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从自由基SAM酶到P450、BURP与MNIO：肽类大环化学生物学的全景解析 通讯作者：Brandon I. Morinaka（新加坡国立大学药学系）发表时间：2026年2月16日发表期刊：Chemical Society Reviews（英国皇家化学会）原文链接：https://doi.org/10.1039/d5cs00585j第一章：引言——肽类天然产物的结构多样性与自由基环化的独特价值 天然产物自古以来就是人类药物发现的重要源泉。从青霉素的发现到现代抗癌药物的研发，肽类天然产物始终处于药物化学的核心位置。环肽因其独特的构象刚性和抗蛋白酶降解能力，成为药物研发中备受瞩目的分子骨架。代表性的环肽包括万古霉素（vancomycin）、达托霉素（daptomycin）、罗米地辛（romidepsin） 和环孢菌素（cyclosporine），这些化合物在抗生素、免疫抑制和抗肿瘤治疗中发挥着不可替代的作用。 肽类天然产物的生物合成主要通过两条途径实现：非核糖体肽合成酶（NRPS）途径和核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPP）途径。在NRPS途径中，环化通常发生在肽链延伸过程中或紧随其后，由硫酯酶结构域或独立环化酶催化，形成酯键、酰胺键或硫醚键。而在RiPP途径中，环化发生在翻译后阶段，由自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶、羊毛硫氨酸合成酶或P450酶催化，安装多种分子内交联，稳定成熟的核心肽结构。 自由基介导的环化反应具有独特的优势。与依赖于配对电子机制的N端到C端环化不同，自由基环化利用高反应性的自由基中间体，能够激活未活化的C–H键，形成传统化学合成难以实现的C–C、C–S、C–N和C–O键。这些交联不仅增强了肽的构象稳定性和蛋白水解抗性，还赋予了其独特的生物活性和药代动力学性质。 本文聚焦于自由基介导的肽环化反应，系统总结了近年来在rSAM酶、细胞色素P450酶、BURP结构域蛋白、DUF3328结构域蛋白和多核非血红素铁依赖氧化酶（MNIOs） 等领域的最新进展。通过对这些酶的催化机制、结构基础和生物合成途径的深入剖析，本文揭示了自然界如何利用自由基化学构建复杂的肽类大环结构，并为合成生物学和药物发现提供了新的思路。第二章：自由基SAM酶——肽环化的主力军 自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶是自然界中催化功能最多样化的酶家族之一。这些酶通过一个保守的CxxxCxxC motif结合一个[4Fe–4S]簇，催化SAM的还原裂解，生成5′-脱氧腺苷自由基（5′-dAdo•） 和甲硫氨酸。5′-dAdo•随后从底物中夺取一个氢原子，启动自由基反应。这一机制被称为自由基引发阶段，紧接着是自由基传播阶段和终止阶段。 rSAM酶的催化多样性源于其复杂的结构域组成。许多rSAM酶在C端含有SPASM结构域，该结构域可结合多个辅助[4Fe–4S]簇，参与底物结合、自由基稳定和电子传递。这些辅助簇的存在使得rSAM酶能够催化多种复杂的反应，包括C–C键形成、C–S键形成、C–N键形成和C–O键形成。 2.1 碳–碳键形成：从链球菌到肠道菌群2.1.1 Streptide：Lys–Trp交联的典范 Streptide是由Streptococcus属细菌产生的C–C交联环肽，其生物合成基因簇（BGC）包含strA（前体肽）、strB（rSAM酶）和strC（肽酶-转运蛋白融合蛋白）。StrB催化Lys2的Cβ与Trp6的C7之间的C–C键形成，生成一个21元大环。 机制研究揭示了自由基亲电芳香取代（rEAS） 途径的详细过程：StrB首先通过其[4Fe–4S]簇还原裂解SAM，生成5′-dAdo•，该自由基从Lys2的Cβ夺取一个氢原子，生成赖氨酰自由基。该自由基随后进攻Trp6的吲哚环C7位点，形成一个σ-自由基中间体，其中新的C–C键将吲哚环上的C7转化为sp³杂化中心。这一中间体随后通过电子转移被辅助[4Fe–4S]簇（Aux1） 氧化，完成芳香环的再芳构化，形成最终的C–C交联。 关键实验证据包括： 同位素标记实验：当使用侧链氘代赖氨酸（Lys-d3）作为底物时，观察到选择性丢失β-氘原子，并生成氘代的5′-脱氧腺苷（5′-dAdoH），证实氢原子夺取发生在Lys的Cβ位点。 EPR光谱：通过冷冻淬灭EPR技术，研究者成功捕获并表征了Lys–Trp自由基中间体，直接证实其为催化循环中的通路中间体。 立体化学分析：通过全合成和立体化学比较，确定Lys的Cβ位点形成R-构型的手性中心。 SuiB是StrB在Streptococcus suis中的同源酶，其晶体结构揭示了rSAM酶的三维组织：一个N端rSAM核心结构域、一个中间桥接结构域和一个C端SPASM结构域。SPASM结构域结合两个辅助[4Fe–4S]簇，这些簇在底物识别和催化过程中发挥关键作用。2.1.2 Trygysin A：双环肽的精准构建 Trygysin A是由Streptococcus ferus产生的双环肽，其结构包含一个前所未有的四氢[5,6]苯并吲哚大环。这一复杂结构由单个rSAM酶WgkB催化形成，该酶在同一底物上安装两个连续的C–C交联：Trp–C5与Lys–C6（形成trygysin A）和Trp–C6与Lys–C2（形成trygysin A的异构体）。 值得注意的是，在催化过程中未检测到单交联中间体，表明WgkB可能在单一催化循环中完成两个交联，或者对单交联产物具有极高的亲和力，使其迅速转化为双环产物。这种过程性催化（processive catalysis） 机制在rSAM酶中较为罕见，反映了酶对底物的精确控制。 生物活性研究显示，trygysin A对主要人类病原体肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 具有低于100 nM的最低抑菌浓度（MIC），与广谱抗生素环丙沙星（ciprofloxacin） 相当。然而，与环丙沙星不同的是，trygysin A对15种其他链球菌属物种和常见人类共生菌无抑制活性，显示出极高的选择性。这一特性使其成为窄谱抗生素的理想候选，可最大程度减少对肠道菌群的破坏。 有趣的是，trygysin A对其产生菌S. ferus也具有自抑制效应，但这种抑制是抑菌性（bacteriostatic） 而非杀菌性（bactericidal） 的。基因簇中缺乏专门的免疫基因，加上抑制作用的可逆性，提示trygysin A可能具有调控或信号传导功能，而非单纯的抗菌分子。研究者提出，trygysin A可能在链球菌群落中扮演生态信号和群体感应调节因子的双重角色。2.1.3 Rypides：Arg–Tyr环烷烃的简洁之美 Rypides是由RrrB催化形成的三残基环烷烃（cyclophane），其结构基于一个RRY motif，在Arg的Cδ和Tyr的C3之间形成C–C键。rrr BGC最初发现于Streptococcus suis LSS38_2菌株，包含shp/rgg群体感应系统、前体肽RrrA、rSAM酶RrrB和转运蛋白RrrC。 催化机制研究显示，RrrB遵循经典的rSAM途径：SAM裂解生成5′-dAdo•，该自由基从Arg的Cδ夺取氢原子，生成精氨酰自由基。该自由基随后对Tyr的C3进行亲核进攻，形成稳定的C–C键。RrrB的SPASM结构域中含有多个辅助[4Fe–4S]簇，这些簇可能参与自由基中间体的稳定和副反应的抑制，确保大环化的选择性。 底物特异性研究表明，RrrB对核心序列的修饰具有严格选择性，任何对RRY motif的突变都导致产物无法形成。然而，前导肽（leader peptide） 却是可有可无的，这是RiPP修饰酶中较为罕见的现象。这一发现提示，RrrB可能通过直接识别核心序列中的结构特征来实现底物特异性，而非依赖于传统的前导肽识别机制。2.1.4 Bacteroides来源的Trp交联肽：肠道菌群的化学暗物质 通过创新的共现搜索策略，Bushin等人绘制了约15,500个rSAM-RiPP基因簇的分布图，将其划分为800个亚家族。在这一大规模基因组挖掘中，研究者鉴定出来自人类肠道菌群核心成员多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron） 的一个独特基因簇，编码YcaO酶（ItfB） 和rSAM/SPASM酶（ItfD）。 ItfD催化一个前所未有的C–C交联，连接Ile55的Cδ1和Trp53的C7，形成一个三残基大环。这一修饰与ItfB催化的骨架脒基化共同构成了该RiPP的独特结构特征。通过体内和体外生化实验，结合NMR和HR-MS/MS分析，研究者确认了这一交联的结构，并提供了机制见解。 关键证据来自氘代标记实验：当在交联位点引入全氘代异亮氨酸（Ile-d10）时，产物出现-4 Da的质量位移，同时生成氘代5′-dAdo。这一结果明确表明，Ile是氢原子夺取的位点，支持自由基机制在交联形成中的作用。这一研究不仅扩展了rSAM酶的催化功能谱，还建立了基于共现分析的RiPP发现框架，为后续的基因组挖掘工作提供了方法论基础。2.2 吡咯喹啉醌（PQQ）：辅因子生物合成中的自由基化学 吡咯喹啉醌（PQQ） 是一种氧化还原活性的RiPP辅因子，在细菌脱氢酶中发挥关键催化作用。与链球菌来源的群体感应相关RiPP不同，PQQ参与能量代谢，是甲基营养菌和假单胞菌等细菌中不可或缺的辅因子。 PQQ的生物合成由保守的六基因操纵子（pqqA–pqqF/G） 编码，其中rSAM酶PqqE催化关键步骤：在PqqA前体肽中形成一个Glu与Tyr之间的C–C键。以扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens AM1） 为模型系统的研究揭示了这一途径的关键机制特征。 PqqE是SPASM结构域rSAM酶家族的成员，其催化机制包括： SAM还原裂解：PqqE的[4Fe–4S]RS簇还原SAM，生成5′-dAdo•和甲硫氨酸。 氢原子夺取：5′-dAdo•从Glu的β-位夺取氢原子，生成肽基自由基。同位素标记实验使用β-位氘代的Glu变体PqqA，观察到5′-dAdoH形成的显著氘动力学同位素效应，证实了氢原子夺取步骤。 自由基偶联：Glu自由基与Tyr环的邻位发生区域选择性偶联，形成PQQ的核心结构。 与大多数RiPP修饰rSAM酶直接通过前导序列识别底物不同，PqqE需要PqqD作为分子伴侣来辅助底物定位。结构研究表明，PqqD与PqqA和PqqE形成三元复合物，稳定前体肽并确保反应残基在活性中心的正确取向。这一伴侣辅助机制代表了RiPP生物合成中的一种独特策略，类似于其他rSAM修饰天然产物中前导肽的作用。 PqqE的SPASM结构域含有两个辅助铁硫簇：AuxI和AuxII。通过X射线晶体学、EPR光谱和Mössbauer光谱的多角度研究，研究者揭示了这些簇的性质和功能： AuxII配位一个典型的[4Fe–4S]簇，由三个半胱氨酸和一个独特的天冬氨酸配体（Asp319） 组成。 AuxI在晶体结构中表现为[2Fe–2S]构型，但在强还原剂（如Ti(III)柠檬酸盐或Eu(II)-DTPA）存在下可还原为[4Fe–4S]状态。 Mössbauer光谱区分了三个独立的Fe-S环境，而天然质谱则量化了金属-硫含量，确认了同时含有两个[4Fe–4S]和一个[2Fe–2S]簇的PqqE物种的存在。 定点突变研究表明，所有三个Fe-S簇对产酶活性都是必需的，它们在自由基引发和稳定中发挥关键作用。这些辅助簇微调反应的特异性，引导自由基介导的交联具有高度的区域选择性和立体选择性。 PqqE催化C–C键形成后，交联的PqqA衍生中间体经历下游加工步骤，包括蛋白水解修饰和进一步成熟，最终通过PqqC催化的氧依赖多步氧化转化为成熟的PQQ。生化研究表明，PqqB是一种Fe²⁺依赖性羟化酶，催化PqqA衍生中间体的氧插入反应，为PQQ生物合成途径提供了关键环节。2.3 三肽环烷烃（Triceptides）：最小基序中的最大多样性 三肽环烷烃是一类独特的RiPP，其特征是由三个残基构成的环烷烃大环，其中芳香残基（通常是Trp、Phe或Tyr）与另一残基（通常是Asn、Ser、Arg或Lys）的β-碳形成C(sp²)–Cβ(sp³)交联。这一转化由rSAM/SPASM酶催化，统称为三残基环烷烃形成酶（3-CyFEs）。 三肽合成酶虽然具有统一的催化机制，但它们的SPASM结构域中缺乏典型的Aux I结合半胱氨酸残基。然而，基于整体序列相似性，这些酶仍归属于rSAM/SPASM蛋白家族。三肽合成酶的三个创始成员是Xye、Grr和FxS系统，每个系统都与特征性的前体序列相关，并分布于特定的细菌类群中。 2.3.1 XYE系统：xenoreptides的复杂环化 Xye系统以Xenorhabdus、Yersinia和Erwinia三个细菌属命名，通常由前体肽XyeA、负责交联的rSAM/SPASM成熟酶XyeB、天冬氨酸蛋白酶XyeC、HlyD型转运蛋白XyeD以及蛋白酶-转运蛋白融合蛋白XyeE组成。 前体肽XyeA约含60个残基，其核心区与导肽之间由Gly-Gly motif分隔。C端有一个特征性的WxxF/YxxWxxxx序列，作为自由基介导交联的支架。来自嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila） 的rSAM成熟酶XncB的催化活性通过在大肠杆菌中与同源前体肽XncA的异源表达得到验证。 功能表征确认，XncB引入三个独立的环烷烃交联： Trp1–C6与Asn3–Cβ Phe5–C4与Asn7–Cβ Trp8–C6与Arg10–Cβ 这些交联形成了一个刚性的多环骨架。有趣的是，Han等人对来自Photorhabdus australis的同源成熟酶PauB的体外研究表明，这些交联是独立且顺序发生的，从N端位点开始，然后是C端位点，最后是中心交联。 然而，Phan等人对XncB生物合成灵活性的进一步研究揭示了意外的氧掺入现象。全长簇表达研究（His6-SUMO-xncA + xncBCDE）检测到一个微小的+12 Da质量位移，通过MS/MS定位于Asn7，提示存在氧化衍生物。这一修饰在非芳香性X3变体（N7R/K/S/A）中消失，表明氧掺入可能与特定底物性质或自由基稳定性有关。氧的精确来源尚不清楚，可能的机制包括氢过氧化物介导的氧化、自由基重排或通过脱氢氨基酸中间体的水加成。