Pegvisomant

肽类药物占据着介于小分子和生物制剂之间的独特化学空间，兼具高靶向特异性、结构可编程性和良好的安全性。近期监管部门的批准和不断扩展的临床研发管线凸显了肽类药物日益增长的治疗和商业价值。本文概述了化学修饰方法和现代设计策略，并评估了它们对蛋白水解稳定性、药代动力学、膜渗透性和靶点结合的影响。随后，我们重点介绍了人工智能（AI）指导的肽类药物设计的最新进展，包括机器学习模型、蛋白质语言模型和生成式架构，这些方法能够实现高通量活性预测、性质优化和从头序列生成。这些方法共同加速了传统的发现-设计-验证周期，并通过数据驱动、结构导向的建模框架降低了实验损耗。在这些应用中，人工智能还能够合理设计细胞穿透肽（CPP），从而增强细胞内递送和生物活性。基于这些方法学进展，我们进一步探讨了它们在肽类药物中的应用，尤其侧重于基于人工智能的CPP预测模型以及在中枢神经系统和呼吸系统中的治疗应用。最后，我们概述了未来的发展方向，并强调将人工智能驱动的序列设计与合理的化学工程和先进的递送技术系统地结合起来，并辅以严格的实验验证，对于开发稳健且临床持久的肽类药物至关重要。 1. 引言 肽类药物是由短链氨基酸（通常少于50个氨基酸残基）组成的药理活性物质，旨在调节特定的生物靶点[ 1 , 2 ]。肽类药物的发展源于早期的突破性进展，例如1922年胰岛素的临床应用[ 3 ]以及Du Vigneaud等人合成催产素和加压素[ 4 , 5 ]，这些发现共同奠定了现代肽化学和化学生物学的基础范式。这些发现表明，短链多肽可以模拟复杂的激素活性，从而为现代肽类药物的发现铺平了道路。肽类药物固有的生化特性，包括特异性受体结合、结构灵活性和副作用小，使其特别适合用于开发治疗癌症、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、慢性疼痛、骨质疏松症、微生物感染、慢性肾病和糖尿病等疾病的治疗药物[ 1 , 6 , 7 ]。截至 2025 年，已有 100 多种肽类药物获得全球监管部门批准 [ 8 ]，目前还有许多代表不同结构类别和作用机制的肽类候选药物正在进行临床开发 [ 6 , 9 ]。 尽管肽类药物的治疗选择日益丰富，但其长期以来仍受到一些固有缺陷的限制，例如代谢不稳定、肾清除迅速和膜渗透性有限，这些缺陷历来阻碍了肽类药物的研发。这些特性通常导致循环半衰期短和生物利用度低，给全身给药和临床转化带来了巨大挑战[ 8 , 10 , 11 ]。为了应对这些挑战，人们开发了多种策略，包括肽结构的化学修饰、序列优化以及与功能分子偶联[ 11 ]。值得注意的是，胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RAs），包括利拉鲁肽和索玛鲁肽，彻底改变了2型糖尿病和肥胖症的治疗[ 12 , 13 ]。这强调了合理的化学修饰与先进的制剂技术相结合，可以有效地克服肽类药物通常存在的药代动力学障碍，从而延长半衰期，提高生物利用度，增强治疗效果[ 14 ]。 除了化学优化之外，递送技术已成为改善肽类药物药代动力学和细胞内可及性的关键途径。值得注意的是，细胞穿透肽（CPP）因其能够促进细胞摄取并增强治疗药物的细胞内递送而备受关注[ 15 , 16 ]。然而，高效CPP的设计仍然面临挑战，因为细胞摄取效率、毒性和稳定性受肽序列和理化性质的强烈影响。因此，包括CPP在内的肽的合理设计需要系统地探索庞大的序列空间，这对传统的实验方法提出了巨大的挑战[ 17 , 18 ]。 随着肽化学和制剂技术的进步，人工智能（AI），包括机器学习（ML）和深度学习（DL）方法，正日益变革肽类药物的发现[ 19 , 20 , 21 ]。近期的计算框架能够对肽序列-结构-功能关系进行大规模分析，从而有助于预测关键性质，例如生物活性、稳定性、毒性和膜渗透性[ 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 ]。生成模型和人工智能驱动的设计平台进一步实现了具有更优药理学特性的肽序列的从头生成和优化[ 28 ]。这些进展通过加速早期发现和更高效地探索庞大的肽序列空间，拓展了肽类药物的应用范围[ 29 ]。此外，人工智能驱动的方法也越来越多地应用于递送相关肽（包括细胞穿透肽）的设计和优化。尽管技术取得了这些进步，但肽类药物在实现最佳治疗效果方面仍然面临着重大挑战，这主要是由于细胞类型异质性、细胞内递送有限以及药理学性能欠佳[ 1 , 30 , 31 ]。 近期综述强调了人工智能在肽设计和基于细胞穿透肽（CPP）的药物递送中的应用[ 32 , 33 , 34 ]。然而，这些研究主要集中于生成建模或递送预测等单个组成部分，并未充分探讨如何将这些方法整合到一个统一的治疗药物开发框架中。本综述重点介绍一个整合框架，该框架通过多目标分类和实验验证，将计算机预测与体外和体内评估联系起来。我们将在以下章节中系统地讨论这些方面：（i）肽类药物概述；（ii）增强肽类药物特性的化学修饰策略；（iii）基于细胞穿透肽的药物递送系统；（iv）人工智能指导的肽类药物设计和预测建模；以及（v）肽类药物研究的未来展望和发展趋势。 2. 肽类药物概述 2.1 与小分子和抗体的比较 药物领域涵盖多种治疗方式，可分为小分子药物、生物制剂以及包括核酸疗法和细胞疗法在内的新兴类别[ 8 , 35 ]。小分子药物（<500 Da）是药物治疗的基础，而生物制剂——包括单克隆抗体和治疗性蛋白——是增长最快的市场领域[ 6 ]。