CRS-207

微生物药物：在癌症治疗中解锁微生物组的治疗潜力 引言 微生物与人类健康的维护有着悠久的共生关系，而基因工程与合成生物学的近期进展，使得开发能够靶向治疗疾病的工程化微生物成为可能。本综述评估了微生物作为治疗制剂，特别是在癌症治疗领域中日益增长的应用。这些工程化微生物能够检测疾病标志物，并将治疗性载荷精确递送至病灶。通过靶向肿瘤微环境并增强抗肿瘤免疫，这类基于细菌的疗法在对抗胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌等癌症方面展现出显著前景。尽管仍存在个体差异、安全性担忧和监管障碍等挑战，但微生物疗法的医疗潜力是巨大的。未来的研究应聚焦于深入理解微生物与宿主相互作用的机制，并完善细菌工程技术，以持续开发更精准、更有效的疗法。最终，利用微生物的力量有望彻底改变癌症等复杂疾病的治疗格局。 合成生物学的飞速发展正推动着微生物作为治疗制剂的开发。这些微生物常被视为需要避免的对象；然而，新兴研究表明，它们可以帮助我们对抗包括癌症在内的各种难治性疾病。微生物群与人类宿主之间的互惠关系早已为人所知，随着对这种关系背后相互作用和机制的进一步理解，其治疗潜力也进一步显现。尽管微生物群在从癌症到心血管疾病、皮肤病等多种疾病中都扮演着重要角色已被广泛接受，但除了某些形式的粪菌移植(FMT)外，基于天然微生物的疗法尚未被广泛开发。目前，天然微生物物种在医疗保健中的应用受到其研究数据不一致的限制。几种工程化活体细菌疗法(LBTs)正处于早期或中期临床开发阶段，可能为确定这类新型治疗制剂的未来提供所需的概念验证。临床研究的结果将决定微生物疗法在临床中的实际应用。达成这些里程碑后，利用合成生物学开发工程化细菌疗法的研究者将能够建立最佳的安全性、给药和制造流程，并确定这些制剂如何与现有疗法有效结合。优化这类新型药物的应用将满足患者未获满足的需求。尽管临床前和早期临床结果令人鼓舞，但要将这些发现应用于临床实践，仍需解决存在的监管障碍。 在探讨微生物如何被工程化用于癌症治疗之前，有必要了解推动该领域进步的分析工具。对单细胞微生物的测序技术在很大程度上揭示了栖息于人类肠道微生物组中的共生微生物的特性。这些针对单细胞生物的测序技术主要旨在进行三类分析：单细胞基因组测序、单细胞转录组测序和单细胞蛋白质组测序。在单细胞基因组测序中，可以分析遗传异质性。这是通过扩增微生物的整个基因组来实现的，可采用多种方法，每种方法各有优缺点。这使得能够检测微生物中的突变或微生物间的基因组差异。单细胞转录组测序分析微生物转录的RNA水平。在这些技术中，从微生物中提取RNA，并使用逆转录酶将其转化为cDNA。由此，可以通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)确定微生物RNA的相对量。可以设计特异性引物选择性结合目标cDNA，从而准确分析微生物中的相对基因表达。单细胞蛋白质组学测序分析微生物蛋白质的翻译情况。成像技术如PET、CT和MRI常被用于准确评估体内细菌细胞群。除Westernblot外，质谱法和流式细胞术是分析蛋白质表达的两种常用方法。可以确定特定目标蛋白质的相对丰度，从而深入了解微生物基因的表达情况。此外，可以整合多种测序技术，以更深入地分析目标基因的微生物表达途径。 有趣的是，人工智能(AI)和机器学习在细菌设计的发现、分析和优化方面发挥了越来越大的作用。新开发的算法通过两种方式辅助细菌研究：预测复杂相互作用以及增强生物工程和合成。这些AI模型已被用于准确预测病原体与宿主、病原体与治疗性细菌以及治疗性细菌与宿主之间的关系和相互作用。通过模拟这些相互作用，新技术、治疗性菌株和载荷递送机制的开发效率大大提高。在细菌合成方面，AI在预测代谢反应和开发能够实现细菌持续制造和储存的细胞工厂方面也很有用。例如，Srivastava等人创建了一个基于AI或机器学习的工具，用于准确预测某些小分子对细菌生物被膜产生的抑制活性。在另一项研究中，Gupta等人开发了一种基于机器学习的工具，可以对细菌蛋白进行分类并评估其致病性，这有助于确定某些细菌菌株或药物是否会产生致病性不良反应。这些例子反映了AI在生物技术领域日益增长的应用，并突显了这些模型在细菌疗法开发中的实用性。理解这些基本的微生物组-宿主相互作用以及分析工具和模型，为工程化治疗性细菌以对抗癌症等复杂疾病奠定了基础，这将在后续章节中讨论。 >> 微生物组在癌症治疗中的作用 利用微生物治疗癌症是一个不断发展的研究领域，其结果令人鼓舞。从历史上看，这一概念可以追溯到19世纪，当时研究人员观察到感染某些类型细菌的患者的肿瘤出现了消退。自20世纪70年代以来，一种减毒的细菌菌株——卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)已被有效地用于治疗膀胱癌。目前，科学家和研究人员正在探索工程化细菌以刺激抗肿瘤免疫或递送抗癌药物的新方法。即使在现代取得突破的今天，癌症仍然对全球健康构成挑战，需要开发创新和有效的治疗方法。传统的癌症疗法，如化疗和放疗，在疗效、全身毒性和耐药性出现方面存在局限性。因此，迫切需要能够克服这些挑战并改善患者预后的新型治疗策略。