Futibatinib

点击蓝字 ↑ 关注药学观澜 近日，上海有机所丁克/王震与中南大学陈永恒、广州科恩泰生物医药科技常少华、密歇根大学Arul M. Chinnaiyan等团队在药物化学权威期刊 Journal of Medicinal Chemistry 上发表了一篇题为 "基于三环骨架的新型强效选择性共价FGFR2/3抑制剂的结构导向设计与优化" 的研究论文。该研究基于结构生物学策略，设计并优化了一系列含三环骨架的共价FGFR2/3抑制剂，其中代表性化合物 KNT-0919 对FGFR2和FGFR3表现出亚纳摩尔级抑制活性（IC₅₀分别为1.1 nM和0.20 nM），对FGFR1的选择性达16倍以上，且在416种激酶筛选中展现出高度选择性。该化合物通过丙烯酰胺弹头与FGFR2/3 P-loop中的半胱氨酸残基形成共价键，经质谱与X射线晶体学确证；在SNU-16胃癌异种移植模型中，口服给药可实现肿瘤消退，口服生物利用度达56%，为FGFR2/3驱动型肿瘤（包括耐药突变型）的精准治疗提供了具有全新化学骨架的候选药物。 Introduction 成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）是调控细胞增殖、分化、存活和血管生成的受体酪氨酸激酶家族（FGFR1−4），其信号失调由基因扩增、激活突变和染色体易位等遗传改变驱动，是多种癌症发病的关键因素：FGFR2改变常见于胆管癌、胃癌和子宫内膜癌，FGFR3改变主要与膀胱癌和多发性骨髓瘤相关。FDA已批准futibatinib、erdafitinib和pemigatinib等泛FGFR抑制剂用于FGFR2/3改变的癌症，但临床应用受限于FGFR1抑制导致的高磷血症、FGFR4抑制引起的腹泻等剂量限制性毒性，以及激酶域看门人突变（如FGFR2V564F/I）引发的获得性耐药。因此，选择性靶向FGFR2/3成为治疗策略新方向，目前已有lirafugratinib（首个高选择性共价FGFR2抑制剂）、LOXO-435（高选择性FGFR3抑制剂，保留看门人突变活性）和TYRA-300（可逆选择性FGFR3抑制剂）等进入临床阶段。本研究基于结构生物学设计，发现了一类三环四氢吡嗪-吡咯-嘧啶氨基衍生物作为新型共价FGFR2/3抑制剂，代表性化合物KNT-0919对FGFR2/3表现出亚纳摩尔级抑制活性，对临床相关突变保持效力，口服生物利用度达56%，并在SNU-16胃癌异种移植模型中实现显著抗肿瘤效果。 Results ①分子设计 药物化学研究以已获批的不可逆泛FGFR抑制剂futibatinib（TAS-120）为起点，该化合物对FGFR1−4的酶抑制IC₅₀为1.3−8.3 nM，对常见看门人突变FGFR2V564F的IC₅₀为83 nM。利用公开的TAS-120与FGFR2共晶结构（PDB: 8W2X），分析发现其吡唑并[3,4-d]嘧啶骨架与铰链区Glu565和Ala567形成氢键，丙烯酰胺弹头与P-loop中的Cys491形成共价键，二甲氧基苯基延伸至疏水性后口袋，其中一个甲氧基与Asp644形成氢键。受Relay Therapeutics前期工作启发——即利用FGFR1与FGFR2 P-loop柔性差异可增强FGFR2选择性——研究者将TAS-120的吡唑基和哌啶基环化以引入结构刚性；同时，TAS-120与FGFR2V564F的预测结合模式显示Val564替换为Phe564后，一个甲氧基产生空间位阻，因此去除一个甲氧基并采用环合并策略，使新形成的环与邻近Phe645形成π−π相互作用，且在新环中引入氮原子以维持与Asp644的关键氢键。由此得到化合物8a，对接研究显示其在野生型FGFR2和FGFR2V564F中均保留了与Cys491的共价键、铰链区氢键及与Asp644的氢键等关键相互作用，且苯并[d]噻唑部分避免了与Phe564的空间位阻并与Phe645形成π−π相互作用；与FGFR3的对接则揭示了与FGFR2相似的结合模式，这些计算结果为后续合成与生物学评价提供了支持。 ②结构优化 Ba/F3细胞增殖抑制活性作为主要评价指标。TAS-120验证显示其对各亚型及看门人突变均具低纳摩尔级活性，与文献一致。