Nivolumab

10 月 22 日早上，业界传来一项天价合作消息：信达与武田就前者的新一代肿瘤免疫（IO）及抗体偶联药物（ADC）达成全球战略合作，合作总金额高达 114 亿美元，刷新了中国新药出海的新纪录。 信达此前曾洽谈过众多合作伙伴，不乏其它 MNC，为何最终选择了武田？授权合作的几款产品市场潜力有多大，为何值这么多钱？本文将结合信达高管在今天上午电话会议上的介绍以及公开资料做简单梳理，仅供参阅。 截图来源：信达官网 为什么选择武田？ 据信达在电话会议中介绍，过去一年时间中，其曾与多家合作伙伴洽谈过，其中也包括全球肿瘤能力很强、规模比武田还大的企业。最终选择武田主要有以下几方面的原因： 第一、武田是制药企业从亚洲走向世界的一个典范。过去几年，他们通过对 Millennium、 Shire 等的收购，从一个亚洲公司转变成了一家全球领先的制药公司，是一个值得学习的榜样。 第二、武田资金实力非常雄厚，去年营收约 300 亿美金，其中有 52% 是来自美国，北美加上欧洲一共超过 75%，业务遍布全球 80 多个国家和地区，有约 5 万多名员工，是一家地地道道具有全球化能力的企业。 第三、武田的研发实力也非常强大，它们在全球有 4500 名 R&D 人员，在日本、美国和欧洲都有 R&D 团队，每年研发投入有约 50 亿美金。 第四、武田的团队模式也与信达高度契合，过去一年中，双方的团队沟通、合作非常顺利；双方对 IBI363 和 IBI343 两个分子的开发理念也高度契合。 第五、武田的肿瘤业务拥有一个非常强大的领导团队，其全球肿瘤业务部总裁 Teresa 曾在 BMS 担任高级副总裁兼全球肿瘤商业化负责人，在推出 Opdivo、加速肿瘤药物研发管线以及制定免疫肿瘤产品组合的长期战略中发挥了关键作用。另外，武田的肿瘤业务负责人 P.K. Morrow，曾在安德森癌症中心（MD Anderson Cancer Center）、安进等任职，也拥有丰富的肿瘤药物研发经验。 所以，依托信达生物在 IO 与 ADC 领域的专业洞见和丰富积累，以及武田在全球开发和商业化方面的深厚经验与强大实力，双方将通过协同一致的临床开发计划，加速将信达生物的新一代肿瘤疗法推向全球市场，实现产品价值最大化。 而对武田而言，IBI363 和 IBI343 也有望为其肿瘤管线带来颠覆性突破，并显著提升武田在 2030 年后的增长潜力。 为何选择 Co-Co 合作模式？ 为何选择 Co-Co 模式，还要从信达生物的目标和愿景说起。 在 2021 年时，信达曾规划公司的第二个十年发展目标，希望到 2030 年成为一家具有全球开发能力、产业化能力和商业化能力的公司。 信达给自己立的目标是：到 2027 年，产品收入达到 200 亿人民币；到 2030 年，至少推动 5 个管线进入全球多中心 III 期临床研究，海外销售占比 40%。 所以，信达需要的不止是商业化层面的合作，而是希望借助商业合作把信达的全球化能力建设起来。只有通过 Co-Co 模式合作中，才有可能实现这一目标。 本次与武田的合作，12 亿美元（含 1 亿美元的溢价战略股权投资）的首付款和高达 114 亿美元的合作总金额，并不是信达最为看中的。信达更为看重的是合作带来的长期价值，既希望通过与武田的 Co-Co 合作，深度参与药品的海外开发和商业化，借助武田的丰富经验，搭建其全球开发、商业化能力，实现五年后成为一家具有全球化能力的公司的目标。 截图来源：信达官网 三款产品有何治疗潜力， 撑起天价 Deal? IBI363：潜在 FIC 产品 IBI363 是信达生物自主研发的全球首创（FIC）PD-1/IL-2α-bias 双特异性抗体融合蛋白。该药采用独特的 PD1 单抗和 IL-2 融合设计，通过「松刹车」和「踩油门」实现效应 T 细胞的双重激活。IBI363 的 IL-2 臂经过了设计改造，保留了其对 IL-2α 的亲和力，但削弱了对 IL-2Rβ 和 IL-2Rγ 的结合能力，以此降低毒性；而 PD-1 结合臂可以同时实现对 PD-1 的阻断和 IL-2 的选择性递送。 IBI363 已在前期研究中已展示出优秀的治疗潜力。2025 年 ASCO 大会上公布的 Ib/II 期临床数据显示，IBI363 在免疫耐药肺癌、肢端型/黏膜型黑色素瘤以及微卫星稳定型（MSS）结直肠癌等 「冷肿瘤」中，均展现出优异的肿瘤响应与初步生存获益。 目前 IBI363 已进入多项注册临床开发，包括一项针对 IO 耐药鳞状非小细胞肺癌（sqNSCLC）的全球 III 期注册临床研究在未来数月内启动；该适应症已获中国 NMPA 突破性疗法认定、美国 FDA 快速通道资格。 