治疗性肽（10-50个氨基酸，500-5000 Da）介于小分子药物和抗体（~150 kDa）之间，具有高亲和力和特异性，可作为激素、神经递质和蛋白质-蛋白质相互作用调节剂发挥作用[ 36 ]。 肽类药物融合了小分子和抗体的优势，同时克服了各自类别的局限性。首先，肽的大小从根本上影响其药理学特性和生物分布：小分子药物可进入细胞内靶点，抗体药物则局限于细胞外靶点，而肽类药物则具有介于两者之间的膜渗透性，某些特定序列更有利于其进入细胞内[ 37 ]。在靶点特异性方面，抗体药物展现出卓越的选择性，小分子药物的选择性较低，且存在脱靶相互作用，而肽类药物则通过多个接触点实现与抗体相当的选择性，同时保持了结构的简洁性[ 38 ]。因此，肽类药物能够结合抗体通常具有的靶点选择性和小分子药物的生物利用度，从而展现出独特的优势[ 39 ]。例如，icotrokinra (JNJ-77242113) 是一种选择性靶向白细胞介素-23受体并以个位数皮摩尔级亲和力结合的肽，在斑块状银屑病的3期临床试验中已显示出显著疗效[ 40 , 41 , 42 ]。这些特性，结合模块化的化学合成方法，使得肽类药物能够高度适应各种治疗领域——从肿瘤学和内分泌学到传染病和神经退行性疾病。 然而，肽类药物存在明显的药代动力学局限性。抗体可通过FcRn介导的循环利用实现较长的半衰期（2-3周）[ 43 ]；小分子药物的半衰期较短（数小时），且易受肝肾清除的影响[ 8 ]；肽类药物则易发生蛋白水解降解，导致其半衰期仅为数分钟至数小时[ 44 ]。化学修饰，例如聚乙二醇化（PEG化）、环化和非天然氨基酸（NCAA）的引入，可以提高肽类药物的稳定性[ 1 ]。此外，小分子药物可口服给药，抗体药物需要肠外给药，而肽类药物由于胃肠道酶的降解，口服生物利用度有限（<1-2%）[ 13 , 45 ]，尽管新兴的制剂策略展现出一定的潜力[ 8 , 13 ]。最后，生产采用成本效益高的化学合成法生产小分子，采用昂贵的哺乳动物细胞系统生产抗体，采用成本适中的固相合成或重组表达法生产肽[ 36,46 ]。 在药物研发中，小分子、肽类和抗体之间的策略选择主要取决于靶点的可及性、所需的结合特性以及递送限制[ 47 ]。小分子通常适用于具有明确结合口袋的细胞内靶点，而抗体则更适合需要高特异性和长循环的细胞外靶点[ 47 , 48 ]。肽类尤其适用于具有更复杂结合界面（小分子通常难以处理）的靶点，并且与抗体相比，肽类具有更好的组织穿透性[ 49 ]。因此，肽类药物融合了抗体特有的特异性、增强的组织穿透性和更低的免疫原性，展现出优于具有细胞内靶点结合能力的小分子药物的选择性[ 15 , 50 ]。这些优势凸显了一种范式转变，即肽类药物正从小众分子发展成为在多学科创新推动下快速扩张的药物类别[ 8 , 36 , 50 ]。 2.2 肽类药物治疗面临的挑战 2.2.1. 代谢周转快、作用持续时间短 限制肽类药物应用的主要生物学屏障是其易受酶降解和快速系统清除[ 2 , 8 ]。肽类药物暴露于生理环境后，会立即成为存在于体循环和组织中的普遍存在的蛋白酶的靶标。例如，GLP-1的半衰期仅为1-2分钟，这是由于其易被二肽基肽酶IV (DPP-4) 快速灭活[ 51 ]。同样，生长抑素也会在1-3分钟内被普遍存在的肽酶降解，导致循环浓度低，从而限制了其治疗效果[ 52 ]。此外，快速的肾脏清除进一步损害了它们的药代动力学特征。大多数肽类药物的分子量低于肾小球滤过阈值，因此能够有效地从体内清除[ 2 ]。蛋白水解和肾脏滤过导致其作用持续时间短，因此需要频繁的高剂量给药。 2.2.2. 物理化学不稳定性及化学降解 除了生物降解和清除外，治疗性肽的结构本身就比小分子复杂得多。肽易受多种化学降解机制的影响；例如，含硫氨基酸（如蛋氨酸和半胱氨酸）尤其容易被氧化[ 53 ]，而天冬酰胺脱酰胺和二酮哌嗪的形成会改变肽的结构[ 11 , 54 ]。此外，物理不稳定性也是一个重大挑战，因为肽在温度或剪切力等应力作用下容易发生构象展开和聚集[ 2 ]。当制剂的pH值接近等电点时，净电荷的最小化会导致沉淀或非特异性吸附到表面，从而进一步降低治疗药物的有效浓度。 2.2.3. 免疫原性限制 免疫原性仍然是肽类药物面临的一项关键安全问题，因为即使是源自内源序列的肽也可能引发不良的免疫反应[ 55 , 56 ]。这种生物反应通常会产生抗药抗体（ADA），ADA会中和药物疗效、加速药物清除或诱发超敏反应，从而构成临床应用的重大障碍。近期临床分析显示，在3期临床试验中，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）/GLP-1受体激动剂替泽帕肽在51.1%的患者中诱导产生了ADA，这些ADA与超敏反应和注射部位反应相关[ 57 ]。因此，预测并最大限度地降低免疫原性是肽类药物成功设计和临床转化的根本前提。 3. 增强肽类药物性能的化学修饰策略 目前有超过600种肽类药物处于临床前或临床开发阶段，预计到2022年，全球将有超过80种肽类药物获批上市[ 1 ]，且获批用于临床的肽类药物数量在全球范围内持续增长[ 8 ]。这一趋势凸显了药物研发领域的关键性转变，其驱动力在于递送技术的进步和治疗产品线的多元化。本节将重点介绍能够提高肽类药物稳定性、生物利用度和治疗效果的主要化学修饰策略。 3.1. 增强肽类药物性能的化学修饰策略 本综述系统地考察了肽类药物设计中的化学修饰策略，重点关注构象限制和基于偶联的方法，包括环化、聚乙二醇化、脂化和糖基化。文章着重阐述了这些化学策略如何提高肽的稳定性、靶点亲和力和类药性，并探讨了计算设计整合和转化应用所面临的挑战。