在最近的研究中，经过基因重编程的细菌能够增强抗肿瘤免疫力或增强其他癌症疗法的效果，这表明这些生物体可能成为对抗癌症的盟友。微生物具有多种特性，使其成为适合癌症治疗的制剂。例如，细菌具有独特的运动方式，使其能够轻松穿透肿瘤。工程化微生物用于癌症治疗已成为癌症治疗领域一种有前景的方法。细菌可以通过直接瘤内注射或基于梯度(氧气、pH值、趋化性、温度)操纵其自主引导运动，精确地递送至肿瘤。这一策略涉及将基因修饰的细菌直接递送到肿瘤微环境中，在那里它们可以发挥其抗癌作用。它们在肿瘤的缺氧和营养缺乏环境中茁壮成长。它们可以消耗肿瘤微环境中癌细胞生存所需的营养物质。这些特性，连同易于修饰的基因组和诱导免疫反应的能力，促使人们探索细菌在癌症治疗中的潜力。工程化微生物可以被设计为选择性靶向肿瘤细胞、诱导直接细胞毒性效应、调节免疫反应以及增强现有疗法的疗效。例如，研究人员工程化了一种非致病性大肠杆菌菌株(MG1655)，使其在酸性(pH5)肿瘤微环境条件下表达溶细胞素A(ClyA)。这种工程化细菌AIB@ClyA能特异性靶向肿瘤，通过损伤血管诱导肿瘤局部血栓形成，并通过膜穿孔表达ClyA增强细胞毒性。在小鼠模型中，这种方法显著抑制了肿瘤生长(减少79%)，阻止了转移，并显示出最小的全身毒性，提供了一种有前景且精确的抗癌治疗。 图1. 从肠道微生物组的发现到其当前临床应用的科学进展概览 这项研究的吸引力在于细菌载体与现有治疗方法相比具有独特的优势。主要有四个优势。首先，用于治疗的微生物的基因组可以被操纵以降低其致病性，从而限制不良反应的数量和严重程度。其次，微生物已经具备在人体组织中增殖的能力，特别是如果所使用的微生物是通常在人体中发现的改良菌株。第三，用于治疗的微生物的种群规模可以通过使用抗生素来控制。最后，微生物的基因组可以很容易地被操纵以引入、移除或改变表达的毒力因子，这拓宽了它们可以治疗的癌症范围。此外，微生物疗法因其具有杀瘤和免疫调节的特性，在癌症治疗中也显示出潜力。然而，这种方法也存在一些局限性。其中一些局限性包括潜在的细胞毒性(取决于所使用的细菌菌株)、细菌基因组发生突变的可能性、所携带货物的异质性和复杂性，以及无法完全裂解肿瘤细胞。2014年的一项研究通过将Novyi梭菌注射到狗的肿瘤中来测试微生物治疗肿瘤的效果。总体而言，治疗反应良好，最常见的副作用与细菌感染一致。这项研究的结果促使研究人员将Novyi梭菌注射到一名患有晚期平滑肌肉瘤的人类患者的肿瘤中。瘤内注射后，骨内及骨周围肿瘤的大小得以减小。在另一项有趣的研究中，将破伤风梭菌注射到未患病小鼠的健康组织和患癌小鼠的肿瘤中。结果发现，只有在肿瘤内注射了破伤风梭菌的小鼠死于破伤风，这表明破伤风梭菌仅在癌组织中萌发。这一发现为未来的研究提供了潜力，即操纵破伤风梭菌的基因组，使其在癌组织存在时释放抗肿瘤因子，而非破伤风毒素。由于破伤风梭菌仅在肿瘤中萌发，这将降低影响健康人体组织的风险。最近，研究人员专注于通过工程化微生物组来对抗癌症的机制。 >> 肠道微生物组-癌症相互作用的机制 肠道微生物群调节肿瘤生理学的机制是复杂的。有证据表明，微生物群通过三种机制在肿瘤生理学中发挥作用：肿瘤发生、肿瘤细胞代谢和肿瘤血管生成。肠道微生物群以多种方式对肿瘤发生施加影响。首先，肠道中的微生物失调可导致致病性大肠杆菌和空肠弯曲杆菌丰度增加，已发现它们分别产生并释放致癌物大肠杆菌素和细胞膨胀致死毒素(CDT)。这两种化合物都能损伤DNA，从而可能导致癌症的发展。粪肠球菌和脆弱拟杆菌过量产生活性氧(ROS)，导致胃肠道细胞氧化性DNA损伤和基因组不稳定。通常，DNA修复机制或环GMP-AMP合酶(cGAS)-干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)途径可以防止这种情况发生。然而，这些防御机制并非总是有效。cGAS-STING途径发生在DNA损伤导致DNA释放到细胞质中时。细胞质DNA被cGAS检测到，从而激活STING蛋白，导致产生抑制肿瘤发展的I型干扰素。同样，肠道微生物群失调与MSH2和MLH1(参与错配修复(MMR)的蛋白质)的耗竭有关。如果没有DNA修复的正确调控，致癌突变的发生和持续存在的可能性就大得多。肠道微生物群通过糖酵解和脂质代谢参与肿瘤细胞代谢。肠道微生物群与免疫系统之间的Toll样受体(TLR)信号传导导致巨噬细胞中糖酵解上调和线粒体活性下调，进而导致可靶向肿瘤的促炎细胞因子释放增加。经肠道微生物群修饰的胆汁酸也被证明在调节肿瘤进展中发挥重要作用。最后，健康的肠道微生物群与促血管生成和抗血管生成化合物的平衡水平相关。研究表明，微生物失调与IL-6、IL-1β和VEGF-A水平升高有关，这些都有可能放大已在上调的肿瘤血管生成。 图2. 肠道微生物群紊乱导致肿瘤发生和发展的机制 理解天然肠道微生物群如何影响肿瘤发生、肿瘤代谢和血管生成为癌症治疗的新领域——工程化微生物作为精确工具来对抗这些相同的促肿瘤机制——奠定了基础。借助合成生物学和微生物工程的进步，研究人员现在正在重新编程有益细菌，使其能够感知、靶向和治疗特定类型的癌症。