乎完全缓解了过敏性症状。 3. 针对肿瘤的疫苗 一般CpG ODN作为独立的治疗来说相对安全但诱导免疫反应的大小不足以消除肿瘤。单独注射疫苗通常不能引起强烈的免疫反应。多肽疫苗的调查研究包括对Melan-O/Mart-1 gp100，EGF，Mage-A10，NY-ESo-1，idm–2101，MAGE-A3和霍奇金病的肿瘤核内蛋白1（WT-1）。因此,许多临床试验检测了CpG ODN联合各种肿瘤相关抗原（TAAs）肽链型疫苗，CpG ODN佐剂的免疫效果。值得注意的是，许多研究评估了CpG ODN与其他免疫佐剂组合包括Montanide®ISA-51，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和弗罗因德的不完全佐剂（IFA）。在这些临床试验中包含不同类型的CpG ODN,但是最常用的是K型CpG ODN7909。 黑色素瘤患者接种包含CpG 7909疫苗产生的Melan-O/MART-1特异性T细胞是无CpG ODN疫苗的10倍。当用含CpG 7909的疫苗刺激的T细胞，T细胞再经疫苗衍生肽在体外再刺激后产生的细胞因子TNF-α、IL-2和CD107a与无CpG ODN疫苗组相比增加2倍～10倍（P<0.01）。 结语 CpG ODN在抗感染、过敏治疗、疫苗和肿瘤治疗等方面具有广阔的应用。然而CpG ODN的作用机理还需进一步深入探索，仍然存在一些问题需要继续研究，比如，证实不同类寡聚核苷酸与疫苗联合免疫后对人类免疫刺激的不同影响；明确不同类寡聚核苷酸调节免疫反应的重要因素，此外，对于CpG ODN作为佐剂影响免疫效应的剂量、持续时间等都需深一步的研究。随着生物免疫学的不断发展，这些问题都将有望得到解决，提高CpG ODN诱导保护性免疫的能力，使之成为一种高效的新型疫苗佐剂。 奥科（武汉）生物科技有限公司 网址：www.augct.cn （当前更新中） 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路388号生物医药加速器C4-4     027-87868608（总机）         销售部  info@augct.com         测序部  wh.seq@augct.com         小核酸  wh.syn@augct.com         基因部  wh.gs@augct.com         项目部  wuhan@augct.com