截图来源：信达官网 根据协议，信达与武田将在全球范围内共同开发 IBI363，并按照 40/60 比例（信达/武田）分担开发成本；双方将在美国共同商业化 IBI363，并按照 40/60 比例（信达/武田）分配美国市场利润或损失。武田将在共同治理和协同一致的开发计划下主导共同开发及共同商业化的相关工作。 此外，信达将授予武田 IBI363 除大中华区及美国以外市场的商业化权益。武田将拥有在大中华区以外供应 IBI363 的全球生产权, 并与信达共同享有在美国市场商业化供应的独家权利。武田需向信达就大中华区以外市场支付潜在的研发与销售里程碑付款，并按大中华区及美国以外市场净销售额的比例支付最高可达十几百分比的高位的梯度销售分成。 未来，双方将共同推进经达成一致的临床开发计划，加速探索并最大化 IBI363 作为新型 IO 基石疗法的临床潜力。基于目前已积累的超过 1200 例患者的扎实临床数据，双方将率先推进 IBI363 于非小细胞肺癌（NSCLC）与结直肠癌（CRC）的全球开发，包括着重拓展一线 NSCLC 和一线 CRC 适应症；此外，双方计划于近期启动 IBI363 更多适应症的临床开发。 截图来源：信达官网 IBI343：CLDN18.2 ADC IBI343 是信达生物自主研发的一款创新型靶向 CLDN18.2 的拓扑异构酶 1（TOPO1）抑制剂类 ADC，具有高稳定性和强杀伤作用，已在临床中显示出优异的安全性特征与令人鼓舞的疗效信号。 据信达生物介绍，IBI343 具有两个潜在的优势：一是安全性方面，相对于其他 ClDN18.2 同类产品有极大提升，可以和化疗进行联合治疗探索；二是，已在一线治疗中显示出了独特的差异化优势。 目前，IBI343 正在中国与日本开展针对胃/胃食管交界处癌的 III 期临床研究（G-HOPE-001），该适应症已获中国 NMPA 突破性疗法认定；同时，IBI343 针对既往接受过治疗的胰腺导管腺癌（PDAC）的全球 I/II 期临床研究已完成，该适应症已获中国 NMPA 突破性疗法认定，以及美国 FDA 快速通道资格。 截图来源：信达官网 根据协议，信达生物将授予武田制药 IBI343 在大中华区以外地区的全球独家开发、生产与商业化权益。武田制药将重点拓展 IBI343 的全球开发至一线胃癌与一线胰腺癌治疗领域。针对此次授权，武田制药将向信达生物支付潜在里程碑付款和最高可达十几百分比的高位的梯度销售分成。 IBI3001：EGFR/B7 H3 ADC IBI3001 是一款处于 I 期临床阶段的全球首创靶向 B7-H3 与 EGFR 的双抗 ADC，具备多重抗肿瘤机制，包括增强型 EGFR 阻断作用、受体介导的内化作用，以及强效 ADC 介导的细胞毒性，并在临床前模型中展现出高安全治疗窗口。IBI3001 也是全球首个进入临床的 EGFR/B7 H3 ADC。 根据协议，信达生物将授予武田制药 IBI3001 在大中华区以外地区的全球独家开发、生产与商业化权益的选择权。若武田制药行使该权利，将向信达生物支付行权费、潜在里程碑付款，和最高可达十几百分比的中位的梯度销售分成。 截图来源：信达官网 新品试用 国产突破：GC-CEX 系列高密度细胞培养瓶 通过底透气膜创新表面微结构设计与材料工艺优化，可实现对 G-Rex 系列高密度细胞培养瓶的完美替代。 6孔/24孔/100ml培养罐 新品试用申请 活动时间：9-10月 关于医麦优品 作为专注生物创新药领域的赋能电商平台，医麦优品已汇聚 500+ 国内外优质供应商（覆盖设备、试剂原料、耗材、技术服务等），现开放「需求速配」 绿色通道，助力高效供需对接。诚邀更多合规供应商入驻平台，更多采购需求/线索将不定期发布。 如何入驻医麦优品？ ①扫码加入 「医麦优品采购供需社群」 ②点击阅读原文，1个工作日反馈，专属顾问1对1服务

好文阅读： 这篇文章于2025年10月17日发表在《Antibody Therapeutics》，主要研究提出了一种新型的IgG型bsAb平台，该平台通过集成合理设计的抗原结合VHHL实现，为多功能抗体的开发提供了一种简化和通用的策略。 摘要： 背景：双特异性抗体（bsAbs）作为最有前途的下一代抗体疗法之一，因其独特的双靶向机制而受到越来越多的关注。然而，目前的bsAb形式由于结构复杂，往往面临表达水平低、均匀性差、治疗效果不稳定等挑战。因此，迫切需要克服当前的技术限制，开发结构更稳定、表达效率更高的bsAb新形式。 方法：通过合理的设计和基于噬菌体展示的筛选，我们设计了一种新型的轻链单域抗体（VHHL）。采用模块化组装和替换策略，将VHHL复溶为常规免疫球蛋白G（IgG），并通过尺寸排阻高效液相色谱、生物层干涉结合法、酶联免疫吸附法和流式细胞术对所得bsAb进行全面表征。 结果：开发了一种将互补性决定区3（CDR3）接枝与CDR1/CDR2定点诱变相结合的轻链工程策略，以生成VHHL。