化合物8a保留对Ba/F3-FGFR2（IC₅₀=7.8 nM）和Ba/F3-FGFR3（21.2 nM）的强效抑制，对Ba/F3-FGFR1活性降低（337 nM），对亲本Ba/F3细胞大于1000 nM，且对V564F突变效力略优于TAS-120。R¹位置考察中，含氢键接受氮原子的8b−e活性均低于8a。受KIN-3248启发，在8a和8c中引入炔键相邻二氟 motif得到8f和8g，8f对FGFR3和V564F的IC₅₀分别提升至6.8 nM和29.1 nM，较8a增强约3倍。基于8f与FGFR2的对接模型，后口袋可容纳小型疏水基团，据此设计8h−m；甲基取代8h对FGFR3活性增强，乙基（8i）和环丙基（8k）因位阻增加活性降低，异丙基（8j）、环丁基（8l）和环戊基（8m）活性最弱。进一步分析发现哌啶环对侧存在未占据空间，遂引入手性甲基得到8n、8o、8r及KNT-0919（8s），并设计8p和8q以提高代谢稳定性。手性甲基显著增强各细胞系活性，8n对FGFR2/3/V564F的IC₅₀分别为0.78、0.63和0.89 nM。KNT-0919表现最均衡：对FGFR2、FGFR3和V564F的IC₅₀分别为1.1、0.20和5.6 nM，亚型选择性最高（FGFR2/FGFR1为16倍，FGFR3/FGFR1为85倍），酶抑制与细胞水平活性趋势一致。 ③KNT-0919选择性抑制FGFR2/3激酶活性 采用ADP-Glo激酶活性检测法评价KNT-0919对FGFR1−4的抑制活性，结果显示其对FGFR2和FGFR3的IC₅₀分别为0.8 nM和0.3 nM，而对FGFR1（IC₅₀=2.2 nM）和FGFR4（IC₅₀=20.3 nM）活性较低。为表征共价抑制动力学，测定了对FGFR1和FGFR2的稳态动力学参数：KNT-0919对FGFR2的Kᵢ为0.4 nM、kᵢₙₐcₜ为0.00405 s⁻¹，kᵢₙₐcₜ/Kᵢ效率常数为0.01053 nM⁻¹·s⁻¹；对FGFR1的相应参数分别为5.3 nM（Kᵢ）、0.00599 s⁻¹（kᵢₙₐcₜ）和0.00113 nM⁻¹·s⁻¹（kᵢₙₐcₜ/Kᵢ），表明其对FGFR2优于FGFR1的选择性主要由可逆结合亲和力而非共价键形成速率决定。在100 nM浓度下对416种蛋白激酶进行筛选，除FGFR家族外，仅RET野生型激酶（RET改变型癌症的已验证靶点）抑制率大于90%；KNT-0919同时对多种临床相关FGFR2和FGFR3突变变体表现出强效抑制活性。这些结果表明KNT-0919选择性抑制FGFR2/3激酶活性。 ④KNT-0919与FGFR2和FGFR3的共价结合 为验证共价结合机制，进行了完整蛋白质质谱分析：重组FGFR2与过量KNT-0919孵育后出现明确的完整质量偏移，与KNT-0919-FGFR2共价复合物的形成一致；高能碰撞诱导解离（HCD）MS/MS进一步确认Cys491发生共价修饰，在修饰样品中鉴定出对应KNT-0919加合物的独特肽段。X射线共晶结构解析显示，在KNT-0919-FGFR2复合物（PDB: 22ZR）中，三环四氢吡嗪-吡咯-嘧啶氨基核心通过Glu565和Ala567的氢键锚定于铰链区，苯并[d]噻唑部分延伸至疏水性后口袋，丙烯酰胺弹头与P-loop中的Cys491形成不可逆共价键，且丙烯酰胺羰基与Arg630形成两个额外氢键，可能稳定共价结合构象；由于FGFR2结构中激活环定义不清，噻唑氮与Asp644之间的预测氢键未能清晰解析。相反，在KNT-0919-FGFR3复合物（PDB: 22ZS）中，该相互作用在噻唑氮与Asp635之间被明确观察到。总体而言，KNT-0919在FGFR3中的结合模式与FGFR2一致：核心与铰链区Glu556和Ala558形成氢键，丙烯酰胺弹头共价修饰Cys482，其羰基与Arg621形成氢键。这些结果确认KNT-0919与FGFR2和FGFR3均形成共价结合。 ⑤KNT-0919选择性抑制FGFR2依赖性癌细胞增殖及下游信号并诱导凋亡 在四种携带不同FGFR改变的癌细胞系中评价KNT-0919的抗增殖活性：A204（FGFR1扩增）、SNU16（FGFR2扩增）、KATO III（FGFR2扩增）、KMS-11（FGFR3 Y373C及融合）、MDA-MB-453（FGFR4-Y367C突变）和HEK-293T（人胚肾细胞）。