Rose Bengal disodium

编辑：丹青 肿瘤是一类因细胞异常增殖并脱离正常生长调控而形成的疾病。按生物学行为可分为良性与恶性。良性肿瘤生长缓慢、界限清楚、罕见浸润；而恶性肿瘤增殖指数高、具浸润破坏与远处转移倾向，即使依循现有指南进行规范治疗复发率仍偏高[1]。近年来，国内外在癌症研究领域取得了显著进展，包括癌症筛查技术、中医药辅助治疗、免疫治疗及靶向治疗药物、液体活检技术，以及利用人工智能及大数据进行早期检测与精准治疗[2-5]，这些进步显著改善了患者的临床获益。然而，对于晚期或产生耐药性的患者群体，现有治疗策略的局限性依然突出。因此，寻找新型抗肿瘤药物及其作用靶点成为研究的核心问题。在此背景下，源于天然产物及传统药用植物的活性成分凭借其独特的结构多样性和潜在的临床安全性优势已成为抗肿瘤药物研发的重要来源。 芦荟为多年生常绿肉质草本植物，主要品种包括库拉索芦荟Aloe barbadensis Miller、中华芦荟A. vera L. var. chinensis (Haw.) Berger、木立芦荟A. arborescens Miller及好望角芦荟A. ferox Miller等。其原产于非洲，现广泛分布于热带及亚热带地区[6]。有关芦荟应用的最早文字记录可追溯到公元前1550年的古埃及医学文献《埃贝尔草纸》，其中记载被用于治疗腹泻、眼病等多种疾病[7]。此后，芦荟沿丝绸之路逐渐传入中国，最早的文字记载见于隋末唐初的《药性论》，在《海药本草》与《开宝本草》等多部古籍中也有详细记载[8]。 芦荟的活性物质主要存在于3个部位：叶片内部的透明凝胶、外部的绿色表皮以及切口处渗出的苦黄色黏液[9]。这些部位富含蒽醌类、黄酮类、多糖类、生物碱等多种功能成分（表1），这些成分可单独或协同作用于多个肿瘤相关靶点，具有良好的生物活性[11]。自古以来，芦荟被广泛用于治疗烧伤、割伤、虫咬、湿疹等各种皮肤损伤；此外，芦荟还因其抗炎、抗菌及促进伤口愈合的特性，被用于缓解消化系统不适[12]。近年来，芦荟因其丰富的天然活性成分、显著的药理活性及较低的不良反应，被认为是极具潜力的抗肿瘤天然药物来源之一[13]。与传统化疗药物相比，芦荟提取物在抑癌同时往往对正常细胞毒性较小，有望减轻治疗过程中的不良反应。芦荟中主要抗肿瘤成分为蒽醌类化合物，包括芦荟大黄素（aloe-emodin，AE）、大黄素（emodin）、芦荟苷（aloin）等[14]。其中，AE由于能够通过多种机制抑制癌细胞的增殖和诱导其凋亡而成为研究热点。在当前肿瘤治疗研究中，AE不仅展现出广谱的抗癌活性，还因其天然来源、不良反应少而被视为潜在的辅助或替代治疗药物。 AE是一种主要源于芦荟、大黄等中药中的天然蒽醌类化合物，已有研究证实，AE具有多种生物活性，如皮肤修复、抗菌、抗氧化、抗病毒等，尤其在抗肿瘤领域展现出显著的潜力[15]。值得注意的是，蒽醌类化合物对特定类型癌细胞表现出选择性抑制效应，使其成为新型抗癌药物开发的候选成分[16]。目前全球研究趋势显示，AE的研究重点正从单一的表型观察向深层的分子机制解析转变，同时，基于纳米技术和结构修饰的新型给药系统正成为突破其临床转化瓶颈的关键方向[17-20]。尽管已有研究初步揭示了AE的抗肿瘤作用机制，但仍存在明显不足，机制研究多集中于凋亡通路，而对免疫微环境调控、铁死亡、自噬等新兴机制缺乏系统阐释。同时，AE结构修饰与其药效提升之间的构效关系尚未明确，严重限制了其临床转化进程[21]。本文系统阐释AE及其衍生物的多靶点抗肿瘤机制，重点梳理了蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等关键信号通路及相关表型调控的实验证据，并总结了通过结构修饰、金属配合物构建与纳米递送策略对其溶解性、稳定性及体内分布等药剂学特性的改良成效。进一步探讨上述剂型优化在协同增效方面的潜力，结合联合用药效果，综述AE与化疗、内分泌治疗等方案联用所呈现的协同抗肿瘤效应。最后，基于现有临床前研究，从转化医学角度展望了AE在机制探索与剂型优化方面的未来方向与应用前景。 1  AE对抗肿瘤信号通路的调控作用 1.1  诱导肿瘤细胞自噬与凋亡 细胞凋亡是由基因精密调控的程序性死亡过程，对维持机体稳态至关重要[22]。研究表明，蒽醌类化合物能够抑制肿瘤细胞的增殖过程并诱导其凋亡，其中以AE为代表的蒽醌类化合物在诱导细胞凋亡中发挥着重要作用，例如，在非小细胞肺癌模型中，AE可以通过调节Akt/mTOR与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路，同时诱导自噬与凋亡的发生[23-24]，从而增强其对肿瘤细胞的毒性作用。 1.1.1  抑制Akt/mTOR通路诱导自噬 Akt/mTOR信号通路作为调控细胞代谢、增殖与存活的核心通路之一，其异常激活与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明，AE能够抑制该通路中Akt的磷酸化过程，进而有效降低其下游关键因子mTOR的活性[25]。mTOR作为调控细胞生长和自噬的重要节点，AE对其的抑制可解除肿瘤细胞的自噬抑制，从而激活自噬机制，最终导致细胞自我降解与死亡。Shen等[23]研究发现AE以剂量和时间相关的方式降低了非小细胞肺癌A549与NCI-H1299的活性，能够通过抑制Akt/mTOR信号通路与激活MAPK信号通路，协同诱导非小细胞肺癌细胞发生自噬与凋亡，从而抑制其生长。值得注意的是，这一机制同样在蒽醌化合物大黄素中得到了佐证。例如，Zhang等[26]通过MTT法、流式细胞术等方法分析大黄素对非小细胞肺癌细胞系的敏感性、周期性及凋亡情况，发现大黄素在非小细胞肺癌细胞系中显著抑制Akt/mTOR的活性，进而在体内外实验中均表现出对非小细胞肺癌细胞增殖的明显抑制，且对正常肺细胞系的毒性较低，显示出良好的选择性，该结果提示，AE可能通过类似的Akt/mTOR调控机制发挥抗肿瘤效应。综上所述，AE对Akt/mTOR通路的抑制是其诱导线粒体自噬、抑制肿瘤细胞增殖的重要分子机制之一。 1.1.2  调控MAPK通路诱导肿瘤细胞凋亡 MAPK信号通路在细胞响应胞外信号过程中发挥核心调控功能，调控着包括生长、分化与凋亡在内的多种生命活动。AE能够特异性激活MAPK通路中与应激诱导凋亡密切相关的2个分支，p38 MAPK与c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）[27-28]。在p38 MAPK激活后，其可促进促凋亡蛋白表达上调及抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表达下调，从而诱导线粒体通路介导的细胞凋亡过程。与此同时，JNK的激活能够进一步通过调控下游凋亡相关基因，增强整体凋亡信号传导。这一机制在结肠癌细胞研究中得到证实，Jiang等[29]通过MTT法和细胞集落形成实验，发现AE在结肠癌HCT116细胞中呈剂量与时间相关的抑制增殖作用，并伴随G0/ G1期阻滞；AE上调Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、下调Bcl-2，诱导线粒体细胞色素C向胞质转位，继而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（cysteine-aspartic protease-9，Caspase-9）、Caspase-3，提示其主要经线粒体途径介导凋亡，基于网络药理学的整合分析，发现AE与结肠癌交集靶点在京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集中涉及包括MAPK在内的多条肿瘤相关通路，提示AE可能通过调控MAPK轴影响上述线粒体凋亡进程。在雌激素受体α阳性的乳腺癌MCF-7细胞中，Tseng等[30]证实了AE与他莫昔芬联用72 h可下调大鼠肉瘤病毒癌基因与细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2），并显著抑制ERK1/2及磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/mTOR的磷酸化；与此同时，线粒体膜电位进一步丧失， Bcl-xL水平下调，Bcl-2相互作用细胞死亡介导因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）及Bax水平上调，Caspase-7与多聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶［poly (ADP-ribose) polymerase，PARP］含量增加，提示线粒体通路介导的凋亡被增强且细胞周期分布未见显著变化。上述结果表明，AE通过调控MAPK通路并联动抑制PI3K/mTOR通路，从而达到抗肿瘤作用。 1.2  多通路调控抑制肿瘤细胞增殖 AE作为一种源自蒽醌类的中药单体，已经被众多研究证明具有抗肿瘤的潜力。