通过噬菌体筛选，鉴定出两种具有良好结合亲和力和生物物理特性的小鼠CD16特异性VHHL候选物，其中一种通过X射线晶体学（3.05Å分辨率）进行结构解析。当掺入全长IgG中时，所得的bsAb保留了与天然单克隆抗体的高度结构相似性，并通过各自的轻链和重链保持双抗原结合能力。 结论：因此，本研究提出了一种新型的IgG型bsAb平台，该平台通过集成合理设计的抗原结合VHHL实现，为多功能抗体的开发提供了一种简化和通用的策略。 【NO.1】介绍 抗体治疗作为生物制药领域的基石，继续引领着全球生物制药市场。近年来，随着抗体工程的不断进步，各种新型抗体疗法不断涌现，并迅速在生物制药市场站稳脚跟。这些下一代抗体药物的特点是效率更高、特异性更高、安全性更高。其中，双特异性抗体（bsAb）药物因其独特的双靶点机制，成为增长最快、应用最广泛的品类之一。自2009年全球首个双抗药物卡妥索单抗获批以来，已有十几种双抗抗体投放市场，在肿瘤、遗传性疾病和自身免疫性疾病中表现出卓越的治疗潜力。然而，目前的bsAb形式由于结构复杂，往往面临表达水平低、均匀性差、治疗效果不稳定等挑战。因此，迫切需要克服当前技术限制，开发结构更稳定、表达效率更高的bsAb新形式，从而开辟新的范式，为多靶点协同治疗提供解决方案。 传统单克隆抗体（mAb）的抗原结合特异性是由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）组成的抗原结合区赋予的，它们在结构上相互依赖。当任一可变区单独表达时，它通常表现出较差的结构稳定性和强烈的聚集倾向。在之前的研究中，我们小组创新地开发了一种模块化重组策略，将人类VH域划分为框架要素和多样性要素。通过系统地筛选和重构各种重链亚家族的骨架，我们确定了一种具有优异稳定性和溶解度的优化支架。将B细胞来源的多样性元件移植到该支架上导致了一种新型抗体形式的产生，称为全人源单域抗体（UdAb）。通过筛选大型UdAb噬菌体展示文库，我们获得了一系列对不同抗原具有高亲和力和优异生物物理特性的候选分子。基于上述基础，我们进一步假设人类VL结构域也可以被改造成功能性的、抗原结合的单结构域型。值得注意的是，多项研究表明，与VH相比，人类VL通常表现出较低的聚集性，这可能使它们更适合治疗用途。此外，在传统的IgG框架内重构这种单结构域VL，同时保留其独立的抗原结合功能，并结合靶向不同表位的重链，为生成具有天然IgG结构的bsAb提供了一种新策略。然而，目前鉴定的抗原结合VL片段在很大程度上受到低结合亲和力的限制，通常在几百纳摩尔至微摩尔水平的范围内，这给后续的功能验证和治疗开发带来了重大挑战。此外，这些VL分子已使用不同的人类轻链亚家族作为支架进行独立鉴定，导致稳定性、溶解度和其他理化性质存在很大异质性。因此，一种系统的方法来开发具有强大抗原结合潜力的明确且稳定的VL支架，可以为IgG型bsAb的构建提供一个新颖且可推广的平台，为具有改进可开发性的多靶点疗法提供新的机会。 在这项研究中，通过合理的设计和基于噬菌体展示的筛选，我们生成了一类名为VHHLs的新型重组轻链单域抗体，并鉴定了两个有前景的候选抗体L6和L15，它们与mCD16具有特异性结合和良好的生物物理特性。为了研究其稳定性的结构基础，我们利用X射线晶体学确定了L6的晶体结构。此外，在模块化设计原则的指导下，我们将VHHL重新组装成全长IgG。这种新型的重构抗体保留了天然IgG的结构完整性，同时保留了重链和轻链的独立抗原结合活性，从而为bsAb的生成提供了一种简化而灵活的方法。 【NO.2】材料和方法：请参考原文：https://doi.org/10.1093/abt/tbaf020 【NO.3】研究结果 3.1人轻链可变区工程策略的建立 行为良好的支架对于轻链单域抗体的有效表达至关重要。根据先前的研究，IGKV基因位点表现出明显低于IGHV基因座的多态性。据报道，在成人和新生儿中表达的所有kappa轻链亚家族中，IGKV3-20*01等位基因的使用频率相对较高[21,24,25]。此外，据报道，IGKV3-20亚家族在细菌原核表达系统中有效表达，并可成功在丝状噬菌体上显示。基于这些发现，本研究选择IGKV3-20作为轻链单域抗体的支架。 为了产生具有抗原结合能力的轻链单域抗体，由于轻链CDR的多样性有限，我们选择将重链CDR移植到IGKV3-20支架上。先前的研究表明，骆驼科纳米抗体CDR比人类VH更长，这有助于其更高的序列多样性。此外，羊驼的免疫可以进一步提高获得高亲和力结合剂的可能性。因此，我们将来自骆驼科免疫文库的CDR移植到IGKV3-20支架上，以构建重组轻链单域抗体（VHHL）。为了确定一种平衡结构完整性和表达产量的策略，我们设计了一系列工程策略（T1-T6）来优化CDR移植方法（图1A和B）。