Brolucizumab-dbll

8月13日，国家药品监督管理局药品审评中心官网显示，复宏汉霖与亿胜生物联合提交的贝伐珠单抗眼内注射液HLX04-O上市申请获得受理。HLX04-O是专为眼科疾病设计的抗VEGF单抗注射液，针对湿性年龄相关性黄斑变性这一导致老年人不可逆失明的主要眼病。HLX04-O成为继兆科眼科/东曜药业的TAB014之后，国内第2款申报上市的贝伐珠单抗眼科制剂。 湿性年龄相关性黄斑变性是造成老年人视力损害和不可逆失明的主要原因之一。据世界卫生组织报告，全球约有3000万AMD患者，每年约有50万人因此致盲。在AMD致盲患者中，湿性黄斑变性比例高达90%。目前，中国境内上市的贝伐珠单抗产品均未获得湿性年龄相关性黄斑变性适应症批准。抗VEGF药物已成为湿性年龄相关性黄斑变性的一线疗法。2024年中国境内wAMD适应症药物销售额约49.0亿元。 根据申报资料，HLX04-O是在复宏汉霖已上市的汉贝泰基础上进行优化开发的新制剂。保持了贝伐珠单抗这一活性成分不变，但针对眼科用药的特殊需求，对处方、包装材料、规格和生产工艺进行了全面优化。 在作用机制方面，该产品通过基因工程技术构建，能够特异性结合血管内皮生长因子，阻断VEGF与内皮细胞上的受体Flt1和KDR结合。这种作用可抑制酪氨酸激酶信号通路的激活，进而抑制内皮细胞增生，减少新生血管生成，从而实现对湿性年龄相关性黄斑变性等血管增生眼部疾病的治疗。可比性研究证实，生产工艺和制剂处方的变更对药物制剂的质量、安全性和有效性未产生不利影响。 关键临床研究数据 此次上市申请主要基于一项名为NCT05003245的III期临床研究结果。这项多中心、随机、双盲、阳性对照研究采用非劣效设计，比较了玻璃体内注射HLX04-O与已上市药物雷珠单抗治疗湿性年龄相关性黄斑变性的有效性和安全性。 2025年4月，复宏汉霖宣布该研究已成功达到预设的主要研究终点：HLX04-O组第48周最佳矫正视力较基线改善的平均字母数变化非劣于雷珠单抗组。 在安全性方面，HLX04-O表现出良好的耐受性，未观察到新的安全信号。两组患者整体、眼部及非眼部的安全性特征相似。 除这项中国患者研究外，复宏汉霖还就HLX04-O同步开展了一项国际多中心III期临床研究（NCT04740671），在中国、澳大利亚、欧盟和美国等国家和地区入组受试者。 该研究已于2025年1月完成最后一名患者的最后一次访视。 合作开发与竞争 复宏汉霖与亿胜生物的合作始于2020年10月，当时两家公司就HLX04-O达成全球许可协议。根据协议，亿胜生物获得HLX04-O就眼科适应症的全球共同开发权益，其全资附属公司成为该产品的受许人。此次合作将复宏汉霖的抗体开发能力与亿胜生物在眼科领域的专业优势相结合。 目前，国内已有多款抗VEGF药物获批用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性，包括诺华的雷珠单抗和布西珠单抗、再生元的阿柏西普，以及康弘生物的康柏西普。在贝伐珠单抗眼科制剂领域，兆科眼科和东曜药业已率先一步，于今年6月联合提交了贝伐珠单抗眼科制剂TAB014的上市申请。 国内多家药企也在积极布局眼科赛道。齐鲁制药在眼科用药市场深耕多年，其阿柏西普生物类似药已于去年12月获批上市，雷珠单抗注射液也在今年8月获批。 康弘药业研发的康柏西普眼用注射液是新一代抗VEGF融合蛋白，自2014年首次获批以来，已陆续获批多个适应症。此外，信达生物的IBI302（抗VEGF-补体双靶点药物）和荣昌生物的RC28-E（VEGF/FGF双靶标融合蛋白药物）均已进入III期临床研究阶段。 