在细胞识别与内化方面，Pecere等[31]通过基因沉默、受体竞争及分子模型实验，证明AE可特异性经由生长抑素受体2（somatostatin receptor type 2，SSTR2）与SSTR5进入肿瘤细胞，提示其具备受体靶向作用的潜力。在调控细胞死亡方面，AE能显著影响线粒体功能，诱导线粒体途径的细胞凋亡，从而显著削弱肿瘤细胞的存活能力[32]。AE还能干预肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）发挥其抗肿瘤效应，该通路在细胞凋亡、炎症反应与免疫调节中起着关键作用，AE可以通过调控TNF信号通路中的关键分子，减少炎症因子的释放，从而抑制肿瘤增殖[33-34]。Zhao等[35]研究发现AE通过激活p90RSK（核糖体S6激酶）来减弱齐多夫定诱导的心肌细胞凋亡，进一步表明其调控细胞存活的能力。在鼻咽癌模型中，AE通过激活Caspase-8介导的线粒体通路诱导细胞凋亡[36]。Li等[37]也报道AE以剂量相关的方式抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移，诱导Caspase依赖性细胞死亡，从而引起线粒体功能障碍与细胞焦亡。综上所述，AE能够通过调节包括受体识别、线粒体凋亡、TNF信号传导在内的多条通路，在多个层面抑制肿瘤细胞的增殖与存活，展现出多靶点作用的特性。 2  AE对肿瘤侵袭与转移的抑制 2.1  抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）介导的肿瘤细胞侵袭 MMPs是一类依赖金属离子的蛋白水解酶，在肿瘤侵袭与转移中扮演关键角色，其主要通过降解细胞外基质和基底膜来为癌细胞迁移提供路径[38]。在众多MMPs亚型中，MMP-2与MMP-9的研究较为深入，二者与肿瘤细胞的侵袭、迁移及血管生成过程密切相关。研究表明，AE能有效抑制上述过程。例如，Chen等[39]研究发现，AE对人类舌癌细胞SCC-4的侵袭和转移具有显著的抑制作用，其机制在于下调MMP-2的蛋白表达与活性，并抑制MMP-9的基因转录，进而有效减缓癌细胞的迁移和侵袭能力。Abdellatef等[40]在乳腺癌模型中证实，AE通过抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路[41]，降低包括MMP-2和MMP-9在内的多种基质金属蛋白酶的表达与活性，进而有效抑制乳腺癌细胞的侵袭与转移潜能。由此可知，AE可以通过下调MMP-2与MMP-9的表达与功能，抑制肿瘤细胞的侵袭与转移。 2.2  调控NF-κB与p53通路促进肿瘤细胞凋亡 NF-κB是一种重要的转录因子，参与调控细胞增殖、炎症反应、免疫调节与细胞存活等多种过程，其在多种肿瘤中常处于持续激活状态，通过上调抗凋亡蛋白促进肿瘤细胞存活[42]。NF-κB亦是一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）表达的重要调控通路，特别是对诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的调控，NO由NOS催化合成，NOS包括神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）与iNOS 3类[43]。iNOS在肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞中高度表达，构成炎症与肿瘤之间的关键连接。iNOS催化产生的NO在肿瘤中呈现浓度相关性双重作用：高浓度NO可诱导DNA损伤和线粒体功能障碍，进而激活p53等通路促进凋亡；而低浓度NO则主要促进血管生成，利于肿瘤生长[44]。TP53基因在该过程中发挥关键抑癌作用，其编码的肿瘤抑制蛋白p53可激活Bax、p53上调凋亡调控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）、佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1（phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1，NOXA）等促凋亡基因，诱导线粒体通路介导的细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖与存活[45]。然而，AE激活p53通路的效应具有组织特异性。虽然在肿瘤细胞中有助于诱导凋亡，但Quan等[46]在斑马鱼模型中发现，AE引起正常肝细胞凋亡和肝毒性也与NF-κB及p53通路的过度激活有关，提示在利用p53通路抗癌的同时，必须关注其对正常肝组织的潜在损伤。此外，在前列腺癌细胞中，Tran等[47]使用前列腺癌LNCaP细胞探究AE抗癌作用的机制，发现AE能够通过激活转录因子p53蛋白诱导LNCaP细胞凋亡。由此可知，AE通过激活NF-κB和p53通路，表现出显著的炎症调控和促凋亡作用，可诱导NO合成并引发细胞凋亡。综上所述，AE通过激活NF-κB和p53通路，展现出显著的炎症调控与促凋亡潜力，但其可能引发的毒性反应也提示在后续的抗肿瘤研究中需对其疗效与安全性进行系统评估。 3  AE调控氧化应激与诱导铁死亡的抗肿瘤作用与癌种特异性分析 3.1  调控氧化应激与诱导铁死亡 3.1.1  调控氧化应激抑制肿瘤细胞 氧化应激是由于体内自由基与活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生或抗氧化防御系统减弱所致的一种状态[48]，也是引起人类癌症、衰老、炎症的重要因素[49]。研究发现，蒽醌类化合物具有强大的自由基清除能力，AE能够有效清除多种自由基，包括超氧自由基、羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基，因此表现出较好的抗氧化活性[50]，其中酚羟基结构是抗氧化功能的关键，能够直接与自由基反应终止自由基链式反应。值得注意的是，AE在肿瘤细胞内可发挥促氧化效应，通过插入DNA干扰转录与复制过程，并改变细胞内ROS水平，进而引发氧化应激并导致肿瘤细胞损伤[51]。Baldassari等[52]采用靶向与非靶向代谢组学分析结合细胞能量代谢分析系统检测，评估了大黄素及AE对具有不同代谢表型的人类黑色素瘤细胞系增殖和代谢途径的影响，发现二者可干扰葡萄糖代谢、降低三羧酸循环中间产物，并诱导线粒体ROS大量积累，最终通过氧化应激与氧化还原失衡机制抑制黑色素瘤细胞增殖。这些发现揭示了AE在调节氧化还原平衡中的双重角色，既可作为外源性抗氧化剂，又能在肿瘤细胞内引发促氧化应激，为其在抗癌治疗中的潜在应用提供了理论依据。 3.1.2  调控铁死亡抑制肿瘤细胞 铁死亡是一种依赖细胞内铁离子与活性氧失衡所触发的受调控细胞死亡形式[53]，该过程涉及铁代谢、脂质代谢及氧化应激相关基因与蛋白的调控，能够引起细胞自噬，从而影响肿瘤细胞的生长和存活[54]。该概念最初由Dixon等[55]系统阐述，指出铁死亡是由特定小分子诱导并依赖细胞内铁参与而引发的死亡表型。Zhou等[56]进一步指出，铁死亡在肿瘤调控中具有多面性：如肿瘤抑制蛋白p53可通过抑制胱氨酸转运体（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）的表达，诱导肿瘤细胞发生铁死亡[57]；而核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号通路能够通过上调铁死亡防御基因来增强癌细胞的存活能力[58]。在相关实验研究中，Wu等[59]通过将红细胞膜、铁蛋白与AE结合，构建了一种兼具铁死亡和光动力治疗的协同抗肿瘤仿生纳米晶体，发现该纳米粒在舌鳞癌肿瘤细胞中能够同时激活光动力治疗与铁死亡，达到抑制肿瘤增殖作用。在癌症相关治疗肾损伤中，Dai等[60]发现AE可通过激活Nrf2通路，上调其下游抗氧化/抗铁死亡基因谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）表达，抑制氧化应激与铁死亡，从而显著减轻顺铂诱导的急性肾损伤，为后续AE临床转化与联合用药研究奠定了科学基础。He等[61]发现AE能够激活p21介导的细胞衰老，进而抑制人前列腺癌LNCaP细胞的增殖。Yang等[62]开发了AE与Mn2+配位形成的新型纳米药物［Mn(II)-aloe-emodin polymeric nanoparticles，MAPNPs］，该体系在非小细胞肺癌肿瘤微环境中可降解生成Mn2+与AE，Mn2+与H2O2反应生成Mn4+，后者可被谷胱甘肽（glutathione，GSH）还原为Mn2+，形成自循环催化过程，持续消耗GSH并产生大量ROS。同时，AE通过抑制Nrf2活性及降低细胞内GSH水平，与Mn2+发挥协同抗肿瘤作用。该循环反应不仅持续产生高细胞毒性的羟基自由基，更重要的是导致了细胞内GSH的快速耗竭，使得GPX4失去还原辅因子，从而导致脂质过氧化物的致死性积累，触发铁死亡。