首先，为了减少CDR移植引起的潜在结构紊乱，接枝的重链CDR数量限制在1个或2个。其次，鉴于CDR3在抗原识别中的关键作用，以及羊驼IGHV与人IGKV3-20之间CDR3的连接框架序列的高度相似性，CDR3的移植被纳入所有设计策略。此外，为了尽量减少重链和轻链CDR1/CDR2区域之间不同连接框架序列对VHHL表达的潜在影响，引入了两种不同的CDR移植方法（称为“接枝”和“替换”）。在“嫁接”中，通过重叠延伸PCR将CDR与羊驼VHH的连接骨架序列一起插入IGKV3-20中，这可能对轻链支架的结构完整性产生很大影响。在“替换”中，轻链CDR被完全替换为羊驼CDR，同时保留原始的人类来源的连接框架残基，从而最大限度地减少局部干扰。基于上述指导，选取2个候选者评价不同CDR移植策略下VHHLs的表达。结果表明，当仅移植CDR3时（T1和T2），VHHL表现出更好的表达，SDS-PAGE在~15kDa处观察到单个明确的靶带（图1C）。此外，我们观察到，与T4相比，T3下靶蛋白的表达更优越，这表明CDR的“替换”对轻链支架的结构破坏比“接枝”更小。因此，我们选择使用“替换”策略将CDR1和CDR2移植到IGKV3-20支架中。然而，由于“替换”仅限于替换固定的CDR序列，并且不允许像“接枝”策略那样扩增完整的CDR库，因此我们试图通过定点诱变来增强重链CDR1和CDR2的多样性。使用IMGT和AbYsis数据库，我们观察到羊驼和人类在相应CDR位置的氨基酸偏好高度相似。因此，我们分析了羊驼和人重链中CDR1和CDR2的氨基酸频率分布，并根据所选位置设计了两种不同的诱变策略。（图1D，补充表S4和中五)。综上所述，我们建立了一种将CDR3接枝与CDR1和CDR2定点诱变相结合的轻链工程方法，为后续开发具有抗原结合能力的VHHL提供了合理的基础。 图1 新型轻链单域抗体工程策略的建立。（A）两种CDR移植策略示意图。基于替换的策略涉及用羊驼衍生的CDR序列直接替代原始轻链CDR。相比之下，基于嫁接的策略将羊驼衍生的CDR及其连接框架序列引入IGKV3-20支架内的相应位置。（B）羊驼重链CDR移植策略汇总表。（C）不同CDR移植策略下VHHL表达的SDS-PAGE分析。将两个候选者的CDR分别通过“替换”或“嫁接”移植到IGKV3-20支架中。标记为1T1-1T6和2T1-2T6的泳道代表在不同移植条件下产生的VHHL。（D）氨基酸在重链CDR1和CDR2区域的频率分布。 3.2 mCD16特异性VHHL的鉴定 为了验证上述建立的人轻链工程策略，选择小鼠CD16（mCD16）作为靶抗原。mCD16在免疫细胞上广泛表达，包括自然杀伤细胞、中性粒细胞、多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞，是bsAb的关键靶点。为了获得具有mCD16结合能力的VHHL，用mCD16（补充图。S1A).经过四轮免疫，血清ELISA证实羊驼（补充图。S1B)。随后，使用两步PCR方法从羊驼PBMC中扩增重链可变区域（补充图。S1C)。按照VHHL工程策略，通过逐步组装将单个多样性元件扩增并与轻链支架组装，最终成功扩增VHHL片段（图2A）。构建了两个VHHL噬菌体文库并合并进行四轮生物探选。多克隆噬菌体ELISA结果表明，在连续几轮选择中，mCD16特异性结合噬菌体显着富集（图2B），并通过单克隆ELISA选择了一组17个候选者进行进一步验证。所有候选VHHL均成功表达，大多数在SDS-PAGE上表现出良好的纯度（图2C）。为了进一步评估候选VHHL的抗原结合特异性，使用BLI进行了结合测定（由于SDS-PAGE条带模式异常，L2和L11被排除在分析之外）。结果表明，鉴定出四种mCD16特异性VHHL。它们与mCD16结合，并且没有检测到与人CD3或CD16蛋白的结合[图2D，补充图。S2)。 图2 通过噬菌体淘选鉴定针对mCD16的新型轻链单域抗体。（A）VHHL噬菌体展示文库的构建和生物平移工作流程的示意图。（B）通过多克隆噬菌体ELISA确定的四轮生物平移的噬菌体富集。（C）候选VHHL纯度的SDS-PAGE分析。每个凝胶中最左边的泳道代表蛋白质标记。L1–L17表示每个VHHL的相应名称。（D）BLI评估VHHL的抗原结合特异性。所有VHHL均以2μM的浓度进行测试。（E）mCD16特异性VHHLs均匀性的SEC-HPLC分析。横轴表示保留时间，纵轴表示280nm处的吸光度。 为了进一步评估mCD16特异性VHHL的生物物理特性，使用尺寸排阻（SEC）-HPLC来检查每个候选药物的均匀性。结果表明，所有VHHL都表现出良好的均匀性，没有明显的聚集（图2E）。其中，L6和L15表现出更有利的轮廓，具有单一的尖锐峰值。因此，选择了这两个VHHL进行进一步验证。 