随着中国老龄化进程加速，湿性年龄相关性黄斑变性的患病率将持续上升，对抗VEGF药物的需求也将不断增长，HLX04-O如能成功上市，将为国内患者提供更多治疗选择。 参考来源： [1] http://stock.10jqka.com.cn/hks/20250813/c670342619.shtml  [2] https://www.zyzhan.com/news/detail/96809.html  [3] https://wt.cfi.cn/p20250813002298.html 立即扫码加入药事纵横交流群

点击上方“蓝字”关注我交流学习！ 好文阅读： 这篇文章由药明生物中国研发团队于2023年1月发表在Antibody Therapeutics，主要总结了在抗体衍生疗法（包括单抗、双抗、抗体-药物偶联物）的开发中，在早期发现阶段的可开发性评估的标准、方法和观点。以下为本文的（上）第01部分内容。 摘要： 可开发性是指候选抗体成为可制造、安全和有效的药物的可能性。尽管候选药物的安全性和有效性会受到申办方和监管机构的充分考虑，但狭义的可开发性可以定义为候选抗体以合理的成本和合理的时间内顺利完成化学、制造和控制（CMC）过程的可能性。从这个意义上说，可开发性是本综述的重点。为了降低可开发性差的候选抗体进入CMC阶段的风险，应尽早筛选、评估和优化候选药物的可开发性相关特性。在早期发现阶段对可开发性进行评估应以快速和高通量的方式进行，同时消耗少量的测试材料。除单克隆抗体外，作为单克隆抗体的衍生物的双特异性抗体、多特异性抗体和抗体-药物偶联物也应评估其开发能力。此外，我们提出可开发性的标准是相对的：预期的临床适应症，抗体的剂量和给药途径可能影响该标准。我们还建议在抗体衍生疗法的早期发现阶段进行一般筛选过程。随着人工智能辅助预测蛋白质结构和特征的进步，计算工具可用于预测、筛选和优化候选抗体的可开发性，并大大降低将次优候选药物转移到开发阶段的风险。 【NO.1】介绍 抗体相关生物药，包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAbs）和抗体药物偶联（ADCs），已成为创新药的重要类别。在此类药物研发的发现阶段，虽然最初的重点通常是候选药物的独特作用机制和生物学功能，但这些候选药物的可开发性也变得至关重要。 图1.影响可开发性评估的关键因素。可开发性的四个关键属性（均匀性、稳定性、溶解性和特异性）由抗体结构和改变决定。这些属性和候选抗体的使用用于确定可开发性标准。 【NO.2】抗体药物发现和开发的一般过程 抗体发现和开发过程包括几个步骤（图2）。一旦确定了靶点或疾病相关途径，就可以使用体内免疫、体外展示技术、B细胞选择或技术组合来生成一组抗体。从数百到数千个靶标结合抗体开始，可以使用几个筛选步骤来缩小有希望的抗体范围，这一过程称为筛选漏斗。在此过程中，鉴定出具有适当亲和力、特异性和功能的抗体。这些抗体可以通过亲和力成熟、人源化、Fc工程等工艺进一步优化或工程化。这些抗体的理化性质可能会在此过程中改变。如果抗体在与细胞上的靶标结合时可以内化，则该抗体可以与有效载荷偶联以制造ADC。BsAb候选药物可以通过对适当mAb的原始筛选产生，也可以在鉴定出一对mAb后进行工程设计（图3）。BsAb候选药物通过与单克隆抗体类似的工艺进行筛选和工程设计，尽管可以应用复杂的蛋白质工程和生物测定来制备和表征此类BsAb候选药物。 图2.从目标评估到IND申请的不同阶段与可开发性相关的测量的考虑。 图3.IgG mAb的结构和bsAb或msAb的基本构建模块。 一旦抗体被鉴定为临床前候选药物，就会开发出一种用于抗体稳定表达的细胞系，并开发一系列纯化步骤。