此外，在非肿瘤模型的研究中，He等[63]通过MTT检测法评估了H9c2心肌细胞中铁死亡的抑制情况以及对心脏毒性的保护作用，发现AE及其二价铁复合物能够激活Nrf2增加其下游抗氧化基因SLC7A11和GPX4的表达，减轻阿霉素诱导的H9c2细胞的氧化应激，该证据虽源于心肌细胞，但同样提示了AE具备调控铁死亡关键防御系统的分子潜力，值得在肿瘤细胞中进一步确证。这些研究共同提示，AE能够通过调控Nrf2等相关因子影响铁死亡过程，进而发挥其对肿瘤细胞的抑制作用。 3.2  在不同癌种中的作用机制差异性分析 尽管AE表现出广谱的抗肿瘤活性，但系统梳理文献分析发现，其在不同组织来源的肿瘤中，核心调控网络呈现出显著的差异性与特异性。例如，①在常见实体瘤中，AE主要通过调控经典的生存与增殖通路。在非小细胞肺癌中，AE通过抑制Akt/mTOR信号并激活MAPK通路，从而诱导肿瘤细胞自噬与凋亡；AE与Mn2+制得的新型纳米制剂被证实可通过抑制Nrf2-GPX4轴、耗竭GSH，并协同抑制肿瘤增殖。而在结肠癌中，AE则通过线粒体途径，通过上调Bax/Bcl-2并激活Caspase级联反应来诱导凋亡。这表明在这些增殖代谢旺盛的实体瘤中，AE核心作用在于干扰基础能量代谢与生存信号[23,29,62]。②在激素依赖性肿瘤中，AE展现出对激素受体或特定转录因子的靶向能力。例如，在ER阳性乳腺癌中，AE通过沉默Notch调节的锚蛋白重复蛋白（Notch-regulated ankyrin repeat protein，NRARP）基因及诱导细胞衰老，特异性增强他莫昔芬的细胞毒性。而在前列腺癌中，则聚焦于激活p53信号通路并抑制mTORC2复合物，提示其可能干预激素非依赖性转化关键节点[25,64]。③在病毒相关性肿瘤与难治性脑瘤中，AE表现出独特的分子靶点。在人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）相关的宫颈癌中，AE特异性抑制致癌基因E6/E7表达，这显著区别于其他癌种。在胶质母细胞瘤中，AE能够突破血脑屏障，通过下调O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的表达并抑制NF-κB p65/p50亚基，从而克服替莫唑胺耐药性，以及已被证实的铁死亡调控潜能（Nrf2-GPX4轴调节和GSH耗竭等）[20,60,65]。综上所述，AE的抗肿瘤机制并非单一模式，而是基于肿瘤遗传背景与病理特征，在广谱抑制与精准靶向之间形成动态调控网络（表2）。 4  AE抗肿瘤应用的策略优化与临床转化研究 4.1  在特定病理状态下的抗肿瘤作用 4.1.1  AE在高血压相关肾癌中的抗肿瘤作用 高血压是动脉血压持续高于正常值的临床综合征，是肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）公认的风险因素之一。最新统计，全球每年约有40.3万新发RCC病例，并导致约17.5万人死亡[66]。其致病机制可能与长期高血压引发的血流动力学改变、慢性炎症及氧化应激有关。从机制上看，肾小球内高压可导致微循环障碍和组织缺氧，进而诱导血管紧张素II（angiotensin II，AngII）释放、缺氧诱导因子激活等，共同促进RCC的发生发展[67]。遗传因素可能进一步加剧该风险，例如，Liao等[68]发现同时携带MMP9 rs3918242的T等位基因高血压患者，其肾细胞癌发生风险显著增加。Zhang等[69]研究表明，AE能够抑制AngII诱导的NLRP3炎性小体（NLRP3 inflammasome，NLRP3）的形成与活化，并减少高迁移率族蛋白1的释放，从而达到降血压作用。基于AngII在高血压相关肾癌中的推动作用，AE通过拮抗AngII信号通路，不仅为高血压的临床管理提供了新策略，也为预防或干预高血压相关肾细胞癌提出了可能的分子机制与研究方向。 4.1.2  AE介导免疫调节的抗肿瘤作用 恶性肿瘤在侵袭人体时，必须突破多重免疫防御屏障，而在此过程中，免疫调节机制在抗击肿瘤方面扮演着至关重要的角色。研究表明，蒽醌类化合物在肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）调节方面具有重要功能[70]。以宫颈癌为例，Gao等[21]发现AE可下调HPVE6/E7致癌基因的表达并调节葡萄糖代谢，从而改善免疫状态并诱导凋亡。在黑色素瘤的研究中，Tabolacci等[71]通过评估AE对人黑色素瘤细胞的抗肿瘤及免疫调节活性，发现其可能通过影响粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和γ干扰素等细胞因子水平，间接调节巨噬细胞与T细胞功能，进而实现抗肿瘤的效果。在肝细胞癌中，Xie等[72]构建了叶酸靶向的金属有机框架FeMn-MOF纳米颗粒，研究发现其在Hepa1-6细胞中可快速释放AE、Fe3+及Mn2+，并催化ROS，激活NLRP3/Caspase-3/焦亡执行蛋白E（gasdermin E，GSDME）通路，最终引发细胞焦亡，焦亡释放的细胞内容物作为免疫佐剂可促进树突状细胞（dendritic cells，DC）活化，进一步激活了机体的抗肿瘤免疫。最新研究表明，大黄素可在H22肝癌模型中通过激活糖原合成酶激酶-3β促进PD-L1蛋白酶体降解，显著增强肿瘤内CD8⁺ T细胞和NK细胞的浸润以及TNF-α、γ干扰素、颗粒酶B（granzyme B，GrB）的分泌，并与抗PD-L1抗体联用协同抗肿瘤，该研究虽以大黄素为主，但充分说明蒽醌骨架可以通过增强效应T细胞功能、调控CD8+ T/Treg平衡和NK细胞杀伤活性来重塑TIME，其潜在作用还可能延伸至调节髓源性抑制细胞及癌症相关成纤维细胞等免疫抑制性组分，为AE在相似通路上的潜在作用提供了重要参照[73]。而在非肿瘤模型中，AE对肥大细胞、炎症因子及免疫细胞谱的调控，也从免疫药理学层面支持其作为TIME调节剂与免疫佐剂的潜力[74]。综上所述，AE能够通过多靶点调节肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞、T细胞亚群等多种免疫细胞功能，从而显著增强抗肿瘤效应，并在提升免疫治疗疗效及降低毒性方面展现出巨大潜力。 4.2 AE成药性局限性及现代制剂技术提升策略 4.2.1  AE成药性的主要局限性 AE作为一种典型的蒽醌类化合物，其固有的理化性质如强疏水性及较高脂水分配系数（lgP），导致水溶性差、口服溶出度低，进而造成生物利用度不理想，这已成为制约其抗肿瘤药物开发的主要瓶颈。此外，AE在体内易受胃肠道环境及首过效应影响，表现为达峰时间延迟、血药浓度维持短暂及清除较快，难以在肿瘤部位形成稳定有效的药物暴露。药动学和安全性研究表明，AE存在肝、肾组织蓄积倾向，长期或高剂量给药可能诱发肝损伤与肠道刺激等不良反应。同时，其体内分布广泛但肿瘤靶向性不足，往往需提升剂量以达到有效抗肿瘤浓度，从而加剧全身毒性风险[46,75-77]。综上所述，AE的成药性缺陷主要集中于①溶解性与溶出度差，显著限制口服吸收；②首过效应显著，生物利用度低；③体内处置特性不佳，潜藏肝肾毒性及长期用药安全隐患；④肿瘤组织选择性低，难以在病灶部位蓄积足够浓度。因此，针对上述缺陷，通过结构修饰、金属配合物构建及纳米递送等策略，系统改善其理化与药动学性质，在维持乃至增强抗肿瘤活性的同时提高安全性，已成为推动AE临床转化的关键研究方向。 4.2.2  AE衍生物结构优化与抗肿瘤潜力 为改善AE的成药性，对其进行化学结构修饰是1项基础而关键的策略。研究人员常通过在母核上引入特定官能团或构建杂合分子，以期优化其溶解性、代谢稳定性并增强药理活性，AE功能基团与活性关系见图1。原凤蕉等[78]以AE为母体，通过溴代、叠氮化设计合成出17个新型AE-吲哚偶联物（5a～5q），通过MTT实验表明，部分化合物对MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人胃腺癌细胞AGS等肿瘤细胞具有显著抑制活性，其中化合物5h对MCF-7与人卵巢癌SKOV3细胞的IC50分别为1.73、3.09 μmol/L，活性优于阳性对照药依托泊苷。Shang等[33]报道了一系列含氮的AE衍生物，发现AE衍生物相比于AE显著下调iNOS及COX-2的表达水平，该作用可能与Akt、NF-κB和JNK信号通路的调控有关，提示结构修饰有助于增强其对关键信号通路的调节能力及抗肿瘤效果。Kumar等[79]通过进一步结构优化，合成了多个AE衍生物，并系统评估了它们对一组癌细胞系的抑制活性，结果表明大多数衍生物活性优于天然AE，提示在提高生物利用度的同时可增强抗癌效能。Yuan等[80]以大黄酸和AE为原料，在二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的作用下合成了大黄酸-芦荟大黄素杂合分子（RH-AE），并采用CCK-8法比较了RH-AE、大黄酸及AE对HepG2细胞、人鼻咽癌CNE细胞、人肺癌NCI-H460细胞、SKOV3细胞与HeLa 5种人癌细胞的体外抑制效果。