Temozolomide

作者 | 无名  编辑 | 郑瑶 2025年即将结束，在开年至今的近一年里，据初步统计，年初至今超过650个药品申请撤回或未批准，其中有302个药品已有不低于10家企业获批…… 01 医药反内卷 从源头开始 长期以来的低水平重复建设和同质化申报，导致大量仿制药在有限的市场空间中恶性竞争，企业利润被压缩至极限，研发投入动力不足，形成了严重的“内卷”困局。这种内卷不仅造成社会资源的巨大浪费，也阻碍了产业整体技术升级和创新能力的培育。 为适应新时期需要，引导医药产业从“数量扩张”转向“质量引领”的高质量发展轨道，国家持续优化审评审批政策。一方面，提高仿制药的上市门槛，鼓励临床急需、高技术壁垒的品种；另一方面，通过主动撤回、不予批准等方式，对已上市或申报中的低效、重复品种进行结构性出清，从而实现从源头上“反内卷”。 据不完全统计，2025年以来，年初至今超过650个药品申请撤回或未批准，既有少量的首仿药，也有已有大量厂家获批上市的品种。笔者以已有供应厂家不低于10家作为竞争激烈的分界点，则有302个药品属于该类申请撤销或未批准。 本文试从药品类型、治疗领域、医保基药属性、市场竞争度、OTC分类等多个维度进行深入剖析，旨在揭示当前我国仿制药“去内卷化”进程的内在逻辑、结构特征与发展趋势。 02 申请撤销或未批准药品 批文类别分布 从申请撤销或未批准产品中化药分布来看，302个产品中化学药最多，有239个，其次为中成药有54个，生物制品有9个。 注：根据公开资料整理，供参考。 03 申请撤销或未批准药品以抗感染品种为主 其次为呼吸系统用药 从302个申请撤销或未批准产品的治疗领域分布来看，全身抗感染药品数量最多，达到50个，其次为呼吸系统用药，合计有43个（含25个西药和18个中成药），再次为心脑血管系统疾病用药和消化系统用药，均在40个产品左右。此外，包含肿瘤药在内的抗肿瘤和免疫调节剂产品有14个。 注：根据公开资料整理，供参考。 在这14个申请撤销或未批准的肿瘤及免疫调节剂品种中，既有免疫调节剂也有靶向药和化疗药，涵盖肺癌、乳腺癌、白血病等多个瘤种。可见随着创新药加速上市，一些老旧、重复的抗肿瘤药物申请逐渐被淘汰，反映出我国行业从“数量扩张”向“质量提升”的转变趋势。 这14个品种中，肌苷注射液已上市企业数已接近150家，注射用盐酸吉西他滨和甘露聚糖肽口服溶液已上市企业数也在20家以上，其余品种则在10-20个之间。 注：根据公开资料整理，供参考。 04 302个产品的特征属性情况 医保：大部分为医保品种 302个品种中，医保品种超过230个，占比超过77%，其中医保甲类品种84个，医保乙类150个，约占总产品数的50%；非医保产品有68个。 注：根据公开资料整理，供参考。 基药：基药产品超1/3 302个品种中，大部分为非基药品种。基药品种110个，约占总产品数302个的36%，超过了302个产品总数的1/3；非基药产品192个。 注：根据公开资料整理，供参考。 处方/OTC：以临床处方药为主 302个品种中，大部分为处方药，约占8成，有241个；OTC品种32个，约占总数的10%，双跨品种29个，也约占10%。 注：根据公开资料整理，供参考。 