在临床前开发过程中，抗体可能会在猴子或其他相关物种中进行测试，以进行毒理学研究。国际协调会议（ICH）指南（S6R1）建议“应选择剂量水平以提供有关剂量反应关系的信息，包括毒性剂量和未观察到的不良反应水平（NOAEL）”。在毒理学研究中选择高剂量水平以指导临床使用是常见的，有时也是必要的。 一旦抗体被鉴定为临床前候选药物，就会开发出一种用于抗体稳定表达的细胞系，并开发一系列纯化步骤。在临床前开发过程中，抗体可能会在猴子或其他相关物种中进行测试，以进行毒理学研究。国际协调会议（ICH）指南（S6R1）建议“应选择剂量水平以提供有关剂量反应关系的信息，包括毒性剂量和未观察到的不良反应水平（NOAEL）”。在毒理学研究中选择高剂量水平以指导临床使用是常见的，有时也是必要的。 【NO.3】可开发性分析在发现和开发阶段是不同的 发现阶段的可开发性评估与化学、制造和控制（CMC）阶段的可开发性研究不同，如图4所示。在发现阶段，重要的是要确定具有目标产品特征的治疗分子，这通常基于这种潜在治疗剂的临床使用。将进一步评估先导分子的关键质量属性（CQA），以在CMC阶段建立质量目标产品概况。在发现阶段进行可开发性评估是建立潜在CQA的第一步。在发现阶段进行评估，以使用快速和高通量方法识别潜在的可开发性风险。在早期发现阶段，可以通过可开发性相关测定比较几种具有相似生物学功能的候选抗体，通常选择一两个具有可接受可开发性的抗体进入CMC阶段。即使在发现阶段仅鉴定出一种功能最佳抗体，其开发能力仍需要评估并可能进行优化。在发现阶段设计抗体的成本明显低于在开发阶段优化工艺和配方的成本。此外，抗体的理化性质差可能会影响其在体外和体内的生物学功能。例如，抗体互补性决定区（CDR）中的翻译后修饰（PTM）会显着降低其效力。据报道，抗体轻链（LC）CDR1中的天冬酰胺（Asn）在40°C 3个月后达到92.6%的脱酰胺，这与该抗体效力的丧失相关。这种抗体在猴子体内的药代动力学研究也表明，随着时间的推移，靶标结合会丧失。在其他报道中，CDR中位于Asn脱酰胺和Asp异构化与抗体效力降低相关。 图4.在发现和开发阶段进行不同的目的和测试。 如果在发现阶段发现抗体存在可开发性问题，可以通过蛋白质工程来修复。例如，删除单克隆抗体CDR结构域中的两个疏水残基可显著降低其沉淀倾向。在另一个例子中，通过结构引导诱变和噬菌体显示的抗体平移和筛选优化了针对CD3和GUCY2C的bsAb的开发能力：去除抗GUCY2C的CDRH2中的脱酰胺位点和抗CD3的CDRH2中的蛋白水解切割位点降低了其多反应性和自缔合潜力。经过多维优化活动，获得了适合制造的行为良好的双抗。 相比之下，在开发阶段进行可开发性研究，以获得具有合理工艺和配方的足够材料，供临床前和临床使用。该研究通常是全面且耗时的，并且需要大量（数百毫克到几克）的测试材料，这些材料通常来自稳定的细胞系或稳定的细胞库。溶解度研究可以通过聚乙二醇沉淀筛选不同pH值的不同缓冲液（例如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液），以确定溶解度最高的缓冲液。可以通过筛选含有合适赋形剂（例如蔗糖和聚山梨醇酯80）的缓冲液来进一步评估溶解度。对于每种制剂，抗体被溶解至尽可能高的浓度并储存在2°C–8°C。以不同的时间间隔采集样品，确定其外观、浓度和尺寸排阻色谱（SEC）谱，并将结果与T0时的结果进行比较。这部分研究可以作为制剂前筛选。然后，可以在压力条件下使用所选缓冲液中的样品和目标浓度的赋形剂进行可开发性研究。一组测试通常用于评估候选产品的可开发性（如图5所示），包括一般测试方法和压力条件下的稳定性研究（例如暴露于高温、低或高pH、光、氧化试剂和冻融）。 