结果显示，RH-AE对各细胞系的IC50值均显著低于大黄酸与AE，表明其体外抗肿瘤活性明显提升。综上所述，通过引入特定官能团或构建杂合分子对AE进行结构优化，可有效增强其药理活性与成药性，为其在医药领域的进一步开发提供了新的研究方向。 4.2.3  AE金属配合物提升抗肿瘤作用 近年来，研究人员尝试将AE与多种金属离子进行配位，构建结构新颖的金属配合物，以改善其溶解性、稳定性及生物活性[81]。此类配合物不仅能改善AE在体内的吸收与分布特性，还可能通过金属离子本身的药理特性产生协同作用，从而增强其抗肿瘤作用[82]。金属离子因其固有的生物活性在抗肿瘤研究中备受关注，而与有机配体形成的金属配合物往往表现出优于单一组分的生物效应[83]。在特定反应条件（如配比、温度、pH等）调控下，金属离子可与配体形成结构稳定的配合物，兼具金属中心与配体的双重化学与生物学特性。研究表明，金属配合物的抗肿瘤作用常超过单一金属元素或其配体，这种效能的提升可能源于其分子结构与电子特性，较高配位数的配合物通常具备更强的电子转移能力[84]，从而更有效地与肿瘤细胞内生物靶点相互作用，进而展现更显著的抗癌效果[85]。蒋夫辰等[86]在pH 10条件下合成了AE-锌(II)配合物，并通过MTT法比较了AE及其锌配合物对HepG2细胞的抑制作用。结果显示，与AE相比，该配合物对HepG2细胞的生长抑制率平均提高5.95%，IC50值降低30.82%，表明金属配位策略可显著增强AE的抗肿瘤活性。综上所述，金属配位策略有望显著改善AE的药动学特征，一方面，配位键的引入改变了分子的lgP值，有望优化药物的跨膜吸收与组织分布；另一方面，金属中心的引入可能阻碍肝脏代谢酶对AE母核的快速修饰，从而延长其体内半衰期并提高体内暴露量与肿瘤部位的有效暴露。未来研究需重点关注此类配合物在生理环境下的稳定性解离动力学及其对正常脏器的安全性评价。 4.2.4  基于纳米技术的AE递送系统与抗肿瘤作用 尽管金属配合物策略显著增强了AE的生物活性，但其临床转化仍受限于递送效率低下与靶向性不足。为此，纳米药物递送系统已成为天然产物抗肿瘤研究的前沿方向，通过构建多种AE纳米递送体系，以针对性优化其药动学与治疗效能。这些纳米载体能够提升AE的稳定性与溶解特性，延长系统循环时间，并利用被动或主动靶向机制实现肿瘤部位的选择性富集，从而在增强抗肿瘤效果的同时减少脱靶毒性[87]。Chen等[88]制备了AE-固体脂质纳米粒（AE-SLN），体外研究显示，与AE溶液相比，AE-SLN对MCF-7细胞与HepG2细胞的体外细胞毒性显著提高，而对人乳腺上皮MCF-10A细胞未见显著毒性，表明纳米载体可有效提高AE的选择性抗癌活性。Yu等[89]构建了铜离子负载的AE自组装纳米配合物，并在体外及小鼠肿瘤模型中验证其抗癌作用。该纳米体系在肿瘤微环境中可释放Cu2+与AE，协同诱导ROS爆发、线粒体功能紊乱和脂质过氧化积累，触发铜死亡，并在光动力作用下进一步增强抗癌效果。Chen等[90]以铁基纳米金属有机框架［MIL-101(Fe)］为载体，AE为负载药物，叶酸修饰的β-环糊精（FACD）为靶向药物，成功构建了靶向AE递送的多组分超分子组装体［MIL-101(Fe)-Fc@AE@FACD］，该组装体通过FACD有效减少药物提前释放，在肺癌肿瘤微环境中，能够利用肿瘤微环境的pH/H2O2实现精准释药，同时消耗GSH增强化学动力学疗效，显著提升AE的抗肿瘤活性，这表明纳米载体不仅提升了溶解度，更通过渗透滞留效应或主动靶向配体，显著改善了AE的治疗指数，克服了游离药物毒副作用大的缺陷。上述体内外研究共同表明，相较于游离AE，新型纳米递送系统在改善成药性方面优势显著。 4.3  AE联合用药抗肿瘤能力 4.3.1  AE联合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）协同抗肿瘤 5-FU作为广泛应用于肿瘤化疗的经典药物在多种实体瘤治疗中具有重要地位。然而，其细胞选择性较低，在抑制肿瘤细胞的同时往往对正常组织产生显著毒性，导致一系列严重不良反应[91]。为改善其治疗窗口，研究者探索了AE与5-FU的联合策略。例如，在默克尔细胞癌（Merkel cell carcinoma，MCC）研究中，Fenig等[92]发现化疗药物5-FU、顺铂、阿霉素以及酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼均能独立抑制MCC细胞的增殖，而AE的加入能够进一步增强这些药物的抑制作用，尤其是在使用低浓度抗癌药物时效果更显著。该作用在大黄素中也有体现，Zu等[93]以大黄素为研究对象发现，在单药条件下，≤20 μmol/L的大黄素或≤40 μmol/L的5-FU对MCF-7细胞增殖均未产生显著抑制，然而，当两者以1∶2联合作用时，可显著降低细胞活力并诱导凋亡。进一步机制研究表明，该协同作用与通过沉默NRARP基因、上调p21/p16/p27等衰老相关蛋白，进而诱导肿瘤细胞衰老密切相关；同时，联合处理引起细胞内ROS水平显著上升及GSH耗竭，提示氧化应激亦参与其协同机制。鉴于AE与大黄素结构高度相似，推测AE与5-FU联用也可能通过类似的机制产生协同效应，为AE的临床联用提供了新的思路。这些研究结果表明，AE与5-FU等化疗药物联合使用可能产生协同增效作用，为提高抗肿瘤疗效、降低化疗药物临床应用剂量提供了新的思路。 4.3.2  AE联合替莫唑胺（temozolomide，TMZ）协同抗肿瘤 TMZ作为第2代口服烷化剂类抗肿瘤药物，具有良好的生物利用度与血脑屏障穿透能力，是胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）的标准化疗方案。然而，其药效常因MGMT过度表达及相关DNA修复通路的激活而产生耐药，限制其治疗效果[94]。近年研究表明，AE与TMZ联合应用可有效逆转此类耐药表型，Staffieri等[65]在具有TMZ耐药特性的原代GBM细胞系中评估了AE与TMZ的联合效应，采用20 μmol/L AE与10 μmol/L TMZ联合处理，可显著抑制细胞增殖并增强毒性作用，该研究证实联合处理能够显著下调MGMT蛋白水平，并抑制其上游调控因子NF-κB p65/p50亚基的表达，从而削弱DNA损伤修复能力，恢复TMZ的化疗敏感性。此外，该联合方案还可抑制GBM细胞的集落形成与迁移能力，提示其在延缓肿瘤进展与复发方面亦具潜力。Okon等[95]指出AE可作为TMZ的化疗增敏剂。综上，AE与TMZ的联合使用为克服GBM化疗耐药提供了新策略，不仅有望降低TMZ的用药剂量及相关毒性，还可能延缓疾病进展并改善治疗预后。 5  结语与展望 恶性肿瘤的发生发展受到多靶点、多通路构成的复杂分子网络的调控，针对该网络开发有效干预策略已成为肿瘤学研究的核心挑战。本综述系统阐述了源于芦荟中的蒽醌类化合物AE在抗肿瘤领域中的多维作用机制（图2），揭示了天然产物在复杂肿瘤调控网络中的独特价值。从Akt/mTOR通路介导的细胞凋亡到ROS依赖的氧化应激爆发，AE展现出超越传统化疗药物的多机制协同抗肿瘤特性，这为解决当前靶向药物治疗效果有限提供了新视角，并为临床转化研究提出可行路径。AE通过调控Akt/mTOR、MAPK、NF-κB等信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡与自噬；通过调控凋亡相关蛋白促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。此外，AE还可引起氧化应激并调节细胞因子网络，从而促进癌细胞死亡并增强机体抗肿瘤免疫。值得注意的是，AE的作用机制具有显著的组织特异性，例如，在宫颈癌中靶向病毒蛋白、在胶质瘤中靶向耐药酶MGMT，而在激素依赖性肿瘤中干扰受体信号。为克服AE在临床应用中的局限性，将AE与特定金属离子配位形成金属配合物可显著增强其细胞毒性与抗癌活性。 在药物递送系统设计方面，基于脂质体、聚合物纳米粒等先进载体构建的AE制剂不仅改善其水溶性与化学稳定性，更显著提高了在肿瘤组织的富集能力与靶向释放特性，在临床前研究中展现出优于游离药物的抗肿瘤效果[90]。多项研究证实AE与传统化疗药物联用可产生显著的协同增效作用，有效提升对多种肿瘤细胞的杀伤效率，提示其在联合用药方案中具备重要潜力[65,92-93]。然而，当前研究仍存在若干亟待解决的问题：①AE直接作用于肿瘤细胞的靶点尚未明确，其作用机制及涉及的相关信号通路尚未完全阐明；②其靶向递送系统搭建尚不全面，不同递送系统的药动学特性与靶组织蓄积能力差异显著，需根据不同病理表型制定精准治疗决策；③多数机制研究仍依赖于动物模型，需要构建更精准的人源化肿瘤模型以验证其靶点特异性及作用机制。未来研究应致力于识别AE的直接作用靶标、优化其递送系统的靶向效率，并整合多组学技术与人工智能方法，构建AE的多靶点网络药理学模型，为推进其在肿瘤精准治疗中的应用提供理论依据与实践路径。 利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来  源：吉燕华，刘朝煌，马晓雪，张思源，邹艺鹏，黄荣婷，曾治君．芦荟大黄素抗肿瘤的多靶点机制与转化策略研究进展  [J]. 中草药, 2026, 57(8): 3210-3222. END 文章内容仅供思路参考，不代表本刊观点，非中医药专业人员请勿试药 文章来源：中草药杂志社，本草全球转载仅为传播行业信息，不做商业用途。若转载不当，请联系：28331285@163.com删除，感谢原作者的辛劳付出。文中插入广告与本公众号无关。 本草全球服务内容  包括但不限于:  中药新药、经典名方、配方颗粒、中药CMC、美国FDA IND、中药保护品种临床试验申报、中药上市再评价、药物经济学评价、新药研发及中药类注册备案全过程咨询与委托服务;可为有关单位疑难问题提供解决方案与技术支持、开展内训等服务。凡提交至本草全球的疑难问题,均可协助解决。  联系人:田先生 13801667235