肽的药理学性能主要取决于其化学结构和代谢稳定性。过去十年中，人们引入了多种化学修饰方法来提高肽的稳定性、增强结合亲和力并延长半衰期（图1，表1）。 图 1. 肽修饰策略增强治疗效果的示意图。上图展示了天然线性肽及其 N 端、C 端和侧链（R1、R2）。下图（a - e）描绘了各种化学修饰，包括环化、聚乙二醇化、脂化、糖基化以及引入非天然氨基酸，以改善肽的蛋白水解稳定性和药代动力学特性。缩写：GalNAc，N-乙酰半乳糖胺；GlcNAc，N-乙酰葡萄糖胺。 3.1.1. 环化 环化是克服线性肽固有药理学局限性的有效策略。大多数短肽在其天然线性形式下，由于其高度柔性，会发生快速的构象互变，导致靶标结合过程中熵损失显著[ 58 ]。此外，线性序列中暴露的酰胺键极易被肽酶水解，导致体内半衰期较短[ 59 ]。为了应对这些挑战，环化促进了二级结构（例如环状或转角结构）的稳定形成，从而提高了肽的蛋白水解稳定性和细胞渗透性[ 1 ]。通过预先组织肽的内部连接，这种结构锁定不仅可以保护肽链骨架免受溶剂介导的降解，还可以促进其与靶标结合位点的有效结合[ 58 , 60 ]。对人血浆中线性肽、单环肽和双环肽的直接比较表明，蛋白水解降解仅限于大环结构之外的残基，其中一种双环肽（B5）几乎所有残基都位于环内，在24小时内保持完整[ 61 ]。类似地，通过针对凝血酶的组合筛选鉴定的环状肽在模拟胃肠液中孵育8小时后仍能保持活性，并且在大鼠体内口服生物利用度高达18%——这是未经修饰的线性肽几乎无法达到的终点[ 62 ]。 因此，人们开发了多种技术，包括通过N端和C端之间的连接实现头尾环化、侧链-侧链环化或侧链-主链环化（图1a）。头尾环化是通过酰胺键将N端和C端残基共价连接，从而形成闭合环状结构。这种末端残基的消除提高了对主要识别N端和C端基团的外肽酶的抵抗力，同时增强了结构刚性，从而限制了内肽酶对肽链主链的接近[ 63 ]。环孢素A和短杆菌肽S是该策略的典型临床批准实例[ 63 ]。 此外，侧链-侧链或侧链-主链环化可通过在功能性侧链之间或侧链与主链之间引入新的共价键（例如二硫键、酰胺键、硫醚键、三唑键或内酰胺键）来形成大环[ 64 ]。与头尾环化不同，这些局部交联策略可以保留至少一个末端或两个末端，使末端功能基团保持完整，从而有助于靶标识别[ 65 ]。这种选择性约束有效地将肽预先组织成其生物活性构象。值得注意的是，烃链交联是一种特殊的侧链环化形式，它通过钌催化的闭环复分解反应稳定α螺旋[ 66 ]。此外，与未交联的序列相比，烃链交联的肽表现出更强的膜穿透性，尽管增强程度取决于环几何形状、主链酰胺的封闭程度和支架类型[ 67 , 68 ]。 Walensky等人开发的环状BH3肽显著提高了蛋白酶抗性和细胞摄取能力[ 69 ]，凸显了构象稳定和预组织作为肽类药物设计和蛋白质-蛋白质相互作用调控的关键策略的重要性。此外，近期的研究进展进一步强调了环化策略在肽类药物开发中的持续重要性，环状肽和环状肽正被越来越多地用于提高药物稳定性、靶向亲和力和细胞内递送效率[ 62 , 70 , 71 , 72 ]。 尽管环化具有这些结构优势，但它也存在一些固有的局限性，例如产率低和合成复杂[ 73 ]。在受限结构无法将肽预先组织成有利的生物活性构象的情况下，环化可能会导致更高的结合焓和更低的效力[ 74 ]。因此，虽然环化是设计和提高肽类药物疗效的有效方法，但其应用需要精心设计，以平衡这些优势与潜在的权衡取舍。 3.1.2. 聚乙二醇化 环化主要通过限制构象柔性来增强肽的稳定性和结合亲和力，而其他策略则通过改变肽的理化性质或利用血清成分延长循环时间来改善其药理活性。其中最成功的策略之一是肽的聚乙二醇化（PEG化）[ 75 ]（图1b）。聚乙二醇由重复的环氧乙烷单元组成，具有诸多优良特性，包括不可生物降解性、低毒性和低免疫原性[ 1 ]。将聚乙二醇与肽偶联可以增加肽的流体动力学尺寸，通过空间位阻保护肽免受蛋白酶的降解[ 76 ]。此外，增大的体积还可以减少肾脏滤过，延长聚乙二醇化肽在体内的滞留时间[ 77 , 78 , 79 ]。事实上，培维索孟（pegvisomant）是一种在第三个α螺旋上修饰的人类生长激素（GH），广泛用作生长激素受体拮抗剂，经聚乙二醇化后，其半衰期延长，免疫原性降低，并已被批准用于治疗肢端肥大症[ 80 , 81 ]。 尽管聚乙二醇化具有这些优势，但由于聚乙二醇链长度的异质性，它会产生多分散性缀合物，这可能导致不同的生物学效应[ 82 ]。此外，据报道，聚乙二醇化导致的肾脏排泄减少会导致药物在组织中蓄积，引发了人们对大分子综合征的担忧，凸显了优化聚乙二醇化分子量和连接基团化学的重要性[ 75 ]。尽管如此，聚乙二醇化仍然被认为是肽类药物设计中的关键策略，尤其适用于需要增强药代动力学特性的应用。 3.1.3. 脂化 脂化是指将脂肪酸（例如棕榈酸和肉豆蔻酸）与肽残基结合，从而促进肽与血清白蛋白的可逆结合并延长其半衰期[ 83 ]（图1c）。脂化肽因其可调控的亲脂性和增强的生物利用度而备受关注，被视为治疗药物[ 84 ]。Kurtzhals等人率先提出了这种方法，他们证明通过连接子将脂肪酸连接到肽的赖氨酸或其他残基上可以促进其与血清白蛋白的结合，从而减少酶降解和肾清除[ 85 ]。白蛋白是血液中最丰富的蛋白质，半衰期长达约20天，它可以通过与多种药物结合而作为载体[ 86 ]。具体而言，研究发现C10至C18的脂肪酸可以与白蛋白上的七个位点结合[ 87 ]。这为脂化肽提供了明显的益处，脂化肽保持与白蛋白相互作用的高概率，并在与白蛋白解离后发挥其治疗作用[ 86 ]。 