图5.在发现和CMC阶段进行可开发性评估的一组测试。（A）在发现阶段和CMC阶段通常用于可开发性评估的分析方法。（B）发现阶段和CMC阶段的典型受迫应力研究计划。 •在发现阶段，低pH用于Asp异构化敏感性测试，而高pH值用于脱酰胺敏感性测试； •0.05%和1%H2O2在25°C下处理； •低pH值：pH3.5孵育；高pH值：pH9.0孵育； •3或5次冷冻（-70°C）和解冻（25°C）循环； •将抗体暴露在5000lx的强光下4小时和24小时； •2°C–8°C、25°C和40°C下的热应力。 生物候选药物的可开发性极大地影响着这些候选药物从发现到临床开发和商业化的速度、成本和成功率。随着现代生物技术的进步和经验的积累，应在早期发现阶段评估可开发性，以降低此类次优药物的开发风险。 【NO.4】与可开发性相关的注意事项和发现阶段的评估 对已批准的抗体药物的分析可以建议在发现阶段考虑与可开发性相关的考虑因素，从头到尾。图6总结了美国、欧洲、日本和中国机构批准的129种抗体药物的浓度和给药途径。在54种获批静脉注射用于癌症治疗的抗体中，中位浓度为11.25mg/mL，远低于皮下注射用于自身免疫性疾病的抗体中位浓度（100mg/mL）。用于眼科治疗的玻璃体内注射抗体以高浓度的小体积配制。例如，针对血管内皮生长因子的brolucizumab的配制体积为0.05mL，浓度为120mg/mL。 图6.基于疾病适应症（A）和给药途径（B）的批准抗体浓度：数据分析纳入了美国、欧洲、中国和日本机构批准的129种抗体。生物仿制药或撤回的产品不包括在内。 在几种已批准的bsAb中，有三种是T细胞接合剂：针对CD3和CD19的blinatumomab，以冻干粉末配制，注射剂量为0.009–0.028mg/天；针对CD3和gp100的tebentafusp，以0.2mg/mL的浓度储存在溶液中，剂量为0.02–0.068mg/天；以及针对CD3和CD20的mosunetuzumab，在溶液中配制，浓度为1mg/mL。其他四种双抗体是阿米万他单抗、卡多尼利单抗、艾米珠单抗和法瑞单抗，它们在溶液中配制的浓度分别为50mg/mL溶液（IV注射）、12.5mg/mL（IV注射）、150mg/mL（皮下（SC）注射和120mg/mL玻璃体内注射。 13种获批的ADC中有12种采用冻干粉末配制，这可能是由于接头和有效载荷在液态下的不稳定性所致。 通过对这些已批准的抗体药物的分析，我们可以得出结论，基于抗体药物治疗的疾病适应症以及抗体药物可能的剂量和给药途径，不同项目的可开发性标准可能不同。在这里，我们概述了不同发现阶段与可开发性相关的考虑因素，并提出了一些评估可开发性相关属性的测定（图2）。在靶点评估阶段，我们建议考虑治疗性抗体的可能临床用途。例如，针对眼科适应症的治疗性抗体通常是小体积玻璃体内注射，因此候选抗体需要具有高溶解度和低粘度。 在抗体生成阶段，通常通过抗原结合活性和生物学功能筛选候选抗体。在此阶段表达和纯化少量（通常为<1mg）每种抗体。应检查靶标的外观、表达水平、产量、纯度和与同系物的结合。在抗体的制造和使用过程中，包括细胞培养、培养上清液的收获、纯化、浓缩、储存、冷冻/解冻和稀释到测定缓冲液中，应观察抗体的外观。应注意具有可见颗粒或沉淀物的抗体，并且可能需要优化。表达水平可以通过分析蛋白A色谱法测量，也可以通过蛋白A亲和纯化来估计。通常，来自Expi293瞬时表达的100mg/L mAb可以被认为是可以接受的。通常，大多数体外测定可以接受大于90%的纯度，尽管某些测定需要更高纯度的抗体以避免杂质的影响。颗粒、聚集体、低表达、低纯度或与同源物结合的发现可能是可开发性问题的警告信号。