05 申请撤销或未批准药品 已上市厂家数量分布 从302个申请撤销或未批准产品的已有上市厂家数量的分布区间状况来看：100个厂家及以上的产品有55个，说明这些企业已经严重内卷，市场潜在竞争激烈；已有50-99个厂家上市的产品有33个；已有30-49个厂家上市的产品有45个；已有30个以下、10个以上厂家上市的产品数最多，约占302个产品的56%。 注：根据公开资料整理，供参考。 06 趋势 从“规模竞争”到“价值竞争” 仿制药企业必须进行深刻的战略转型，推动医药行业从规模竞争转向价值竞争。 制药企业要怎么应对？ 一是赛道选择差异化：主动避开过度拥挤的普通口服固体制剂“红海”，转向具有更高技术壁垒的领域，如复杂注射剂（脂质体、微球）、吸入制剂、透皮贴剂、眼科用药等。 二是研发方向升级：布局改良型新药（2.2类），通过剂型创新、复方组合、新的给药途径等，创造差异化的临床价值，提升产品生命周期和市场竞争力。 三是苦练成本内功：通过生产工艺优化、供应链管理、规模化生产等方式，打造极致的成本控制能力，这是参与集采竞争的入场券和生存基础。 四是追求国际品质：积极推动生产线通过欧美cGMP认证，申请FDA或EMA的仿制药上市许可（ANDA），开拓国际市场，规避国内单一市场的政策风险。 五是主动优化产品线：定期评估自身产品组合，果断放弃缺乏竞争力、维护成本高的“僵尸批文”，将资源集中于核心优势品种和未来有潜力的研发管线。 未来，能够在这场深刻变革中胜出的，必将是那些兼具卓越质量管控体系、强大成本控制能力、前瞻性研发视野和国际化战略布局的企业。 已上市厂家数10个以上的申请撤回或未批准产品详单 序号 产品名称 大类 已上市厂家数 1 复方磺胺甲噁唑片 化学药 100家及以上 2 安乃近片 化学药 3 板蓝根颗粒 中成药 4 土霉素片 化学药 5 去痛片 化学药 6 对乙酰氨基酚片 化学药 7 维生素B6片 化学药 8 氨咖黄敏胶囊 化学药 9 氯霉素片 化学药 10 葡萄糖注射液 化学药 11 盐酸雷尼替丁胶囊 化学药 12 异烟肼片 化学药 13 醋酸泼尼松片 化学药 14 四环素片 化学药 15 氯化钠注射液 化学药 16 头孢氨苄胶囊 化学药 17 西咪替丁片 化学药 18 复方乙酰水杨酸片 化学药 19 葡萄糖氯化钠注射液 化学药 20 穿心莲片 中成药 21 盐酸吗啉胍片 化学药 22 阿司匹林肠溶片 化学药 23 维生素C注射液 化学药 24 联磺甲氧苄啶片 化学药 25 双氯芬酸钠肠溶片 化学药 26 地塞米松磷酸钠注射液 化学药 27 枸橼酸喷托维林片 化学药 28 维生素B6注射液 化学药 29 藻酸双酯钠片 化学药 30 复方茶碱麻黄碱片 化学药 31 氧(液态) 化学药 32 甲硝唑氯化钠注射液 化学药 33 小儿复方磺胺甲噁唑片 化学药 34 大山楂颗粒 中成药 35 蛇胆川贝液 中成药 36 碳酸氢钠注射液 化学药 37 肌苷注射液 化学药 38 桑菊感冒片 中成药 39 麻黄碱苯海拉明片 化学药 40 复方氨酚烷胺片 化学药 41 胞磷胆碱钠注射液 化学药 42 注射用奥美拉唑钠 化学药 43 氨咖黄敏片 化学药 44 桂附地黄丸 中成药 45 注射用头孢曲松钠 化学药 46 注射用头孢他啶 化学药 47 氨基比林咖啡因片 化学药 48 刺五加片 中成药 49 复方氢氧化铝片 化学药 50 复方妥英麻黄茶碱片 化学药 51 氯化钾注射液 化学药 52 注射用头孢呋辛钠 化学药 53 注射用头孢唑林钠 化学药 54 小柴胡颗粒 中成药 55 杞菊地黄口服液 中成药 56 琥乙红霉素颗粒 化学药 