基于此，通过脂化法开发的最具代表性的治疗性肽是利拉鲁肽。利拉鲁肽是一种人GLP-1类似物，其26位赖氨酸残基上连接有C16脂肪酸，广泛用于2型糖尿病的治疗[ 88 ]。这种方法使利拉鲁肽的半衰期从天然形式的1-2分钟延长至10小时以上[ 88 ]。此外，近期研究表明，包括利拉鲁肽和索玛鲁肽在内的GLP-1衍生物可以自组装形成球形胶束或寡聚体，这有利于维持其半衰期[ 89 ]。然而，这种策略也需要仔细优化。脂化法也存在一些局限性，例如白蛋白亲和力和受体效力之间可能存在权衡[ 90 ]。因此，优化酰基链长度和连接子设计等参数[ 90 ]对于开发长效、稳定和有效的肽类药物至关重要。 3.1.4 糖基化 糖基化是另一种用于提高肽稳定性、溶解度和半衰期的化学修饰策略[ 91 , 92 ]。根据糖链所连接的氨基酸侧链原子，糖基化可分为四种亚型：N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化和S-糖基化[ 93 ]（图1d）。通过将这些糖基单元连接到肽上，可以影响肽的多种药理学性质，例如体内分布、细胞穿透性、代谢稳定性、受体结合和降解速率[ 91 , 94 , 95 ]。糖基化最重要的优势之一是其能够通过亲水性聚糖掩蔽疏水性肽表面来提高肽的水溶性[ 96 , 97 ]。这种修饰能有效防止糖基化肽发生不可逆的聚集和沉淀，而这正是肽设计中的主要障碍[ 98 ]。糖基化生长抑素类似物的开发充分证明了该策略的有效性，这些类似物具有人源复杂型N-糖链[ 97 ]。Ochiai等人证明，定点引入糖基不仅提高了肽的溶解度，还延长了其半衰期，并在不影响受体亲和力的情况下维持了其药理活性[ 97 ]。该实例强调了合理糖基工程在肽药物设计中的重要性。然而，对糖基结构、连接位点和糖型异质性的精确控制仍然具有挑战性[ 93 , 94 ]，因此需要精心设计。 3.1.5. D-氨基酸和非典型残基 传统的策略，包括环化、聚乙二醇化、脂化和糖基化，主要目的是构建空间位阻以抑制蛋白水解活性。相比之下，用D-氨基酸或非经典氨基酸残基取代天然氨基酸残基，会从根本上改变肽链的主链或侧链，使其无法被内源性酶识别[ 99 ]（图1e）。尽管肽和蛋白质主要由L-氨基酸组成，但D-氨基酸——L-氨基酸的对映异构体——天然存在于某些肽中[ 100 ]。引入D-氨基酸的概念源于在细菌细胞壁和非核糖体抗生素肽中发现D-氨基酸，这些肽能够抵抗多种肽酶[ 101 ]。这种天然的酶促逃避策略随后被应用于人类治疗，例如去氨加压素的开发。在这种情况下，N端脱氨结合第8位L-精氨酸被D-精氨酸取代，显著提高了肽的稳定性，并通过防止快速降解延长了其半衰期[ 102 ]。值得注意的是，这种D-氨基酸策略已得到进一步发展，实现了完全由D-氨基酸组成的肽的合成[ 103 ]。Liu等人应用镜像噬菌体展示技术合成了一种由D-氨基酸组成的肽，并鉴定出一种p53-MDM2相互作用的D-肽抑制剂，该抑制剂表现出蛋白水解抗性和对靶点的纳摩尔级亲和力[ 103 ]。这些发现强调了通过精确的立体化学控制，D-氨基酸取代在肽类药物中的有效性。作为该策略的代表性临床批准实例，奥曲肽（一种含有D-色氨酸残基的合成生长抑素类似物）因其增强的稳定性和优异的药理学特性而被广泛应用于临床[ 104 ]。 相比之下，非经典氨基酸（NCAA）是指除核糖体蛋白合成所基因编码的20种标准L-氨基酸之外的任何氨基酸[ 105 ]。与其他方法不同，引入NCAA可以调节肽链骨架几何结构、酰胺键性质和局部构象柔性，从而为肽设计提供超越侧链取代的优势[ 106 ]。例如，正如Castro等人所强调的，α-异丁酸（Aib，一种α,α-二烷基甘氨酸）可以限制肽链骨架二面角，从而促进α-螺旋结构的形成并增强肽的稳定性[ 106 , 107 ]。此外，其他NCAA亚型，包括脯氨酸类似物、β-取代氨基酸和α,β-脱氢氨基酸，也报道了类似的调节作用[ 106 ]，证实了该方法在设计改良肽类药物方面的有效性。 然而，尽管非典型氨基酸（NCAA）具有诸多优势，但其在合成可及性和转化应用性方面仍面临诸多挑战[ 108 ]。Azam等人已证实，NCAA的应用可通过降低T细胞对抗原的识别来调节免疫原性[ 109 ]，但其总体免疫原性后果仍然复杂且尚未完全阐明。大多数证据来源于动物模型，而特定NCAA取代的免疫原性后果可能无法直接转化到人类系统中。这是因为小鼠和人类的MHC结合特异性通常不同，某些表位仅在人类中被识别，而在小鼠模型中则不被识别[ 110 ]。此外，目前的计算机免疫原性预测工具大多针对标准氨基酸进行了优化，并非专门设计用于处理含有D-氨基酸和NCAA的序列，这进一步增加了转化评估的复杂性[ 111 ]。 本节讨论的化学修饰策略总体上通过提高稳定性、药代动力学和结合亲和力，极大地拓展了肽类药物的研发。然而，尽管取得了这些进展，但由于肽类药物膜渗透性有限且易降解，高效的细胞内递送仍然是许多肽类药物面临的主要挑战。为了克服这些限制，细胞穿透肽（CPP）作为一种增强治疗药物细胞摄取和细胞内递送的有效策略而脱颖而出。因此，以下章节将概述基于CPP的药物递送系统及其治疗应用。 4. 细胞穿透肽药物递送系统 高效的细胞内和组织特异性递送仍然是肽类药物临床转化的一项核心挑战。为应对这一挑战而开发的递送系统可大致分为两类：基于肽的载体（例如细胞穿透肽，CPP）和非肽类系统（包括外泌体、纳米颗粒和物理递送方法）。其中，CPP 的特点在于其短肽序列，能够有效促进细胞摄取；而其他递送系统通常依赖于囊泡运输、包封或外部物理力来实现细胞内递送[ 112 , 113 , 114 ]。