这些发现揭示了rSAM酶学中此前未被认识的功能分化，某些成熟酶如XncB可能表现出超出常规C–C键形成的潜在氧化能力。 质谱分析还显示，XncB修饰环烷烃的顺序与PauB不同：XncB首先修饰C端motif，然后是N端motif，最后是中心环。同源酶之间反应顺序差异的根本原因尚不清楚，可能归因于活性位点结构的差异、底物定位的不同或辅助Fe-S簇对自由基稳定的影响。2.3.2 Gly-rich repeat系统：蓝藻中的多功能环化酶 Gly-rich repeat（Grr）系统主要存在于蓝藻中，编码前体肽GrrA、rSAM/SPASM酶GrrM和ABC转运蛋白底物结合蛋白GrrP。这些BGCs（如来自Oscillatoriales cyanobacterium（osc）、Lyngbya sp. PCC 8106（lsc） 和Geminocystis sp. NIES-3709（gsc） 的系统）指导合成的前体肽长度为100至200个残基。每个前体肽的约一半对应于富含甘氨酸的C端核心区，其中散布着多个Ω1–X2–X3 motifs，作为酶修饰的识别位点。 与修饰紧凑前体的Xye系统不同，Grr型成熟酶表现出广泛的底物混杂性，可催化几乎所有可用motif的修饰。当带有胰蛋白酶切割位点的天然或工程化前体与同源成熟酶在大肠杆菌中共表达时，LC-MS检测到几乎每个Ω1–X2–X3 motif都出现-2 Da质量位移，表明广泛的交联活性。 使用含有两个motif（WGN和FIN）的最小OscA2前体进行的详细结构解析确认，OscB催化形成Trp–C7与Asn–Cβ环烷烃以及Phe–C4与X3–Cβ的交联。X2和X3位置的替换灵活性以及对motif间距变化的耐受性进一步凸显了OscB的宽松序列特异性。 功能研究揭示，OscB在X2位置接受广泛的氨基酸，包括小、极性和疏水残基，而在X3位置更具选择性——耐受某些替换但效率降低。关键的是，只有色氨酸和苯丙氨酸在Ω1位置被接受，强调了酶对芳香族自由基引发的特异性。 深入突变分析还确定了导肽内的一个关键识别区域，对OscB的催化活性至关重要。值得注意的是，该酶对具有显著变化的Ω1–X2–X3 motif数量和间距的底物表现出强大的活性，有效加工C端核心区长达47个残基的前体肽，甚至可加工延伸至80个残基的工程化嵌合前体。尽管存在这种结构复杂性，OscB始终形成三残基环烷烃，表明对环拓扑结构和大小的精确控制。 基于NMR的构象研究表明，Trp–C7修饰产物表现出平面手性，吲哚环的取向与C6修饰产物相当，揭示了这类环烷烃的立体化学特征。2.3.3 FxS系统：放线菌中的多功能成熟酶 FxS系统是存在于放线菌中的三肽BGCs。这些系统的特征在于含有C端FxSxx motif的前体肽（FxsA）、rSAM/SPASM成熟酶（FxsB）以及辅助蛋白如四肽重复蛋白和mod_HExH结构域蛋白。 对来自小单孢菌属（Micromonospora sp. ）的成熟酶MscB-375的初步研究表明，该酶在这一motif内催化形成Phe–C4与Ser–Cβ的交联，凸显了这一家族催化的典型反应。对FxS系统的后续研究扩展了其已知的底物范围和反应多样性。 酶SjB-399表现出显著的催化混杂性，不仅在体内形成典型的环烷烃产物，在体外还能产生非典型的氧化修饰，生成甲酰甘氨酸（FGly） 和氨基丙二酸（Ama）。这些发现表明，某些FxS型成熟酶可能根据反应条件通过机制上不同的途径运作。对SjB-375的进一步研究显示，其有潜力作为醛标签的替代策略用于生成甲酰甘氨酸。这种独特的催化氧化侧链修饰的能力使某些FxS成熟酶区别于主要形成C–C交联的Xye和Grr系统。 YxdB、HaaB、WnsB及相关成熟酶的发现将FxsB样酶的反应性扩展至在Ω1位置包含所有芳香族氨基酸（Phe、Tyr、His）的底物。额外的底物诱变实验表明，某些成熟酶在X3位置表现出宽松的特异性，允许替代残基的掺入，这可能影响交联的区域选择性。 FxS及相关成熟酶是自由基介导的RiPP成熟中功能多样且进化上独特的分支，扩展了三肽的已知化学空间。理解三肽生物合成的酶学机制为工程化具有生物活性的环肽提供了框架，特别是在开发具有药物相关性的结构刚性和蛋白酶抗性骨架方面。2.3.4 Amc系统：放线菌中的多重环化酶 放线菌多重环烷烃（Amc）成熟酶是参与三肽生物合成的rSAM/SPASM酶的一个独特类别。主要存在于放线菌中，这些酶在单个前体肽内催化多个C(sp²)–Cβ(sp³)键形成，生成复杂的环烷烃结构。序列相似性网络（SSN）分析显示，Amc型成熟酶在放线菌基因组中富集，特别是在链霉菌属（Streptomyces） 和小单孢菌属（Micromonospora） 中，支持其作为独特成熟酶亚家族的分类。 生物信息学分析揭示了超过500个独特的Amc相关前体，许多含有串联或重复的Ω1–X2–X3 motifs。这些motif通常以Trp或Phe作为芳香交联残基，以聚集模式排列，使Amc前体区别于Xye、Grr或Fxs系统。鉴定出五个主要的前体家族，其中一些编码高达7–8个潜在交联位点，表明单个基因产物中编码了异常高的大环化潜力。 来自Actinospira robinae的Fwv系统作为功能验证的模型。当FwvB成熟酶与其前体肽FwvA在大肠杆菌中共表达时，LC-MS/MS和NMR确认了多个环烷烃的酶促形成。在特定的WDN和WSK motifs中鉴定出Trp–C7与Asn–Cβ或Lys–Cβ之间的交联，NMR分析确认了与OscB产生的环烷烃类似的平面手性大环。 重要的是，工程化变体揭示，FwvB以部分过程性和motif选择性的方式修饰这些位点，通常从C端motifs开始，然后向上游进行。底物诱变显示，FwvB在Ω1位置对Trp相对特异，在X3位置容忍有限的变化，尽管某些改变可能破坏活性。与某些三肽酶不同，FwvB不需要Aux I结合半胱氨酸，表明它可能仅通过一个辅助[4Fe–4S]簇运作。保守活性位点残基Glu280的突变降低了催化活性并改变了形成的环数，突显了其在调节反应性中的作用。 尽管尚未分离出Amc BGCs的天然终产物，但FwvB的功能能力证明了这些酶在肽骨架中安装多个立体化学定义的交联的潜力。因此，Amc成熟酶扩展了三肽生物合成的多样性和生物合成逻辑，代表了进一步探索这些途径的有前景的方向。2.3.5 YxRxHxRHxR-tail系统：双结构域融合酶的协同催化 YxRxHxRHxR-tail系统存在于包括蓝藻和肠杆菌在内的多种细菌中。该家族的前体肽在核心肽的C端含有典型的YxRxHxRHxR序列。已报道两种类型的系统。 第一类包含前体肽（A）、rSAM/SPASM酶（B）、αKG和Fe依赖的氧合酶（C），在某些情况下还包含αKG-HexH氧合酶。这类系统的例子是来自N. lactamica的yhh BGC。当rSAM/SPASM酶YhhB与其前体肽YhhA在大肠杆菌中共表达，随后进行MS/MS和NMR分析，鉴定出三种新型C–C交联的形成：Tyr1–C3与Arg3–Cβ、His5–C2与Arg7–Cβ和His8–C2与Arg10–Cβ。当前体肽（YhhA）、rSAM/SPASM酶（YhhB）和相关的氧合酶YhhC三者共表达时，在X2残基（Asp2、Asn6和Asn9）上引入了β-羟基化，证据包括+16 Da质量位移、NMR中修饰的自旋系统以及通过Marfey分析确认的L-赤式构型。 第二类YxRxHxRHxR-tail系统的例子来自Chlorogloeopsis sp. PCC 7702。该系统包含前体肽（ChlA）、融合的rSAM/SPASM-αKG-HexH氧合酶（ChlBH）、精氨酸酶、N-乙酰转移酶和一个未知功能蛋白。ChlBH是一个双功能酶，包含一个rSAM/SPASM结构域（B） 和一个αKG依赖的羟化酶结构域（H）。 为理解融合蛋白的功能，首先研究了rSAM/SPASM结构域。Suarez等人表征了在Tyr1–C3与Arg3–Cβ处发生的环烷烃形成。这些研究还表明，ChlB具有混杂性，可以在X2和X3位置接受其他氨基酸。随后，Morishita等人研究了全长蛋白ChlBH的活性。这些研究表明，ChlB催化Tyr–C3与Arg–Cβ、His5–C2与Arg7–Cβ以及His8与Arg–Cβ的三肽交联。最初被认为是蛋白酶的C端HexH结构域被发现催化Asp2、His5和His6的β-羟基化。这些研究表明，修饰始于rSAM/SPASM结构域，并在两个结构域之间穿梭以完成完全修饰。HexH结构域蛋白的X射线晶体结构显示，其核心折叠最接近锌蛋白酶，但其余结构代表了αKG和Fe依赖的氧合酶的新折叠。这些在三肽和其他RiPP途径中广泛编码的氧合酶已被命名为αKG-HexH家族氧合酶。 最近，rSAM/SPASM结构域ChlB与前体肽（ChlA）变体的复合物晶体结构揭示了底物识别和催化的见解。前体肽通过其导区与连接两个催化结构域的螺旋接头对接，使核心区能够在rSAM或氧合酶活性位点之间摆动。生化和结构数据显示，ChlBH很可能以确定的顺序安装修饰：首先在YDR和HNR motifs上形成环烷烃，然后在Asp2和His6上进行β-羟基化，接着在HHR motif上进行环化，最后在His5上进行β-羟基化。这一有序进程通过使用截短的ChlB变体（ChlBΔ375）的体内和体外测定、LC-MS/MS以及底物肽的突变分析得到确认。 ChlBΔ375与底物类似物的复合物晶体结构显示了Arg Cβ在活性位点中被精确排列，以便5′-dAdo•进行氢原子夺取，并优化了芳香残基以进行C–C键形成的取向。这些数据还揭示了一个盐桥存在于Arg残基和ChlB的Asp201之间，这可能解释了在所有三个ΩXR motifs中Arg在X3位置的保守需求。 机制上，rSAM结构域通过还原裂解SAM生成5′-dAdo•来启动催化，该自由基从X3 Arg残基的β-碳夺取一个氢原子。产生的碳中心自由基随后与邻近Tyr或His环的邻位发生区域选择性加成，形成一个C1-自由基中间体，该中间体通过电子转移被再芳构化。 有趣的是，ChlB缺乏SPASM结构域典型的Aux1 [4Fe–4S]簇。相反，它仅包含[4Fe–4S] RS和AuxII簇。尽管缺乏AuxI，但反应性自由基中间体与RS簇之间的12.5 Å距离足以允许直接电子转移以淬灭自由基，绕过了对辅助继电中心的需求。AuxI簇的缺失似乎是三肽合成酶的一个普遍趋势。2.3.6 Htk系统：可编程的底物选择性 Htk系统发现于*Pandoraea sp. XY-2*，代表了最近表征的三肽合成酶亚家族，催化HTK motifs内的自由基介导C–C键形成。该BGC编码前体肽（HtkA）和rSAM/SPASM成熟酶（HtkB），共同实现His1–C2与Lys3–Cβ之间的大环交联的形成。这一转化与其他FxS样三肽成熟酶如HaaB和YhhB催化的反应类似，但其底物偏好和活性位点结构有所不同。 通过在大肠杆菌中异源表达HtkA/B对，随后进行肽纯化、胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，对HtkB进行了功能表征。定位于HTK motif的-2 Da质量位移表明成功发生了大环化。NMR结构解析确认了His1–C2与Lys3–Cβ之间的交联，并揭示了所得环烷烃中的平面手性。基于NOESY相关性和Marfey分析（确认所有残基保持L-构型），该构型被指定为²P。这一构型和取代模式类似于其他三肽酶形成的HAA和HNR环烷烃。 为探究HtkB的底物范围，将His1替换为Phe和Trp。与HtkB共表达产生可检测的环化产物，其中FTK变体形成显著量的产物，NMR确认其采用对环烷烃拓扑结构。这些结果表明，环烷烃拓扑结构可能取决于芳香残基的特性和侧翼残基的性质，含Phe的底物倾向于对位而非间位连接。此外，双变体H1F/K3R保留最低活性，表明尽管效率降低，但具有更广泛的底物接受潜力。 本研究的一个关键见解是鉴定了一个保守的活性位点残基，即HtkB中的Asp214，该残基控制着X3位置的底物特异性。与HaaB（一种His1–C2至Ala3–Cβ环烷烃合成酶）的同源建模和结构比较揭示了HtkB Asp214与HaaB His204之间的位置等价性。定点突变确认了它们的作用：HtkB中的D214H取代增强了对X3 = Ala底物的活性，而HaaB中的反向突变H204D则赋予了对含Arg和Lys的motif的活性。这些发现表明，单个残基的变化可以逆转底物偏好，实现对三肽合成酶底物范围的理性重编程。这凸显了三肽成熟酶作为调整rSAM酶反应性和扩展环状RiPP多样性的有用系统的潜力。2.4 Wpr系统：C(sp²)–Cγ(sp³)键的罕见案例 Wpr系统由Khan等人最新报道，扩展了rSAM肽大环化的范围，其独特的交联拓扑结构使其区别于典型的三肽家族。虽然WprB在短的三残基WPR motifs上催化环烷烃形成，在结构上类似于三肽系统，但其基础化学和生物合成逻辑是独特的。 WprB是一种来自Xenorhabdus sp. psI的SPASM结构域rSAM酶，在其前体肽WprA的三个保守WPR motifs中，催化色氨酸C5位与精氨酸Cγ位之间罕见的C–C键形成。这一反应从根本上区别于三肽成熟酶（如XncB、OscB、FxsB），后者介导芳香残基与脂肪族氨基酸（如Asn、Ser或Lys）的β-碳之间的C(sp²)–Cβ(sp³)键形成。相比之下，WprB靶向Arg的侧链亚甲基碳，形成此前在rSAM环烷烃合成酶中未观察到的C(sp²)–Cγ(sp³)键。 WprC是一种RiPP识别元件（RRE） 样分子伴侣，对产酶修饰至关重要，可能通过促进导肽结合和底物定位来发挥作用。wpr簇在大肠杆菌中的体内重构导致产生了三个修饰肽片段，每个片段在WPR motifs处带有-2 Da质量位移。详细的NMR表征确认了Trp–C5与Arg–Cγ之间区域选择性C–C键的形成。 虽然motif长度和重复架构类似于三肽底物，但WprB表现出独特的序列偏好和较低的底物混杂性。三肽成熟酶通常在X2和X3位置接受广泛的替换，但WprB对其天然WPR motif表现出严格的专一性，无法加工在X3位置缺乏Arg的变体。总之，wpr系统定义了一个独立的rSAM环烷烃合成酶类别，尽管利用三残基motif，但催化独特的键型并具有更严格的序列约束。这项工作凸显了rSAM酶化学日益增长的多样性，并强调了motif拓扑结构在控制酶反应性中的重要性。2.5 Darobactins 和 Dynobactins：靶向革兰氏阴性菌的新型抗生素 Darobactins和Dynobactins代表了两个不同的环烷烃rSAM-RiPP亚类，因其对革兰氏阴性病原体的活性而备受关注。它们独特的作用机制靶向β-桶组装机器（BAM）复合体，这是革兰氏阴性菌外膜蛋白生物发生的关键组分。