3.3 mCD16特异性VHHL的结合活性 接下来，我们使用BLI表征了L6和L15与mCD16的结合动力学。结果表明，L6与mCD16的结合具有较高的亲和力，平衡解离常数（KD）为54.3±1.41nM。相比之下，L15的KD为126.0±3.39nM（图3A）。 图3 mCD16特异性轻链单域抗体L6和L15的表征。（A）通过BLI测量的L6和L15与mCD16抗原的结合动力学。（B）使用SA生物传感器对L6和L15与生物素化蛋白L的结合进行BLI评估。每种抗体的起始浓度为2μM，然后连续稀释2倍。我们团队之前鉴定的全人源sdAbn501被列为阴性对照。（C）ELISA对L6和L15的蛋白L结合。所有抗体均以2μM的浓度进行测试，每次测量一式三份。（D）使用不同的树脂纯化L6和L15。中央泳道代表蛋白质标记。左侧和右侧的泳道分别显示了使用Ni-NTA树脂和CaptoL树脂纯化的VHHL蛋白。 根据先前的研究，人类kappa轻链可变结构域（亚型1、3和4）的一个内在特征是它们结合蛋白L的能力。鉴于重链CDR接枝在轻链支架上的潜在结构紊乱，我们通过ELISA和BLI评估L6和L15与蛋白L的相互作用，研究了这种修饰是否消除了蛋白L结合。正如预期的那样，两种VHHL都保留了结合蛋白L的能力（图3B和C）。相比之下，n501（我们实验室之前鉴定的一种全人源重链单域抗体）与蛋白L没有检测到结合。接下来，我们尝试使用CaptoL树脂纯化L6和L15。结果表明，两种VHHLs均成功纯化，目标蛋白的纯度与Ni-NTA树脂（Fig.3D）的纯度相当。这表明L6和L15无需外源标签即可高效纯化，从而简化纯化过程并显着降低工业环境中的生产成本。综上所述，上述发现证实了所选的mCD16特异性VHHL具有良好的生物物理特性，凸显了稳健的轻链单域抗体开发平台的成功建立。 3.4 轻链单域抗体L6的结晶及结构测定 轻链单域抗体L6在优化条件下成功结晶，产生分辨率为3.05Å的晶体（表1，PDB：9VUZ）。L6的晶体结构是使用源自AlphaFold3预测的模板进行分子替换来确定的。最终的精细模型表现出较高的立体化学质量，Rwork/Rfree为27.7%/32.6%，键长的RMSD为0.2Å，键角的RMSD为0.57°。该结构表明，L6采用典型的免疫球蛋白可变结构域折叠，由排列在β片核心中的七条β链组成，其中三个CDR向外延伸形成抗原结合表面（图4A）。值得注意的是，所有三个CDR环的电子密度图都显示出清晰且连续的密度，表明环放置和构象分配具有很高的置信度（图4B）。这种优越的地图模型一致性进一步支持了改进的L6模型的结构完整性和精度。 图4 L6的晶体结构以及与AlphaFold3预测和IGKV3-20框架的比较。（A）L6的卡通表示，突出显示β片核心和CDR。（B）电子密度图（2Fo-Fc，轮廓为1.0σ）叠加在CDR环上，显示出清晰的密度，并且与细化模型非常吻合。CDR1，橙色;CDR2，红色;CDR3，紫色。（C）与天然IGKV3-20框架的结构比较。L6和IGKV3-20的叠加揭示了最小的框架扰动，CDR由于序列修饰而形成对比。（D）L6的晶体结构和AlphaFold3模型的叠加。 为了评估CDR嫁接的结构影响，将实验确定的L6结构叠加到其天然轻链框架IGKV3-20（PDB：5IBT）上。使用MOE基于FR的Cα原子的结构比对模块进行结构比对。由此产生的RMSD为0.853Å，表明尽管进行了广泛的CDR序列修改，但主链扰动最小（图4C）。值得注意的是，与IGKV3-20模板中更分散的CDR环相比，L6中接枝的CDR采用更紧凑的钩状构象。这种重排可能通过将结合残基集中在共面方向来增强抗原接触。分析表明，IGKV3-20支架在结构上对CDR长度和序列变异具有耐受性，凸显了其作为轻链抗体工程的稳定框架的适用性。L6的晶体结构采用由9条反平行β链组成的典型免疫球蛋白折叠，CDR1、CDR2和CDR3形成从β夹心核心突出的钩状结构（图4A）。这些环（颜色为橙色、红色和紫色）共面延伸，形成连续且可访问的抗原结合表面。与AlphaFold3预测相比，观察到显着的构象差异（图4D）。实验结构中的CDR1横向突出，而预测模型呈现出更内侧偏移的环（黄色）。CDR2显示出总体主链一致性（CαRMSD：0.89Å），但检测到侧链旋转胺的显着变化（χ1角度偏差>40°）。CDR3表现出最显着的差异，预测的环垂直延伸，破坏了实验模型中观察到的平面抗原结合表面（洋红色与紫色）。总的来说，晶体结构和AlphaFold3模型之间的全局RMSD为1.63Å，其中78%的偏差局限于CDR，这凸显了当前预测算法在工程抗体拓扑建模方面的局限性。 3.5 基于VHHL的新型IgG bsAb平台开发 接下来，我们尝试将VHHL重新组装成全长IgG主链，旨在构建一种结构与传统IgG相同的新形式bsAb。