基于这一特点，CPP 作为能够促进膜转位并克服生物屏障的递送载体而备受关注。除了通用的细胞内递送外，基于 CPP 的系统也被积极探索用于靶向复杂的解剖部位，例如中枢神经系统和肺上皮[ 115 , 116 ]。与此同时，人工智能的进步正在加速 CPP 序列的识别和优化，进一步扩大其转化潜力。 4.1 细胞穿透肽 在过去的三十年中，细胞穿透肽（CPP），也称为肽转导结构域（PTD），已从一项生物学观察发展成为一种应用广泛的细胞内递送载体。该领域的研究始于某些转录因子能够穿过细胞膜的发现[ 117 ]，并最终在1988年Frankel和Pabo的报告中达到顶峰，该报告表明HIV-1 Tat蛋白能够进入细胞并在细胞核内积累[ 118 ]。Tat蛋白中一段富含精氨酸的短区域（氨基酸残基47-57），通常被称为TAT肽，介导细胞内化，并已成为研究最为广泛的CPP之一[ 119 ]。这些以及后续的发现证实，短肽基序足以促进细胞摄取[ 120 ]，并为利用CPP将治疗性药物递送至特定细胞开辟了道路[ 112 , 113 , 121 ]。与此同时，包括单克隆抗体、酶、细胞因子和疫苗在内的蛋白质疗法研发管线不断扩展，凸显了这些药物的治疗潜力及其递送方面的实际困难[ 122 , 123 ]。大多数已获批准的蛋白质药物都是针对细胞外靶点设计的[ 124 ]，因为亲脂性细胞膜形成一道有效的屏障，阻止了大型亲水性大分子到达细胞内作用位点[ 125 ]。为了克服这一限制，人们探索了多种物理和载体递送方法，包括超声雾化[ 126 ]、电穿孔[ 127 ]、磷酸钙共沉淀[ 128 ]、外泌体[ 129 ]和纳米颗粒系统[ 114 , 130 ]。然而，这些方法通常存在一些实际缺陷，包括与操作相关的安全问题、技术复杂性以及对递送蛋白的最终剂量和体内分布的控制有限[ 131 , 132 ]。在此背景下，细胞穿透肽（CPP）作为一种有吸引力的肽基载体脱颖而出，与许多其他细胞内递送技术相比，其免疫原性通常更低，给药更可预测[ 133 ]。 细胞穿透肽（CPP）能够将多种生物活性物质运输到细胞内，包括蛋白质[ 134 , 135 , 136 , 137 ]、肽[ 138 ]、DNA[ 139 ]、siRNA[ 140 , 141 , 142 , 143 ]和小分子药物[ 144 , 145 , 146 ]。通过促进这些治疗药物在原本难以到达的组织和细胞区室中的积累，CPP可以显著提高局部药物浓度和治疗效果[ 147 , 148 ]。因此，CPP 正在被积极开发和改进为药物递送载体 [ 149 ]，用于抗菌药物 [ 150 , 151 , 152 , 153 ]、抗炎药 [ 154 , 155 ]、抗肿瘤药物 [ 156 , 157 , 158 ]、其他类别的药物和神经保护化合物 [ 159 ]。 除了作为递送载体[ 160 ]外，基于细胞穿透肽（CPP）的系统还可以通过化学修饰策略得到进一步增强。环化、脂化和引入非氨基酸（NCAA）等修饰可以提高蛋白水解稳定性、膜相互作用和细胞内持久性，从而增强CPP介导的递送[ 161 ]。例如，富含精氨酸的CPP（如寡精氨酸（R8））的环化可以增强细胞摄取和蛋白水解稳定性[ 162 , 163 ]，而CPP的脂化已被证明可以提高膜亲和力并促进细胞内化[ 164 , 165 ]。基于这些进展，CPP正越来越多地与更复杂的基于肽的递送平台相结合。特别是，基于肽的纳米颗粒和自组装肽系统已成为提高药物稳定性、实现可控或刺激响应释放以及增强细胞内靶向性的多功能方法[ 166 , 167 , 168 ]。这些系统可作为递送平台，封装治疗性药物并保护其免受降解，从而补充了细胞穿膜肽（CPP）主要介导的膜转运功能[ 169 ]。此外，这些平台还可以相互结合，例如，通过将高效的细胞摄取与改进的药代动力学控制相结合，如CPP功能化的纳米载体[ 170 ]。这种整合方法进一步拓展了基于CPP的系统的应用范围，包括其克服血脑屏障等生物屏障的潜力。 4.2. 基于CPP的中枢神经系统药物递送 随着年龄相关疾病患病率的上升[ 171 , 172 ]，基于肽的疗法研究显著增加，这些疗法利用了肽固有的生物相容性[ 173 , 174 ]。大脑受到多种特殊屏障的保护，免受体循环的影响，这些屏障严格调控血液、脑脊液和神经组织之间分子的运动[ 175 , 176 ]。其中，血脑屏障（BBB）的限制性最强[ 177 ]。它由无孔脑微血管内皮细胞构成，这些细胞通过复杂的紧密连接和黏附连接相互封闭，并由基底膜、周细胞和星形胶质细胞终足支撑[ 178 ]。这一神经血管单元严格限制了细胞旁扩散，并通过一系列流入和流出系统严格控制跨细胞转运[ 179 , 180 ]。因此，只有极少数全身给药的化合物——通常是分子量小于400 Da、亲脂性足够强且氢键结合能力有限的小分子——能够通过被动扩散穿过血脑屏障[ 181 ]。尽管还存在其他途径，例如转运蛋白介导、受体介导或吸附介导的胞吞作用[ 182 ]，但药代动力学数据显示，大多数靶向中枢神经系统的候选药物由于无法有效穿过血脑屏障，因此无法在大脑中达到治疗浓度[ 183 , 184 ]。为了克服这一障碍，人们正在探索利用细胞穿膜肽（CPP）和其他靶向肽作为替代递送平台，以提高药物进入中枢神经系统的效率[ 115 , 185 ]。CPP具有与细胞膜相互作用并进行胞吞作用的固有能力[ 186 ]，因此可以将其与小分子、肽、蛋白质或纳米颗粒偶联，以促进它们穿过血脑屏障[ 187 , 188 ]。