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噬菌体展示技术是一种用途广泛且高效的平台，可用于鉴定和改造生物制剂。利用标准的分子生物学实验室技术，可以构建高度多样化且功能强大的抗体噬菌体展示库，并快速筛选出能够以极高的特异性和亲和力结合目标靶点的抗体片段。如何利用噬菌体展示技术开发抗体发现策略的关键方面，以获得可成功开发成治疗药物的分子，包括靶点验证、抗体设计目标以及噬菌体筛选实验的准备和执行注意事项。精心设计和实施筛选实验——无论靶点如何——都能最大程度地提高筛选出用于后续治疗药物开发的理想抗体片段的几率，因此这些原则可应用于任何新的发现项目。 介绍 从乔治·史密斯首次将肽展示在M13噬菌体表面的实验到他与格雷戈里·温特爵士于2018年因利用噬菌体展示技术设计抗体药物而共同荣获诺贝尔化学奖，这项技术已发展成为一种强大的方法，用于鉴定具有特定结合和功能特征的肽和抗体。随着近几十年来生物疗法的蓬勃发展，噬菌体展示技术已取代或补充了传统的杂交瘤融合技术，成为学术界和制药实验室中抗体发现的重要方法。数十种噬菌体衍生抗体进入临床开发阶段，也证明了该方法的成功。截至 2022年，已有 14 种抗体获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 和/或欧洲药品管理局 (EMA) 的批准，用于治疗多种疾病。 尽管噬菌体展示技术能够快速筛选出针对特定靶点的抗体结合物，但该方法仍存在一些必须考虑的局限性，并且在噬菌体筛选前后，先导化合物筛选流程中也需要考虑一些关键因素，以提高筛选成功率。这一点尤为重要，因为越来越多的学术研究人员正致力于在其转化研究项目中或与生物技术/制药公司合作中寻找治疗药物。事实上，鼓励学术药物研发的呼声日益高涨，但这些研究人员未必接受过设计和实施抗体发现策略的培训，而这种策略能够筛选出具有理想特性、可作为治疗药物的分子。 利用噬菌体展示技术开展抗体发现活动的一些主要考虑因素，包括：噬菌体文库的选择、淘选和筛选方法。这些考虑因素通常包括评估靶标特征、确定抗体设计目标以及创建先导化合物识别流程。此外，构建半合成文库的方案，该文库可作为特异性且可开发抗体的来源，用于治疗药物的研发。 抗体发现过程概述 在着手筛选治疗性抗体之前，了解高效筛选和表征具有所需结合和/或功能特性的分子所需的一般流程和工作流程至关重要。图1概述了这一流程；虽然每个步骤都可以在专门的综述中单独讨论，仅简要介绍每个步骤，并重点关注噬菌体展示技术在抗体发现中的应用。此外，着重介绍临床前开发和新药研究申请（IND）提交之前的早期阶段。 图1 抗体发现策略的制定。抗体发现和开发过程的主要准备阶段，以及每个阶段制定抗体发现策略时需要考虑的因素。详情请参阅正文。 抗体发现过程的第一步是制定策略，以分离具有所需功能特征的分子，最终将其开发成生物治疗药物。正如科学界常说的，“在办公桌前花一天时间规划实验，胜过在实验室里花两天时间做实验”。因此，制定计划以降低潜在风险并最大限度地提高成功率至关重要。首先，必须鉴定并验证某个分子是否为相关抗原，该抗原在被抗体靶向时，能够在体内产生治疗效果。简而言之，需要确定给定分子是否 (1) 与疾病相关，(2) 在细胞表面或体液中具有足够的表达，以及 (3) 可被抗体成药。换句话说，预期抗体药物能够在体内到达靶点并发挥治疗作用。靶点的鉴定和验证通常源于基础研究实验室产生的数据。例如，研究项目可能提示，某些肿瘤或自身免疫性疾病中存在此类分子的过度表达。基于这些初步信息，研究人员会生成一组针对该分子的概念验证特异性抗体，用于肿瘤细胞与正常细胞的表达谱分析，评估组织特异性，或确定抗体与靶点的结合是否会干扰蛋白质-蛋白质相互作用，从而导致信号级联改变并介导特定表型。在这种情况下，抗体发现过程可以在尚未完全阐明靶点生物学特性的情况下进行，因为抗体本身将有助于解答这些问题，从而验证该分子是否为可成药靶点。 下一步是靶点可行性评估（图1）。该过程包括分析靶点的特征，例如其类别（例如，可溶性蛋白、膜结合蛋白或多通道跨膜蛋白）、结构和翻译后修饰。例如，如果靶点是多通道跨膜蛋白，则在筛选过程中，应使用处于天然构象的蛋白片段作为选择剂，而不是使用无结构的线性肽片段，以识别能够识别该蛋白正确构象的抗体。此外，糖基化会显著影响抗体结合位点的可用性；因此，谨慎的做法是确定靶点上潜在的N-糖基化位点的数量，这可以通过PROSITE等计算机工具进行预测。