New BPEI preclinical data address treatment protocol, corneal biochemical environment, fungal resistance mechanism, MRSA biofilm inhibition, and enhanced cysticidal activity KNOXVILLE, Tenn., May 04, 2026 (GLOBE NEWSWIRE) -- Provectus Biopharmaceuticals, Inc. (“Provectus” or the “Company”) (OTCQB: PVCT), a clinical-stage biopharmaceutical company developing proprietary synthetic small molecule rose bengal sodium (“RBS”)-based medicines, notes that researchers from Bascom Palmer Eye Institute (“BPEI”) at the University of Miami will present four posters on rose bengal photodynamic antimicrobial therapy (“RB-PDAT”) at the 2026 Annual Meeting of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (“ARVO”), to be held May 3–7 in Denver, Colorado. Provectus’s subsidiary VisiRose, Inc. (“VisiRose”), a private clinical-stage biotechnology company, is commercializing RB-PDAT for the treatment of infectious keratitis (“IK”) and other eye infections, such as infectious scleritis. RB-PDAT is an innovative, investigational, non-invasive treatment developed by the Ophthalmic Biophysics Center (“OBC”) at BPEI. It combines PV-305, a formulation of Provectus’s pharmaceutical-grade active pharmaceutical ingredient RBS, and OBC’s green light medical device to treat eye infections caused by bacteria, fungi, and parasites, including multidrug-resistant strains. A fifth abstract will be presented by domestic and international principal investigators and medical centers who sponsored and conducted a randomized controlled trial (“RCT”) named REAGIR. REAGIR compared one RB-PDAT treatment — an approximately 45-minute outpatient procedure — against natamycin, the standard of care (“SOC”) administered topically over multiple weeks. BPEI donated RB-PDAT devices and provided technical support. Taken together, the abstracts reflect the progression of RB-PDAT well beyond proof of concept. The questions being asked at ARVO 2026 — How many treatment cycles are needed? How does the corneal biochemical environment shape therapeutic outcome? What structural features of pathogens confer resistance? — are questions of a therapy approaching maturity of clinical understanding. Abstract A: REAGIR 12-Month Outcomes — A Signal About Protocol, Not Potential Bernard et al. “Rose Bengal Electromagnetic Activation with Green Light for Infection Reduction (REAGIR): Twelve month outcomes from sham-controlled, masked, randomized trial.” Abstract 3527-0110. The REAGIR trial ( NCT05110001 ) was a 330-patient, multi-center, international, double-masked, sham-controlled RCT reporting 12-month outcomes for adjunctive RB-PDAT versus sham in fungal, Acanthamoeba , and smear/culture-negative keratitis. The protocol administered a single RB-PDAT treatment. At 12 months, no statistically significant difference was observed between arms for best-corrected visual acuity, infiltrate/scar size, or rates of corneal perforation or therapeutic penetrating keratoplasty. Abstract authors are from the University of California San Francisco (trial sponsor), Stanford University, Aravind Eye Care System (India; primary clinical sites), and Federal University of São Paulo (Brazil). Interpreting these data requires understanding the REAGIR trial design and its patient strata. Species-level results tell a differentiated story. Fungal keratitis (“FK”) comprised 91% of enrollment. Fusarium , the most prevalent cause of FK globally, was 63% of all study patients. This Fusarium subgroup showed directionally better visual acuity with RB-PDAT