具体而言，它们作为竞争性抑制剂结合BamA的侧向门，阻止新生蛋白的插入。其功能所需的结构刚性源于由rSAM/SPASM酶催化的自由基介导修饰，导致形成独特的C–O–C、C–C和C–N交联。 2.5.1 Darobactin：氧利用型rSAM酶的突破 Darobactin是通过对67株Photorhabdus和Xenorhabdus分离株进行生物活性引导筛选发现的，旨在鉴定对大肠杆菌有活性的化合物。虽然大多数分离株未能抑制生长，但来自Photorhabdus khanii HGB1456的浓缩提取物产生了一个小的抑制区。在这一活性引导下，研究者分离出一种新型化合物，其m/z为966.41047，后经HR-MS和NMR鉴定为七肽，氨基酸序列为W¹–N²–W³–S⁴–K⁵–S⁶–F⁷。NMR研究揭示了一个包含两个前所未有的大环交联的七肽结构。基因组挖掘确认了其来源于一个沉默操纵子的核糖体合成起源，该操纵子编码一个rSAM酶（DarE），操纵子的缺失终止了化合物产生，验证了其生物合成作用。 Darobactin的特征在于一个由C–O–C醚键（连接Trp1的吲哚环与Trp3）和一个C–C交联（连接Trp3–C7与Lys5–Cβ）稳定的七肽支架。与典型的RiPP修饰不同，醚键并非来源于预先存在的官能团，而是利用分子氧进行翻译后安装。这一修饰由DarE催化，这是一种前所未有的氧利用型rSAM酶，扩展了该类酶的已知反应性。 Darobactin生物合成中醚键形成的机制通过两项互补研究得以阐明。Guo等人通过体外重构证明，rSAM酶DarE单独负责在成熟的双环骨架中安装C–O–C和C–C两种交联。初步机制见解表明，DarE介导的醚形成通过从Trp3夺取氢原子进行，随后发生羟基化并与Trp1的吲哚环偶联。值得注意的是，同位素标记研究表明，醚键中的氧原子可能来源于水。包含醚键作为定义性转化的这类环烷烃rSAM-RiPP被命名为daropeptides。 然而，Nguyen等人提供了更确定且生理相关的证据，证明醚氧来源于分子氧。在这一更新模型中，DarE利用O₂作为共底物，SAM裂解生成的5′-dAdo•自由基引发从肽底物夺取氢原子。产生的肽自由基经历氧插入，最终导致醚键形成。这些发现明确地将分子氧（而非水）确立为darobactin醚键中氧原子的真实来源。 在一种可能的机制（机制A）中，5′-dAdo•从Trp3夺取β-氢，形成一个Cβ自由基，该自由基直接与O₂反应生成过氧自由基。随后的电子和质子转移（可能涉及辅助簇）将该中间体转化为氢过氧化物。醚交联随后可通过W1吲哚环对氢过氧化物的亲核进攻（路径a）或通过O–O键均裂生成烷氧自由基进而攻击Trp1吲哚环（路径b）形成，完成醚的形成。 或者，在机制B中，氧插入可能通过活性氧物种（ROS）（如在DarE活性位点内从O₂生成的羟基自由基）对Trp1吲哚环的直接氧化进行。这将产生一个7-羟基-Trp1中间体，该中间体可通过与脱饱和的Trp3的自由基偶联或通过与AUX1簇的相互作用（类似于在硫醚形成RiPP酶中观察到的机制）参与醚键形成。这一途径也可以解释副产物的形成，其中Trp3–Cβ自由基在成功进行Trp1氧化之前形成。然而，使用过氧化氢和超氧化物（潜在的ROS来源）进行的DarE测定未能产生醚连接产物。此外，在缺乏SAM和由此产生的5′-脱氧腺苷自由基的情况下，未检测到Trp1氧化。这表明ROS单独不足以驱动这一转化。这些观察结果使得机制B不太可能，尽管不能完全排除。 与这些发现一致，来自工程化底物的数据与底物控制的Cβ自由基寿命一致，该寿命有利于芳香残基的醚形成和脂肪族残基的C–C偶联。此外，DarE可以独立地并在替代位置安装醚和C–C大环，与选择性的底物控制模型一致。同时，Trp与Lys之间的C–C交联遵循典型的自由基重组机制，可能通过从Lys5–Cβ夺取氢原子开始，生成碳中心自由基，该自由基与Trp3的吲哚自由基重组。或者，DarE可能催化Lys5的α,β-脱饱和，形成一个亲电的Michael受体，与W3自由基反应完成C–C连接。反应可能由DarE的辅助Fe-S簇协调，确保对自由基化学和区域选择性的严格控制。 Ma等人对darobactin成熟酶（包括DarE同源物PasB）的研究表明，产物结果由底物序列控制，而非仅由酶特异性决定。在这项工作中，他们从Photorhabdus asymbiotica中发现了一个新的daropeptide亚家族，包括photorhapatin A，它包含一个单一的醚交联，缺乏darobactin典型的C–C交联。通过系统发育分析和诱变研究，该研究表明daropeptide成熟酶表现出固有的多功能性，能够催化醚键形成、C–C交联和丝氨酸氧化。值得注意的是，Ω1–X2–Ω3 motif主要促进醚交联形成，而Ω1–X2–X3 motif则促进C–C交联。这些发现建立了一个底物控制的催化模型，该模型是daropeptides结构多样性的基础。2.5.2 Dynobactin：C–N键的醌甲基化物机制 Dynobactins是通过结合计算基因组挖掘和针对革兰氏阴性病原体的抗菌筛选的混合策略发现的。使用rSAM酶DarE作为种子，研究者鉴定出一个系统发育上独特的RiPP修饰酶分支，命名为DynA，编码于Photorhabdus australis中。对含有dynA样BGC的菌株进行发酵和生物活性筛选，导致分离出dynobactin A，这是一种十肽，具有两个独特的大环，对大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌具有强效活性。该肽的氨基酸序列为W¹–N²–S³–N⁴–V⁵–H⁶–S⁷–Y⁸–R⁹–F¹⁰。通过冷冻电镜（microED） 进行的结构解析揭示了两个交联：一个三肽样C–C键连接Trp1–C6与Asn4–Cβ，以及一个前所未有的C–N键连接His6–Nε2与Tyr8–Cβ。 虽然结构上不同于darobactins，但dynobactins共享一个共同的生物合成框架，但引入了一个前所未有的His–Tyr C–N交联以及一个C–C键。由rSAM酶DynA催化的C–N键形成，代表了与先前已知的rSAM-RiPP环烷烃反应的不同之处。这一转化通过Tyr–Cβ自由基形成启动，由5′-dAdo•促进的氢原子夺取所促成。与典型的自由基重组途径不同，Tyr自由基经历氧化形成对-醌甲基化物中间体，然后与His–Nτ通过亲核加成反应，完成交联。 支持醌甲基化物机制的多个实验观察包括： 氘标记：Tyr8的Hβ标记转移到5′-dAdoH，直接表明该位点的氢原子夺取。 α,β-脱饱和排除：在D₂O中未掺入溶剂氘，且产物中保留了α-氘，排除了α,β-脱饱和途径。 亲核捕获实验：当His6替换为Ala时，DynA允许中性小亲核试剂如咪唑、半胱胺和半胱氨酸攻击Tyr8–Cβ，产生共价加合物，这些加合物在MS/MS下不稳定，行为符合捕获短寿命醌甲基化物的特征。 结构要求：在位置8需要Tyr酚羟基，以及检测到在最终C–C键形成之前的His–Tyr交联中间体，进一步强化了这一逐步途径。 最近的DynA生化研究表明，该酶通过一个逐步机制催化dynobactin A中的C–N交联。研究发现，His6与Tyr8之间的N–C键首先形成，随后是Trp1与Asn4之间的C–C交联。 除了它们生物合成上的新颖性，这些途径还提出了关于氧在rSAM酶功能中的作用的更广泛问题。传统上，由于[4Fe–4S]簇对氧敏感，rSAM酶被认为是严格厌氧的，然而DarE催化的氧依赖醚化挑战了这一范式。这些酶在氧化环境中运作的能力表明，某些rSAM酶可能已经进化出利用氧衍生中间体的能力，这一概念值得在其他RiPP生物合成途径中进行进一步研究。此外，这些肽的结构模块性凸显了rSAM酶的生物工程潜力。在受限的肽框架内安装高度选择性的C–C、C–O–C和C–N键的能力，为设计具有改进药理学性质的稳定、蛋白酶抗性环肽提供了途径。2.6 Nosiheptide：rSAM酶的甲基转移-环化耦合 Nosiheptide是一种结构复杂的噻唑肽类抗革兰氏阳性菌抗生素，由土壤放线菌Streptomyces actuosus产生，对包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 和万古霉素耐药肠球菌在内的革兰氏阳性病原体具有强效活性。它经历广泛的翻译后修饰，最终形成一个高度修饰的大环支架。nosiheptide的一个定义性特征是独特的侧环大环，由3,4-二甲基吲哚酸（DMIA） 部分锚定。该部分通过酯键和硫酯键共价连接至核心肽中的Glu6和Cys8，形成一个独特的大环结构。 与依赖于分子内亲核取代或基于自由基的C–C交联的常规大环化反应不同，nosiheptide的侧环系统经历一个自由基介导的甲基化和交联过程，由C类rSAM酶NosN协调。 NosN的催化机制不同于典型的rSAM酶，后者主要催化SAM的还原裂解以生成用于氢原子夺取的5′-dAdo•。在NosN的情况下，两分子SAM同时结合在活性位点中。一分子SAM经历典型的还原裂解形成5′-dAdo•，该自由基特异性地从第二分子SAM的甲基夺取一个氢原子，生成亚甲基自由基。这一反应性中间体随后加成到前体肽上通过硫酯键连接至Cys8的MIA（3-甲基-2-吲哚酸） 部分的C4位置。所得自由基中间体在C4位去质子化，生成一个自由基阴离子，该阴离子经历C–S键异裂，消除5′-硫代腺苷，形成一个反应性的环外亚甲基物种。该亲电中间体随后被Glu6的侧链羧酸捕获，形成完成nosiheptide侧环系统的酯键。反应序列因此包括： SAM裂解 → 5′-dAdo• 从甲基-SAM夺取氢 → 亚甲基自由基 自由基加成至MIA C4 消除5′-硫代腺苷 Glu6进攻 → 环闭合 这一机制提议得到了全面的生化和结构研究支持。使用合成肽模拟物（如MIA-SNAC和三肽共轭物MIA-S-3mer）对NosN进行体外重构证明，只有在存在SAM和还原剂（如连二亚硫酸盐或Ti(III)柠檬酸盐）的情况下才能转化为二甲基化产物。这些反应产生了两个关键的副产物：5′-dAdoH和5′-甲硫腺苷（MTA），而非典型的S-腺苷高半胱氨酸（SAH），凸显了与典型SN2甲基化不同的异常SAM断裂机制。时间分辨LC-MS分析和捕获实验进一步捕获了SAM-吲哚加合物，与在形成环外亚甲基基团之前存在的基于自由基的中间体一致。重要的是，无法形成侧环或带有刚性连接体的底物类似物导致停滞中间体的积累，强化了C1转移和大环化的顺序性质。 使用nosN敲除突变体的互补研究揭示了一个缺乏C4甲基和酯键的nosiheptide类似物的积累，确认了NosN对于完整侧环组装的不可或缺性。此外，对途径内底物时序的分析表明，它可能发生在NosD/E催化的脱水反应之前，强调了它在塑造大环拓扑结构中的早期作用。 NosN的作用发生在精确定时的序列中，很可能在由NosO催化的吡啶环形成之前，以及在由NosD/E催化的特定氨基酸脱水之前。使用肽模拟物的研究捕获了基于反应的SAM加合物，为含有离域自由基物种的中间体提供了证据，支持所提出的基于自由基的机制。此外，NosJ、NosI和NosK负责将MIA部分激活并转移至核心肽，其中NosK作为酰基转移酶，在NosN介入之前将MIA附加到Cys8上。 nosiheptide生物合成途径展示了rSAM酶催化复杂大环化反应的分化策略。NosN催化的反应引入了一个氧连接的甲基化耦合酯化步骤，这使其区别于其他rSAM介导的RiPP修饰，如C–C或C–S键形成。这种独特的修饰模式不仅扩展了rSAM化学的酶学库，而且凸显了工程化具有改变药理学性质的噻唑肽衍生物的新潜力。2.7 Aminopyruvatives 和 Pbs系统：B12依赖性rSAM酶的C–C键形成2.7.1 Aminopyruvatives：多酶协同的复杂修饰 2024年，Nguyen等人从Burkholderia thailandensis中发现了一类新的大环RiPP，命名为aminopyruvatives。该生物合成途径涉及四种金属酶的顺序作用： B12依赖性rSAM酶ApyD：在酪氨酸上安装一个β-甲基，形成(2S,3R)-β-甲基酪氨酸。 细胞色素P450酶ApyO：催化联芳基C–C交联，生成具有轴手性的大环。 多核非血红素铁依赖氧化酶（MNIO）ApyHI：将C端天冬氨酸转化为氨基丙酮酸，这是一种发生在非半胱氨酸残基上的罕见修饰。 甲基转移酶ApyS：通过形成(S)-3-氨基-2-氧代丁酸完成途径。 ApyO的催化产物通过光谱和微晶电子衍射（MicroED） 研究确认了其大环联芳基连接的轴R手性，凸显了ApyO进行区域选择性和立体选择性自由基酚偶联的能力。虽然这一架构类似于芳基霉素，但它与来自Peribacillus simplex的pbs系统的大环产物在结构上具有相似性。 在pbs途径中，联芳基大环化并非由P450介导，而是由B12依赖性rSAM酶PbsB催化，该酶通过5′-脱氧腺苷自由基引发的途径运作，在PbsC/D介导的羟基化和PbsE介导的脱胍基化之后，产生两个邻位羟基化的Phe/Tyr残基之间的邻位-邻位′ C–C键。虽然ApyO和PbsB都实现了类似的芳香族C–C键，但它们的催化策略根本不同：ApyO通过血红素介导的氧活化和酚氧自由基偶联进行，而PbsB通过rSAM介导的氢原子夺取和自旋离域自由基攻击启动。这一比较强调了RiPP生物合成中的一个更广泛主题：自然界采用正交的酶学策略来趋同于相似的结构结果。P450和B12-rSAM酶都可以锻造联芳基大环，但它们通过不同的催化逻辑、辅因子和底物范围来实现。2.7.2 Pbs系统：羟基化驱动的联芳基偶联 对Peribacillus simplex中pbs BGC的表征阐明了一种新颖的大环化策略。该基因簇编码三个顺序作用的金属酶：多核非血红素铁依赖氧化酶（MNIO，PbsC）、精氨酸酶（PbsE） 和B12依赖性rSAM酶（PbsB）。它们共同协调通过来自苯丙氨酸的两个邻位羟基化芳香残基的ε2位之间的前所未有的C–C键形成，逐步构建一个刚性的大环骨架。 基因组挖掘在前体肽基因（pbsA1–A4）中鉴定出一个保守的FHAFRF motif，这些基因与pbsCDE和rSAM基因pbsB共同编码。该途径在大肠杆菌中的异源重构使得关键中间体的纯化和结构表征成为可能，包括双羟基化产物（PbsA3-CD）、脱胍基化中间体（PbsA3-CDE） 和完全环化的大环（PbsA3-BCDE）。 生物合成顺序始于PbsC在其RiPP识别元件（RRE） 包含的伴侣蛋白PbsD的协同作用下，催化Phe8和Phe10的区域选择性邻位羟基化，生成邻位酪氨酸残基。这一修饰是后续加工的先决条件。PbsE随后选择性地将Arg9脱胍基化为鸟氨酸，但仅在双羟基化中间体上进行。最后的大环化步骤由PbsB介导，通过自由基机制安装一个联芳基C–C键。 