如果目标是糖蛋白，并且通过重组技术生产用于抗体发现，那么在哺乳动物细胞中而不是在细菌中进行生产非常重要，以确保糖基化发生，并且分子的构象尽可能接近功能性天然蛋白质的构象。 确定靶点在人类中最接近的同源物以及相关物种（主要是啮齿类动物和非人灵长类动物 (NHP)）中的直系同源物也至关重要，这些直系同源物最终可用于体内疗效和安全性研究。了解人类靶点与其啮齿类动物和/或 NHP 直系同源物之间的相似性水平，将决定所鉴定的抗体与这些物种发生交叉反应的可能性。在疗效和安全性研究中使用的人类与相关物种（例如啮齿类动物和 NHP）之间通常需要具有交叉反应性，这样就不需要替代抗体。此外，如果某个靶点来自一个蛋白质家族，且该家族成员之间具有高度相似性，则可能需要在抗体筛选流程中加入反向筛选，以确保抗体的选择性，从而避免因靶向密切相关的分子而导致不必要的毒性。或者，将抗体生成工作集中在与同源物差异最大的蛋白质结构域上可能是明智之举，以提高鉴定靶向选择性单克隆抗体的机会。 一旦获得上述靶点信息，就应预先制定一套额外的成功标准，用于抗体发现和优化。这些标准包括但不限于基于细胞的检测和/或体外功能检测中的亲和力、同型和效价，以及疗效、安全性、药代动力学、药效学和可开发性。例如，如果预期作用机制（MOA）是破坏配体-受体相互作用，则可能需要高于配体与受体亲和力的亲和力。在某些情况下，这种亲和力应达到低皮摩尔范围。然而，如果目标仅仅是与膜结合蛋白结合，则低纳摩尔范围的亲和力可能就足够了。如果作用机制是阻断配体-受体相互作用，且不需要抗体依赖性细胞毒性（ADCC）等效应功能，则应考虑使用人源同型抗体，例如免疫球蛋白（Ig）G4 或 IgG2。另一方面，如果作用机制是通过 Fc 结合破坏肿瘤细胞，则 ADCC 是必需的，因此 IgG1 应为首选同型抗体。 就疗效而言，可以设定具体的基准，例如，在小鼠异种移植模型中，与现有针对该靶点的疗法相比，肿瘤体积的减少幅度达到或超过现有疗法的水平。根据预期疗法的产品特性，某些标准的重要性会高于其他标准。例如，如果最终产品是嵌合T细胞抗原受体（CAR-T）细胞，则抗体片段将在患者自身的细胞上表达，因此作为可溶性重组蛋白的生产性能并非主要考虑因素。相反，如果最终产品是IgG，则生产性能特性（例如生产细胞的高表达产量、在制剂缓冲液中的溶解度、最小或无聚集以及短期和长期稳定性）对于基于抗体的药物的开发至关重要。或者，目标可能是开发一种给药频率低于现有疗法的分子。在这种情况下，抗体的药代动力学是首要考虑因素。重要的是，在启动抗体发现项目之前，必须尽可能明确定义每一项抗体标准，并根据具体的抗体开发项目进行调整。在项目初期尽可能精确地制定抗体设计目标至关重要，因为这些目标将决定先导化合物筛选和优化工作的关键路径、临床前和临床开发的成本和时间安排，并最终决定项目的成功概率。 抗体设计目标中预先设定的标准允许我们构建先导化合物筛选流程，该流程适用于任何源自杂交瘤融合、B细胞分选序列回收或抗体噬菌体展示筛选的抗体（图2）。在确定筛选策略（例如靶标展示、浓度、淘选轮次和洗脱条件等）后，大多数筛选流程的第一步是使用可溶性重组蛋白或表达靶标的细胞进行一级结合试验。之后，可以对一级筛选结果进行筛选（或复筛），以检测其与相关物种同源蛋白的交叉反应性，用于疗效和/或安全性研究，以及与相关蛋白的交叉反应性，从而评估其选择性。二级筛选可以包括与内源性表达目标靶标的细胞结合，或在靶标敲除细胞中评估结合情况，以在更相关的生物学背景下确认其特异性。筛选出的候选化合物可被制成所需亚型的IgG，并用于筛选其功能，例如通过细胞实验阻断配体-受体相互作用或进行细胞中和试验。重要的是，在评估已展现出所需结合和功能特性的候选化合物的体外生物活性的同时，还应进行分子可开发性方面的初步评估，包括纯化后的单体含量、通过完整质谱法鉴定、热稳定性以及溶解度。 图2 抗体先导化合物筛选的通用流程。在基于噬菌体展示技术的抗体发现过程中，首先通过噬菌体淘选富集与靶标结合的多克隆抗体池，然后在初筛中筛选出单克隆抗体。这些抗体随后进入二级筛选，部分筛选出的抗体将进入体内试验、生物物理优化和工程改造阶段。在每个阶段，抗体的数量都会进行筛选，从数百或数千个抗体最终减少到几个。 对于那些已展现出所需功能和可开发性特征的先导化合物，可以考虑进行体内疗效研究。基于靶点生物学特性，选择与疾病相关的动物模型，并确定研究参数。如果与参考分子（如有）或预先设定的标准（如无基准）相比，观察到足够的体内效力，则先导化合物候选物可以进入优化阶段。此时，先导化合物的数量可能已从数百个减少到少数几个。