than with SOC alone (0.17 lines better, p=0.1), marking the first time that a therapy has demonstrated a favorable directional signal versus natamycin in an RCT. Topically applied natamycin, approved by the U.S. Food and Drug Administration in 1978, remains the only ophthalmic drug approved for FK. Aspergillus FK patients trended in the opposite direction (0.39 lines worse, p=0.07), a divergence that connects directly to the melanin-mediated resistance mechanism investigated in BPEI Abstract 2. Acanthamoeba (parasitic) keratitis accounted for 3% of patients. In this cohort, too small for statistical conclusions, RB-PDAT showed 2.5 lines better vision and smaller scar size at six months, a directional signal consistent with the literature on Acanthamoeba keratitis and treatment repetition discussed below. Scar size data further support this interpretation: RB-PDAT showed meaningfully smaller scars at three weeks and three months, converging with the sham arm only at 12 months — a temporal pattern consistent with real but not sustained biological activity from a single RB-PDAT treatment. The REAGIR trial design, first listed on ClinicalTrials.gov in 2021, administered RB-PDAT only once. Bagga et al. ( Journal of Ophthalmic Inflammation and Infection , 2025) (LV Prasad Eye Institute, India) treated 14 Acanthamoeba keratitis patients with two cycles of RB-PDAT in conjunction with standard anti-amoebic therapy, demonstrating clinical resolution in cases refractory to standard therapy alone (86% success). Separately, BPEI’s Naranjo et al. ( American Journal of Ophthalmology , 2019) treated 18 patients with severe, progressive bacterial, fungal, and parasitic keratitis: nine patients received one RB-PDAT treatment (67% success) and nine received two or three (78% success). The REAGIR principal investigators concluded that “there may be value in assessing alternative…treatment algorithms.” BPEI Abstract 4 below provides direct in vitro evidence for why treatment repetition may be decisive in the most challenging pathogen class. The REAGIR trial was designed and conducted by independent clinical investigators. Based on the ophthalmic RB-PDAT biomedical literature and Provectus’s experience developing RBS across multiple disease areas, the Company believes that adequate treatment is a meaningful variable in determining patient outcomes. This is a hypothesis that mechanistic data in BPEI Abstracts 1 and 4 below directly support. BPEI Abstract 1: The Corneal Biochemical Environment Actively Shapes RB-PDAT Output Paudyal et al. “Amino Acid Modulation of Reactive Oxygen Species Generation in Rose Bengal Photodynamic Antimicrobial Therapy.” Abstract 3529-0112. RB-PDAT generates reactive oxygen species (“ROS”) upon green light activation of rose bengal. This in vitro study examined how endogenous corneal amino acids modulate that ROS output. Using an optimized DCFH₂ fluorescence assay, BPEI found that aromatic amino acids (tyrosine and tryptophan) and histidine markedly increased ROS generation, while arginine strongly suppressed it, likely through guanidinium group-mediated quenching of reactive intermediates. Negatively charged and polar neutral amino acids had minimal effect. The clinical implication is significant: a patient’s individual corneal amino acid pro modulate therapeutic response to RB-PDAT in ways not captured by standard dosing protocols. The authors note that the relationship between Type 1 (ROS) and Type 2 (singlet oxygen) pathways requires further investigation to determine which dominates antimicrobial efficacy, a question with direct bearing on rational clinical protocol design. BPEI Abstract 2: Melanin as a Resistance Mechanism in Aspergillus Keratitis Sanchez Campo et al. “Impact of Melanin on Antifungal Efficacy of Rose Bengal Antimicrobial Photodynamic Therapy in Clinical Aspergillus Isolates.” Abstract 4305-0575. RB-PDAT