这些工程化微生物可以被设计为选择性地定植于肿瘤微环境(TME)，递送免疫治疗载荷，破坏癌症相关的代谢途径，或以受控方式调节免疫反应。为了更好地理解利用微生物对抗癌症的潜力，有必要了解微生物(无论是天然的还是工程化的)如何总体上影响人类健康。 >> 用于疾病检测和治疗的工程化微生物：利用微生物为人类医疗保健服务 微生物早已被用于人类医疗保健，基因工程的出现更增加了它们在治疗学中的潜力。这种潜力体现在疾病的诊断、治疗和管理，以及促进健康和预防疾病方面。基因工程微生物潜力的一个例子是工程化益生菌。工程化益生菌，被称为"智能益生菌"，是一种被"劫持"的天然微生物，用于感知特定疾病的生物标志物水平。响应于疾病生物标志物水平的升高，智能益生菌可以判断个体是否患病(诊断)，并可以释放抗疾病治疗药物(可根据所靶向的疾病而改变)。这具有联合效应，既能治疗已存在的疾病，又能通过早期识别和阻止其扩散来预防疾病。智能益生菌有许多优点。首先，益生菌的递送在定位和反应方面都具有高度选择性。其次，传统治疗药物生产和纯化所需的费用和时间将不再需要，因为微生物产生的药物是在原位制造的。最后，随着对疾病理解的深入或疾病本身的演变，智能益生菌的设计和实现可以轻松改变。研究已经开始突显基因工程乳酸菌(LAB)如乳酸乳球菌的潜在益处。乳酸乳球菌已被改造用作递送DNA疫苗的载体，而CRISPR-Cas系统的进展为工程化微生物的治疗应用带来了更多希望。其中一个例子是一株工程化的贝氏不动杆菌，它仅在存在具有特定致癌突变DNA时才表现出对某种药物的抗性，有效地充当了特定类型癌症的诊断工具。甚至已经开发出益生菌引导的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，以有效地将CAR-T细胞引导至肿瘤。在这个模型中，经过工程化改造表达特定抗原的EcN定植于肿瘤，然后施用经过修饰可识别这些抗原的CAR-T细胞，这些细胞浸润肿瘤，在那里有效杀死癌细胞。其他各种阶段也被工程化以克服可能由术后或其他感染引起的多重耐药菌。这些进展也使得开发针对特定复杂疾病(如癌症)的疫苗成为可能。 图3. 工程益生菌抵御疾病的直接(左)和间接(右)机制 >> 用于载荷递送的生物工程策略 微生物可被操纵的另一种方式是通过它们释放抗癌产品的机制，也称为它们的载荷递送机制。目前使用几种载荷递送机制，其中之一是异或(XOR)门放大基因开关。在这种机制中，一个终止转录的DNA序列(转录终止子)被两个重组位点包围，每个位点由研究者选择的两个不同信号之一激活。当两个信号中的其中一个存在时，转录终止子发生倒位，阻止其作用并允许基因表达。如果两个信号都不存在或同时存在，转录终止子将处于其原始方向，基因表达将被抑制。本质上，XOR门放大基因开关使得细菌仅在两个信号之一存在时递送其载荷。Zhou等人将XOR门放大基因开关整合到一株EcN中，以靶向结直肠癌。在该模型中，信号输出大约增加了两倍，体外结直肠癌细胞的细胞活力降低了30-50%。此外，在小鼠模型测试中，肿瘤生长受到50%的抑制。XOR门放大基因开关只是已应用于抗癌细菌疗法的众多机制之一。 群体感应是一种可用于确保在载荷递送开始前细菌种群足够庞大的技术。在这种机制中，每个细菌产生并释放称为自诱导物的信号分子。这些自诱导物激活通常以磷酸化级联反应结束的信号转导途径，最终产生载荷，但细菌仅在自诱导物水平达到一定阈值时才对其作出反应。这导致了细胞间的协调，使一群细菌能够作为一个整体行动，并仅在达到阈值种群密度时才递送其载荷。Swofford等人开发了一株沙门氏菌，通过群体感应选择性地递送其治疗剂，以减少对健康组织非预期的副作用。结果发现，在小鼠模型中，这种沙门氏菌在诱导分子达到特定阈值的癌组织中启动药物表达，但在肝脏中不产生任何药物。 基于群体感应，生物工程师设计了同步裂解回路，作为治疗性细菌递送其载荷的方式。在该途径中，群体感应用于确保工程化细菌中有足够的种群密度，但自诱导物不是导致载荷释放，而是激活细胞裂解途径。这有两个优点。首先，它消除了细菌释放载荷可能出现的错误或挑战的可能性。一旦种群密度达到阈值，细胞就会裂解，细菌产生的任何产物都被释放到肿瘤微环境中。其次，少数细菌会存活下来，使它们能够重新繁殖，然后循环再次重复。这允许一种循环载荷递送机制，其中治疗产品被重复释放。这种同步回路的一种变体是细菌联合体。细菌联合体是一种基因回路，其中两个独立的细菌菌株被混合到一个群体中，每个细菌产生另一种细菌信号分子的抑制剂。如果一个菌株被改造为在癌组织中增殖，而另一个在健康组织中增殖，就可以创建一个仅在肿瘤内释放载荷的系统，从而最大限度地减少不良副作用。Din等人工程化了一株使用这种同步裂解回路有效遵循抗癌药物脉冲式释放周期的细菌。使用这种菌株，患有肝癌的小鼠的肿瘤活性降低，存活率提高。 图4. 细菌载荷递送系统的工程原理示意图 最后，研究人员已经开发出机制，使细菌能够响应其环境的变化来递送载荷，例如通过温度依赖性和pH依赖性途径或响应光。生物工程师可以将环境依赖性启动子克隆到细菌中，这些启动子通过改变基因表达来响应外部环境的变化。就温度依赖性而言，华盛顿大学的研究人员开发了一种启动子，当温度降低时会激活细胞裂解途径。