KNT-0919对FGFR2依赖的SNU16和KATO III细胞表现出强效活性（IC₅₀分别为6.2 nM和6.3 nM），对FGFR3依赖的KMS-11细胞IC₅₀为13.5 nM，而对A204（IC₅₀=75.3 nM）、MDA-MB-453（1310 nM）和HEK-293T（>1000 nM）活性显著降低。此外，KNT-0919对表达FGFR2突变体的Ba/F3细胞保持强效抑制，对FGFR2V564I和FGFR2N549K的IC₅₀分别为9.6 nM和20.4 nM。Western blot检测显示，在SNU-16细胞中KNT-0919剂量依赖性抑制FGFR2磷酸化及其下游效应分子FRS2α、Akt和ERK1/2的磷酸化；同时以剂量依赖性方式诱导SNU-16细胞凋亡，100 nM处理48 h后约28%细胞发生凋亡，而相同条件下A204细胞几乎无凋亡发生。这些结果表明KNT-0919选择性抑制FGFR2依赖性癌细胞增殖和下游信号，并促进细胞凋亡。 ⑥KNT-0919在大鼠中表现出良好的口服生物利用度及体内强效抗肿瘤活性 KNT-0919的药代动力学特征在Sprague-Dawley大鼠中经静脉（1 mg/kg）和口服（10 mg/kg）给药后评估，口服生物利用度为55.6%，最大血浆浓度（Cₘₐₓ）为500 ng/mL，暴露量（AUC₀₋∞）为1708 ng·h/mL。体内疗效在SNU-16异种移植小鼠模型中评价，KNT-0919以3、10和30 mg/kg剂量每日两次口服给药，连续35天，结果显示剂量依赖性抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为78.6%、97.4%和115.6%，最高剂量下观察到肿瘤消退；所有治疗均耐受良好，研究期间未出现显著体重下降。体内药效学评估证实KNT-0919治疗导致FGFR2及其下游信号磷酸化的剂量依赖性抑制；治疗结束时肿瘤样本分析显示治疗组凋亡增加，H&E和TUNEL染色证实这一点。进一步疗效研究中，TAS-120作为阳性对照每日一次口服10 mg/kg，KNT-0919以10 mg/kg每日一次或两次口服给药，连续22天，结果显示KNT-0919每日两次给药的抗肿瘤活性与TAS-120相当，且未出现显著体重下降。 Conclusions 选择性靶向FGFR2和/或FGFR3已成为治疗这些特定亚型驱动癌症的有前景治疗策略，但目前尚无此类抑制剂获批临床使用，因此需要具有不同化学骨架的新型选择性FGFR2/3抑制剂。本研究报道了一类三环四氢吡嗪-吡咯-嘧啶氨基衍生物作为不可逆FGFR2/3抑制剂的设计与合成，其中代表性化合物KNT-0919对FGFR2和FGFR3驱动的Ba/F3细胞表现出强效抗增殖活性，IC₅₀分别为1.1 nM和0.20 nM，对表达FGFR2看门人突变的Ba/F3细胞保留活性，而对Ba/F3-FGFR1细胞（IC₅₀=17.1 nM）和亲本Ba/F3细胞（IC₅₀>1000 nM）活性降低。在416种激酶筛选中，KNT-0919选择性抑制FGFR2和FGFR3，包括临床相关突变变体；为更好缓解FGFR1相关全身毒性，该化合物的选择性仍可进一步优化。值得注意的是，研究者采用了更刚性的三环骨架，成功增强了对FGFR2/3的亚型选择性，进一步证明构象限制是提高激酶抑制剂选择性的有效策略。KNT-0919与FGFR2和FGFR3的共价结合经完整蛋白质质谱和X射线共晶结构确证。此外，KNT-0919表现出良好的药代动力学性质，包括56%的口服生物利用度。重要的是，口服给药KNT-0919在SNU-16异种移植小鼠模型中导致显著肿瘤消退，且未观察到毒性。尽管仍需更多表征以研究其疗效和安全性特征，但这些发现确立了KNT-0919作为有前景的共价FGFR2/3抑制剂，支持其进一步开发用于FGFR2/3驱动恶性肿瘤的治疗，包括与获得性耐药突变相关的肿瘤。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c00585 说   明 欢迎合理转载，请写明来源于【药学观澜】，公众号内容为阅读文献提炼总结的内容，学识有限，恳请批评指正。标记【原创】指原创编译，是出于便于传播目的，著作权归出版社与作者所有。合作，投稿，商务等请联系后台 分享让更多人看看