has demonstrated consistent antifungal efficacy across multiple pathogen classes, but the Aspergillus species has remained a relative exception. This study investigated whether melanin, a known antioxidant polymer in fungal cell walls, may function as a protective shield against ROS generated by RB-PDAT. Using DHN- and DOPA-pathway melanin inhibitors across four clinical Aspergillus strains, the authors found that DHN-pathway inhibition produced the most marked depigmentation, particularly in A. fumigatus , but yielded only modest increases in RB-PDAT susceptibility and only in one of four strains ( A. glaucus ). The authors propose that melanin may act as an energy sink rather than a conventional antioxidant, a distinction with practical implications for how combination strategies targeting Aspergillus keratitis should be designed. BPEI Abstract 3: Rose Bengal Inhibits Biofilm Formation in Clinical MRSA Isolates Durkee et al. “Inhibition of Biofilm Formation of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates with Rose Bengal.” Abstract 4317-0587. Biofilms represent one of the primary structural mechanisms by which ocular pathogens evade both antibiotic therapy and host immune clearance. The authors exposed six clinical methicillin-resistant Staphylococcus aureus (“MRSA”) isolates from IK patients to rose bengal for 96 hours and quantified biofilm formation using an XTT metabolic activity assay. Rose bengal inhibited biofilm formation by 74% across all six strains. This finding complements and extends research published by the University of Tennessee Health Science Center and sponsored by Provectus on RBS’s antibacterial properties, Kurosu et al. ( Molecules , 2022) , which characterized RBS’s direct antibacterial activity across multiple organisms and growth conditions, including biofilms. BPEI biofilm data add an important structural dimension: rose bengal does not merely kill planktonic organisms; it may also prevent the architectural reorganization that renders infections refractory to treatment. The clinical implications are particularly relevant for contact lens-associated keratitis, which was the most common risk factor in BPEI’s Naranjo et al. noted above. BPEI Abstract 4: Repeat and High-Fluence RB-PDAT Substantially Enhance Cysticidal Activity Navia JC, et al. “RB-PDAT Enhances Cysticidal Efficacy Without Altering the Stability of Standard Antiamoebic Agents.” Abstract 3530-0113. This abstract may carry the most direct implications for clinical protocol development. The study evaluated Standard (1×), Repeat (2×), and High-Fluence (3×) RB-PDAT in combination with standard anti-amoebic agents (PHMB and chlorhexidine) against four Acanthamoeba isolates induced to encyst. Standard RB-PDAT alone was insufficient to achieve sustained cyst inhibition, with trophozoite regrowth observed at 24 hours. Repeat and High-Fluence RB-PDAT, in combination with either PHMB or chlorhexidine, achieved 100% inhibition at 24 hours and maintained 50% cysticidal activity at 21 days. Anti-amoebic monotherapy produced only transient suppression, with regrowth by 21 days. Critically, PHMB and chlorhexidine retained full chemical stability under all RB-PDAT exposure conditions, confirming their compatibility for concurrent use. Dominic Rodrigues, Provectus’s President and Vice Chairman of its Board of Directors and Acting Chief Executive Officer of VisiRose, said, “The body of science presented at ARVO 2026 tells us what Provectus has come to understand deeply from years of work with this molecule in different diseases: rose bengal sodium is a potent, biologically active, versatile agent whose full therapeutic potential is realized when adequate treatment is given.” He added, “In the REAGIR trial, a single RB-PDAT treatment cycle was a starting point. This independently conducted international study has advanced the ophthalmology field’s