该模型可以被操纵以防止细菌将其载荷递送到健康组织，或者创建一个系统，其中有意识地在目标区域改变温度以诱导局部载荷递送。对于pH响应型启动子，可以操纵这些启动子以防止载荷释放，除非pH值充分下降，这是肿瘤微环境的一个特征。最近的研究发现，生物被膜或附着细菌的基质可以对光产生响应。这种称为光遗传学控制的机制，可以用来响应光的变化，通过生物被膜将抗肿瘤药物直接递送到肿瘤部位。这些机制中的每一种都允许将载荷直接局部递送到肿瘤，并降低影响健康组织的风险。 >> 联合疗法与协同策略 将靶向肿瘤的细菌与其他癌症疗法结合使用，已被证明可以通过解决标准癌症治疗无法克服的局限性(如免疫抑制、耐药性和肿瘤穿透性差)来改善临床结果。靶向肿瘤细菌的一个应用是与纳米颗粒结合使用，将癌症治疗药物运送到肿瘤部位并整体靶向免疫系统。纳米颗粒在癌症治疗中越来越受欢迎，因为它们可用于药物递送、基因治疗和成像。然而，要使纳米颗粒有效，它们需要穿过生物屏障，如内皮屏障、细胞屏障、皮肤屏障和粘膜屏障，这些屏障阻止纳米颗粒在肿瘤部位积聚。靶向肿瘤的细菌，如沙门氏菌和梭菌，会被肿瘤缺氧和血管化不良的坏死区域所吸引，这使得药物更难到达肿瘤。靶向肿瘤的细菌负载有携带化疗药物的纳米颗粒，可以作为载体迁移并穿透到肿瘤更深处释放治疗药物，从而实现更高的药物浓度和更低的全身毒性。肿瘤学家必须通过一个决策树来决定哪种疗法或联合疗法最适合他们的患者，而基于细菌的疗法显示出未来成为一种可行的治疗选择的潜力，无论是单独使用还是与其他疗法联合使用。 靶向肿瘤细菌与标准疗法结合的另一个应用是它们与免疫检查点抑制剂一起使用。这种方法可以通过克服药物递送不良和免疫激活受限等障碍，提高免疫检查点治疗的有效性。靶向肿瘤的细菌已被证明可以增强免疫检查点阻断疗法。免疫检查点抑制剂，如抗PD-1和抗PD-L1抗体，用于阻断抑制T细胞的蛋白质，使免疫系统保持活跃以识别和攻击癌细胞。然而，它们的有效性在"冷"肿瘤中受到限制。一些细菌可以通过激活先天免疫系统、产生细胞因子以及将免疫细胞吸引到肿瘤中来改变肿瘤微环境。细菌诱导的炎症可以将冷肿瘤转变为"热"肿瘤，使其对免疫检查点抑制剂有反应。一个例子是益生菌假长双歧杆菌产生肌苷。结果发现，假长双歧杆菌与免疫检查点抑制剂同时给药，可以同时提高免疫疗法的有效性并减少副作用，虽然确切的潜在机制尚不清楚，但很可能与肌苷的产生和释放有关。 第三，靶向肿瘤的细菌可以与光热疗法(PTT)配对，后者利用光吸收材料产生的热量来破坏癌细胞。在这种方法中，对细菌进行基因工程改造以制造金纳米颗粒，金纳米颗粒是微小的金粒子，可以吸收和散射光，使其成为癌症治疗和成像的有用工具。金纳米颗粒可以吸收近红外光。细菌将金纳米颗粒携带到肿瘤部位，一旦近红外光使纳米颗粒产生局部热量，它们就会杀死癌细胞而不损伤周围组织。与靶向肿瘤细菌一起使用的PTT可以实现精确有效的肿瘤破坏，同时通过杀死肿瘤后释放肿瘤抗原引发抗肿瘤免疫反应。用于PTT的细菌载体可用于确保热量在需要的地方精确产生，甚至在肿瘤的深部区域也是如此。 此外，靶向肿瘤的细菌已被证明与化疗一起使用时是有益的。标准化疗由于肿瘤的缺氧和坏死区域无法通过血管到达，难以完全杀死肿瘤，这意味着化疗药物无法到达肿瘤的全部。然而，靶向肿瘤的细菌可以到达肿瘤内严酷的缺氧区域，使其成为局部药物递送的理想候选者。一项研究展示了使用细菌将常用化疗药物阿霉素直接递送至肿瘤，实现了肿瘤缩小并减少了副作用。靶向肿瘤细菌与化疗药物一起使用改善了肿瘤内的药物分布，并有效降低了全身毒性。 最后，细菌也被证明可以与放射疗法有效配合。放疗通过破坏癌细胞的DNA起作用，导致细胞死亡，并通过释放肿瘤相关抗原增加肿瘤细胞对免疫系统的可见性。然而，由于放射诱导的DNA损伤依赖于氧气，放疗在肿瘤的某些区域效果不佳。靶向肿瘤的细菌，尤其是厌氧菌株，可以整合到这些缺氧区域，并刺激细胞因子释放以激活更多免疫细胞。细菌在放疗无法到达的肿瘤区域的定植，弥补了放疗在缺氧区域效率不足的问题。放疗和靶向肿瘤细菌的结合可以导致肿瘤细胞直接杀伤、放疗诱导的肿瘤细胞DNA损伤以及免疫激活。 >> 针对特定类型癌症的微生物组工程研究 理解天然肠道微生物群影响肿瘤生物学的多种机制——从DNA损伤到代谢重编程和血管生成调节——已经催化了治疗策略的范式转变。这导致了能够精确靶向肿瘤、重塑TME和增强抗癌免疫力的工程化微生物疗法的出现。利用合成生物的进展，研究人员设计了细菌平台，将细胞毒性剂、免疫调节蛋白甚至放射增敏剂直接递送至肿瘤。以下示例展示了如何定制工程化微生物，通过新颖机制对抗特定类型的癌症。 基于上述机制理解和工程策略，研究人员已经开始开发专门针对个体癌症类型的细菌。从肿瘤微环境特征到免疫景观，癌症的异质性需要针对特定癌症的治疗方法。以下部分探讨了针对四种主要癌症类型：胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌的工程化微生物疗法。 胰腺癌中的工程化微生物组 胰腺癌具有高死亡率和发病率，是所有癌症中预后最差的类型之一。最近，关于健康组织和癌变胰腺组织都是无菌位点的观点受到了挑战。这种微生物组，尤其是在肿瘤中的，已被证明与胰腺癌的各个方面有关，包括诊断、进展、治疗和治疗耐药性。在胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤中，最普遍的细菌门是变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，真菌门是子囊菌门和担子菌门，这可能作为筛查或诊断PDAC的潜在生物标志物。通过调节先天性和适应性免疫系统，PDAC肿瘤中的胰腺微生物组促进了PDAC的进展。PDAC微生物组激活补体系统的凝集素途径、释放中性粒细胞趋化因子、刺激肿瘤相关巨噬细胞2以及减少CD8+T细胞，创造了一个允许PDAC进展的免疫抑制肿瘤微环境。抗生素和益生菌的研究都证明了PDAC微生物组在癌症治疗中的作用。当给患有PDAC的小鼠施用抗生素时，肿瘤进展受到抑制。同时，PDAC患者接受抗生素治疗后，预后得到改善。益生菌补充剂，特别是乳酸杆菌，具有减少胰腺癌前病变和减缓PDAC癌细胞增殖的作用。研究还表明，PDAC微生物组中的细菌可以赋予PDAC对化疗的耐药性。在另一个例子中，经过工程化改造表达溶细胞素A的鼠伤寒沙门氏菌通过静脉注射给药，导致在携带皮下或原位人胰腺肿瘤的裸鼠肿瘤微环境中释放溶细胞素A。还开发了表达胶原酶(Streptomyces omiyaensis胰蛋白酶，SOT)的鼠伤寒沙门氏菌载体，用于靶向PDAC中富含胶原蛋白的细胞外基质。在侵袭性PDAC模型中，这种疗法降解了瘤内胶原蛋白，减少了肿瘤细胞增殖和免疫抑制细胞，并重塑了肿瘤微环境以支持潜在的免疫疗法。表达细菌透明质酸酶的靶向肿瘤鼠伤寒沙门氏菌被开发用于降解胰腺肿瘤中的透明质酸。hBs-ST有效定植于PDAC肿瘤，消耗肿瘤透明质酸，并增强细菌在致密肿瘤基质内的扩散。该策略显示出改善药物递送同时减少肿瘤外毒性的潜力。 乳腺癌中的工程化微生物组 乳腺癌是最常见的癌症形式之一，其目前的治疗存在两个问题：缺乏特异性和靶向效率低效。2024年的一项研究旨在通过设计和工程化大肠杆菌BL21，使其表达选择性结合乳腺癌细胞上HER2+受体的纳米抗体来克服这些障碍。在这项研究中，表面表达的纳米抗体用于帮助促进大肠杆菌与乳腺癌细胞的结合，并且在附着后，大肠杆菌释放HlyE，这是一种形成孔道杀死乳腺癌细胞的毒素。结果表明，他们工程化的大肠杆菌显示出对癌细胞有效且高效的治疗。然而，这些实验仅在体外进行。另一项发表于2022年的研究测试了一种对热敏感的工程化大肠杆菌Nissle1917(EcN)。在这个设计中，EcN会在体内响应特定温度释放TNF-α。选择温度调节是因为与目前的其他调节方法(化学物质或光)相比，它具有许多优点，例如更可控，并能更好地扩散到深层组织中。结果显示，在热刺激工程化EcN后，肿瘤受到抑制。除了体外和啮齿动物测试外，目前还有一项I期研究，将基因工程改造的表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)的麻疹病毒施用于转移性乳腺癌患者，以确定脱落情况和免疫应答率。另一种策略利用过度囊泡化的EcN(ΔECHy)通过外膜囊泡递送ClyA-透明质酸酶融合蛋白。这种设计靶向并降解肿瘤基质，特别是透明质酸，透明质酸是免疫细胞和药物渗透的主要屏障。递送CHy重塑了致密的细胞外基质，增强了肿瘤对检查点抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的可及性。当与拉帕替尼联合用于携带4T1肿瘤的小鼠时，ΔECHy显著改善了治疗反应并延长了生存期，从而强调了细菌介导的基质调节的作用。 肺癌中的工程化微生物组 肺癌是癌症相关死亡的主要原因，也正在开始被研究作为工程化微生物的靶点。2022年的一项研究探索了使用改良的鼠伤寒沙门氏菌来帮助治疗非小细胞肺癌，这是肺癌最常见的亚型。研究人员设计了一种释放θ-毒素(一种成孔毒素)的细菌，以杀死NSCLC细胞。他们发现，表达θ-毒素的鼠伤寒沙门氏菌导致了更多的细胞死亡。同时，研究人员发现，用改良的鼠伤寒沙门氏菌处理的NSCLC球状体的细胞活力显著降低。这些有希望的结果，尽管是在体外，也值得在活体小鼠模型中探索这些细菌。给小鼠接种NSCLC肿瘤，然后实验组用工程化的鼠伤寒沙门氏菌治疗。实验组不仅显示出肿瘤生长的显著减少，而且小鼠的外周器官未受治疗影响。外周器官中未检测到鼠伤寒沙门氏菌，未显示凋亡迹象，并且在治疗期间小鼠未显示发病迹象。这意味着工程化的鼠伤寒沙门氏菌在治疗NSCLC方面非常有效，同时没有显示出任何全身毒性迹象。研究人员还指出，如果与其他标准抗癌疗法联合使用，沙门氏菌的治疗效果可能会得到提高。一项I期研究针对患有多种癌症类型的患者进行，其中测试的包括NSCLC。将CRS-207，一种经过广泛研究的释放间皮素的单核细胞增生李斯特菌菌株，给予NSCLC患者，结果发现这些患者产生了诱导的先天性和适应性T细胞反应。这种在人类癌症患者研究中的成功是细菌癌症疗法的一个重要进步，并再次强调了这些疗法在未来癌症治疗中的巨大潜力。 结直肠癌中的工程化微生物组 结直肠癌是另一种正在被研究作为细菌疗法靶点的癌症。一项研究特别在老鼠和人类群体中测试了工程化EcN对结直肠腺瘤的作用。这项研究发现了许多有希望的结果。