先导化合物优化是一个独立的领域，通常包括对分子进行更全面的生物物理评估，并改进其亲和力、交叉反应性和选择性等性质；在生产平台（通常为CHO细胞）上的表达；在应激条件下的稳定性；以及在制剂缓冲液中的浓度。这些活动通常在学术研究机构或药物发现实验室之外进行，而是由生物技术或制药公司的特定专业团队完成。 有了明确的抗体发现策略和筛选流程，即可开始试剂和检测方法的制备。鉴定先导抗体的关键步骤是抗原和检测方法的质量控制（QC），而这在学术实验室中常常被忽视。所有用于淘选或筛选的重组蛋白都应通过SDS-PAGE分析和尺寸排阻色谱法评估其纯度。一个好的经验法则是纯度>90%且无明显聚集。进一步的质量控制可以包括通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或动力学方法（表面等离子共振、生物层干涉法）检测蛋白与其配体的结合情况，以确认抗原处于天然且相关的构象。其他质量控制还可以包括使用针对靶标的参考抗体进行ELISA或动力学评估。如果使用全细胞作为抗原进行噬菌体筛选，则必须通过流式细胞术评估抗原密度和靶标在细胞表面的相对表达水平。 噬菌体展示文库的构建与筛选用于治疗性单克隆抗体的鉴定 与所有抗体生成方法一样，各种噬菌体展示文库及其在抗体发现中的应用各有优缺点。噬菌体展示文库主要分为三种类型，如表1所示。完全天然文库是指捕获天然免疫库的文库，通常来自健康供体。这类文库的免疫库未针对任何特定靶点进行偏倚，仅包含供体在其一生中自然接触过的靶点。为了最大限度地提高多样性，通常的做法是增加文库构建中使用的供体数量，并使用能够完全捕获可变基因重排库的抗体基因扩增引物。如果采取谨慎的措施扩增这些基因片段，并进行多次连接/电穿孔反应，这些文库通常可以达到非常高的多样性，通常包含10⁹ - 10¹¹个独特的抗体序列克隆。值得注意的是，天然抗体库不依赖于任何特定免疫反应的产生，因此其优势在于可用于筛选针对多种靶点的抗体。这使得此类抗体库在治疗性抗体发现方面尤为吸引人，因为同一个抗体库可以针对各种目标抗原进行重复筛选，从而在实验室开展一系列发现项目时节省大量时间和成本。Xoma公司开发的抗体库就是此类抗体库的著名例子，该抗体库以Fab和单链可变区片段（scFv）的形式，从30名健康人类捐献者中生成。这些抗体库已使用数百个靶点进行筛选，产生了多种用于临床开发的治疗性抗体，并且自其建立以来已授权给多家生物技术公司使用。 表1 噬菌体展示文库的类型及其特征 尽管天然抗体库用途广泛，但其中的抗体通常需要额外的工程改造，因为抗体库并非在构建用于生产治疗性抗体的抗体库之前自然进化而来，因此抗体库的构建并未考虑单克隆抗体（mAb）开发的重要生物物理特性，例如热稳定性、在治疗所需（高）浓度下的溶解度以及在生产平台上的高表达产量。因此，源自天然抗体库的抗体可能需要进行亲和力成熟以提高亲和力，或采取其他措施来提高稳定性，因为这种成熟过程通常在体内B细胞成熟过程中发生，而天然抗体库中的抗体并非全部都经历了这一过程。 此外，免疫库是一种极具吸引力的噬菌体库类型，可用于发现（表1）。这些库在艾滋病或新冠肺炎等传染病中展现出巨大价值，在这些疾病中，个体自然感染病原体后，通过产生针对病原体的免疫反应而存活下来。然而，在癌症或自身免疫性疾病等无法对人类进行免疫的疾病中，免疫库的构建则使用来自动物（例如小鼠、鸡或羊驼）的材料，这些动物已用目标病原体进行免疫。免疫库中的抗体库更集中于针对免疫方案中所用靶标的特异性抗体，这使得抗体对原始免疫原具有更高的亲和力，因为亲和力成熟发生在体内。尽管亲和力更高，但如果抗体来源于非人源，则需要对免疫库衍生的抗体进行额外的下游工程改造，以最大限度地减少潜在的免疫原性问题，这一过程称为抗体人源化。制药/生物技术公司通常会在抗体工程或先导化合物优化团队中开展这些工作。然而，随着多种表达全人源免疫球蛋白库的转基因小鼠模型的出现，例如Alloy、OmniMouse、AlivaMab和VelocImmune小鼠，可以直接从啮齿动物免疫接种中获得人源抗体，其中许多模型已上市或可供授权使用。 第三种选择是使用合成或半合成文库（表1）。此类文库的设计多种多样，从人工构建的全抗体库（全合成文库）到仅在抗体片段的特定区域（例如互补决定区 (CDR)）引入天然多样性的半合成文库。全合成文库具有预先设计的支架，并通过PCR或克隆合成DNA片段，在CDR的某些位置引入人工变异。为了避免在随机片段中引入终止密码子导致无功能克隆，诸如HuCAL文库系列之类的合成文库采用三核苷酸诱变 (TRIM) 技术来产生多样性。