当抗体序列可用时，应进行计算机分析以标记PTM热点、特定位置的异常残基、序列的缺失或添加等。 单克隆抗体通常会进一步设计以满足项目的要求，例如人源化、亲和力成熟、Fc工程等。在此阶段，除了监测外观、表达水平和纯度外，还应去除高风险的PTM热点并进行热稳定性。应去除高风险基序，包括NG/NS/DG基序、多余的Cys残基和可变区域的N-糖基化基序，以减轻对疗效和安全性的潜在风险。一旦确定了一些用于临床前研究的候选抗体，我们建议测试溶解度相关特征和广泛的非特异性结合。 当单克隆抗体通过接头与有效载荷偶联形成ADC时，有效载荷、接头和偶联物可能会改变单克隆抗体的构象。有效载荷的疏水性和不均匀的电荷分布可能会触发ADC的聚集。因此，在偶联时，需要测量ADC的纯度、产量和药物抗体比（DAR），特别注意高分子量组分的百分比。还应测量ADC在几个循环冻融后的稳定性。可以检查ADC的血清稳定性，以测量ADC裂解的有效载荷的百分比。 bsAb通常由一对针对不同靶标的亲本抗体组装而成。由于亲本抗体可变区域的理化性质将延续到bsAb上，因此强烈建议在构建和优化bsAb之前评估亲本抗体，并在必要时对其进行优化。还应检查BsAb的外观、表达、纯度、热稳定性等。还应进行计算机分析，以避免在bsAb工程过程中增加PTM热点。 对于具有潜在可开发性风险的候选抗体，可以应用多种策略。具有微可见颗粒或沉淀物的抗体分子可以在不同的制剂缓冲液中进行测试。对于具有严重可开发风险的抗体，例如具有持续聚集、稳定性差、溶解度超低或显着非特异性结合的分子，需要对抗体序列进行工程设计。序列优化后，应重新评估所有可开发性属性，如果发现危险信号，则需要进一步优化。最后，如果无法在不改变抗原结合的情况下去除PTM热点，则应进行强制应激研究以评估潜在风险（图5B）。 【NO.5】抗体的内在特性决定其可开发性 为了分析和优化可开发性相关属性，例如抗体衍生候选药物的均匀性、稳定性和溶解度，有必要了解影响其可开发性的抗体的内在特性，包括其多多肽折叠、电荷分布和疏水性（图1）。 抗体聚集是一种常见的可开发性问题，可由抗体结构域的部分展开触发，导致单体-单体结合，然后成核和生长。抗体聚集/胶体稳定性也会受到CDR环表面电荷分布的影响。当出现不对称或变化的表面电荷分布时，局部表面电荷斑块可能通过静电相互作用产生有吸引力的蛋白质-蛋白质相互作用，最终导致胶体不稳定。蛋白质的静电表面电荷分布在控制分子间相互作用以及随后的自缔合和粘度行为中起着主导作用，尤其是在高抗体浓度下。 疏水性和亲水性由20种氨基酸的侧链及其翻译后或共翻译修饰的衍生物决定。疏水表面斑块的强度可以通过相邻的带电残基来调节。CDR中疏水贴片的展开或错误折叠会赋予抗体高度疏水性，并可能导致分子间吸引、低溶解度、高粘度甚至聚集。 BsAbs或多特异性抗体（msAbs）通常通过组装多个构建块来构建（图3），例如VHH（单域抗体）、可变区域（Fv）、单链可变片段（scFv）、Fab和单链Fab（scFab），针对不同的抗原或表位。这些抗体片段的折叠稳定性可能低于全长IgG。此外，不同的结构域可能具有极性电荷，一个分子上的多个结构域可能会增加其聚集或不稳定的趋势。影响化学稳定性的问题，如脱氨和异构化，与单克隆抗体相似。然而，bsAb化学不稳定性的累积效应可能比mAb更严重。 5.1 同质性 由于抗体是由活细胞制成的，因此抗体衍生的药物不能像化学合成的小分子药物那样均匀。非物质文化遗产指南（Q6B）建议，应将与制造过程相关的杂质和一些与产品相关的杂质减少到可接受的水平。