在一项代表性研究中，系统性给药含有HIV-1 TAT蛋白转导结构域的Bcl-xL融合蛋白，可有效将药物递送至脑神经元。该方法显著降低了局灶性脑缺血小鼠模型中的梗死体积和神经元凋亡[ 189 ]。因此，细胞穿透肽（CPP）提供了一种绕过或调节血脑屏障的策略，有望增加原本会被排除在外的治疗药物进入大脑的几率，并扩大中枢神经系统内可进行药物治疗的靶点范围。 4.3. 基于CPP的肺部药物递送系统 由于肺部给药系统可通过吸入直接且无创地给药，其巨大的吸收表面积以及细胞内信号传导驱动的疾病机制的普遍性，因此，基于细胞穿透肽（CPP）的给药策略极具吸引力[ 190 ]。与肝脏、心脏、肾脏和大脑等需要穿过血管内皮屏障或血脑屏障（BBB）的全身器官不同，肺部给药使CPP能够绕过这些主要的全身屏障[ 191 ]。尽管具有这些解剖学优势，肺上皮仍然存在生物屏障，会限制治疗性大分子有效进入细胞。CPP通过促进主动膜转位，为克服肺上皮屏障提供了一个强大的框架。这使得药物能够到达传统肽类和蛋白质类药物难以触及的细胞内治疗靶点[ 192 ]。研究表明，经气管内给药后，TAT肽偶联的siRNA可递送至小鼠肺上皮细胞和巨噬细胞，从而显著降低靶基因的表达[ 193 ]。此外，与天然胰岛素相比，TAT偶联显著增强了siRNA跨肺上皮的转运，表明CPP偶联可以提高蛋白质治疗药物的肺部吸收[ 194 ]。最近，研究人员发现了一些靶向肺的CPP，例如S7A和R11A，它们能够有效穿透人支气管上皮细胞，并在体内优先积累于肺组织中，从而实现将治疗性siRNA递送至肺泡上皮细胞[ 116 ]。这种解剖学优势有助于药物高效进入细胞，同时可能限制非特异性全身分布及其相关毒性，从而解决了基于CPP的治疗药物转化应用中的一个重要瓶颈[ 195 , 196 ]。这种能力对于呼吸系统疾病尤为重要，因为呼吸系统疾病的致病过程是由上皮细胞或免疫细胞内的细胞内通路调控的。此外，细胞穿透肽（CPP）展现出卓越的载药多样性，能够递送多种有效载荷，包括肽、蛋白质、核酸、小分子和纳米载体系统。当与吸入给药相结合时，CPP介导的转运可增强药物在肺组织内的局部蓄积，同时最大限度地减少全身循环。这通过减少脱靶效应和剂量限制性毒性来提高治疗指数[ 197 ]。 尽管细胞穿透肽（CPP）通常缺乏固有的细胞类型特异性，可能被多种肺部细胞群内化，但通过序列优化和整合活性靶向基团，这一挑战正日益得到克服[ 198 ]。此外，包括黏液滞留、表面活性剂相互作用和免疫监视在内的肺部清除机制会降低体内递送效率。然而，制剂科学和吸入技术的持续进步正在有效地缓解这些问题[ 199 ]。最后，长期或高剂量吸入可能产生的细胞毒性和免疫原性，使得CPP的设计和安全性评估必须十分严谨[ 200 ]。这些因素应被视为临床应用中可控的障碍，而非根本性的阻碍。 然而，传统的治疗性肽筛选实验方法主要依赖于人工修饰和反复试验，本质上耗时、成本高昂且费力[ 201 ]。在此背景下，肽序列优化和递送性能的复杂性凸显了开发更高效、更系统化设计方法的必要性。因此，基于人工智能的药物设计已成为一种强大的策略，它能够实现数据驱动的肽序列生成、活性和毒性的预测建模以及多目标优化，从而加快药物发现速度并提高候选药物筛选效率。在接下来的章节中，我们将讨论人工智能驱动的肽类药物设计领域的历史进展和新兴策略。 5. 人工智能引导的肽类药物设计和预测建模 5.1 肽类药物研发算法框架的演变 过去二十年来，肽类药物发现的计算格局已从基于经验的、物理化学规则的方法发展到先进的人工智能框架（图2）。早期研究依赖于肽的生化活性与物理化学描述符（如净电荷、疏水性和两亲性）之间的统计相关性，这构成了定量构效关系（QSAR）模型的基础[ 202 ]。随着肽数据集的扩展，机器学习方法——特别是支持向量机（SVM）和随机森林（RF）模型——得到了广泛应用，使得通过氨基酸组成等描述符进行更系统的特征工程和序列分类成为可能[ 203 , 204 , 205 , 206 , 207 , 208 , 209 , 210 ]。随着肽数据集复杂性的增加，后续发展引入了集成学习策略和元学习框架，这些策略和框架整合了多个分类器，以提高预测稳定性并减少模型偏差[ 211 , 212 , 213 , 214 ]。最近，基于Transformer的蛋白质语言模型（PLM）[ 215 ]，包括ProtBERT、ProtT5[ 29 ]和ESM[ 216 ]等模型，通过生成无需人工特征工程即可捕获结构和进化信息的高维序列嵌入，显著推进了肽预测[ 216 , 217 , 218 ]。这种从经验描述符到深度表征学习的演进，极大地提高了肽活性预测和合理设计的准确性和可扩展性[ 219 ]。然而，这些模型并非没有局限性：它们的计算需求可能很大，而且它们产生的高维嵌入空间往往难以进行直接的生物学解释，这在预测能力和机制洞察力之间提出了权衡。 图 2. 肽类药物发现和设计算法方法的演变。时间轴展示了五个不同阶段的按时间顺序发展：（a）早期统计和基于规则的方法，例如定量构效关系（QSAR）（2005–2012）；（b）传统机器学习应用，包括支持向量机（SVM）和随机森林（RF）（2013–2018）；（c）高级集成和元学习策略（2018–2022）；（d）深度学习和蛋白质语言模型（PLM）的应用（2022 年至今）；以及（e）生成式人工智能在从头设计中的当前和未来应用。缩写：QSAR，定量构效关系；SVM，支持向量机；RF，随机森林；PLM，蛋白质语言模型；GNN，图神经网络；CNN，卷积神经网络；ESM-2，进化尺度模型 2。 