为了尽量减少可能损害结合的链之间的干扰，我们最初选择骆驼科纳米抗体作为新型IgG型bsAb的重链成分，因为它们具有相对独立的抗原结合能力（图5A）。在这种模块化组装的bsAb中，选择了先前报道的抗人HER2纳米抗体11A4作为重链的可变区，并掺入了mCD16特异性VHHL结构域L6或L15作为轻链。由于骆驼科动物来源的IGHV与人类轻链骨架不相容，因此有必要确定能够与人类IGKV3-20轻链支架配对的人IGHV亚家族。为此，我们分析了PDB数据库中所有以IGKV3-20为轻链的抗体，并编制了相应IGHV亚家族的频率分布（图5B）。如图所示，IGHV1-58是最常配对的亚家族，约占所有序列的五分之一。此外，IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-53和IGHV5-51也与IGKV3-20表现出相对较高的配对频率。基于此分析，选择这5个IGHV亚家族作为11A4人源化的候选支架。由于mCD16可能与人IgG的Fc区（hIgG）发生交叉反应，因此在设计IgG型的bsAb时必须消除Fc介导的与mCD16的潜在结合。根据之前的报道，mCD16与人IgG4（hIgG4）之间的相互作用相对较弱。为了验证这一点，我们使用BLI评估了携带不同人IgG亚类（hIgG1、hIgG2和hIgG4）的对照mAb与mCD16的结合亲和力（补充图。中3)。与之前的报道一致，结果表明，hIgG1同种型与mCD16的结合最强，而hIgG2和hIgG4的相互作用明显较弱。基于这些发现，我们选择hIgG4来构建bsAb，以最大限度地减少Fc介导的对mCD16的交叉反应（图5A）。 图5 基于模块化组装的新型IgG型双特异性抗体的设计和表征。（A）基于模块化组装策略的新型IgG型bsAb的示意图。（B）与IGKV3-20自然配对的人IGHV亚家族的频率分布。（C）SEC-HPLC评估每个hIgG4bsAb的均匀性。（D）评估每个hIgG4bsAb与hHER2-Fc抗原的结合，通过ELISA确定。抗体从33nM开始，连续稀释三倍。数据以三个生物重复的平均值±标准差表示。（E）流式细胞术分析每个hIgG4bsAb与SKOV-3细胞的结合。抗体浓度设置为1μM。抗hHER2mAb赫赛汀作为阳性对照。（F）通过BLI测定的每种hIgG4bsAb与mCD16抗原的结合动力学。每个bsAb的起始浓度为1μM，然后进行三倍连续稀释。在所有面板中，标记为1至5的hIgG4bsAb分别利用重链IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-53和IGHV5-51。商业hIgG4mAbOpdivo作为同种型对照被纳入其中。 接下来，我们构建并成功表达了所有hIgG4型的bsAbs。SEC-HPLC分析显示，大多数hIgG4型bsAb具有良好的均匀性，其特征是具有明显的主峰（图5C）。值得注意的是，所有测试的抗体的保留时间约为3.36分钟，与hIgG4对照mAbnivolumab（Opdivo）的保留时间非常接近。这表明，与传统单克隆抗体相比，基于VHHL的IgG型bsAb表现出高结构完整性。接下来，为了检查IgG型bsAb的重链和轻链在组装后是否保留其原始抗原结合能力，我们评估了它们与各自靶抗原的结合。首先，进行ELISA评估重链结合活性，所有hIgG4型的bsAb都表现出与hHER2的特异性结合（图5D）。在细胞背景式细胞术分析进一步证实了它们与hHER2阳性SKOV-3细胞的结合，其模式与阳性对照曲妥珠单抗（赫赛汀）相当，而同种型对照Opdivo则显示出可检测到的结合（图5E）。同时，进一步评估所有bsAb中轻链的抗原结合。进行BLI并显示，所有IgG型bsAb中的VHHL衍生轻链都保持了与mCD16的结合能力（图5F）。总之，这些发现验证了使用模块化组装策略将VHHL合并到IgG主链中的可行性。 上述结果启发了我们进一步的设计策略：是否可以用VHHL结构域直接替代单克隆抗体的轻链，以赋予其额外的抗原结合特异性。通过对PDB数据库中的抗体-抗原复合物进行结构筛选，选择17C7（靶向RABV）和戈利木单抗（Gmab，靶向hTNF-α）作为概念验证（补充图。中4,补充表S7和S8)。首先，我们仅用VHHL替换天然轻链，同时保持亲本mAb的原始hIgG1框架（补充图。S5A系列)。通过模块化替换策略生成的hIgG1bsAbs成功表达，其分子量和SEC-HPLC保留时间与传统mAbCR3022相当，表明结构完整性得以保留（补充图。S5B和C)。鉴于hIgG1Fc区域与mCD16表现出交叉反应性，所有bsAbs进一步重建为IgG4型（图6A）。