与制造过程相关的杂质包括细胞底物（例如宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA）、细胞培养成分（例如诱导剂、抗生素或培养基成分）和下游加工底物。与产品相关的杂质（例如前体、某些降解产物）是在制造和/或储存过程中产生的分子变体，在活性、功效和安全性方面不具有与所需产品相当的特性。在发现阶段，与产品相关的杂质是可开发性评估和优化的主要关注点。 未配对、遗漏或不匹配的链 未配对或缺失的LC是mAb和bsAb制剂中常见的异质性。通常，缺少光LC的抗体的大小、电荷或疏水性/亲水性与完整抗体不同；该差异可用于纯化完整的抗体产品。由于单细胞中可能存在两种HC和两种LC，因此IgG样bsAb可以组成不匹配的HC-LC或HC-HC。防止bsAb产物中的错配是一个特殊的挑战，因此已经开发了不同的bsAb形式，如旋钮入孔、双变量结构域Ig、WuXiBody、κλ体等，以试图获得均匀的bsAb产物。当不对称的IgG样bsAb表达和组装时，有可能形成同源二聚体而不是异二聚体。需要评估正确组装的双抗体和错配副产物的百分比。其他不需要的双歧异性副产物，如聚集体和片段，也有报道。一般的下游纯化工艺，如亲和力、电荷、尺寸、疏水性和混合模式纯化，已被用于去除不需要的副产物。 裂解 抗体的裂解可能发生在N端、铰链区、恒定区或C端。信号肽酶识别的特定切割位点需要满足A-X-B规则，其中A位和B位的残基通常是小的中性氨基酸，如Ala、Gly和Ser。信号肽的切割也会受到成熟蛋白的N端氨基酸组成的影响，这可能导致信号肽的非特异性切割，从而产生重肽和LCs的N端伸长或截短。尽管抗体中剩余的信号肽对抗原结合没有影响，但截短的抗体变异可能会影响抗体的疗效和生物活性。信号肽的准确和特异性切割对于制造完整和均匀的产品至关重要。工程化信号肽序列或成熟蛋白质的N端氨基酸可用于信号肽的精确切割。 与抗体的其他部分相比，铰链区域具有高度柔韧性，暴露于溶剂中。肽键裂解，酶或化学裂解，主要发生在铰链区域和CH2-CH3界面上，导致不同大小的片段。解理敏感性与铰链区域的长度和柔韧性有关。研究发现，IgG1抗体比IgG2和IgG4抗体更容易受到切割过程的影响。铰链切割可能对二价结合、Fc效应功能和新生儿Fc受体（FcRn）功能产生负面影响，导致疗效下降和清除速度加快。因此，应根据抗体的作用机制来评估铰链切割对抗体效力的影响。在CMC中，有效去除抗体片段是必要的，以确保产品的稳定性和有效性。 恒定区的切割位点通常位于环或结构域-结构域界面。高温或酸性或碱性pH值会加速裂解速率。恒定区的裂解可能对Fc介导的效应器功能或FcRn相关药代动力学（PK）特征产生影响。 IgG HC以Lys终止，Lys在细胞加工过程中容易被羧肽酶剪切。C端Lys加工的变化产生具有0、1和2个Lys残基的抗体，由于Lys的正电荷导致不同的电荷分布。鉴于C端Lys远离抗体的功能部分，C端异质性不会影响IgGmAb的结构、热稳定性、抗原结合、效力或药代动力学。然而，据报道，没有C端赖氨酸的IgG在稳定的细胞系培养中具有较低的滴度。在某些情况下，最大补体激活可能需要去除C端Lys。在某些bsAb形式中，抗原结合结构域融合到Fc的C末端，其中去除C端Lys以避免具有各种尺寸和功能的异质产物非常重要。 修饰 修饰可能发生在抗体药物生产过程的任何阶段，甚至在给药后。通常研究的修饰包括Cys相关修饰、脱氨、异构化、氧化和糖基化。这些修饰可能导致抗体大小或电荷的异质性，也可能影响抗体的稳定性、安全性和有效性。 半胱氨酸相关修饰 Cys残基通常参与链内或链间二硫化物键的形成，以支持抗体的结构完整性。每个IgG包含12个链内二硫化物键、两个连接LC和HC的链间二硫化物键以及HC铰链区域中不同数量的链间二硫化物键：IgG1和IgG4有2个，IgG2有4个。