机制研究表明，PbsB的[4Fe–4S]簇通过还原裂解SAM生成5′-dAdo•启动催化。该自由基从一个邻位酪氨酸的酚羟基夺取一个氢原子（很可能在Cε1位点），形成一个稳定的酪氨酰型自由基中间体。NMR和HR-MS/MS分析确认了这一位点的区域选择性激活。所得酪氨酰自由基在Cε2位置显示显著的自旋密度，促进对邻近芳香环的Cε2碳的分子内攻击。这种自由基-自由基偶联产生一个σ-芳香自由基中间体，随后通过电子和质子转移被再芳构化。最后的氧化步骤可能由一个辅助[4Fe–4S]簇介导，类似于其他SPASM结构域rSAM酶（如StrB）中的情况。 尽管B12辅因子的确切作用尚未明确，鉴于缺乏典型的B12依赖性化学（如甲基化或烷基阳离子转移），它可能作为氧化还原介体或发挥组织活性位点的结构作用。重要的是，交联前对邻位羟基化的要求强调了双重机制功能：激活芳香环以进行自由基形成和指导后续偶联的区域选择性。值得注意的是，PbsC和PbsB都表现出中等的底物可塑性：PbsC介导的邻位羟基化是必需的，并使得后续的PbsE活性成为可能，而Tyr即使没有额外的邻位羟基化也可被PbsB交联，且Cε2–Cε2区域化学得以维持。 总之，这一途径代表了B12-rSAM酶一个此前未被认识的催化范式，将其反应性扩展至包括芳香族C–C键形成。所得联芳基连接的大环的结构新颖性以及组装它们的酶学精度，凸显了在基于RiPP的支架生物工程中利用此类系统的潜力，以增强稳定性和治疗相关性。第三章：含硫醚的RiPPs3.1 Sactipeptides：Cα–S硫醚交联的多样性 Sactipeptides是一类RiPP，以其Cα–S硫醚交联为特征，这些交联提供了结构稳定性和生物活性。与羊毛硫肽（lanthipeptides） 不同，这些交联是通过rSAM酶的自由基介导机制安装的，该机制从氨基酸的Cα位置夺取一个氢原子，允许来自半胱氨酸残基的硫形成共价键。这种结构刚性增强了肽的稳定性和抗菌特性。已鉴定出几种结构多样的sactipeptides，每种都表现出独特的硫醚模式和生物功能。 根据其硫醚大环的拓扑结构，sactipeptides被分类为四种类型： 类型1：嵌套拓扑结构：多个硫醚桥形成重叠的大环，创建高度受限的支架。 类型2：非嵌套双环拓扑结构：包含两个或多个非重叠环，通常具有交替的供体和受体残基。 类型3：部分嵌套双环拓扑结构：环共享结构元件，形成紧凑、蛋白酶抗性的折叠。 类型4：最小硫代吗啉环：包含一个单一的六元硫代吗啉环，通常具有独特的修饰，如N-甲基鸟氨酸。3.1.1 类型1：嵌套拓扑结构——AlbA的逐步催化 在四种结构类别中，类型1 sactipeptides是研究最深入的，特别是在硫醚键形成的酶学机制方面。一个充分表征的代表是subtilisin A，一种来自Bacillus subtilis的原型sactipeptide，作为理解rSAM介导环化的模型。Subtilisin A是一个35残基环肽，具有三个Cα–S硫醚交联。这些键发生在半胱氨酸残基的硫醇侧链与苯丙氨酸和苏氨酸的α-碳之间，形成一个对其抗菌特性至关重要的约束性大环支架。 这些连接由AlbA安装，这是一种含有三个[4Fe–4S]簇的rSAM/SPASM蛋白。AlbA的厌氧重构产生约7.6 mol Fe和7.7 mol S/mol蛋白，与三个[4Fe–4S]中心一致。UV-可见光谱显示在325和410 nm处的吸收特征，这是[4Fe–4S]蛋白的特征，在化学还原后减弱。EPR光谱进一步支持了这一指定：还原的AlbA表现出两个不同的g值（2.03和1.92），这是[4Fe–4S]簇的特征，而缺乏典型CxxCxxC motif的突变体保留了一个信号，表明存在一个辅助簇。比较结构建模和序列比对在AlbA的C端结构域中鉴定出七个保守的半胱氨酸，与两个辅助簇的配位一致。 催化发生在[4Fe–4S]RS位点。SAM的还原裂解生成5′-脱氧腺苷自由基，该自由基从受体氨基酸的Cα位置夺取一个氢原子，形成一个碳中心自由基。该自由基并非直接与供体硫醇重组，而是通过电子转移至SPASM结构域中的一个辅助[4Fe–4S]簇被氧化，生成一个酮亚胺中间体。然后通过半胱氨酸硫醇盐对该中间体的亲核进攻形成硫醚键，完成Cα–S连接。这种自由基引发、极性终止的途径与含有SPASM辅助簇的rSAM酶提出的机制一致，其中SPASM结构域充当氧化还原继电器和结构支架，而非催化中心。 值得注意的是，AlbA催化三个硫醚键（Cys4→Phe31、Cys7→Thr28、Cys13→Phe22）的安装，并以顺序方式进行，尽管确切的位点顺序尚未完全确定。这种连续行为似乎是结构上强制的：硫醚形成是导肽依赖的，而含有辅助[4Fe–4S]簇的C端SPASM结构域执行催化。导肽的要求以及前体与辅助簇的相互作用表明在修饰过程中底物定位的重要性。这种组织与核心肽的向量性、连续接合一致，指导顺序修饰。这一模型得到了氘标记实验的有力支持，该实验证明AlbA在形成Cys4–Phe31键的环化步骤中从Phe31夺取Cα氢。当使用含有氘代Phe31的肽作为底物时，LC-MS分析检测到氘掺入5′-dAdoH产物中，标记效率从连二亚硫酸盐还原下的~20% 增加到生理还原系统下的~50%。相比之下，当在供体半胱氨酸上引入氘时未观察到标记，排除了残基间的氢转移。这些结果支持AlbA直接靶向Phe31的Cα–H，并且Cα–H夺取是该成键步骤的限速步骤。 类型1 sactipeptides的其他例子凸显了这种嵌套拓扑结构实现的结构和功能多样性。SkfA，一种来自Bacillus subtilis的26残基肽， exemplifies 一个包含单个Cα–S硫醚键和一个分子内二硫键的最小支架。这些特征赋予了一个紧凑的、构象受限的结构，对其在孢子形成相关的同类相食中的作用至关重要，其中SkfA选择性裂解同胞细胞以释放营养。Cα–S连接由rSAM酶SkfB通过Cα–H夺取安装，氘代标记底物研究证实了氢转移至5′-dAdoH。相比之下，由Bacillus thuringiensis SF361产生的Thurincin H采用一个由四个Cα–S硫醚桥稳定的刚性螺旋发夹结构。它不是破坏膜，而是在革兰氏阳性菌如Listeria monocytogenes中诱导显著的形态变化，并因其选择性抗菌活性和优异的理化稳定性而被评估为潜在的食品防腐剂。另一个嵌套sactipeptide系统是来自B. thuringiensis DPC6431的thuricin CD，它包含两个协同作用的肽，Trn-α和Trn-β。每个肽约30个残基长，并含有三个内部硫醚交联，产生重叠的大环约束。虽然单独只有弱活性，但这些肽协同作用，以显著的特异性有效抑制Clostridium difficile， sparing 大多数共生肠道微生物群。高度选择性的生物活性归因于其独特的嵌套拓扑结构，这可能介导与靶细胞上特定受体的相互作用。3.1.2 类型2：非嵌套双环拓扑结构——GggB的顺序与非顺序催化 Streptosactin，首个从Streptococcus thermophilus鉴定的sactipeptide， exemplifies 一种新颖的类型2拓扑结构，由两个非重叠的Cα–S硫醚大环以非嵌套、顺序方式排列。与具有嵌套或交错交联的类型1 sactipeptides不同，streptosactin中的供体（Cys）和受体残基沿线性前体交替，生成两个离散的四残基sactiine环。这种独特的结构扩展了sactipeptides的拓扑多样性，并由在S. thermophilus和人类微生物组中的其他链球菌中普遍存在的ggg BGC编码。 Streptosactin的生物合成由GggB催化，这是一种SPASM结构域rSAM酶。异源表达和厌氧重构的GggB显示出rSAM酶的特征光谱特性：UV-vis在325和410 nm处有吸收，与至少一个[4Fe–4S]²⁺簇一致；还原蛋白的EPR显示多个[4Fe–4S]⁺簇的信号，以及少量的[3Fe–4S]⁺组分。定量分析显示每个单体约9个Fe和8个S原子，支持存在一个典型的rSAM簇和SPASM结构域中的两个辅助簇。 HR-MS/MS将Ser28和Gly34定位为受体残基，上游保守的Cys25和Cys31为供体。结合1D和2D NMR光谱对位点特异性¹³C标记肽变体的分析，确认了在两个修饰位点形成了Cα–S硫醚连接。使用氘代底物的机制实验表明，GggB夺取Cα氢以启动自由基介导的环化，将氘转移至5′-dAdoH。骨架酰胺的N-甲基化抑制了交联， implicating 酰胺N–H在催化循环中的作用。 体外表征后，在S. thermophilus培养上清液中鉴定出成熟的14残基产物streptosactin，通过HR-MS和共洗脱与酶产物匹配。它对携带相同BGC的菌株（包括生产者自身）表现出窄谱、自相残杀活性，表明其在群体感应调控的微生物竞争中发挥作用。 类型2 sactipeptide系统的另一个代表由来自Streptococcus suis YS56的qmp基因簇编码，包含前体肽QmpA、单个SPASM结构域rSAM酶QmpB和转运蛋白/蛋白酶QmpC。在厌氧条件下，用合成QmpA、SAM和连二亚硫酸盐对QmpB进行体外重构，产生一个比底物轻2 Da的主要物种和一个轻4 Da的次要物种，比例约为5:1，与安装一个和两个硫醚连接一致。HR-MS/MS分析将修饰定位至N20–C22和N24–C26，通过α-硫醚（sactiine）桥生成两个9元、非嵌套大环。与β-硫醚标准品的比较确认了α-连接的特征性碎裂行为。 在两个受体位点使用均匀¹³C标记的Asn时，DEPT-HSQC光谱揭示了Cβ/Hβ信号的诊断性低场位移（约42.5/3.7 ppm），为Cα–S键形成提供了直接的NMR证据。任一半胱氨酸（C22S或C26S）的替换都产生单交联肽，表明QmpB可以独立环化两个位点，而无需严格顺序——这与streptosactin形成中类型II sactiine合成酶GggB的顺序行为形成对比。成熟的双交联产物被提议命名为suisactin。虽然其生物活性尚不清楚，但QmpA紧凑的9元双sactiine拓扑结构扩展了硫醚键合RiPP超家族内类型II sactipeptides的机制和结构多样性。3.1.3 类型3：双环嵌套拓扑结构——RumC1的复杂折叠 Ruminococcin C1（RumC1），由Ruminococcus gnavus产生， exemplifies 一种结构密集的类型3 sactipeptide，其特征在于独特的双环嵌套拓扑结构。与早期sactipeptides中见到的简单嵌套或非嵌套大环不同，RumC1采用一个紧凑的双发夹折叠，由四个Cα–S硫醚交联稳定，形成两个互锁的大环结构域。这种复杂的拓扑结构不仅赋予结构刚性，而且对其强效的生物活性有显著贡献。 其基因簇编码多个前体肽（RumC1–C5），全部产生活性产物。成熟的RumC1肽包含四个位点特异性硫醚桥：Cys3–Asn16、Cys5–Ala12、Cys22–Lys42和Cys26–Arg34。这些交联将肽组织成两个大环环——一个通过Cys3和Cys5连接的N端结构域，和一个通过Cys22和Cys26连接的C端结构域——具有导致嵌套构型的重叠区域。多维NMR分析确认了这些硫醚键的存在，揭示了α-碳共振的低场位移以及半胱氨酸β-质子与受体残基酰胺质子之间的特征性NOE接触，与Cα–S键形成一致。 这些交联的酶促安装由rSAM酶RumMc1和RumMc2催化，两者都包含典型的CxxCxxC motif和一个容纳辅助[4Fe–4S]簇的C端SPASM结构域。光谱表征，包括UV-vis和EPR分析，连同铁和硫化物定量，确认了holo-RumMc1携带三个[4Fe–4S]簇，一个作为SAM结合的RS簇，另外两个可能参与底物结合或电子转移。氘标记实验为自由基介导过程提供了直接机制证据。使用Cα位氘代丙氨酸（如Alaδ1-d4）的合成肽底物证明，RumMc2通过Cα–H夺取启动硫醚键形成，生成一个Cα中心自由基，随后被半胱氨酸硫醇淬灭。质谱确认了Cα氘的丢失，并伴随产生5′-dAdoH，进一步支持通过经典自由基途径的SAM裂解。这些发现与在其他sactisynthases如AlbA中观察到的先前观察结果一致，强化了该酶家族间的机制保守性。 在功能上，RumC1对革兰氏阳性病原体（包括多重耐药性产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens））显示出强效和选择性的杀菌活性。值得注意的是，它对人类细胞系或肠道组织没有毒性，凸显了其治疗潜力。其结构特征赋予RumC1高的体内稳定性、治疗性生物活性和选择性细菌靶向，使其成为一种临床上有前景的RiPP。3.1.4 类型4：硫代吗啉（最小sactiine）——enteropeptins的简约设计 Enteropeptins，一个来自Enterococcus cecorum的新近表征的sactipeptide家族，被提议代表类型4 sactipeptides，其特征是在一个基本上无序的肽框架内嵌入一个最小的硫醚大环。与通常包含多个重叠大环的先前描述的sactipeptides不同，enteropeptins采用一个由单个六元Cα–S连接形成硫代吗啉环的结构简化支架。这种独特的结构反映了一个精简的生物合成策略，同时保留了生物学相关活性。 该BGC编码一个前体肽（KgrA）和三个成熟酶：rSAM酶KgrC、Mn依赖性精氨酸酶同源物KgrD和Fe-S依赖性甲基转移酶KgrB。其中，KgrC已被证明可催化定义性硫醚交联，在核心肽中一个保守的精氨酸残基与其相邻的半胱氨酸之间催化Cα–S键的形成。体外重构显示，单独的KgrC将KgrA转化为一个轻2 Da的产物，与硫代吗啉形成一致，HR-MS/MS将该修饰定位于保守的Arg残基及其相邻的Cys。通过HR-MS/MS分析确认了该硫代吗啉大环的形成，该分析将交联精确定位至Arg41的α-碳和Cys42的硫。下游的脱胍基化和N-甲基化步骤通过HR-MS/MS以及详细的NMR分析得到支持， 酶产物中同时存在α-硫醚连接和N-甲基鸟氨酸。与此指定一致，使用S-甲基-d₃-SAM验证了KgrB催化的甲基转移，产生了预期的+3 Da质量位移，并通过MS/MS将氘代甲基定位至鸟氨酸侧链，最终导致成熟的enteropeptin A支架的形成。 时间过程测定监测5′-dAdoH的形成确认了5′-dAdo• 通过Cα–H夺取引发交联反应。在存在SAM和连二亚硫酸盐的情况下，但在缺乏KgrB或还原剂的对照反应中没有，5′-dAdoH的积累确认了5′-dAdo• 通过Cα–H夺取引发交联反应。额外的底物诱变和类似物测试进一步证明，有效环化需要反应性半胱氨酸和带有α-碳的精氨酸，与自由基介导机制一致。