所有hIgG4bsAbs也都有效表达，并表现出与传统mAb高度相当的结构谱，SEC-HPLC证实了这一点（图6B）。BLI测定进一步证明，被取代的轻链和原始重链都保留了与相应抗原的结合（图6C和D）。总的来说，这些结果证明了将VHHL重组到常规单克隆抗体中的可行性，从而能够产生一类结构上与天然IgG相同的新型双特异性抗体，为下一代抗体疗法的开发提供了一种新的策略。 图6 基于模块化替代的新型IgG型双特异性抗体的设计和表征。（A）基于模块化替换策略的IgG型bsAb设计的示意图。（B）通过SEC-HPLC评估每个hIgG4bsAb的均匀性。（C）通过BLI测量的hIgG4bsAb与RABV和hTNF-a的结合动力学。每个bsAb的起始浓度为1μM，连续稀释两倍。（D）每个hIgG4bsAb与mCD16之间结合动力学的BLI分析。每个bsAb的起始浓度为333nM，连续稀释三倍。 【NO.4】讨论 单域抗体作为近年来生物制药领域的热门研究课题之一，因其分子量小（约12-15kDa）和优越的理化性质而备受关注。与源自重链的传统sdAb不同，轻链sdAb代表了一类新型抗体结构域，它利用人类轻链的可变区域进行抗原识别。在本研究中，我们建立了一个用于开发重组轻链单域抗体（VHHLs）的新平台。为了增强VHHL的抗原结合亲和力，我们提出了一种创新策略，即将骆驼科动物来源的免疫文库中的重链CDR嫁接到人轻链支架IGKV3-20中。这种方法基于观察，即与轻链相比，人类重链可变区亚家族表现出更大的多样性。此外，使用免疫来源的抗体片段作为多样性供体提高了获得高亲和力结合剂的可能性。 为确保重链CDR高效、完整地接枝到轻链支架中，有必要在引物中引入额外的重链连接框架序列。然而，由于重链和轻链支架之间的序列同源性较低，直接用重链衍生的框架序列替换相应的轻链区域可能会对轻链支架的结构完整性造成不利损害。因此，必须探索合适的CDR接枝策略，以平衡工程VHHL的序列多样性和结构稳定性。通过系统评价不同的CDR接枝策略，我们发现额外的重链连接框架序列确实损害了VHHL的表达。此外，减少嫁接的CDR数量可提高靶蛋白的表达水平。基于这些发现，我们建立了一种轻链工程策略，涉及CDR3的扩增以及CDR1和CDR2的定点诱变。基于该策略，我们选择mCD16作为靶抗原来构建VHHL噬菌体展示文库。经过四轮生物探缘后，成功分离出一组候选分子。SDS-PAGE分析证实所有VHHL蛋白的纯度都是高纯度的。随后的SEC-HPLC和BLI测定鉴定出两个先导克隆L6和L15，它们具有良好的生物物理特性，包括较强的结合特异性、高均匀性和对mCD16的强亲和力。有趣的是，尽管嫁接了骆驼科CDR，但L6和L15仍保留了与蛋白L结合的能力，无需外源纯化标签即可通过CaptoL树脂实现一步亲和纯化。这种无标签纯化简化了下游加工并提高了生产效率。综上所述，这些发现凸显了我们的轻链工程战略在产生行为良好的VHHL方面的可行性。 工程化轻链单域抗体L6的晶体结构为了解CDR的空间排列如何有助于抗原识别提供了关键见解。与通常以交错或炮塔状配置呈现CDR的传统抗体或骆驼科VHH不同，L6表现出独特的钩形拓扑结构，其中所有三个CDR环从β夹层框架共面投影。这种几何形状有效地创造了一个宽阔的、连续的副位表面，可以增强抗体与扁平或凹槽状表位（例如在mCD16等膜受体表面发现的表位）结合的能力。共面排列还可以促进表位上同时接触多残基，通过增加界面面积提高结合亲和力，并减少复合物形成时的熵惩罚。除了其功能结构之外，L6的支架基于人类IGKV3-20支架，在耐受CDR移植方面表现出卓越的结构鲁棒性。L6和天然IGKV3-20结构之间0.939Å的低RMSD表明，尽管在超变量环内发生了广泛的序列改变，但主链几何形状基本上保持不受干扰。这种结构耐受性支持将IGKV3-20用作人源性sdAb工程设计的可靠支架。它与不同CDR配置的兼容性也表明了高多样性sdAb文库构建的潜力，特别是在噬菌体或酵母展示系统中。IGKV3-20在适应不同环长和构象方面的稳定性进一步强化了其作为开发下一代疗法的模块化平台的前景。有趣的是，与AlphaFold3预测的比较表明，尽管免疫球蛋白折叠总体上保留了下来，但L6的CDR构象存在明显差异。虽然FR被精确建模，但CDR环（特别是CDR1和CDR3）在位置和方向上表现出显着偏差。此外，L6的预测结构和晶体结构之间的全局RMSD达到1.63Å，大约78%的偏差来自CDR。值得注意的是，AlphaFold3未能预测实验观察到的共面CDR排列，而是呈现出更加交错的配置，可能低估了旁在的可及性。这些发现凸显了目前将通用蛋白质结构预测工具应用于工程抗体结构域的局限性，其中环移植和非天然拓扑引入了额外的建模复杂性。