碱性环境会促进二硫化物键扰乱，并可能导致IgG抗体中链间二硫化物键的重构，特别是在IgG2和IgG4亚类中。据报道，由于二硫键扰乱，IgG4亚类的链内二硫化物形成以及随后的半抗体解离。 尽管大多数配对的Cys残基可以形成二硫键，但单克隆抗体和双抗体的恒定结构域中通常存在低比例的游离巯基。在碱性条件下，由于HC和LC之间的二硫键β消除，肽键水解可能导致铰链区的抗体片段化并形成不可还原的硫醚键。 据报道，许多IgG分子中存在不完全的二硫化物键形成，并已被证明会降低抗原结合亲和力和效力。未形成的二硫化物键，特别是由于额外的游离半胱氨酸，会导致抗体异质性、低热稳定性、聚集、低溶解度和低效力。 据证实，具有额外半胱氨酸的抗体，尤其是CDR中的抗体，可以半胱氨酸化。半蛋白酰化可能会扰乱抗体的结构稳定性，增加聚集，并最终对分子的生物功能产生不利影响。建议通过计算机分析鉴定多余的半胱氨酸，并将半胱氨酸突变为其他残基，以防止异质性和效力或稳定性丧失的风险。 三硫化物键通过将硫原子插入二硫化物键而形成，可以出现在所有IgG同种型中。三硫化物修饰主要发生在HC-LC和HC-HC链间连接中。具有三硫化物键的抗体会使其分子量增加32Da，并产生相对酸性的变体。三硫化物的水平会受到细胞培养条件和硫化氢浓度的影响。先前的研究表明，三硫化物键不影响抗体的抗原结合亲和力或热稳定性。 N端修饰 Gln/Glu的环化是一种主要的N端修饰，对抗体的结构、稳定性和功能没有显着影响。 Asn脱氨 Asn脱氨广泛发生在CDRs或Fc区域。每次Asn脱氨都会使抗体的质量增加1Da，并为抗体增加负电荷。Fc区域的Asn脱氨对抗原结合没有影响，在发现阶段不是一个问题。然而，CDR中的Asn脱氨可能会降低抗原结合亲和力，导致效力和疗效丧失。此外，Asn脱氨可能导致免疫原性。脱氨速率取决于pH值、Asn后残基的大小和柔韧性、温度和抗体的三级结构。pH8.0下的脱氨速率比pH5.5时快近40倍。常见的脱氨基序有Asn-Gly（NG）、Asn-Ser（NS）、Asn-Asn（NN）、Asn-Thr（NT）和Asn-His（NH）。先前的研究表明，NG和NS比其他基序更容易脱氨。因此，应通过蛋白质工程识别并可能去除CDR上的NG/NS基序。此外，即使Asn不在NG/NS基序中，柔性结构中的Asn也可能容易脱氨。脱氨引起的电荷异质性也可能影响抗体的稳定性和粘度。 Asp异构化 Asp异构化是抗体的另一种常见修饰。Asp异构化在肽主链中引入甲基，这可能会改变抗体的结构，当CDR中发生异构化时，会损害其抗原结合亲和力。此外，Asp异构化可能会改变蛋白水解的敏感性，并可能引发免疫原性。异构化速率与残留物在Asp、pH和温度之后的大小和柔韧性密切相关。先前发现的热点包括Asp-Gly（DG）、Asp-Ser（DS）、Asp-Asp（DD）、Asp-Thr（DT）和Asp-His（DH）。在这些典型基序中，DG和DS比其他基序更容易异构化。随着pH值的降低，异构化速率可能会加快。在发现阶段，有必要鉴定候选抗体CDR中的DG和DS基序，并尝试在不改变抗原结合的情况下去除基序。 糖基化 低聚糖可以引入Asn中产生N连接糖型，或引入Ser、Thr或Tyr的羟基生成O连接糖型。糖基化可能是异质的，会改变抗体的大小、功能和半衰期。在发现阶段，通常关注N-连接糖基化基序，而尚未确定O-连接糖基化基序。人IgG在Fc区的Asn297处有一个保守的N-糖基化位点，该位点参与效应器功能，如抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用，并可能通过与FcRn结合来影响抗体的半衰期。 