所提出的机制镜像了其他sactipeptide合成酶的机制，其中5′-dAdo•从受体残基的α-碳夺取一个氢原子，形成一个碳中心自由基，该自由基被附近的半胱氨酸硫醇捕获以产生硫醚交联。 生物学上，enteropeptin A抑制Enterococcus faecalis（其生产者的近亲）的生长，表明其在微生物群落内种间竞争中的作用。这种窄谱活性受群体感应调控，并依赖于硫代吗啉环的存在，因为缺乏Cα–S键的类似物没有显示出抗菌效果。虽然结构最小，但enteropeptins说明了rSAM酶在简约框架内催化肽环化的功能和机制多样性。3.2 Ranthipeptides：Cβ–S硫醚的新范式3.2.1 NxxC系统：Asn–Cys的β-硫醚化 NxxC系统最初从Streptococcus orisratti和Streptococcus porci中鉴定出来，代表了rSAM催化硫醚键形成的一个独特亚类，其中自由基介导机制在Cys硫醇与上游Asn–Cβ残基之间引入β-硫醚交联。这种独特的修饰类型导致了这些肽被分类为ranthipeptides，它们在机制和结构上区别于安装α-硫醚键（称为sactiine桥）的sactipeptides。 与sactipeptides不同，Nxxc成熟酶（NxxcB） 催化β-硫醚化。虽然β-硫醚连接是羊毛硫肽（lanthipeptides） 的一个特征性特征，但在羊毛硫肽中，它们是通过ATP依赖的脱水步骤异源性地引入的，形成脱氢丙氨酸（Dha） 或脱氢丁氨酸（Dhb），随后由Cys进行Michael加成。因此，羊毛硫肽中的β-硫醚键特异性地发生在Ser/Thr残基上，并且在化学和机制上区别于ranthipeptides中的β-硫醚键。 相反，NxxcB在其天然前体肽NxxcA中催化自由基介导的β-硫醚化，其中Asn作为β-硫醚受体，尽管诸如Ala、Gln和Asp等替代残基也可被接受。来自Streptococcus orisratti和Streptococcus porci的NxxcB的功能表征揭示，它依赖于多个辅助[4Fe–4S]簇进行自由基生成和电子转移。 提出的机制模型表明，NxxcB的功能类似于sactisynthases，通过与Fe-S簇的螯合激活半胱氨酸硫醇，这一过程通过在与NxxcA孵育时UV-vis吸收位移得到支持。催化始于形成5′-dAdo•，该自由基夺取Asn的β-氢，生成一个高能自由基，随后与Fe-S激活的半胱氨酸硫醇重组，形成C–S键，同时还原Fe-S簇。高分辨率MS和NMR分析确认，NxxcB专门催化Cβ–S键的形成，未检测到α-硫醚连接，这在机制上将其与AlbA和其他sactisynthases区分开来。尽管其受体耐受性广泛，但NxxcB不加工Ser或Thr来代替Cys。这一限制仍未得到解释，并且也在其他sactisynthases中观察到。诱变进一步证明其具有中等的底物灵活性，允许在受体位点进行修饰，扩展了其潜在的生物催化应用。3.2.2 SCIFF肽：从谜团到明晰 SCIFF肽（Six Cysteines in Forty-Five Residues），最初由Haft和Basu于2011年提出，由于存在保守的半胱氨酸富集motif以及它们与rSAM酶的基因组关联，最初被归类为sactipeptides。然而，早期分离成熟SCIFF产物的尝试未获成功。体外重构实验仅产生部分修饰的肽，可能是由于存在多个未反应的半胱氨酸，以及测定条件下修饰酶的低效率或特异性。这些技术挑战阻碍了完整的结构解析，并在数年内使其化学性质悬而未决。 随后的机制和结构研究揭示，SCIFF肽在β或γ碳位置形成硫醚连接，而非在典型sactiine交联的α碳位置。这一结构区别促使它们被重新分类为ranthipeptides。一个代表性成员是来自Caldanaerobacter subterraneus的Te1186a肽，由SPASM结构域rSAM酶Te1186修饰。尽管含有六个半胱氨酸，质谱和体外重构证明了在Cys14与Thr19之间选择性形成一个单一的硫醚桥，表明具有严格的位点控制。机制研究支持通过SAM裂解进行自由基引发，以及一个潜在的酮亚胺中间体，突出了由辅助[4Fe–4S]簇促进的极性终止机制。 在此基础工作之上，后来在Clostridium thermocellum中鉴定出一个密切相关的系统，为SCIFF肽与新兴的ranthipeptide家族之间提供了直接的结构和机制联系。在该系统中，前体肽CteA及其同源rSAM酶CteB与Tet1186/Tet1186B具有高序列相似性，并在保守的Cys14–Thr19位置安装一个硫醚交联。成熟的肽被称为thermocellin，现在被归类为ranthipeptide而非sactipeptide，因为其独特的S–Cγ硫醚键连接半胱氨酸硫与苏氨酸的γ-碳，这与sactipeptides典型的S–Cα连接形成对比。 CteB的结构表征揭示了一个典型的(β/α)₆ TIM桶状rSAM折叠和一个含有两个辅助[4Fe–4S]簇的C端SPASM结构域，其中一个簇呈现出一个开放配位位点，在催化过程中促进半胱氨酸结合。CteB与SAM和CteA衍生肽片段的共晶结构提供了对硫醚键形成机制的直接见解：SAM裂解生成5′-dAdo•，该自由基从苏氨酸的γ-碳夺取一个氢原子，形成一个碳中心自由基，然后与预先定位的半胱氨酸硫醇偶联形成S–Cγ连接。这些研究进一步强调，ranthipeptides中的位点特异性修饰并非由半胱氨酸的数量决定，而是由精确的酶-底物相互作用和结构预组织决定。因此，thermocellin代表了ranthipeptide家族中一个机制和结构上独特的成员，初步测定已显示其对革兰氏阳性菌具有抗菌活性。虽然其详细的生物活性概况仍有待完全阐明，但独特的硫醚拓扑结构和构象刚性可能有助于其化学稳健性和作为生物活性支架的潜力，与其他rSAM修饰的RiPP提出的功能作用一致。3.2.3 PapB家族：CXXXD/E motif的电子传递新范式 来自Paenibacillus polymyxa的rSAM酶PapB定义了一个独特的硫醚形成成熟酶类别，该酶在前体肽PapA内的Cys与Asp/Glu残基之间安装Cβ–S键，产生特征性的CXXXD/E motif。属于rSAM酶的SPASM结构域亚家族，PapB拥有三个[4Fe–4S]簇： 典型的RS簇：负责SAM裂解和自由基引发。 辅助簇AC1：结合并激活底物的半胱氨酸硫醇。 远端AC2：新近被确认为电子传递通道。 机制上，还原的RS簇生成一个5′-脱氧腺苷自由基，该自由基从Asp或Glu的β-碳夺取一个氢原子，产生一个底物自由基，该自由基与AC1结合的半胱氨酸硫醇盐偶联，形成Cβ–S连接。这一转化在AC1上留下一个电子，该电子必须返回RS簇以完成催化循环。与先前的分子内模型相反，最近的研究揭示，PapB通过分子间电子转移再生其活性状态，其中电子从AC1通过AC2迁移至一个外部氧化还原伴侣（如另一个PapB分子、一个黄素辅因子或一个无关的rSAM酶），然后返回RS簇。这一过程构成了一种异构机制氧化还原异构化，为rSAM的周转建立了一个新范式，并解释了PapB如何在温和的FMN/NADPH还原条件下有效运作，而无需专用的黄素氧还蛋白/还原酶系统。 除了其机制新颖性，PapB还表现出非凡的底物混杂性： 接受Glu作为替代受体，形成相应的Cys–Cγ连接。 容忍广泛的间距和多样的序列上下文。 可以加工在供体或受体位置之间或之处的α-氨基酸。 当硫醇或羧酸侧链延长时（如高半胱氨酸或高谷氨酸），催化硫醚形成。 当羧酸被四唑生物电子等排体替代时，催化反应。 硒代半胱氨酸也可作为有效的供体。 这些结论得到了系统LC-MS/MS分析的支持，该分析揭示了特征性的-2 Da质量位移、碘乙酰胺烷基化的缺失以及诊断Cys–Asp/Glu或等排硫醚交联的碎裂模式。与此同时，PapB表现出不依赖于导肽的催化：它有效交联含有非同源或截短导肽的底物，甚至完全缺乏导肽序列的底物。值得注意的是，该酶还大环化附加到GLP-1途径治疗药物（如semaglutide、tirzepatide和retatrutide）C端的CSANDA motifs，产生完全转化的、抗烷基化的硫醚大环。这些特征使PapB成为一种用于药物化学中肽大环化的多功能后期酶工具。3.3 不饱和硫醚：SycC（AviCamCys）系统的独特化学 SycC（AviCamCys）系统代表了一类独特的rSAM依赖修饰，其中自由基介导机制和黄素蛋白活性协同作用，在核糖体合成肽的C端区域引入一个不饱和硫醚残基。该系统在来自Streptomyces ureilyticus YC419的syc基因簇中被鉴定出来，涉及SycD（一种LanD黄素蛋白）催化C端半胱氨酸的氧化脱羧，形成一个高反应性的烯硫醇中间体。该烯硫醇随后由rSAM酶SycC通过自由基介导的偶联与上游天冬酰胺残基的β-碳连接，形成S-[2-氨基乙烯基]-3-氨甲酰半胱氨酸（AviCamCys）。这一转化生成一个13元大环，在结构上区别于先前表征的rSAM介导的C–S键形成。 与NxxcB类似，SycC通过利用其SPASM结构域[4Fe–4S]簇促进电子转移和自由基生成来催化这一修饰。在SAM的均裂裂解后，生成的5′-dAdo• 从天冬酰胺残基的β-碳夺取一个氢原子，生成一个反应性自由基中间体。该自由基然后与C端的烯硫醇反应，要么通过直接自由基重组，要么通过氧化去质子化和Michael型加成，导致形成不饱和硫醚AviCamCys。 对纯化的含AviCamCys肽的结构分析已确认了新形成双键的Z-几何构型，进一步凸显了酶的立体化学控制。与加工游离半胱氨酸硫醇以生成硫醚交联的其他rSAM酶不同，SycC仅在SycD（一种LanD样蛋白）介导的氧化脱羧之后才起作用，展示了一种涉及自由基和黄素蛋白化学的顺序生物合成策略。在缺乏SycC的情况下，中间体经历水合耦合的脱硫醇反应，形成副产物醛。这种两步酶促过程扩展了rSAM依赖的RiPP修饰的功能版图，为在肽的C端区域进行肽大环化提供了一种新机制。鉴于LanD-rSAM融合系统在放线菌和厚壁菌门中的广泛分布，很可能仍有类似的途径未被发现，进一步拓宽硫醚修饰RiPP的生物合成和功能多样性。第四章：醚键交联肽——TqqB与rotapeptides TqqB在tqq生物合成途径中催化的醚键形成代表了一种新颖的rSAM依赖的C–O交联反应。虽然RiPPs中五元杂环（如噻唑和噁唑）的形成已有充分文献记载，但六元杂环相对罕见， 包括含吡啶的噻唑肽、PQQ中的氧化喹啉以及pantocin A中的双环结构。 最初在Streptococcus suis中鉴定出的tqq簇并非链球菌所独有。生物信息学分析揭示了至少六个同源簇，每个都编码一个带有保守苏氨酸残基的前体肽（TqqA），提示存在额外的醚键连接RiPP。这个新兴的RiPP家族被命名为rotapeptides（radical oxygen-to-alpha-carbon-linked peptides），其定义是由苏氨酸的羟基与相邻氨基酸（通常是谷氨酰胺）的α-碳之间形成的独特脂肪族醚键。rotapeptides中第一个被表征的亚组是threoglucins，这是在S. suis中发现的一组22个同系物，包括Threoglucin A–R和四种oxo-threoglucins，它们都共享一个中心的1,3-噁嗪烷杂环。 TqqB催化苏氨酸残基的羟基与相邻谷氨酰胺的α-碳之间形成脂肪族醚键，导致形成4-酮基-1,3-四氢-噁嗪杂环。针对这一转化，提出了两种可能的机制：自由基介导的直接醚化和亚胺/噁嗪途径。 在第一种提议的机制中，TqqB还原裂解SAM，生成一个5′-dAdo•，该自由基从Gln–Cα夺取一个氢原子，产生一个碳中心自由基中间体。该自由基然后与苏氨酸的羟基发生直接重组，通过自由基偶联事件形成C–O键。这一机制类似于rSAM催化的C–C键形成，但涉及一个亲核氧物种，凸显了酶控制区域选择性自由基重组的能力。 或者，Gln–Cα自由基在酰胺氮处去质子化为亚胺，Thr–Oγ加成形成1,3-噁嗪中间体，然后通过氧化/重排得到相同的醚产物。产物是连接Thr–Oγ和Gln–Cα的4-酮基-1,3-四氢-噁嗪连接。 两种提出的机制都强调了rSAM酶在RiPP生物合成中的独特反应性。TqqB的催化活性扩展了自然界将杂环基序掺入肽中的策略，标志着酶促大环化途径的重要补充。所得的threoglucins，以其1,3-噁嗪烷杂环为特征，对*S. suis表现出高度特异的生物活性。构效关系研究揭示，杂环和C端Trp-Tyr二元组对其功能都是必需的。在低浓度（0.5–4 μM）下，threoglucins诱导抑菌性休眠，增强细菌在抗生素胁迫下的存活，而更高剂量（30 μM）则是杀菌的，将存活率降至<1%。这种双重作用表明它们作为生态介体发挥作用。它们可能在恶劣条件下促进持久性，或在资源丰富时消除竞争者。值得注意的是，它们的活性是极其窄谱的，对其他链球菌或人类细胞没有影响，凸显了它们作为物种特异性抗菌剂的潜力。此外，TqqB的醚键形成能力的鉴定提示，其他未表征的rSAM酶可能催化类似的氧化重排，进一步拓宽天然产物生物合成中基于自由基的转化的功能版图。第五章：C–N交联肽——bicyclostreptins的酰胺氮活化 Bicyclostreptins代表了rSAM-RiPP的一个亚类，其特征是独特的大环β-醚键和一个前所未有的C–N交联。这些修饰由hgh BGC（在Streptococcus thermophilus和相关物种中鉴定出）编码的两个rSAM酶HghB和HghC催化。与靶向氨基酸侧链的典型RiPP大环化策略不同，bicyclostreptin生物合成涉及骨架酰胺氮的活化，标志着首次已知的自由基化学促进酰胺键交联的实例。 在生物合成顺序中，HghC首先催化丝氨酸羟基与组氨酸Cβ之间的β-醚交联形成，生成一个13元大环。然后该中间体被HghB进一步修饰，安装一个骨架酰胺氮与相邻α-碳之间的C–N键，形成一个咪唑烷-4-酮杂环。这一反应从根本上不同于典型的自由基介导交联，因为它需要活化一个固有稳定的酰胺键，这种转化在RiPP生物合成中此前未曾观察到。 这一转化在RiPP生物合成中是机制上前所未有的，因为它涉及酶促活化一个酰胺N–H键以形成共价交联。研究已证明，bicyclostreptin途径受群体感应（QS）元件的严格调控，表明这些修饰肽可能作为细菌信号分子或生长调节剂发挥作用。成熟的bicyclostreptin肽被发现对S. thermophilus具有选择性的抑菌活性， 表明它们在种内竞争或群体控制中的作用。鉴于bicyclostreptins以纳摩尔浓度产生，其生物学作用可能超出直接的抗菌活性，包括在微生物群落中的调控相互作用。