根据文库的预期应用，可以通过在互补决定区（CDR）引入高多样性来控制多样性的程度，从而扩大筛选范围；也可以在抗原结合位点的特定残基上进行精细的多样性引入。合成文库的设计也可以以最终治疗产品为目标，从而选择已知稳定且具有理想生物物理特性的特定骨架。 半合成文库是一种用于构建多功能抗体发现文库的混合方法。这类文库利用了合成文库对骨架选择和特定残基变异的控制优势。然而，它也引入了互补决定区（CDR）的天然多样性；例如，重链的第三个CDR（HCDR3）通常（但不总是）是抗原相互作用结合位点中最重要的区域，并且由于该区域的高度多样性和灵活性，设计难度较大。以下详细描述了半合成文库的示例，并且本合集中包含了构建方案，例如 ALTHEA Gold Plus 文库、方案：半合成噬菌体展示文库构建：过滤文库的生成和方案：半合成噬菌体展示文库构建：单链可变片段二级文库的生成。 与天然抗体库类似，合成抗体库和半合成抗体库对于专注于抗体发现的实验室来说也是宝贵的资源，因为它们不局限于特定靶点，几乎可以用于筛选针对任何目标靶点的抗体。此外，这类抗体库无需依赖冗长的免疫方案和强烈的免疫反应即可鉴定抗体结合物。然而，尽管已有报道指出可以从合成抗体库和半合成抗体库中鉴定出高亲和力结合物，但某些抗体仍需要进行额外的改造才能达到所需的亲和力。 除了用于构建天然、合成或半合成抗体库的抗体库来源外，选择有利于目标发现流程和预期结果的抗体库特征也至关重要。这包括最适合正在开发的治疗模式的抗体片段形式。例如，如果最终目标分子是常规IgG，则Fab噬菌体展示文库可能更合适，因为它更接近治疗药物的最终形式。Fab通常比scFv更稳定，因为除了scFv的VH:VL界面外，Fab还通过CH:CL界面和C端二硫键稳定。然而，Fab文库的构建可能更困难，并且在大肠杆菌中的表达可能不如较小的scFv片段。不过，目前已有一些研究致力于优化scFv的构建。 文库的其他特征也必须经过仔细选择。对于scFv文库，选择合适的结构形式（VH-连接子-VL或VL-连接子-VH以及连接子（通常是柔性甘氨酸-丝氨酸重复序列）的性质，都会影响筛选结果。较长的连接子允许scFv自身折叠，促进单体形成；而较短的连接子则会导致两个scFv的VH和VL之间二聚化，从而形成双抗体。双抗体由于多个抗体片段与靶标相互作用，可能导致表观亲和力增加，这通常被称为亲和力效应，而这与IgG（最常见的最终治疗性抗体形式）的真实亲和力存在偏差。噬菌体载体的其他一些标准特征包括琥珀终止密码子，以便直接从噬菌体载体生产不含pIII片段的可溶性抗体，以及用于检测的标签。通常会选择6X-His、myc、HA或V5标签，但根据您要筛选的抗原上常见的标签，您可能需要避免使用其中一种或多种标签。例如，His标签对于通过镍或钴亲和柱纯化scFv以及使用抗His抗体的检测分析非常有用。然而，许多市售抗原都带有His标签，因此，带有His标签的scFv可能会不利于使用抗His检测抗体开发检测方法。 治疗性单克隆抗体发现的文库构建案例研究：ALTHEA GOLD PLUS 文库 ALTHEA Gold Plus 文库是 ALTHEA Gold 文库的升级版，Valadon 等人对此进行了详细描述。Almagro等人对 ALTHEA Gold 文库与过去十年文献中报道的最先进的抗体噬菌体展示文库进行了比较。这些文库包括 Xoma 公司开发的天然文库以及 Morphosis 公司开发的合成文库，例如 HuCAL Platinum和 Ylanthia，这些文库被大型制药和生物技术公司用作抗体发现平台。 ALTHEA Gold文库由两个scFv亚文库组成，这两个亚文库分别由合成的、已知的人类IGHV和IGKV种系基因构建而成，并结合了从大量健康人供体外周血单核细胞中获得的天然人类HCDR3/JH (H3J)片段。其中一个合成的IGHV基因（IGHV3-23）提供了一个通用的重链可变区(VH)支架，并与来自IGKV3-20和IGKV4-01基因的两个可变轻链(VL)支架配对，从而在抗原结合位点形成两种不同的拓扑结构，因此能够结合靶标上的不同表位。 除HCDR3外，这些文库中的所有CDR均经过合成多样化。合成VH和VL采用了一种策略性方法，即在已知抗原-抗体复合物结构中与抗原接触的特定位置对支架进行突变。这些已知抗原-抗体复合物结构在文库设计时已有数据（蛋白质数据库，https://www.rcsb.org/ ，收录了超过2000种抗体结构）。