大约20%的人IgG在可变区含有N-糖基化共有NXS/T基序（X指除脯氨酸以外的任何氨基酸残基），这可能会影响抗体与抗原的结合亲和力。每次糖基化都会使分子量增加1.5-4kDa，并导致尺寸异质性。一些聚糖，如唾液酸，可能会引起免疫原性。在已批准的抗体药物中，只有西妥昔单抗在可变区具有N-糖基化位点。在抗体发现阶段，去除可变区域的N-糖基化位点是一种一般做法。 氧化 氧化主要发生在Met和Trp残基暴露在光照下、与氧化试剂一起孵育或长期储存时。Fc区域中两个保守的Met残基（M252和M428）的氧化对抗原结合没有影响，但可能会降低热稳定性，诱导聚集，降低CDC活性，减少与FcRn的结合并缩短体内半衰期。相比之下，Trp残基通常存在于抗体CDR中，并且通常暴露于溶剂中。CDR中Trp的氧化可能导致抗原结合和抗体效力降低。应评估Trp在CDR中对氧化的敏感性，并需要开发适当的配方。 聚集体 聚集是生产治疗性抗体的CQA之一。蛋白质聚集的主要机制包括天然单体的结合、构象改变的单体的聚集、化学修饰单体的聚集、成核控制的聚集和表面诱导的聚集。 抗体的聚集可能导致免疫原性潜力增加和抗体候选者的生物学功能降低。抗体的聚集倾向主要与折叠稳定性和表面的疏水特性有关。折叠稳定性差与热稳定性低有关，这可能会增加疏水残留物暴露的概率，从而导致聚集。同时，抗体表面的疏水贴片可能导致抗体自相互作用。特别是，抗体聚集主要是由于蛋白质部分或瞬时展开导致的CDR或框架区中疏水区的分子间相互作用。如上所述，CDR中Trp的氧化和额外Cys的修饰也可能导致聚集倾向增加。单克隆抗体或双抗抗体上的极性带电贴片与分子间吸引力引起的聚集有关。 一些外在因素可能会诱导或减少抗体聚集。在低pH值下、超滤/浓缩步骤、物理应力、冻融循环后、与容器相互作用或长期储存后，可以加速候选抗体的聚集。 赋形剂可以作为一般的蛋白质稳定剂。在蔗糖存在下，表面积最小的蛋白质状态将在热力学上受到青睐；蔗糖可以通过驱动蛋白质进入致密的天然状态来稳定蛋白质。盐和缓冲液可以通过三种机制与蛋白质相互作用：改变各种侧链的电离焓、共溶剂排阻机制和电荷波动的德拜筛选。稳定盐通过优先排除机制，可以通过“盐析”蛋白质来最大限度地减少暴露于溶剂的蛋白质表面积。一些缓冲分子（磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液）与IgG的Fc结构域之间的特异性相互作用参与了热变性IgG的聚集倾向。 对于具有细长链的对称bsAb来说，聚集可能是一个主要问题。链伸长增加了bsAb的柔韧性和不均匀的电荷分布，并增强了分子内和分子间相互作用，从而导致聚集。 未完待续，继续阅读（下）第02部分…… 点击上方蓝字关注“梓树艺药荟”，@梓树ZiShu，获取学习资料。 经典系列阅读推荐： 1.梓树推荐 2.FDA官方课程 3.《生物制药CMC法规合规性》阅读笔记 4.《生物制药质量源于设计QbD》阅读笔记 5.《干细胞生产：过程、实践和监管》阅读笔记 6.《生物制药工艺：工艺开发、设计和实施》阅读笔记 7.《抗体-药物偶联物》阅读笔记 8.《生物制药生产工艺验证》阅读笔记 经典分享持续更新中……，敬请关注“梓树艺药荟“！ 邀您加入“艺药荟社群”交流学习! 备注：姓名+单位+方向 版权说明：本文欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权或其他合作需求，请联系梓树ZiShu（微信：Z07302256）。 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