第六章：细胞色素P450酶——氧化环化的多面手 细胞色素P450酶（P450s） 构成一个庞大的血红素-硫醇盐单加氧酶超家族，在多种氧化生化转化中发挥重要作用。这些酶因其特征性光谱位移而得名，当其亚铁状态与一氧化碳络合时，在420至450 nm之间显示一个吸收最大值。P450酶产生自由基的能力源于其保守的血红素-硫醇盐辅基，该辅基循环生成Compound I（Fe(IV)=O，卟啉π-阳离子自由基）。最近，P450s已成为能够介导RiPP生物合成中复杂自由基环化反应的多功能生物催化剂。通过其独特的血红素依赖催化循环，这些酶生成高价氧-铁酰中间体，从肽底物夺取氢原子，产生能够进行受控分子内交联反应的自由基物种。 大多数P450s依赖来自氧化还原伴侣的电子转移来驱动其催化循环。在真核系统中，这一角色由NADPH-细胞色素P450氧化还原酶（CPR） 履行，而细菌和线粒体P450s则采用铁氧还蛋白还原酶（FdR）/铁氧还蛋白（Fdx）系统。催化循环始于底物结合，这触发配位水分子从静息态高铁（Fe³⁺）血红素铁上位移，促进向高自旋态的转变，使酶准备好进行还原。一次单电子转移然后将血红素铁从高铁（Fe³⁺） 还原为亚铁（Fe²⁺），使分子氧结合成为可能。第二次电子转移还原氧结合的亚铁中间体，形成高铁过氧物种，该物种在质子化后，生成高铁氢过氧中间体（通常称为Compound 0）。 Compound 0中O–O键的裂解导致形成高反应性的铁-氧物种，即Compound I。这种强氧化剂从底物夺取一个氢原子，创建一个铁(IV)-羟基自由基（Compound II）。所得底物自由基经历快速的氧回弹反应，导致羟基化或其他氧化修饰，从而完成催化循环。这种显著的催化多功能性使P450s能够参与广泛的生化途径。尽管这一广泛接受的框架存在，几个中间体，特别是Compound 0和Compound II，在实验上仍然难以表征，并且在特定条件下也存在替代的“分流”途径。这种显著的催化多功能性支撑了P450s参与广泛的生化途径的能力，催化通常通过经典合成化学难以实现的反应。 在此，我们聚焦于P450酶在两大类天然肽：非核糖体肽（NRPs） 和核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPPs） 中的自由基介导环化作用。在肽环化的背景下，底物自由基在氧回弹步骤之前经历分子内重组，将典型的羟基化途径转向成键反应。酶活性位点内反应性残基的空间排列决定了偶联的几何结构，使得能够选择性地形成联芳基醚（C–O）、联芳基（C–C） 或杂原子连接的交联。最近的P450-肽复合物结构研究揭示了底物锚定motif如何将特定氨基酸侧链定位在血红素中心附近，以进行顺序自由基生成和偶联。6.1 NRPS生物合成中的P450酶6.1.1 糖肽抗生素——万古霉素 糖肽抗生素（GPAs） 代表了一类重要的抗菌剂，临床相关例子包括万古霉素和替考拉宁。其中，万古霉素作为理解GPA生物合成的模型被广泛研究。它通过由细胞色素P450酶（OxyB、OxyA和OxyC） 催化的高度协调的氧化交联过程产生。这些酶通过一系列区域选择性氧化偶联反应，将非核糖体肽合成酶（NRPS）组装的线性七肽前体转化为其刚性的、生物活性的构象。 万古霉素的氧化环化始于OxyB，它催化C和D残基的酚环之间形成C–O键。这一反应由Compound I启动，这是一种铁(IV)-氧物种，从C环夺取一个氢原子，生成一个稳定的自由基。在D环上的第二次氧化事件产生一个酚氧双自由基，该自由基重组形成第一个联芳基醚键。Nguy等人通过过氧化物分流策略为这一转化中Compound I的形成和功能相关性提供了直接的光谱和动力学证据。OxyB在间氯过氧苯甲酸（mCPBA） 处理下形成Compound I，其λ = 695 nm的特征性特征通过停流UV-vis和冷冻淬灭EPR光谱得以确认。这揭示了与卟啉自由基耦合的铁(IV)-氧物种的特征性信号。此外，通过顺序混合停流动力学测试了这一瞬态中间体的反应性，其中Compound I的衰减速率与肽底物浓度直接成正比。随后通过HPLC-QToF-MS确认了交联的单环产物的身份，在Compound I衰减和催化周转之间建立了直接联系。这些结果不仅确认了Compound I在酚偶联中的催化能力，还凸显了其与典型氧回弹途径的机制差异。在此之后，OxyA催化类似的自由基介导反应，在D和E环之间形成第二个联芳基醚键，进一步刚性化七肽结构。 最后，OxyC催化A环和B环之间的交联，通过C–C偶联反应进行，区别于先前的醚化反应。这一步涉及芳香碳之间的直接自由基-自由基偶联，创建了对万古霉素抗菌活性至关重要的刚性多环骨架。OxyC的催化循环被提议以Compound I的形成开始，这是细胞色素P450酶常见的典型铁(IV)-氧π-阳离子自由基中间体。这种高价物种从Hpg残基（A环） 的酚羟基夺取一个氢原子，生成一个酚氧自由基和Compound II（Fe(IV)-OH）。Hpg上的自由基离域到邻位，然后与Dpg环（B环） 发生自由基酚偶联，形成一个直接的联芳基C–C键。所得中间体通过去质子化发生再芳构化，这可能由Compound II或一个活性位点碱基介导。随后是电子转移，将血红素铁恢复到其高铁静息态，从而完成催化循环。 这一机制模型得到了全面体外实验的有力支持。使用锚定在X结构域载体蛋白上的合成七肽底物对OxyC进行活性重构，实现了万古霉素苷元的完全化学酶法合成。用OxyB、OxyA和OxyC的顺序酶处理产生的反应产物显示出累积质量损失，与安装C–O和C–C交联一致。高分辨率串联质谱（HR-MS/MS）确认了预期的结构变化，包括在形成三环支架后诊断性b和y型离子的消失。此外，使用氘代Hpg的同位素标记提供了关键的机制见解。OxyC介导的交联导致特征性的7 Da质量损失，对应于一个氢和一个氘的同时夺取。这一观察结果与酚氧化引发过程一致，而非经典的双自由基偶联。这些结果验证了Compound I的催化作用，并为涉及亲电芳香取代的细化机制提供了有力证据。 在糖肽相关的天然产物complestatin中，采用了类似的氧化大环化策略。两个P450酶，ComI和ComJ，催化顺序交联。第一个是4-羟基苯甘氨酸（Hpg） 与色氨酸之间的联芳基C–C键，第二个是C–O醚键。这些修饰共同构建了一个刚性的双环支架。与万古霉素一样，这些反应可能通过铁(IV)-氧介导的酚氧自由基生成进行，然后发生区域选择性邻位-邻位偶联。结构研究和重构实验确认，ComJ表现出底物灵活性，并在仍锚定于NRPS的肽上运作，且交联对于结合细菌肽聚糖和抑制细胞壁重塑酶至关重要，甚至对万古霉素耐药菌株也提供活性。值得注意的是，complestatin还表现出广泛的药理活性，包括抑制HIV gp120-CD4结合、抗凋亡和神经保护作用，以及对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） 的强效抗菌活性，报道的MIC为2 μg mL⁻¹。6.1.2 脂肽抗生素——arylomycin Arylomycins是大环脂肽抗生素，可抑制细菌I型信号肽酶（SPase I），这是一种参与分泌过程中从前蛋白切割信号肽的必需膜结合丝氨酸蛋白酶。SPase I高度保守且对细菌生存不可或缺，使其成为有吸引力的抗生素靶点。Arylomycins的生物合成由Streptomyces roseosporus中的非核糖体肽合成酶（NRPS）组装线指导，由aryA、aryB和aryD基因编码。所得六肽含有一个独特的N-甲基-D-丝氨酸和羟基苯甘氨酸，两者都参与组装后修饰。大环化由AryC介导，这是一种细胞色素P450单加氧酶，催化Hpg与Tyr残基之间的氧化联芳基C–C键形成，形成一个对SPase结合至关重要的刚性14元环支架。独特的是，AryC不需要糖肽生物合成中通常必需的肽基载体蛋白（PCP） 锚定底物。相反，它可以作用于游离的线性脂肽。结构研究揭示，这种不寻常的PCP独立性源于AryC中一个深的、疏水的底物通道，该通道容纳未锚定的肽前体并促进直接的氧化偶联。 虽然早期的arylomycins对包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis） 在内的革兰氏阳性菌显示出强效活性，但它们对革兰氏阴性病原体的功效因外膜渗透屏障和SPase结合亲和力降低而受限。然而，结构导向的优化导致了衍生物如G0775的产生，它不仅穿透革兰氏阴性菌外膜，而且通过一个新的噁二唑弹头与SPase活性位点形成共价加合物，有效克服了预先存在的耐药机制。G0775对多重耐药ESKAPE病原体显示出强效的体外和体内活性，将arylomycin类似物定位为新型革兰氏阴性菌抗生素的有前景的先导化合物。6.1.3 Teleocidins：C–N键的自由基偶联 Teleocidins是一类吲哚生物碱，于1960年从Streptomyces mediocidus中作为对鱼有毒的化合物被发现。后续研究从Streptomyces spp.和海洋蓝藻Moorea producens中鉴定出结构相关的衍生物。这些天然产物的特征是一个吲哚稠合九元内酰胺核心，通过独特的P450催化的C–N键形成生物合成。这一转化由诸如TleB和LtxB等酶催化，在组装indolactam scaffold中发挥关键作用，该支架是teleocidins、indolactam V和lyngbyatoxin A的关键结构特征。 Teleocidins中C4–N13键的形成被提议遵循一个双自由基偶联机制，由铁-氧中间体促进。反应由Compound I（一种铁(IV)-氧物种）启动，它从吲哚环的N1位置夺取一个氢原子，生成一个稳定的吲哚自由基。随后是底物的构象变化，将酰胺N13位置拉近铁中心。由Compound II（Fe(IV)-OH物种） 从N13酰胺氮进行的第二次氢原子夺取导致形成一个氮中心自由基。最终的C–N键通过C4和N13自由基之间的双自由基重组建立，形成稠合的indolactam环系统。 这一机制通过使用TleB及其同源物Hind的体外酶学测定得以阐明。使用N13-环丙基取代的类似物的自由基钟实验导致开环产物，确认了在N13处形成自由基。缺乏N1-氢的底物未能环化，凸显了在N1处初始氢原子夺取的必要性。此外，TleB和Hind的X射线晶体结构揭示，虽然N1理想地定位（约2.7–3.1 Å）以供铁介导的H-夺取，但N13最初距离血红素过远。然而，在Hind-底物复合物中观察到的翻转底物构象将N13重新定位至血红素铁的约3.1 Å内，使得第二次夺取和键形成成为可能。这些结合的结构和生化见解有力地支持了teleocidin生物合成中indolactam形成的逐步双自由基机制。类似的机制已被提出用于lyngbyatoxin生物合成中的LtxB和pendolomycin生物合成中的MpnC，其中P450酶通过自由基中间体催化氧化环化。然而，虽然TleB和LtxB已得到充分表征，但MpnC的机制细节除了生物信息学预测外仍未充分探索。6.2 RiPP生物合成中的P450酶 rSAM和RiPP生物合成研究的早期基础探索了由rSAM/SPASM酶催化的RiPP途径中的自由基介导键形成，突出了独特的肽环化。这些工作为研究肽生物合成中的非常规键形成设立了先例。虽然P450s在次级代谢中的更广泛作用已被研究数十年，但它们具体参与RiPP途径代表了较新的研究领域。 P450s在RiPPs中的作用在2010年代中期至末期开始受到系统关注，当时出现了关于特定RiPP家族中氧化交联、杂环化和修饰的孤立报道。在2020年代初之前和期间发表的几篇综述讨论了P450s在RiPP生物合成中的新兴功能，帮助整合了早期发现和机制见解。 P450催化循环通过精确控制的自由基重组事件促进RiPP环化。在底物结合后，血红素铁经历顺序还原和氧活化，形成高价态的Compound I（Fe⁴⁺=O π-阳离子自由基） 物种。在RiPP修饰的P450s中，Compound I从芳香族氨基酸侧链（通常是酪氨酸或色氨酸）夺取氢原子，生成离域的底物自由基，这些自由基经历分子内偶联而非氧回弹。这种自由基终止途径使得： 联芳基键形成：通过自由基重组实现芳香残基间的C(sp²)–C(sp²)交联。 杂原子连接：通过氧/氮中心自由基偶联形成C–O或C–N键。 大环尺寸控制：通过酶的结构对反应性残基的精确定位决定了环的大小，通常范围为12到20个原子。 值得注意的是，这些反应不需要肽基载体蛋白（PCP）锚定。这一要求是与非核糖体肽（NRP）环化系统的关键区别，使得能够直接修饰核糖体合成的前体肽和合成肽底物。6.2.1 Atropitides和Bityptides：轴手性与Trp–Trp交联 Atropitides是RiPP的一个亚类，以其不寻常的非典型轴手性（atropisomerism） 为特征。与因手性中心或双键几何结构不同而不同的典型立体异构体不同，atropisomers是由围绕单键或多个键的受限旋转产生的稳定构象异构体。在atropitides中，肽中的多个共价交联创造了一个刚性的三维形状，阻止了自由的键旋转，并产生具有相同连接性的两个稳定构型。 这一肽家族的首个已知成员tryptorubin A是从分离自寄生于真菌Hymenochaete rubiginosa的Streptomyces sp. CL12509中发现的。Tryptorubin A是一个六肽，其特征是芳香族氨基酸侧链之间的多个分子内交联：Trp-吲哚-C至Trp-吲哚-C、Tyr-酚-C至Trp-吲哚-N、Trp-吲哚-C至骨架酰胺-N交联。tryptorubin A最引人入胜的方面之一是它的轴手性，即尽管连接性相同，却能以两种不同的构象异构体存在。tryptorubin A的全合成揭示它可以采用两种非典型轴手性构型。trp BGC的异源表达导致产生了以桥在上方异构体为主要产物的tryptorubin A，而负责安装所有三个交联的单个P450酶是TrpB。 Chinamides，最近从源自火山岛的Streptomyces sp. 中分离出来，具有高度同源的生物合成基因，编码一个前体肽和一个P450酶，P450安装在Trp1–C7与Trp2–N1之间的C–N交联，并且缺乏轴手性。An等人提出，Trp–Trp交联应作为主要分类标准，而非最终的化学结构。这导致提议将atropitides合并到一个扩展的bityptide家族中，其中P450催化的Trp–Trp连接是定义性特征。这一观点基于tryptorubins和chinamides之间的基因组相似性，它们共享高度同源的BGC，包括一个前体肽和一个专门的P450酶。其论点是它们的生物合成共性超过了诸如轴手性等结构差异，支持在bityptides下进行更广泛的分类。 