多样化策略包括使用在相应人类生殖系基因中这些位置上常见的高频率氨基酸，以及来自美国国家生物技术信息中心（NCBI ，https ://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和国际免疫遗传信息系统（ IMGT，https: //www.imgt.org）的超过60000个抗体序列。 除了ALTHEA Gold文库独特的结构设计外，其功能性、稳定性和多样性也通过三步构建过程得到提升（图3）。第一步，将多样化的支架与一组90个合成的中性H3J种系基因片段组合，生成全合成的初级文库（PL）。这些中性H3J片段作为“占位符”，避免单个H3J片段在后续文库构建步骤中可能造成的结构限制，从而防止最终文库序列多样性不足。 图 3 三步构建流程，用于生成高度多样化且功能丰富的半合成化合物库。 第二步构建步骤包括选择或筛选PL，其依据是金黄色葡萄球菌蛋白A或巨大消化链球菌蛋白L分别与人V H或V L 支架结合的天然能力。蛋白A结合人IGVH3基因家族成员的框架3，而蛋白L结合人IGKV1、IGKV3和IGKV4基因家族的框架1。蛋白A和蛋白L的这些特性已被广泛用于在变性或去稳定化条件下孵育后筛选折叠良好且稳定的抗体片段。然而，蛋白A或L的使用仅限于富集最终抗体库和/或在诱变后筛选变体以提高稳定性。在随附的实验方案中，我们使用蛋白L生成过滤文库（FLs）作为中间步骤，以富集具有良好折叠抗体片段的噬菌体展示文库（PLs）。该步骤在苛刻的孵育条件之后、用天然H3J片段替换中性H3J片段之前进行。在过滤过程中，与噬菌体颗粒融合的折叠良好的抗体片段会与蛋白L结合，而由于提前终止密码子导致的截短片段或由于插入和/或缺失导致的无功能片段则会被离心去除。这些无功能的抗体变体会削弱文库中功能性抗体片段的种类，导致性能下降，因此去除它们至关重要。 在第三步也是最后一步中，将FLs产生的稳定合成抗体片段与天然H3J片段结合，构建二级文库。由于大部分抗体多样性集中在HCDR3区域，天然H3J片段可以恢复过滤过程中丢失的多样性。此外，由于天然H3J片段在体内经历了选择压力以产生功能性抗体，因此将FLs产生的高度稳定的合成抗体片段与丰富的天然H3J片段相结合，可以构建出高度多样化、稳定且功能完善的文库，用于治疗性抗体的发现。 使用七个靶点对ALTHEA Gold文库进行验证，结果显示所有情况下均获得了特异性抗体。对分离得到的抗体进行进一步表征表明，其KD值与人IgG1分子相当，且在个位数和亚纳摩尔范围内。所有测试的Fab片段的热稳定性( T m )均在75°C至80°C之间，表明ALTHEA Gold文库是特异性强、亲和力高且稳定性高的抗体的宝贵来源。从这些文库中分离得到的几种靶点特异性抗体已进行了详细的表征，其中一种单克隆抗体甚至已进入I期临床试验。 ALTHEA Gold Plus Libraries 从 ALTHEA Gold Libraries 升级而来，新增了两个 V L骨架（IGKV1-39 和 IGKV3-11），使 scFv 半合成文库总数达到四个。这些新骨架提高了文库的结构多样性，有望生成更多样化的抗体。Mendoza -Salazar 等人近期发表了 ALTHEA Gold Plus Libraries 中使用的四个合成 V L骨架的应用和验证。在该研究中，这四个合成 V L文库被用作从感染严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) B.1.617.2 (Delta) 变异株的 2019 冠状病毒病 (COVID-19) 患者体内获得的免疫V H库的对应物。利用标准分子克隆技术，将ALTHEA文库中可变轻链的多样性与COVID-19康复患者的V H 受体库相结合。经过三轮SARS-CoV-2野生型（WT）受体结合域筛选后，获得了34个独特的scFv分子。其中一种名为IgG-A7的抗体能够高亲和力识别来自武汉-Hu-1（WT）、Delta和B.1.1.529（Omicron）毒株的SARS-CoV-2受体结合域。 IgG-A7在噬斑减少中和试验中也能中和三种SARS-CoV-2毒株，并且在5 mg/kg剂量下，能100%保护表达人血管紧张素转化酶2 (hACE2) 的K18-hACE2转基因小鼠免受野生型SARS-CoV-2感染（González-González等人，2022）。IgG-A7的开发潜力与已上市的治疗性抗体相当，这表明ALTHEA Gold Plus文库中使用的合成V L骨架具有生成高亲和力、功能性抗体的潜力，这些抗体有望成为开发抗体药物的先导化合物。 