首先，口服经过改造可释放细胞周期抑制剂和细胞因子GM-CSF的EcN，在小鼠模型中显示可减轻微卫星稳定型结直肠癌的负担。这尤其有趣，因为这种结直肠癌亚型在人类中通常对这些抑制剂的全身给药无反应。同时，虽然潜在机制尚不清楚，但给药的EcN似乎重塑了肿瘤微环境。T细胞通常由于其低氧条件无法在肿瘤微环境中thrive，导致T细胞排斥，其特征是T细胞仅存在于肿瘤外周。然而，治疗组显示出T细胞浸润到肿瘤核心的增加，这证明EcN有助于为T细胞创造更适宜的微环境。这些研究人员还发现，这种EcN可用于辅助结直肠癌的诊断。他们利用EcN定植结直肠肿瘤的能力，展示了通过非侵入性粪便和尿液检测诊断结直肠腺瘤的可能性。除了癌症治疗，基于微生物的癌症疫苗也在开发中。在这项研究中，Vaaben等人工程化了EcN以产生吲哚-3-乙酸，一种芳基烃受体激动剂，并评估了其在结直肠癌模型中的治疗潜力。将工程化菌株(EcNIAA)瘤内注射到携带CT26和MC38CRC肿瘤的小鼠体内，导致肿瘤生长显著减少，生存期延长，以及CD4+和CD8+T细胞浸润增加。IAA的产生激活了肿瘤微环境中的AhR，促进了以IFN-γ和CXCL9升高以及IL-17A减少为特征的促炎免疫反应，且无脱靶效应或全身毒性。值得注意的是，EcNIAA治疗的小鼠在再次挑战后也表现出长期的肿瘤免疫力，突显了这种基于微生物组的疗法在增强CRC抗肿瘤免疫力方面的潜力。在另一种方法中，EcN被工程化以表达FyuA受体，允许选择性摄取铜基放射性核素。这些细菌定植于肿瘤，并作为原位生物反应器，为实体瘤实现预靶向治疗诊断平台。该系统绕过了对肿瘤特异性抗原的需求，为治疗包括MC38结肠肿瘤在内的非表位依赖性癌症提供了一种强大的策略。用工程化EcN和放射性核素治疗的荷瘤小鼠显示出增强的存活率和有利的CD8+T细胞与Treg比率，强调了该平台的免疫调节益处。 跨癌症类型的工程化微生物策略比较评估 工程化微生物疗法在胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌中表现出多样化的作用机制，反映了肿瘤微环境、基质结构、免疫浸润和常驻微生物群的深刻生物学差异。虽然每种癌症类型都呈现出有前景的工程化微生物干预实例，但细菌策略的适用性和功效在很大程度上取决于肿瘤特定的限制条件。以下，我们综合了关键的工程方法，强调了它们的共同原则，并批判性地评估了它们在癌症背景下的优势和局限性。 胰腺导管腺癌(PDAC)由于其广泛的纤维化基质、致密的细胞外基质、极端缺氧和免疫抑制微环境，为微生物疗法提出了最具挑战性的环境之一。因此，PDAC的工程努力强调了ECM降解酶(如胶原酶、透明质酸酶)以改善细菌渗透和药物扩散，以及通过沙门氏菌瘤内定植递送细胞毒性蛋白。这些策略有效地重塑了基质并抵消了免疫排斥，但需要仔细控制以避免肿瘤外基质降解和炎症毒性。 相比之下，乳腺肿瘤，特别是HER2阳性亚型，受益于表面展示的纳米抗体和靶向受体结合机制，这些机制能够实现高精度的细菌定位。热或刺激响应型基因回路在调节乳腺肿瘤内的细胞因子(如TNF-α)释放方面显示出前景。然而，乳腺癌的缺氧梯度不如PDAC一致，使得缺氧依赖性策略不太可靠。在此，基于OMV的递送系统和受体靶向方法提供了卓越的特异性，尽管它们在体内的持久性和生物分布仍然是挑战。 用于肺癌(特别是NSCLC)的工程化微生物通常优先考虑受控的细胞毒性蛋白递送(例如θ-毒素)和全身安全性，因为存在肺部炎症的高风险。鼠伤寒沙门氏菌菌株在啮齿动物模型中已显示出强大的肿瘤选择性和安全性，且无外周器官定植。然而，肺部肿瘤具有高度可变的氧合作用、不规则的免疫浸润模式和复杂的结构屏障，因此需要严格调控的基因回路和故障安全机制来减轻全身毒性的风险。 结直肠癌与其他癌症类型显著不同，因为肠道腔天然harbors丰富的细菌种群。这使得结直肠癌特别适合于口服递送工程化益生菌，如大肠杆菌Nissle1917。诸如分泌GM-CSF、递送细胞周期抑制剂、诱导T细胞浸润、原位肿瘤诊断以及芳基烃受体激动剂产生等策略，利用了EcN的天然定植能力。结直肠癌也受益于创新的治疗诊断平台(例如，装载放射性核素的细菌)，这是由于肿瘤的可及性和细菌的容许性。然而，肠道微生物组的复杂性可能会降低定植的一致性，并且免疫相互作用在患者之间仍然存在差异。 在所有癌症类型中，出现了几个共同的主题。具有致密基质和缺氧的肿瘤需要增强穿透能力和适应代谢的细菌。具有明确细胞表面靶点的肿瘤有利于受体特异性结合和OMV递送系统。具有高全身炎症风险的肿瘤需要严格调控的回路以最小化脱靶毒性。具有天然细菌容许性的肿瘤支持口服细菌给药和复杂的治疗载荷。最终，没有一种单一策略是普遍最优的；相反，最有效的治疗设计整合了多种模式，例如ECM降解与OMV递送相结合，或代谢自噬与逻辑门控载荷释放相结合，以适应每种肿瘤类型独特的生态和免疫学景观。 利用微生物及其产品开发新型癌症疫苗 微生物和微生物产品长期以来一直是疫苗开发和使用的基础。大多数当前疫苗来源于灭活或减毒的微生物。微生物产品，如毒素和抗原，也已被用于疫苗。一个例子是白喉-破伤风类毒素-百日咳疫苗。在疫苗中使用灭活的白喉和百日咳毒素已被证明能有效诱导抗毒素的产生。