与此同时，人工智能驱动的预测建模框架通过将大规模生物数据与先进的学习算法相结合，不断拓展计算肽发现的范围。越来越多的生成式人工智能方法——包括基于扩散的模型和结构感知序列设计框架——被应用于从头设计具有定制治疗特性的肽[ 220 , 221 ]。一些里程碑式的进展，例如Cao等人的研究，已经证明了仅从靶标结构设计高亲和力结合剂的能力[ 222 ]。此外，生成式模型目前正扩展到包含非天然氨基酸和化学修饰残基，这对于提高下一代肽类药物的蛋白水解稳定性和类药性至关重要[ 223 ]。尽管取得了这些进展，但仍存在一些挑战。许多计算设计的序列由于聚集、溶解度差或脱靶效应等原因而无法通过实验验证[ 224 , 225 ]。此外，目前的生成模型仍然难以同时优化多个药理学目标，例如效力、选择性和代谢稳定性。 5.2. 人工智能在CPP预测中的应用 作为这些进展的典型例证，细胞穿透肽（CPP）的预测已从人工智能驱动的建模方法中获益匪浅（图3 ），表2总结了具有代表性的CPP预测模型。这些模型的开发通常始于高质量基准数据集的构建，例如MLCPP2.0[ 226 ]、CPPsite1[ 227 ]、CPPsite2[ 228 ]、CPPsite3[ 229 ]、CPP924[ 230 ]和CPP1708[ 231 ]，这些数据集提供了经实验验证的肽序列，用于训练和评估。表3总结了这些数据集的详细信息，包括数据集大小、序列多样性（例如，使用CD-HIT或重复序列去除进行冗余度降低）[ 114 , 232 ]以及实验验证的程度。构建完成后，肽序列必须转换为计算机可处理的表示形式。这可以通过一系列编码策略来实现，包括手工设计的描述符（用于捕捉物理化学性质，例如疏水性、电荷和氨基酸组成）[ 233 ]、基于SMILES的分子表示（通过RDKit[ 235 ]或DeepChem[ 236 ]等化学信息学库进行处理）[ 234 ]，以及源自大规模预训练模型（例如ProtBERT、ProtT5和ESM）的PLM嵌入[ 29 , 216 ]。此外，还可以使用蛋白质接触图等结构表示来捕捉氨基酸之间的空间关系并描述三维折叠模式[ 216 , 237 ]。 图 3. CPP 预测模型开发的主要阶段。该流程包含四个主要阶段。CPP 数据整理：对包括 MLCPP2.0、CPPsite1、CPPsite2、CPPsite3、CPP924 和 CPP1708 在内的各种数据集进行基准测试，以确保数据的稳健性。特征提取：通过手工特征、PLM、SMILES 序列和蛋白质接触图提取多模态信息。预测模型构建：构建混合架构，该架构整合了传统机器学习（SVM、基于树的分类器）和深度学习框架（CNN、BiLSTM/BiGRU、注意力机制），并使用手工特征和基于 PLM 的特征。通过将蛋白质接触图与现有特征相结合来构建 GNN，以增强预测效果。模型优化与部署：通过超参数优化和集成学习技术改进模型性能，然后部署最终的预测模型。缩写：AAC，氨基酸组成；TPC，三肽组成； DPC，二肽组成；ASDC，自适应跳跃二肽组成；CTDC，k间隔氨基酸对组成（组成）；CTDD，组成、转换、分布（分布）；CTDT，组成、转换、分布（转换）；GAAC，分组氨基酸组成；ProtBERT，基于Transformer的蛋白质双向编码器表示；ProtT5，蛋白质文本到文本转换Transformer；ESM，进化尺度建模；SMILES，简化分子输入行输入系统；SVM，支持向量机；CNN，卷积神经网络；BiLSTM，双向长短期记忆网络；BiGRU，双向门控循环单元；GNN，图神经网络；CPP，细胞穿透肽。 这些多样化的表征通过各种机器学习（ML）和深度学习（DL）架构进行分析。传统的机器学习方法，包括支持向量机（SVM）和基于树的分类器，由于其在处理结构化特征时的鲁棒性和可解释性，仍然被广泛使用[ 17 , 207 , 208 , 209 , 211 , 226 , 230 , 238 , 239 , 240, 241 , 242 , 246 , 247 ]。近年来，深度学习架构使得肽序列的建模更加复杂。卷积神经网络（CNN）可以识别局部序列模式[ 243 , 248 ]，而循环神经网络，例如双向长短期记忆网络（BiLSTM）和双向门控循环单元（BiGRU），则可以捕捉肽序列中的长程依赖关系。基于注意力机制的模型通过突出显示功能重要的残基进一步提升了预测性能[ 29 , 244 , 245 ]。此外，图神经网络（GNN）整合了从蛋白质接触图谱中提取的结构信息，使模型能够捕捉氨基酸之间复杂的三维关系[ 231 ]。这些特征表示和模型架构通常被整合到预测框架中，并采用超参数优化和集成学习策略来提高模型的泛化能力[ 246 ]。为了确保科学界的可访问性和可复现性，许多此类先进模型被部署为开源工具或用户友好的Web服务器，从而弥合了计算开发和实验应用之间的差距。 5.3. 人工智能驱动的肽类药物发现的计算框架 随着机器学习（ML）和深度学习（DL）的快速发展，人们可以通过考虑多种复杂因素来设计肽类药物[ 19 , 20 , 21 ]。为了准确预测所设计肽的疗效，人们开发了多种计算表示方法和特征提取策略，能够将复杂的分子和生物学信息编码成机器可读格式[ 29 , 215 , 233 , 234 ]。这些表示方法与现代机器学习和深度学习架构相结合，使得在化学合成之前能够对候选序列进行快速的计算机模拟筛选，从而克服了传统实验方法的诸多实际局限性[ 249 ]。这些方法共同构建了一个从序列生成到功能评估的集成流程（图4）。 