clinical understanding of RB-PDAT considerably, including the first directionally favorable signal versus natamycin, the standard of care in fungal keratitis, in nearly 50 years.” Mr. Rodrigues concluded, “The REAGIR trial identified the next important question for advancing this investigational ophthalmic treatment for infectious keratitis: what can RB-PDAT achieve when clinical protocol matches biology? We intend to begin answering that question with a proposed Phase 2b/3 clinical trial following VisiRose’s pre-Investigational New Drug Application meeting with the U.S. Food and Drug Administration.” About VisiRose VisiRose is a clinical-stage biotechnology company focused on commercializing Rose Bengal Photodynamic Antimicrobial Therapy (RB-PDAT), an innovative ocular therapy developed at the Bascom Palmer Eye Institute's Ophthalmic Biophysics Center at the University of Miami Miller School of Medicine, which ranked No. 1 in ophthalmology in the United States 24 times ( U.S. News & World Report , 2025-2026 Best Hospitals rankings ). RB-PDAT leverages the inherent anti-pathogenic properties of RBS, combined with light activation, with the potential to deliver safe, effective, broad-spectrum, and non-invasive treatment for infectious keratitis and other serious eye infections. RB-PDAT has been clinically validated across hundreds of patients at leading medical centers in the United States, India, Brazil, and Mexico. For more information, visit . About Provectus Provectus Biopharmaceuticals, Inc. is a clinical-stage biotechnology company developing a pipeline of immunotherapy medicines based on rose bengal sodium, a synthetic small molecule from the halogenated xanthene family. The Company’s clinical programs span oncology, dermatology, and ophthalmology, with additional proof-of-concept programs in hematology, wound healing, infectious diseases, and tissue repair. For more information, visit . Forward Looking Statements The information in this press release may include “forward-looking statements,” within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995, relating to the business of Provectus and its affiliates, which are based on currently available information and current assumptions, expectations, and projections about future events and are subject to a variety of risks and uncertainties and other factors that could cause actual events or results to differ materially from those projected in the forward-looking statements. Forward-looking statements are often, but not always, identified by the use of words such as “aim,” “likely,” “outlook,” “seek,” “anticipate,” “budget,” “plan,” “continue,” “estimate,” “expect,” “forecast,” “may,” “will,” “would,” “project,” “projection,” “predict,” “potential,” “targeting,” “intend,” “can,” “could,” “might,” “should,” “believe,” and similar words suggesting future outcomes or statements regarding an outlook. The safety and efficacy of the agents and/or uses under investigation have not been established. There is no guarantee that the agents will receive health authority approval or become commercially available in any country for the uses being investigated or that such agents as products will achieve any particular revenue levels. Due to the risks, uncertainties, and assumptions inherent in forward-looking statements, readers should not place undue reliance on these forward-looking statements. The forward-looking statements contained in this press release are made as of the date hereof or as of the date specifically specified herein, and Provectus undertakes no obligation to update or revise any forward-looking statements, whether as a result of new information, future events, or otherwise, except in accordance with applicable securities laws. The forward-looking statements are expressly qualified by this cautionary statement. 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