然而，一项更近期的研究鉴定出，bityptides表现出一个保守的Trp–Trp交联motif（xWxxWx），这使它们区别于其他RiPP亚类。该研究提出，不应将bityptides视为一个总括类别，而应将其视为更大的Atropopeptide家族中的一个特定亚组。Atropopeptides，在这个细化定义中，不仅以P450修饰为特征，还具有保守的序列motif（如导肽中的KSLK）和独特的核心肽模式，使其成为一个更广泛的RiPP类别，其中包括bityptides作为子集。该研究揭示，Atropopeptide BGCs分布于不同的细菌属中，主要存在于Streptomyces和Xanthomonas中。Biermann等人还成功异源表达了几个Atropopeptide BGCs并解析了它们的结构，包括：Scabirubin、Varsorubin B和迄今为止发现的最复杂的atropopeptide——Laurentirubin B。6.2.2 Biarylides：P450对短肽的精密切割 Biarylides是一类三肽RiPPs，其特征在于芳香残基之间的侧链交联，具体为C–C或C–N键，由细胞色素P450酶催化。这些P450作用于具有诸如MxYxH等motif的最小肽底物，并安装诸如Tyr–C6至His–C5的连接。这一家族的最早成员，N-乙酰化三肽YYH和YFH，是通过对编码MRYYH等五肽的超短开放阅读框（ORFs） 进行基因组挖掘，从Planomonospora物种中发现的。相应的BGC包括最小的bytA基因（编码五肽前体）和负责大环化的P450酶基因bytO。N端的MR二肽被提议起导肽作用，尽管BGC中未编码专门的蛋白酶，但切割被认为由内源性宿主蛋白酶执行。环化后，新暴露的N端被N-乙酰化，产生成熟的三肽天然产物。 通过异源表达bytAO在Streptomyces coelicolor中的实验验证确认了YYH的产生，它含有Tyr与His侧链之间的联芳基C–C连接。在这些发现之后，来自粘细菌的第一个biarylidine，称为myxarylins，从Pyxidiococcus fallax中被鉴定出来。Myxarylins在两个方面区别于Planomonospora来源的biarylitides：它用N-甲基替代N-乙酰化，并形成Tyr与His之间的C–N连接，反映了不同的酶处理和区域选择性。这种结构差异凸显了P450的催化灵活性，并提示了跨细菌门类biarylidine生物合成的进化分化。 从*Micromonospora sp. MW-13*中的BytO样酶——P450BL的研究中获得了进一步的机制见解。该酶表现出广泛的底物耐受性，并能催化类似于myxarylins的Tyr-酚-C至His-咪唑-N交联。对其五肽底物（MRLYH）的突变分析揭示，Met-1和Arg-2对环化至关重要，而位置4的修饰影响效率。结构和计算研究进一步阐明了P450BL的区域选择性。 最近的工作通过蛋白质工程扩展了这些P450酶作为生物催化剂的效用。在Treisman等人的研究中，对P450BL的活性位点残基（A231、H234和E238） 进行了突变，以改变底物结合和环化概况。工程化变体如Blt-M1（A231V-H234L） 和Blt-M3（H234L-E238N） 使得替代底物如MRHLY和MRYLY的有效环化成为可能，产生了具有His–Tyr或Tyr–Tyr交联的新型三肽。这些工程化P450实现了高达85%的转化率，结构解析确认了非常规C–O连接（例如Tyr–C3–Tyr–O）的形成，区别于天然的C–C或C–N联芳基键。这项工作凸显了biarylidine型P450的催化可塑性及其在生成具有定制性质的新颖大环肽支架方面的潜力。基因组挖掘已揭示出多样的biarylidine BGCs，导致发现诸如roseovertin（Trp–C7′至His–Nτ）、rubrin（Trp–C7′至Tyr–C6） 和lapparbin（Tyr–C6至Trp–N1′） 等具有独特交联化学的新型肽。大规模生物信息学筛选进一步从多个P450亚类中鉴定出新的交联肽，许多具有N端酰化或甲基化，强调了该RiPP家族不断扩大的生化多样性。这些发现凸显了P450酶在工程化新型环肽中的生物催化潜力。6.2.3 Cittilins：双环四肽的P450催化 Cittilins是一类含联芳基的四肽RiPPs，其特点是同时具有C–C和芳基C–O–C连接，使其区别于主要具有C–C和C–N交联的biarylitides。首次在Myxococcus xanthus DK1622中鉴定出的cittilins由三个酪氨酸残基和一个异亮氨酸组成，形成一个让人联想到非核糖体肽抗生素如万古霉素和替考拉宁的刚性双环骨架。 Cittilins的生物合成由最小的BGC介导，该BGC由citA、citB和citC组成，分别编码前体肽、细胞色素P450酶和甲基转移酶。与其他RiPP生物合成系统不同，cittilins需要位于BGC外的一个额外的脯氨酰内肽酶进行前体切割。功能研究确认，CitB单独负责催化C–C和C–O两种交联，使其成为一种高度通用的P450酶，CitB定义了cittilin亚类。citB的缺失完全 abolished cittilin的产生，而citC的缺失导致一个未甲基化的变体cittilin B，保留了核心交联。这些发现表明，CitB首先介导C–C和C–O交联偶联反应，之后前体经历蛋白水解切割，然后由CitC进行甲基化，完成cittilin的生物合成。 不久之后，另一项研究在源自Saccharopolyspora shandongensis CGMCC 4.3530和*Saccharothrix syringae NRRL B-16468*的P450酶SanB和SyrB中鉴定出类似的催化模式。与先前表征的联芳基交联P450s不同，SanB和SyrB催化Trp至Tyr醚（C–O）键的形成，如在shandoamide和syrinamides中观察到的那样。有趣的是，这些酶表现出双功能性，因为它们也介导两个酪氨酸残基之间的C–C交联，进一步扩展了P450s在RiPP生物合成中的功能范围。6.2.4 Nocapeptin：套索肽中的P450修饰 套索肽（Lasso peptides） 是RiPP的一个独特亚类，其特征是独特的套索拓扑结构。它们的定义性特征是由核心肽的N端氨基与天冬氨酸或谷氨酸残基的侧链羧酸之间形成的大内酰胺环。剩余的C端尾部穿过此环，创建一个空间锁定结构，提供对蛋白水解和热降解的优异稳定性。 最近的一项发现通过鉴定nocapeptins扩展了套索肽的结构和酶学多样性，这是一个具有P450催化的C–N联芳基交联的新亚类。这些肽是通过对Nocardia terpenica IFM 0406进行基因组挖掘而鉴定的，其中发现一个套索肽BGC nop编码一个细胞色素P450酶（NopF），这是已知RiPP途径中的一个不寻常特征。后来在Longimycellum tulunense中发现了一个相关的基因簇（lop），含有NopF的同源物和一个额外的酶（LopG），暗示了该类肽内的进一步多样化。 Nocapeptin A，来自Nocardia terpenica的主要产物，含有一个在Trp2–N1与Tyr3–C3之间形成的C–N联芳基连接。这一修饰由NopF安装，并通过稳定同位素标记、2D NMR光谱和LC-MS/MS得到验证。所得产物展示了一个超越经典内酰胺环的刚性双环结构。相比之下，来自L. tulunense的longipeptin A在类似位置含有一个Trp–Trp交联，并经历额外的修饰反应，包括色氨酸羟基化和甲硫氨酸S-甲基化。后者形成一个锍部分，代表了RiPPs中此类修饰的首个例子。 在功能上，nocapeptin A对Micrococcus luteus表现出适度的抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为16 μg mL⁻¹。它在NCI-60癌细胞系 panel 中未显示细胞毒性。其结构刚性，归因于套索构象和P450介导的交联，有助于其高度的耐热性和抗蛋白酶降解能力。Nocapeptins的鉴定说明了P450酶如何扩展RiPP生物合成途径的化学能力。这一发现表明，通过持续的基因组挖掘和生化探索，很可能发现含有不同氧化交联的额外套索肽。6.2.5 Aminopyruvatides：P450与B12-rSAM的协同 来自Burkholderia thailandensis的aminopyruvatide途径 exempl 使用细胞色素P450酶催化芳香残基之间的氧化联芳基C–C交联，产生具有轴手性的刚性大环。在该途径中，P450酶ApyO偶联芳香侧链（Tyr/β-甲基酪氨酸）形成大环。这一反应之前是B12依赖性rSAM酶ApyD催化的独特酪氨酸β-甲基化（生成(2S,3R)-β-甲基酪氨酸），之后是MNIO和甲基转移酶在C端催化的修饰，产生罕见的(S)-3-氨基-2-氧代丁酸。 6.2.6 P450催化的O-插入大环化 采用整合了共保守分析与AlphaFold-Multimer建模的基于规则的基因组挖掘策略，He等人从放线菌中鉴定了四个先前未表征的P450酶，命名为KstB、MciB、ScnB和SgrB。其BGCs的异源表达，随后通过UPLC-HRMS和NMR表征，揭示这些酶在短前体肽内催化涉及三到四个芳香残基的多样氧化大环化反应： KstB产生kitasatides 1017和1019，具有通过一个C–C键和两个C–N键形成的Trp–Trp–Tyr连接。 MciB生成micotide 982，含有一个Tyr–Trp联芳基C–C键。 ScnB产生strecotide 839，具有一个Trp–Trp C–N连接。 观察到的最显著转化是SgrB，它形成了带有His–His醚键的gristide 834，该键是通过直接氧插入产生的。这一修饰通过+16 Da质量增加以及建立两个组氨酸残基的咪唑环之间的C–O桥的诊断性HMBC和NOESY相关性得到确认。同位素标记和光谱数据表明，插入的氧原子来源于分子氧，并通过涉及高价态Compound I（Fe(IV)=O） 物种的典型P450催化循环引入。因此，该反应代表了RiPP生物合成中血红素依赖的氧插入大环化的首个例子。机制上，这一过程根本不同于rSAM酶DarE采用的自由基继电器，后者通过Fe-S簇活化而非血红素-氧中间体在darobactin形成中介导O-插入。尽管它们的催化结构不同，SgrB和DarE都通过分子氧掺入实现醚交联形成，代表了RiPP大环化中C–O键形成的趋同酶学解决方案。这些P450酶的发现将RiPP生物合成的氧化库扩展到了C–C和C–N偶联之外，并将氧插入确立为血红素依赖的肽多样化的新维度。第七章：BURP结构域蛋白——植物中的铜依赖型环化酶 BURP结构域肽环化酶（BpCs） 形成一个产生称为burptides的大环产物的翻译后肽修饰酶谱系。系统发育分析揭示了四个亚家族：USP（Unknown Seed Protein）、RD22（Responsive to Desiccation 22）、PG1β（Polygalacturonase-Inhibiting Protein 1β） 和BNm2（Brassica napus Meristem 2），每个亚家族的结构域结构和核心肽定位各不相同。这些BURP结构域共享一个保守的CHX₁₀CHX₂₅₋₂₇CHX₂₅₋₂₆CH motif，该motif组织了两个相对的2×CH模块。结构分析揭示了在motif一侧存在典型的Ⅱ型铜蛋白的His₂-Cu配位，而第二个潜在位点位于7 Å内；这两个位点是否同时被占据并协同进行O₂活化仍在研究中。这种His配位的铜环境，由附近的二硫键“staples”稳定，代表了肽修饰金属酶中的一个不寻常特征。BURP结构域蛋白通常由多个模块组成，包括一个N端疏水结构域信号肽、一个保守段、一个可选重复结构域和C端BURP结构域本身。 从结构角度看，BURP衍生的大环包括lyciumin型C–N连接、带有Tyr–O–C醚键的环肽生物碱、stephanotic acid型Trp–C–C支架以及hibispeptin型Tyr–C–C框架。尽管这些类别在环拓扑结构和交联化学上不同，但它们都由仅两个机制上不同的酶家族安装：融合型和分离型burptide环化酶，这构成了下文讨论的基础。 基于此分类，几个代表性分子说明了BURP安装的侧链大环化的广度。来自Celosia argentea的moroidin同时含有Leu–Trp C–C和Trp–His C–N连接；来自Hibiscus syriacus的hibispeptin B具有一个Tyr–Leu C–C键；来自Coffea arabica的arabi peptin A则带有由分离型BURP酶催化的Leu–Tyr C–O醚交联。尽管它们共同依赖自由基介导的铜化学，但BpCs表现出多样的表达模式和生物学作用：BNm2与Brassica中的小孢子胚胎发生相关，RD22在Arabidopsis中受干旱胁迫诱导，而BURP结构域常定位于细胞壁基质，可能在分子间肽交联和结构稳定化中发挥作用。7.1 融合型burptide环化酶：AhyBURP的分子内催化 一部分BURP酶被编码为融合蛋白，在同一多肽链中包含修饰结构域和前体肽，从而实现分子内加工。最近的结构和生化研究证实，这些融合型BURP酶通过一种铜和氧依赖的自由基机制运作，该机制区别于先前表征的RiPP环化酶。 Arachis hypogaea 的AhyBURP（一种USP型酶）的晶体结构揭示了一个前所未有的BURP结构域折叠，包括一个不连续的β-桶和β-片层，将核心肽包围在一个His₂-Cu位点之上，而结构模型中在不到7 Å处存在第二个潜在的Cu结合模块。每个活性位点包含一对由Cys-Cys二硫键“staples” 稳定的His配体，每个单体形成两个Ⅱ型Cu位点。该酶作为同源二聚体发挥作用，但每个亚基自主作用于其自身拴系的核心肽——据我们所知，这使AhyBURP成为首个被证实的分子内（顺式）RiPP大环化酶。 机制上，AhyBURP被提议催化两个顺序氧化步骤，首先生成单环lyciumin I，然后是双环legumenin。在第一步中，一个铜位点被提议活化分子氧以生成一个反应性Cu–O物种（例如Cu-超氧和/或双铜μ-氧基形式），该物种从Gly82–Cα夺取一个氢原子，生成一个碳中心自由基。该自由基与Trp86–N1偶联形成C(sp³)–N键（lyciumin I）。使用CHANT（4-氯-3,5-二硝基苄基羟胺） 的自由基捕获实验为局限于Tyr81–Trp86区域的瞬态自由基中间体提供了支持，而同位素标记实验与O₂作为终端氧化剂（而非供体原子）的作用一致。