ALTHEA Gold Plus 文库的三个配套方案包括： 方案：半合成噬菌体展示文库构建：多样化单链可变片段的设计与合成及初级文库的构建；方案：半合成噬菌体展示文库构建：过滤文库的构建 方案：半合成噬菌体展示文库构建：单链可变片段二级文库的构建。 下面我们将讨论一些提高方案实施成功率的一般注意事项。 制定规划策略 遵循上述步骤后，即可构建符合您发现策略需求的抗体库，并启动发现活动。该过程的第一步是基于靶标的特性和可用试剂制定策略。例如，靶标的性质将对抗体设计目标产生重要影响。如果靶标或其相关片段能够以高质量重组蛋白的形式生产，并通过质控分析，则可提供一种直接有效的结合物鉴定方法。利用可溶性蛋白进行噬菌体淘选的最简单方法是固相淘选，即将靶抗原固定在聚苯乙烯表面，例如微孔板或免疫管上。然而，这种简单的淘选方法存在一个缺点，即蛋白质粘附在塑料表面可能会导致轻微的结构变化，从而使蛋白质的构象与溶液中的构象不同。这可能会影响功能性表位的构象或可用性，而这些表位对于获得具有所需功能特征的抗体至关重要。此外，在固相淘选过程中，与溶液中相比，附着在聚苯乙烯上的抗原量难以精确控制，因为只有一部分添加到孔/管中的蛋白质会粘附到板上并饱和可用表面。 另一种方法是在溶液中进行淘选，使用带有亲和标签（通常是生物素）的可溶性靶标进行捕获/固定。在这种淘选方法中，可以使用包被链霉亲和素的磁性纳米珠分离抗原-生物素偶联物，并将溶液中未结合的噬菌体与结合的噬菌体分离。该方法的双重优势在于：（1）可以控制磁珠捕获的蛋白质浓度（以及磁珠数量），这在筛选高亲和力抗体时尤为重要；（2）靶标在溶液中保持其天然构象，从而避免了固相淘选过程中可能发生的构象变化。然而，这种淘选方法的一个潜在问题是，由于抗原需要标记，生物素偶联可能会导致目标表位被阻断。不过，通常可以通过在抗原表达构建体上引入位点特异性生物素化标签（例如 AviTag）来避免这种情况，这样标记比例为 1:1，并且生物素化发生在不会破坏功能性表位完整性的区域。一些商业供应商为此目的提供 Avi 标签蛋白。 分离抗体最具挑战性的靶点包括负载特定肽段以生成TCR模拟抗体的MHC复合物、膜结合蛋白和离子通道。对于MHC-肽复合物，筛选合适的抗原以及确认淘选过程中鉴定出的抗体是否特异性针对与特定目标肽段结合的MHC均存在挑战。一种方法是使用生物素标记的肽-MHC抗原，已有文献报道了在细菌中生产此类复合物的成熟方法。Dao等人描述了两个利用噬菌体展示技术鉴定针对肽-MHC复合物的高特异性抗体的案例研究。 另一方面，膜蛋白难以以可溶形式表达，而且在某些情况下，这些蛋白暴露的外部表面是肽段，其构象依赖于嵌入膜中的蛋白，因此难以生产重组功能性蛋白片段。离子通道同样是众所周知的难以制备抗体的靶点，因为通常的目标是分离一种能够阻断通道功能的抗体，该阻断是通过抗体阻塞通道孔实现的。这通常意味着抗体可结合的“空间”很小，并且依赖于通道复合物以其天然的多聚体形式存在，理想情况下处于单一构象（孔开放或关闭）。在这种情况下，可以使用全细胞或膜组分进行筛选，或者使用负载目标离子通道的病毒样颗粒（VLP）、纳米盘或两性聚合物。两亲性聚合物由一种两亲性聚合物构成，该聚合物被设计成“带状”结构，将寡聚体限制在其天然的膜结合构象中，从而形成可溶性抗原，可用于筛选。类似地，纳米盘是由脂质双层和两亲性蛋白包裹的盘状复合物，也能限制膜蛋白的构象，使其适用于噬菌体筛选。然而，特异性可能是一个问题，因为离子通道的胞外和胞内部分都会暴露在噬菌体筛选混合物中。。 利用噬菌体展示技术分离针对难靶标抗体的另一种方法是基于细胞的淘选。在这种淘选方法中，噬菌体库直接与表达目标蛋白的细胞孵育。该方法的优势在于目标蛋白处于其天然构象和功能状态。然而，基于细胞的淘选方法的一个缺点是目标蛋白的表达水平可能不足，因此可能难以分离出与该蛋白结合的抗体。基于细胞的淘选方法的另一个主要困难是特异性，因为细胞表面除了目标蛋白外，还有许多其他蛋白会与库中的抗体竞争结合位点，从而抑制特异性结合抗体的富集。因此，首先使用不表达目标蛋白的细胞系去除噬菌体库中的非特异性结合抗体以及针对目标蛋白以外的其他蛋白的结合抗体至关重要。这一步骤称为减法或阴性选择，理想情况下应使用用于构建重组细胞系的细胞系进行，即未转染靶标的细胞系。或者，也可以交替使用可溶性抗原和表达靶标的细胞，以选择性地分离同时结合两者的抗体，并去除结合细胞表面无关靶标的噬菌体。 