基于微生物的疫苗一个有趣突破是癌症疫苗的开发。人体对癌症的自然攻击基于抗原呈递细胞接收来自癌细胞抗原信号的能力，然后激活免疫系统的其他各个部分，如细胞毒性T细胞和辅助T细胞。然而，肿瘤的缺氧环境使得这关键的第一步难以发生。通过使用工程化细菌(它们在缺氧环境如肿瘤微环境中thrive)作为递送载体，抗肿瘤疫苗可以更有效和高效地递送。抗肿瘤药物通常在工程化细菌内部产生，因此开发了三种递送系统来克服这一障碍。首先，工程化细菌被改造为在内部表达药物，然后响应于足够的种群密度通过裂解释放。其次，工程化细菌可以被改造为在其表面呈递药物，以引发更强大的体液和细胞介导的免疫。第三，工程化细菌可以被改造为在产生后简单地分泌药物。目前，成功的基于微生物的癌症疫苗的开发关键在于磨练对这些微生物可用于靶向癌症的确切机制的理解。 图5. 利用EcN进行抗癌治疗的两种创新方法。 A)对EcN进行工程化改造以表达FyuA，使其能够摄取放射性核素。 B)对EcN进行工程化改造使其过度囊泡化，通过外膜囊泡(OMVs)递送抗癌药物。 >> 临床管线与监管格局 除了前面讨论的体外和体内研究外，几项值得注意的临床研究也已经启动。在一项I期研究中，一株工程化的ECN菌株被改造为在缺氧条件下产生激活STING途径的环二核苷酸，从而在肿瘤中诱导免疫反应。这项研究发现，在24名患者中，重复施用SYNB1891，无论是单独使用还是与阿替利珠单抗联合使用，都被认为是安全的且参与者耐受性良好。同时，干扰素调节基因、细胞因子和T细胞的上调表明STING途径按预期被激活。然而，这项研究已不再开发中。在另一项II期临床研究中，沙门氏菌被改造为在肿瘤局部释放人白细胞介素-2，以在胰腺癌患者中诱导自然杀伤细胞和T细胞。这种沙门氏菌菌株，Salmonella-IL2或Saltikva，与标准化疗方案FOLFIRINOX联合施用。该研究是成功的，显示出73%的部分缓解率，24个月的中位生存期，意味着Saltikva和FOLFIRINOX的联合使用使中位生存期大约翻倍。 虽然在使用细菌作为癌症疗法的临床研究中取得了成功，但讨论失败的研究也很重要，包括它们失败的原因以及可以从中吸取的教训。一个例子是CRS-207的II期研究，这是一种改良的单核细胞增生李斯特菌菌株，它在肿瘤中产生间皮素以激活免疫反应。该菌株的I期研究结果令人鼓舞，无进展生存期和总生存期分别达到7.5个月和14.7个月，并显示出免疫细胞浸润肿瘤的证据。然而，在II期研究中，虽然被证明是安全的，但与免疫治疗药物帕博利珠单抗联合使用时未观察到临床活性，进一步的评估导致CRS-207的开发被终止。类似地，一项I期研究研究了VNP20009(一种在抑制小鼠肿瘤生长方面显示出效果的改良鼠伤寒沙门氏菌菌株)对转移性癌症患者的影响。在临床研究中，VNP20009被证明是安全且耐受性良好的，但它没有显示出任何抗肿瘤效果。在这些研究的每一个中，重要的是要注意细菌疗法没有引起严重的不良反应，甚至被认为被患者良好耐受。这些研究的缺点在于对整个癌症治疗的有限效果，这表明研究人员应该更多地尝试理解和完善细菌抗肿瘤机制以及细菌-宿主相互作用。 这些基于细菌的疗法开发和测试的监管是生物工程师面临的另一个独特障碍。监管机构如美国食品药品监督管理局，特别是其生物制品评价与研究中心部门监督这些研究。研究人员在开发新的细菌治疗方法时必须考虑的一些因素包括细菌的安全性和控制、制造和标准化、环境风险以及临床研究设计。此外，基于细菌的疗法根据其作用机制可分为两类：活体生物治疗产品或基因治疗产品。LBP是排除疫苗、病毒和基因转移载体的活微生物，而基因治疗产品旨在简单地将新的遗传物质引入患者的细胞。这些分类各有其自身的监管流程，最大的区别是由于基因治疗产品的复杂性和长期安全性问题，对其有更严格的指南。有文件概述了这些针对基于细菌疗法的研究的法规和指南，如《制药微生物学手册》和《研究性新药申请》。然而，FDA指定的"再生医学先进疗法"等途径允许特别创新的药物和疗法加速测试和批准流程。 >> 制造与放大挑战 虽然基于微生物的癌症疗法的最新进展充满希望，但也应注意，将其治疗潜力转化为可行的临床产品伴随着几个制造和放大的挑战，这些挑战可分为三组：上游工艺、下游工艺和质量控制。 上游工艺中的两个主要放大挑战是培养基优化和工艺控制。从实验室小规模推进到这些细菌疗法的大规模生产将需要大量的材料。因此，开发高效且成本效益高的培养基至关重要，这些培养基能支持细菌的最佳活性，同时遵循安全指南，这对研究人员来说是一个重大挑战。此外，拥有大量需要生长的细菌和更大体积的培养基，使得维持细菌的最佳环境条件(包括pH值、温度和营养物可用性)更具挑战性。 涉及分离细菌的下游工艺相关的挑战包括细菌的纯化、稳定性和环境安全。从生长条件和宿主细胞中有效去除杂质，而不影响活体治疗药物的活力，特别是在生产大量细菌时，是放大带来的另一个重大挑战。有待克服的另一个障碍是开发安全且环境友好的方式来储存这些细菌。当大规模生产细菌时，创建确保长保质期、维持其稳定性并对其安全性和活力影响有限的储存制剂非常重要。环境考虑因素也是生产活体治疗药物中的一个问题，因为需要有安全措施来确保其妥善控制。