虽然AlphaFold3为模型生成提供了一个有价值的起点，但我们的数据强调了当精确环定位至关重要时，特别是在涉及表位靶向或基于结构的抗体设计的应用中，实验验证的必要性。 要成功将VHHL重建为全长单克隆抗体并开发新型IgG型的bsAb，必须满足两个关键标准。首先，bsAb的轻链和重链必须能够正确配对，就像在天然IgG中一样，以保持结构完整性。其次，在bsAb组装时必须保留两条链的单个抗原结合功能。为了实现这一目标，确定与IGKV3-20支架天然相容的人类IGHV亚家族非常重要。对PDB数据库中抗体结构的统计分析揭示了一组经常与IGKV3-20配对的人IGHV亚家族。同时，为了最大限度地减少VHHLs对bsAb重链功能的潜在干扰，我们利用骆驼科动物衍生的纳米抗体作为重链成分，因为它们具有结构独立性，并且能够在重新型化成不同的型（例如纳米抗体-Fc融合蛋白）时保留抗原结合功能。在此基本原理的指导下，我们选择了五个与IGKV3-20具有最高自然配对频率的IGHV亚家族，并将抗hHER2纳米抗体11A4嫁接到这些人IGHV亚家族上，以生成人源化VHH。然后将这些人源化VHH与VHHL配对以构建bsAb。实验验证表明，所得的bsAb表现出与传统IgG相当的结构和理化特性。此外，结合测定表明，VHHL衍生的轻链和纳米抗体衍生的重链都保留了其原始的抗原结合特异性，证实了双特异性构建体的功能完整性。受到上述结果的鼓舞，我们寻求进一步拓宽新型双抗体平台的适用性。由于先前构建的bsAb是由不同的抗体模块组装而成的，因此它们在某种程度上没有完全概括天然IgG分子的结构。为了建立更精简、更通用的策略，我们的目标是用VHHL直接替代传统mAb的轻链，同时保持所有其他组分不变。这种方法将能够快速、方便地将现有单克隆抗体转化为双克隆抗体。为了最大限度地降低轻链取代时重链完全破坏抗原识别的风险，我们从PDB数据库中筛选了复杂的结构，并选择了两种抗体17C7和Gmab作为候选抗体。正如预期的那样，所有重建的IgG型bsAb都成功表达并保留了与天然IgG一致的结构特征。此外，抗原结合测定证实，VHHL衍生的轻链和原始重链都保持了各自的抗原结合特异性。 生产成本仍然是抗体药物开发的关键考虑因素之一。与传统bsAb相比，本研究开发的新型IgG型bsAb平台在多个维度上取得了长足的进步，有效地建立了“即用型”的bsAb平台。从结构上讲，这种bsAb型相对简单，只需要用抗原结合VHHL替换亲本轻链。转染程序也与传统单克隆抗体相同，涉及VHHL轻链质粒与原始重链质粒的共转染。此外，使用该平台生产的bsAb表现出高表达产量，达到每升数十毫克，从而显着降低了制造成本。 然而，本研究中描述的bsAb平台具有某些局限性，需要进一步改进。一个主要挑战在于与选择抗原结合VHHL分子相关的高成本。针对特定靶抗原生成此类结合剂通常需要羊驼免疫，这需要大量的时间、劳动力和财力。因此，该策略不适用于在短时间内快速生成针对多种抗原的IgG型bsAb。此外，尽管这项研究解析了轻链单域抗体L6的晶体结构，但L6和mCD16抗原之间的精确相互作用界面仍然未知。未来的工作可能涉及L6-mCD16复合物的结构表征，以更深入地了解轻链单域抗体抗原识别的分子基础。 综上所述，本工作提出了通过合理的抗体工程建立基于VHHL的抗体平台。利用噬菌体淘选，我们成功获得了具有良好生物物理特性的mCD16特异性VHHL分子，并通过X射线晶体学解析了它们的晶体结构。将这些VHHL进一步重构为全长mAb，证明了一种新型的bsAb平台，在结构上模拟天然IgG。这项工作为未来开发下一代抗体疗法提供了有价值的参考。 更多学习干货欢迎关注“艺药荟”知识星球！ 【前20个名额可享受会员特惠价99元/年，名额有限，经典行业资料和合作资源持续更新中……】 经典系列阅读推荐： 1好文阅读 2.FDA官方课程 3.《生物制药CMC法规合规性》阅读笔记 4.《生物制药质量源于设计QbD》阅读笔记 5.《干细胞生产：过程、实践和监管》阅读笔记 6.《生物制药工艺：工艺开发、设计和实施》阅读笔记 7.《抗体-药物偶联物》阅读笔记 8.《生物制药生产工艺验证》阅读笔记 9.《生物制药灌流细胞培养工艺：工艺开发、设计和放大生产》完整编译版 经典分享持续更新中……，敬请关注“梓树艺药荟“！ 邀您加入“艺药荟社群”交流学习! 备注：姓名+单位+方向 版权说明：本文欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权或其他合作需求，请联系梓树ZiShu（微信：Z07302256）。 免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表“梓树艺药荟”立场，亦不代表“梓树艺药荟”支持或反对文中观点。本文不作为治疗方案推荐。如需治疗指导，请前往正规医院就诊。