开展噬菌体淘选活动前的操作注意事项 构建噬菌体展示文库后，必须将其储存在能够维持其多样性的条件下。文库可以以纯化病毒颗粒的形式储存，也可以以冷冻细菌原液的形式储存。后者需要进行培养，并用辅助噬菌体感染才能扩增表达抗体的病毒颗粒。如果文库以噬菌体原液的形式储存，则应将其与50% (v/v) 的甘油混合，并储存在-80°C，且不应经历多次冻融循环。需要注意的是，这样做并非为了保护噬菌体病毒颗粒本身（它们相当稳定且具有抵抗力），而是为了最大限度地减少表达在噬菌体表面的抗体片段的不可逆展开和/或被源自原始细菌培养物的痕量蛋白水解酶降解。这两个过程都会导致筛选过程中噬菌体库多样性的显著损失，但不会反映在噬菌体库的滴度上，因为无论是否展示抗体，噬菌体颗粒仍然具有感染性。为了避免因抗体片段展开和降解而导致库多样性损失，通常的做法是避免大量制备噬菌体原液，并尽可能使用从细菌原液中新鲜扩增的噬菌体库作为第一轮筛选的起始原料。当然，每次启动新项目时都制备噬菌体库既耗时又耗费资源，因此必须根据特定实验室的需求，在预先准备好噬菌体原液和在筛选项目开始前进行制备之间找到合适的平衡点。值得注意的是，从现有的噬菌体库中扩增文库并非理想之选，因为这种做法会引入某些克隆的扩增偏差，这是某些克隆（特别是具有缺陷抗体片段或完全没有展示融合蛋白的噬菌体）相对于其他可能表达有价值抗体的克隆的生长优势的意外后果，这可能会对文库多样性产生不利影响。 噬菌体展示筛选实验所需的设备和试剂相对标准，通常在进行分子生物学和生物化学常规实验的实验室中都能找到。尽管如此，为了高效地进行多轮噬菌体筛选，仍需做好几个准备步骤。这类似于厨师的“mise-en-place”（一切就绪）理念。其核心在于，在开始烹饪（或在本例中，进行噬菌体筛选）之前，确保所有食材都已准备就绪。务必确保所有仪器运转正常，例如离心机、细菌摇床培养箱、分光光度计等；同时，所有试剂，包括高质量抗原、辅助噬菌体原液、培养基和缓冲液，都已准备就绪且供应充足。实验台和移液器应使用10% (v/v) 的漂白剂进行消毒，尤其是在需要同时进行多轮筛选的情况下；此外，建议使用一次性无菌塑料制品，而非可重复使用的制品。 筛选轮次的时间管理是另一个重要的考虑因素。根据方案的不同，单轮筛选可以在1天内完成，也可以分2天完成。在1天完成的方案中，筛选完成后，将洗脱的噬菌体在细菌培养物中过夜扩增，第二天新鲜收集用于下一轮筛选。按照这种方案，一个筛选周期可以在1周内完成。然而，如果在后续的筛选轮次中，洗脱液或扩增后的洗脱液出现任何问题，则可能需要从头开始（第一轮），因为没有“备用”的噬菌体。另一种方法是分2天进行，将洗脱的噬菌体感染细菌培养物，然后涂布在固体培养基上过夜培养。第二天，可以从琼脂平板上刮取菌落，培养至对数生长期，用于辅助噬菌体感染和噬菌体生产。这种方法有三方面的优势：(1) 将洗脱液涂布到固体培养基上，可以让生长较慢的克隆“赶上”那些在液体培养基中生长速度更快的克隆，从而可能增加洗脱噬菌体库的多样性；(2) 可以同时测定该轮淘选的产量，或者观察细菌密度，从而评估淘选的进展情况；(3) 可以将平板刮取的菌落保存在甘油菌种库中，以保存每一轮淘选的菌种。这些细菌甘油菌种库可用于扩增该轮淘选的噬菌体，以便重复淘选、使用不同的抗原进行淘选，或者从该轮淘选的菌落中分离单个菌落进行单克隆筛选。 在淘选过程中，避免污染至关重要，尤其是在使用辅助噬菌体时。由于辅助噬菌体、噬菌粒和表达F菌毛的大肠杆菌具有感染性，如果用于洗脱液扩增的细菌培养物首先被辅助噬菌体感染，则这些细菌细胞将被认为对噬菌粒病毒感染具有免疫力，这可能导致淘选失败。此外，如果同时进行多个淘选实验，避免交叉污染也十分重要。避免污染的最佳方法是遵循良好的实验室操作规范，包括使用带滤芯的移液器吸头和一次性塑料培养皿，并经常使用新鲜配制的10%（v/v）漂白剂对表面进行消毒。 分离目标抗体的技术考量 无论采用何种淘选方法，例如固相淘选、溶液淘选或基于细胞的选择，都必须将抗体设计的总体目标纳入淘选方案中。例如，如果需要与靶标的小鼠或非人灵长类动物（NHP）同源蛋白发生交叉反应，则可以将这些靶标交替加入到不同的筛选轮次中，以富集识别物种间共有表位的结合物。相反，如果需要选择性，并且靶蛋白家族中存在特定的亚型、旁系同源蛋白或相关蛋白，则可以在每一轮淘选开始时添加一个去除步骤，以从噬菌体文库中去除与不需要的靶标发生交叉反应的结合物。 除了靶标选择之外，还可以采取其他措施来分离目标抗体。例如，如果需要更高亲和力的抗体，可以在每一轮淘选过程中逐步降低靶标浓度，通常每轮降低5到10倍。