图 4. AI 驱动的肽药物发现和实验验证工作流程。该示意图展示了 AI 驱动的肽发现和验证的完整工作流程。肽生成：使用生成式 AI 架构（包括 GAN、VAE 和扩散模型）生成多样化的候选序列。特征提取：通过手工设计的特征、PLM 嵌入、蛋白质接触图和基于 SMILES 的描述符，将生成的序列转换为计算机可处理的格式。预测模型：使用机器学习 (ML) 和深度学习 (DL) 架构分析提取的特征。ML 使用 SVM 和基于树的分类器等模型，而 DL 采用 CNN、BiLSTM/BiGRU、基于注意力机制的机制和 GNN 等架构。湿实验验证：通过各种检测（例如细胞毒性和溶血试验）对预测的肽进行实验验证，以确保其安全性，并通过功能活性检测验证其治疗效果。缩写：GAN，生成对抗网络； VAE，变分自编码器；PLM，蛋白质语言模型；SMILES，简化分子输入行输入系统；ML，机器学习；DL，深度学习；SVM，支持向量机；CNN，卷积神经网络；BiLSTM，双向长短期记忆网络；BiGRU，双向门控循环单元；GNN，图神经网络。 尽管计算技术取得了这些突破性进展，但严格的湿实验验证——包括功能性检测和安全性评估——对于最终确认预测候选药物的生物活性和安全性仍然至关重要。此类验证通常包括功能性活性检测以验证治疗效果，以及安全性评估，例如细胞毒性和溶血试验[ 250 ]。以极低的成本和快速筛选设计大量候选肽的能力，为传统的实验验证提供了强大的补充。重要的是，CPP介导的递送不应仅仅从肽序列层面来解读，而应将其视为一个涉及CPP-载体复合物（例如核酸、蛋白质或小分子）的复杂系统[ 225 , 251 ]。在这样的系统中，包括粒径、表面电荷和结构柔性在内的理化性质，会根据靶细胞类型和生物屏障的不同，对细胞摄取产生关键影响[ 113 , 114 ]。因此，目前的AI模型在设计优化的CPP序列方面展现出巨大的潜力，但仍需对CPP介导的递送系统进行进一步的研究。在这方面，人工智能方法为肽类药物的研发做出了有意义的贡献，尽管这种贡献是片面的。为了支持这些进展，持续改进计算算法和人工智能架构至关重要。 6. 未来展望与发展趋势 肽类药物领域正处于变革的关键时刻，融合的技术创新有望克服长期存在的药代动力学和递送方面的局限性[ 36 , 252 ]。人工智能算法通过深度生成模型革新肽类药物的发现，能够快速从头设计具有预测生物活性、降低毒性和增强膜渗透性的优化序列[ 28 , 253 ]。整合包括免疫肽组学和蛋白质组学在内的多组学平台，有助于全面识别用于个性化癌症疫苗的新抗原，临床试验已证实，在黑色素瘤、胶质母细胞瘤和其他恶性肿瘤中，这些疫苗能够诱导强大的T细胞反应并延长无进展生存期[ 254 , 255 , 256 ]。 尽管取得了这些进展，但将这些创新转化为有效的肽递送策略仍然面临诸多关键挑战。开发针对特定载体的设计策略至关重要，因为不同蛋白质、核酸和小分子之间的递送效率差异显著。在此背景下，未来的AI框架应超越基于序列的设计，并纳入与递送相关的参数，例如细胞穿透肽（CPP）与载体的相互作用、颗粒大小和表面电荷，从而更准确地预测跨越各种生物屏障的细胞摄取情况[ 114 ]。 利用肽生成模型设计候选序列，然后通过预测模型（例如分类、溶血和最小抑菌浓度预测）进行多目标优化和评估，可以高效地评估潜在的肽类药物，并可部分替代早期实验筛选[ 257 ]。然而，此类方法无法完全替代全面的湿实验验证和临床评估。因此，肽类药物开发的下一阶段预计将由人工智能驱动的序列设计和预测建模与靶向递送至疾病相关组织的湿实验验证和临床评估相结合来驱动。 这些进展共同将肽类药物定位为精准医疗药物，能够靶向以往难以成药的细胞内通路。这可以通过提高递送效率和降低毒性来实现，从而扩大治疗窗口并最大限度地减少脱靶效应。此外，这种融合预示着一个新时代的到来，在这个时代，计算设计和实验验证将协同加速临床转化，前提是模型可解释性、稳健的实验验证流程以及人工智能设计疗法的监管框架能够取得协调一致的进展。 7. 结论 肽类药物作为一种重要的药物形式，日益被认为是连接小分子药物和生物制剂的重要桥梁，兼具高靶向特异性和良好的安全性。然而，其临床转化仍受限于稳定性差、清除迅速和生物利用度低等问题。本文重点阐述了合理的化学修饰，包括环化、聚乙二醇化、脂化以及引入非经典残基，如何改善肽的蛋白水解抗性和药代动力学性能。同时，基于细胞穿透肽（CPP）的递送策略拓展了细胞内和组织选择性靶向的范围。值得注意的是，人工智能（AI）的整合代表了该领域的一次实质性变革。生成模型支持从头序列设计，而机器学习（ML）和深度学习（DL）则实现了多参数优化和候选药物优先级排序，从而简化了药物发现流程并降低了实验失败率。将人工智能驱动的肽设计与多参数优化和先进的递送策略相结合，有望使人们能够攻克以往难以攻克的治疗靶点。尽管在可制造性和免疫原性方面仍存在挑战，但基于 CPP 的递送策略（作为肽递送的几种方法之一）的进展，以及其他策略（如纳米颗粒、外泌体和肽-药物偶联物），使肽疗法成为未来精准药物治疗的关键组成部分。 在此背景下，人工智能通过整合生成模型和多目标优化，实现了肽的快速设计和评估，从而加速了有前景的候选药物的筛选。然而，全面的湿实验验证和临床评估仍然至关重要，这凸显了构建将计算设计与实验验证相结合的集成平台的必要性。 DOI:10.3390/pharmaceutics18050537 文章来源于： 合肥肽研生物科技有限公司 http://hftaiyan.com/index.php?m=home&c=View&a=index&aid=222 — End —