目前，采用了几种策略；这些设施中使用带有HEPA过滤器的专用空气处理系统和受控访问点，使用无菌密封包装运输活细菌，并实施适当的废物处理技术。 最后，质量控制挑战主要以保持批次一致性的形式出现。生产的每一批细菌相互保持一致至关重要，既为了维持其临床效果，也为了确保患者的安全使用，但由于微小的突变和遗传变异，确保细菌的一致性往往很困难。用于保持批次一致性的一些策略包括标准化生长细菌的环境条件，以及持续监测和调整细菌菌落，这使得能够快速检测和响应可能生长不规则的菌落。同时，实践和遵守良好生产规范指南有助于保持一致性。GMP是活体治疗药物开发者和生产者遵循的框架，以确保其产品的适当质量和安全性，它包括关于设施设计、产品表征和验证以及质量管理的指南。在LBTs方面遵守GMP指南的最大挑战之一是细菌系统的复杂性，这可以通过创建和调整更强大的生物测定来测试这些细菌来克服。 在讨论细菌癌症治疗药物的制造时，随着它们在临床上变得越来越相关，还应考虑经济因素。随着LBT生产的扩大，运营成本也将增加。这源于需要建造和维护生产设施、专用设备、增加原材料(如培养基和营养物质)以及足够训练有素的人员。然而，对LBTs的需求预计会增加，特别是随着它们被进一步理解并持续显示出临床成功。各种分析预测，未来几年LBT市场的年复合增长率将在7%到15%之间。 >> 讨论 人类与微生物的关系已从恐惧和避之不及演变为对其治疗潜力的深刻认识。正如在不同疾病模型中所展示的——从癌症到心血管疾病，再到代谢、呼吸和神经系统疾病——微生物疗法代表了现代医学的一个变革性转变。临床格局以及将基于细菌的癌症疗法纳入医疗实践似乎正在迅速推进，有多个临床研究正在进行中。这些研究的成功显示了治疗性细菌的前景，而失败的研究则有助于完善和进一步理解它们工作的机制。 最近的技术突破为抗癌微生物的开发提供了进一步的机会。AI的进步和模拟生物途径和相互作用的算法的开发，对于预测和创造新的载荷递送机制将非常有帮助。同时，基因编辑系统如CRISPR-Cas的进展将使细菌工程更加高效和准确。最后，标准组学技术和测序分析的完善将有助于在小型实验室和大型制造设施中生产和测试安全的活体细菌疗法。 尽管取得了这些进展，几个挑战依然存在。首先，人类微生物组的复杂性和个体间差异使得标准化微生物疗法变得困难。基于地理、饮食、遗传和既往病史的微生物组组成差异可能影响治疗结果，导致临床前和临床研究之间的不一致。此外，关于微生物-宿主相互作用的机制基础，包括哪些特定的微生物菌株和代谢物驱动健康益处或疾病进展，仍然很大程度上未知。没有这种机制上的清晰度，治疗应用可能存在非特异性或不可预测的风险。在生产和制造方面，扩大规模并保持批次间的一致性，同时遵守严格的安全指南，是另一个障碍。最后，防止细菌的自发突变和进化将是一个需要持续监测的挑战。 为了充分实现微生物疗法的潜力，未来的研究必须优先考虑两个主要方向。首先，更深入的机制研究对于揭示微生物与宿主组织之间的分子相互作用至关重要。利用多组学技术——包括单细胞基因组学、代谢组学和空间转录组学——将是破译微生物代谢物、细胞外囊泡和表面分子如何调节宿主途径的关键。识别能够预测治疗功效的可靠微生物生物标志物将允许进行更个性化的基于微生物组的干预。其次，合成生物学的创新可能会继续完善微生物工程平台。开发能够感知、响应和适应动态疾病微环境，同时最大限度地减少意外系统性效应的可编程益生菌至关重要。将微生物疗法与传统的治疗方法(如免疫疗法、放疗、化疗)相结合，可能会在复杂疾病如癌症中产生协同效益。微生物疗法在预防保健中的应用是另一个令人兴奋的前沿领域，沿着这些方向前进可能会从根本上改变医疗保健范式。 结论 微生物科学和合成生物学的快速发展揭示了微生物是抗击多种疾病的有力盟友。生物工程技术的进步、各种载荷递送技术的创造以及细菌疗法在实验室和临床研究中与其他疗法联合或单独取得的成功，为未来微生物药物的临床转化奠定了基础。尽管目前的研究集中在主要的癌症类型上，但未来细菌疗法研究的进展可能会使一些研究不足的亚型，如平滑肌肉瘤、神经内分泌癌或甲状腺癌等受益。该领域的下一步可能是进一步阐明微生物与肿瘤及宿主生理学相互作用的机制，并继续完善用于创建和生产新型治疗性细菌的合成生物学平台。尽管在机制理解、安全性和监管批准方面仍然存在重大挑战，但临床前和临床研究的早期成功是令人信服的。随着研究的推进，微生物疗法有望重新定义现代医学的格局，为人类面临的一些最复杂和神秘的疾病提供新颖的解决方案。 /////////////////// 参考文献： Canowitz A, Kamble NS, Muck N, Kaur K, Garay N, Bellala P, Gabani BB, Kotagiri N. Microbial medicines: Unlocking the therapeutic potential of the microbiome in cancer treatment. J Control Release. 2026 Feb 12;392:114720. doi: 10.1016/j.jconrel.2026.114720. Epub ahead of print. PMID: 41690480.