最简便的方法是溶液淘选，因为溶液淘选可以严格控制靶标浓度。随着每一轮淘选过程中噬菌体库中靶标结合物的富集，降低抗原浓度会在溶液中产生竞争，高亲和力抗体能够保持结合能力，并胜过低亲和力抗体，从而获得更高的抗原结合位点。 另一种筛选高亲和力抗体的方法是逐步增加连续淘选轮次的洗涤强度；例如，第一轮洗涤10次，第二轮洗涤15次，第三轮洗涤20次。在洗涤缓冲液中添加Tween等去污剂有助于减少噬菌体与靶标之间的非特异性相互作用，从而有助于分离目标抗体。延长洗涤缓冲液的孵育时间也可以提高洗涤强度。这将筛选出解离速率较慢的抗体，从而去除解离常数较低的结合物。在基于噬菌体的亲和力成熟实验中，洗涤时间通常会延长至2小时甚至过夜，以筛选出最高亲和力的克隆。此外，还可以在过夜孵育期间添加过量的非生物素化靶标，以抑制与靶标结合的低亲和力结合物。最后，还应考虑到洗脱方法会影响分离克隆的特异性。与使用极端pH值（例如Tris-甘氨酸pH 2.2或三乙胺pH 10）的通用非特异性洗脱方法（这些方法会不加选择地破坏抗原-抗体相互作用）不同，可以采用更具针对性的竞争性洗脱。在这种洗脱策略中，可以在噬菌体池中添加非生物素化的靶标或已知的活性抗体，以竞争噬菌体展示的抗体。通过这种方法，只有靶标或表位特异性克隆才能从噬菌体-磁珠复合物中洗脱出来。 尽管亲和力对许多治疗性抗体项目至关重要，但在某些情况下，获得能够结合正确表位以实现预期功能的抗体才是关键。事实上，筛选出多样化的抗体库通常比获得少数高亲和力结合抗体更为重要。功能性抗体的动力学可以通过亲和力成熟策略来改善，但如果高亲和力抗体不能结合正确的表位，就无法将其改造为功能性抗体。因此，发现策略的初始目标应集中于筛选能够识别尽可能多的表位的抗体，以提高靶向正确功能性表位的概率，从而将其用于概念验证研究或作为进一步优化的底物。在这种情况下，可以相应地调整淘选条件。为了分离出更多样化的抗体库，第一轮淘选的筛选条件至关重要，因为这些克隆将进入后续的筛选轮次。如果第一轮筛选条件过于严格，多样性将受到显著影响。为避免上述陷阱，第一轮筛选可采用较高浓度的抗原和最少的洗涤次数，以避免丢弃亲和力较低但可能具有功能的结合物。此外，可减少淘选轮次，以避免在后续轮次中出现克隆选择/过度扩增。然而，需要注意的是，任何筛选活动中分离出的抗体多样性均受限于来源文库，因此，精心构建高度多样化且功能完善的文库对于成功的发现活动至关重要。 结论 在治疗性抗体发现过程中，需要考虑诸多变量，这些变量必须在先导化合物筛选之前和筛选过程中加以考虑，以提高成功率。也就是说，一旦抗体发现实验室建立了精简的标准方案、流程和试剂（例如，蛋白质/抗体生产和质量控制能力、经过验证的天然噬菌体展示文库或免疫文库构建方案以及高通量筛选方法），即可高效地开展抗体发现活动，快速筛选出用于后续表征的候选抗体。该工作流程中最关键的部分包括：(1) 作为结合物来源的抗体噬菌体展示文库，因为它对回收抗体的序列多样性和质量影响最大；(2) 试剂的质量，特别是靶标的质量，因为它们决定了是否筛选到了正确的构象/功能；(3) 经过验证的检测方法，用于指导选择最佳克隆，以推进后续的发现和优化工作。此外，筛选过程中的基本步骤，例如结合、洗涤、洗脱和噬菌体扩增，通常在不同的抗体发现项目中保持一致，但筛选方案的细微变化都可能显著影响筛选结果，因此仔细记录实验差异至关重要。利用以往抗体发现项目的信息也有助于推进项目进展。然而，最终，筛选项目的成功往往取决于经验。最好尝试采用成熟的筛选方法和创新的筛选方法，以获得多样化的抗体序列库以供进一步测试，因为最终会从数百种抗体中筛选出少数几个候选抗体，用于全面的临床前开发。 总之，以下几点将为基于噬菌体的先导化合物筛选方法的成功奠定基础。首先，明确抗体设计目标。其次，文库来源和构建方法对序列多样性和实用性影响最大，因此应精心选择或构建最符合项目抗体设计目标的文库。第三，对所有试剂进行严格的质量控制评估。最后，设计并实施文库筛选策略和方法，以最大限度地提高富集具有所需靶标结合和功能特性的抗体的概率。 联系我们： 西安迈博睿生物科技有限公司致力于一站式的CRO技术开发，包括：抗体定制开发、重组蛋白定制、生物偶联、检测方法开发、科研项目整包等服务。 公司名称(中):  西安迈博睿生物科技有限公司 公司名称(英):  Mabioway Biotech Co., Ltd. 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