在第二步中，形成额外交联以生成legumenin的过程被提议通过从Gln79夺取氢原子进行，基于Gln-d₅标记（丢失一个氘）和Y84A变体，Tyr84被 implicating 参与此过程。虽然针对BURP结构域酶提出了替代机制模型，但图29中展示的方案总结了当前提议共有的关键实验支持特征。 融合型BURP酶的催化周转需要温和的还原环境；抗坏血酸或γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸（GSH） 可以通过维持铜中心处于还原态来支持活性。一个内部的Cys104–Cys116二硫键被提议在催化过程中参与电子或质子转移，尽管O₂结合/活化以及整个反应过程中铜氧化/配位状态的细节仍有待完全确定。任一配位组氨酸的突变或关键二硫键的破坏都会取消大环化，强调了铜配位和硫醇氧化还原动力学的必要作用。 在这些机制性见解的基础上，最近对约8900个植物RNA-seq数据集的大规模转录组分析揭示了BURP型大环化酶及其产物的广泛多样化，包括新表征的化合物如glechomanin（Val–Trp C–C） 和mercurialin（Phe–Tyr C–O）。这些化合物保留了定义stephanotic acid支架的典型Leu–Trp C–C连接，但引入了由具有不同底物特异性的BURP酶催化的新颖次级交联。来自Glechoma hederacea的Glechomanin具有一个额外的Val–Trp C–C键，而来自Mercurialis annua的mercurialin形成一个Phe–Tyr C–O醚键，证明BURP结构域铜酶可以介导脂肪族和芳香族侧链之间的C–C和C–O键形成。在Stellaria aquatica中，一个新发现的moroidin变体（QLLVWRNH） 表现出典型moroidins的Trp–His C–N连接，但对非小细胞肺癌细胞显示出增强的抗增殖活性（IC₅₀ ≈ 1.4 μM），表明由细微序列变化驱动的功能多样化。总的来说，这些发现强调，BURP结构域大环化酶构成了一个进化上趋同的平台，用于氧化性侧链大环化，生成涵盖stephanotic acid、moroidin和相关植物RiPP家族的多样支架。7.2 分离型burptide环化酶：ArbB2的反式催化 第二类广泛分布的BURP酶以反式方式作用于分别编码的前体肽。这些分离型BURP系统在植物基因组中形成保守的生物合成盒，其中短的前体基因与一个或多个BURP同源物相邻。在Coffea arabica中，通过体外重构证明，分离酶ArbB2使用同源前体ArbA2安装arabi peptin A的Leu–Tyr C–O醚键。该反应需要铜离子才能进行活性，并且在存在铜螯合剂的情况下修饰被取消，与在其他BURP型环化酶中观察到的Cu依赖的氧化机制一致。相应的arb locus编码多个前体肽和几个BURP同源物，构成一个用于生成环肽多样性的模块化集合。 对ArbB2的机制研究，连同对融合型BURP大环化酶的结构分析，表明分离型BURPs保留了推断用于融合系统的保守His配位的双铜motif和O₂依赖的氧化化学，但作为反式作用的单体酶，在多个肽底物上具有真正的催化周转能力。AlphaFold建模和对接支持一个N端导肽或识别序列在核心肽上游的作用，引导底物结合，将核心中的芳香残基定位在铜活性位点附近的疏水口袋中，以进行选择性侧链氧化。还原剂依赖性实验表明，需要外源性还原剂来维持活性并实现多次周转，与催化过程中Cu(I)的还原性再生一致。顺序修饰测定进一步证明，分离型BURPs可以加工多核心前体中的每个核心，并可作用于不同的前体肽，与其扩展的底物范围一致。比较基因组学，辅以转录组挖掘，揭示分离型BURPs广泛分布于真双子叶植物中，并且经常与编码arabi peptins、hibispeptins、环肽生物碱和moroidin样burptides核心的独立前体基因共聚类。来自Ceanothus americanus和Ziziphus jujuba的直系同源分离系统与诸如frangulanine和homoamericine等环肽生物碱相关，其13-14元大环具有酪氨酸衍生的C(sp³)–O-酚醚交联连接至β-羟基Leu或Ile残基。这些数据将分离型BURPs定义为反式作用的、铜和氧依赖的大环化酶，它们在提议的Cu/O₂依赖的氧化范式内运作，该范式被认为是融合型和分离型burptide环化酶的基础，同时提供更大的催化灵活性和更广泛的产物多样性。 总的来说，融合型和分离型BURP大环化酶阐明了一种新兴的Cu/O₂依赖的自由基策略，用于氧化性侧链大环化。虽然像AhyBURP这样的融合酶以分子内方式作用于拴系的底物，但像ArbB2这样的分离系统在单独的前体肽上执行真正的催化周转。尽管结构各异，但两者共享标志性的His配位的铜位点，并生成结构多样的大环。第八章：DUF3328结构域蛋白——真菌中的氧化环化引擎 真菌RiPPs因其潜在的治疗应用而被发现，包括抗癌、抗微管蛋白、抗线虫等。尽管具有重要性，但仅发现了有限数量的真菌RiPPs，其中大多数属于特定类别，如cycloamides、borosins和dikarints。 Cycloamides是通过氧化大环化形成的带有硫醚交联的环肽，例子包括来自蘑菇Amanita bisporigera的α-鹅膏蕈碱（α-Amanitin） 和鬼笔环肽（phallacidin），但负责其硫醚大环化的酶仍未确定。Borosins依赖于自加工酶学机制进行环化。 在这些家族之外，最近表征的一个DUF3328相关分支——来自Aspergillus flavus和A. oryzae的asperigimycins A–D，说明了多个DUF3328氧化酶可以组合构建远为复杂的支架。apg基因簇编码一个核糖体前体（ApgA）以及六个DUF3328酶（ApgA–F） 和一个N端谷氨酰胺环化酶（ApgG）。逐步敲除 mapping 了各个DUF3328s在早期大环化、水解和醚键构建中的作用，汇聚于一个苯并呋喃二酮核心，该核心被进一步修饰成七环骨架。apgA的缺失 abolished 所有产物，确认了其RiPP起源，而生化测定确立了ApgG作为在N端安装焦谷氨酸（pGlu） 的酶。选定的类似物显示出抗癌活性，而N端脂化增强了效力，强调了DUF3328酶级联作为复杂大环组装和活性调节的多功能平台的地位。 Dikarints构成了一个不断增长的类别，得到了广泛的体内证据支持：基因敲除和异源表达 implicating DUF3328蛋白在ustiloxins、phomopsins、asperipin-2a、victorins和epichloëcylins的生物合成中起核心作用。这些肽经历翻译后氧化修饰，导致Tyr/Phe残基与附近氨基酸的Cβ之间形成独特的C–O交联。对于epichloëcylins，产物是环七肽，其序列和环闭合由LC-MS/MS定义，但详细的交联模式、3D结构和绝对立体化学仍有待完全解析。 最近的一项研究提供了AprY的首个体外生化表征，AprY是来自Aspergillus flavus的asperipin-2a途径的DUF3328酶。该研究成功重构了AprY的酶功能，证明它在核心六肽FYTYGY中催化两个连续的C–O交联反应。这一过程安装了酪氨酸与相邻氨基酸之间的两个Cβ–O醚交联，增强了肽的结构刚性。第一步涉及在Tyr3和Tyr6处的氢原子夺取，生成一个双自由基中间体，该中间体经历自由基重组形成Tyr3–Tyr6醚键。氘代标记实验中质子交换的缺失支持自由基重组机制，而非Michael型亲核加成。第二个交联事件涉及Phe1和Tyr3，由Phe1的氧化脱饱和启动，形成一个α,β-不饱和中间体。该中间体经历进一步的氢原子夺取，导致一个Phe1中心自由基，该自由基与Tyr3重组形成第二个醚交联。最后，Phe1的α-氨基被氧化为α-酮基，通过从水中掺入¹⁸O得到确认，随后由短链脱氢酶/还原酶AprR进行立体选择性还原，产生最终的asperipin-2a结构。 功能扩展：DUF3328内的铜依赖卤化。除了氧化大环化，DUF3328酶还介导铜依赖的C(sp³)–H卤化：ApnU使用一个双核Cu(II)中心，对惰性脂肪族C–H键进行迭代卤化，并且在O₂/抗坏血酸存在下，还可以进行碘化和硫氰化。结构和光谱数据支持一个二硫键连接的同源二聚体，带有HXXHC配位的双铜中心，将DUF3328的化学从大环化扩展到了C–H官能化。第九章：多核非血红素铁依赖氧化酶——MNIOs的复杂氧化 MNIOs，以前归类为DUF692蛋白，是新兴的肽修饰氧化酶，利用多核非血红素铁辅因子和分子氧通过Fe-O介导的氢原子转移启动单电子化学。在这个庞大且机制多样的家族中，已经描述了几个不同的氧化结果。 第一种涉及半胱氨酸中心的四电子氧化，生成诸如噁唑酮-硫酰胺和5-硫代噁唑等局部杂环，如methanobactin生物合成中的MbnB/MbnC和bufferin成熟中的BufB/BufC所示。第二种包括半胱氨酸β-碳编辑，在不形成环的情况下重塑单个残基，如TglH/TglI中所见。第三种模式的特征是 culminate 在残基间大环化的氧化级联反应，以ChrH/ChrI为代表，它们形成一个硫醚连接的大环。最后，几个MNIOs靶向酸性残基：MovX样酶催化Asn的N–Cα键氧化裂解以形成末端酰胺，而ApyH型氧化酶将Asp转化为α-酮酸。这些反应共同强调了MNIOs通过氧活化的铁中心启动重塑肽骨架的自由基转化的能力。9.1 ChrH/ChrI：硫醚大环化的MNIO范例 在已表征的成员中，ChrH与其膜伴侣ChrI一起，通过一个自由基引发、铁依赖的氧化还原程序将线性前体转化为chryseobactin，该程序 culminates 在残基间硫醚大环化。提出的机制始于Fe(II)-O₂在活性位点的活化，生成一个超氧-Fe(III)中间体，该中间体从Cys8夺取Cβ-氢，形成一个Cβ中心自由基。该中间体被认为经历进一步的铁介导氧化为硫代醛，该硫代醛可能被相邻的Gly酰胺氮分子内捕获，产生一个瞬时的β-内酰胺。随后的铁催化β-内酰胺裂解（可能涉及一个高价Fe(V)-氧物种）促进羰基迁移并产生一个咪唑烷二酮核心。第二个半胱氨酸残基（Cys5）然后攻击修饰的骨架以闭合硫醚大环，最后的SAM依赖的硫乙基化完成转化。 全面的生化证据支持这一途径。ChrH及其膜伴侣ChrI在大肠杆菌中的异源共表达仅在存在两种蛋白和铁的情况下产生+10 Da质量位移。保守半胱氨酸的定点突变破坏了产物形成，确认了它们关键的催化作用。修饰肽（ChrA）的NMR谱显示特定酰胺共振的丢失和新的交叉峰，与咪唑烷二酮和硫醚大环一致。使用¹³C-半胱氨酸和¹³CD₃-SAM的同位素标记鉴定了半胱氨酸衍生碳的重排和甲基供体来源，而使用Fe(II)、O₂和SAM的体外重构完全重现了这一转化。总之，这些结果将ChrH定义为一个多核非血红素铁氧化酶，它将自由基中间体引导至选择性键重排和残基间环化——这是MNIO酶促肽环化的一个典型例子。9.2 MbnB/MbnC：MNIO家族的原型 MbnB/MbnC复合物代表了MNIO家族中表征最充分的例子，定义了methanobactin生物合成的核心氧化化学。作用于核糖体合成的前体MbnA，这种异源二聚体酶催化保守半胱氨酸残基的四电子氧化，生成在成熟肽中配位铜的标志性噁唑酮-硫酰胺motif。生化重构确定，MbnB（一个TIM桶状MNIO）需要MbnC才能具有活性，并且Fe和O₂都是必需的辅因子。 结构、光谱和生化研究共同表明，活性辅因子是一个混合价态Fe(II)/Fe(III)双铁中心，而非先前提出的三铁簇。在MbnB活性位点内，MbnA的半胱氨酸硫醇盐直接配位高铁离子，这一特征在MbnABC复合物的晶体学中观察到，并通过电子-核双共振光谱得到确认。当O₂结合到亚铁位点时，生成一个超氧-Fe(III)中间体，该中间体从半胱氨酸残基的Cβ夺取一个氢原子，产生一个底物自由基。该中间体随后被氧化为硫代醛，该硫代醛经历由相邻酰胺氮的分子内攻击，产生一个瞬时的β-内酰胺物种。同时，亚铁位点被氧化为高价Fe(V)=O（ferryl）物种，该物种对β-内酰胺进行第二次氢原子夺取，促进其转化为硫代取代的环状酰亚胺。由酶残基进行的亲核攻击和随后的取代或互变异构步骤导致形成methanobactins特征性的噁唑酮-硫酰胺部分。 总的来说，这些研究支持一个机制，其中底物Cys硫醇盐配位多核铁中心，O₂在铁中心被活化以进行Cβ–H夺取和随后的多电子步骤，而分子内加工产生支撑成熟methanobactins中高亲和力铜结合的噁唑酮-硫酰胺单元。因此，MbnB/MbnC作为原型MNIOs，重塑侧链以构建塑造金属结合位点的局部杂环，而不是锻造新的残基间环。第十章：结论与展望——自由基环化的未来 对自由基肽环化酶的研究已显著扩展，涵盖了广泛的酶系统，包括rSAM酶、细胞色素P450s、BURP结构域蛋白和含DUF的酶，所有这些酶都为天然产物的化学复杂性和功能多样性做出了贡献。这些酶促进多种成键反应，包括C–C、C–S、C–N和C–O连接。这些修饰增强了肽基天然产物的结构稳定性、生物活性和药代动力学性质。 未来研究的一个关键领域在于解析这些多样化酶的结构和机制复杂性。虽然在理解rSAM酶学方面已取得很大进展，但需要进一步研究以阐明P450s、BURP结构域蛋白和DUF家族酶的催化潜力。诸如时间分辨晶体学、用于检测自由基的光谱学以及计算预测和建模等技术将有助于揭示其潜在的反应机制并指导酶工程。 在肽修饰的背景下，自由基酶的一个共同主题是它们能够催化单残基上的氧化反应以及交联反应。对已被发现催化单残基反应的自由基酶的进一步探索可能会带来新的交联反应。这一现象的实例在MNIO（DUF692）酶和B12依赖性rSAM酶中观察到。像αKG和Fe依赖性酶这样的大型超家族可能是进一步探索的沃土。虽然本综述聚焦于自由基环化酶，但这些生物合成途径也编码独特的修饰酶，以进一步功能化大环或由不同酶家族添加额外的环。总的来说，这些探索途径很可能导致化学多样化的肽骨架，作为下一代治疗药物的来源。 这些酶系统的发现对药物发现具有广泛影响，特别是在解决对新抗生素的迫切需求方面。许多RiPPs，包括darobactins、dynobactins，已证明对革兰氏阴性病原体具有活性，使其成为下一代抗菌剂的有前景的先导化合物。此外，自由基肽环化酶引入复杂翻译后修饰的能力为生物工程稳定且功能多样的治疗性肽提供了新机会。 另一个有前景的途径涉及利用这些酶进行生物催化和工业应用。自由基介导转化的区域选择性和立体选择性为肽工程提供了一种创新方法，能够以高效率合成结构复杂的分子。酶工程、人工智能驱动的蛋白质设计和基因组挖掘的整合将进一步加速新催化功能的发现和新型生物技术应用的开发。 原文链接：https://doi.org/10.1039/d5cs00585j