50-99个厂家 57 盐酸普罗帕酮片 化学药 58 维U颠茄铝胶囊 化学药 59 复方氨酚苯海拉明片 化学药 60 小儿咳喘灵口服液 中成药 61 一清颗粒 中成药 62 他达拉非片 化学药 63 复方愈创木酚磺酸钾口服溶液 化学药 64 维生素E软胶囊 化学药 65 三磷酸腺苷二钠注射液 化学药 66 葡萄糖酸钙注射液 化学药 67 玄麦甘桔颗粒 中成药 68 尼可地尔片 化学药 69 健儿消食口服液 中成药 70 康尔心胶囊 中成药 71 硝酸咪康唑乳膏 化学药 72 硫酸奈替米星注射液 化学药 73 头孢氨苄甲氧苄啶胶囊 化学药 74 五子衍宗丸 中成药 75 人血白蛋白 生物制品 76 酚磺乙胺注射液 化学药 77 氟康唑胶囊 化学药 78 阿咖酚散 化学药 79 清脑降压片 中成药 80 吡拉西坦注射液 化学药 81 注射用头孢唑肟钠 化学药 82 法莫替丁注射液 化学药 83 磷酸奥司他韦胶囊 化学药 84 消渴灵片 中成药 85 盐酸氨溴索口服溶液 化学药 86 玻璃酸钠滴眼液 化学药 87 杞菊地黄胶囊 中成药 88 补肾强身胶囊 中成药 89 复方南板蓝根片 中成药 30-49个厂家 90 注射用氨苄西林钠 化学药 91 健胃消食片 中成药 92 门冬氨酸钾镁注射液 化学药 93 注射用帕瑞昔布钠 化学药 94 妇科止带片 中成药 95 乳果糖口服溶液 化学药 96 桑菊感冒颗粒 中成药 97 盐酸多巴酚丁胺注射液 化学药 98 二羟丙茶碱注射液 化学药 99 硫酸氨基葡萄糖胶囊 化学药 100 左氧氟沙星片 化学药 101 阿奇霉素颗粒 化学药 102 熊去氧胆酸片 化学药 103 阿奇霉素干混悬剂 化学药 104 盐酸达泊西汀片 化学药 105 丹七片 中成药 106 瑞舒伐他汀钙片 化学药 107 盐酸特比萘芬乳膏 化学药 108 磺胺嘧啶钠注射液 化学药 109 妥布霉素滴眼液 化学药 110 非布司他片 化学药 111 氯雷他定片 化学药 112 叶酸片 化学药 113 氨溴特罗口服溶液 化学药 114 替格瑞洛片 化学药 115 盐酸乌拉地尔注射液 化学药 116 阿托伐他汀钙片 化学药 117 注射用舒巴坦钠 化学药 118 吡拉西坦氯化钠注射液 化学药 119 恩格列净片 化学药 120 黄柏胶囊 中成药 121 盐酸纳洛酮注射液 化学药 122 格列齐特缓释片 化学药 123 枸橼酸西地那非片 化学药 124 磷酸奥司他韦干混悬剂 化学药 125 双氯芬酸钠注射液 化学药 126 吸入用乙酰半胱氨酸溶液 化学药 127 盐酸酚苄明片 化学药 128 盐酸肾上腺素注射液 化学药 129 注射用盐酸吉西他滨 化学药 130 达格列净片 化学药 131 沙库巴曲缬沙坦钠片 化学药 132 盐酸艾司洛尔注射液 化学药 133 左氧氟沙星氯化钠注射液 化学药 134 人免疫球蛋白 生物制品 10-29个厂家 135 注射用尼可地尔 化学药 136 富马酸替诺福韦二吡呋酯片 化学药 137 硫酸特布他林雾化吸入用溶液 化学药 138 盐酸莫西沙星片 化学药 139 布洛芬混悬液 化学药 140 硫酸氢氯吡格雷片 化学药 141 伤湿祛痛膏 中成药 142 乙型肝炎人免疫球蛋白 生物制品 143 参苓白术丸 中成药 144 红霉素眼膏 化学药 145 孟鲁司特钠咀嚼片 化学药 146 舒更葡糖钠注射液 化学药 147 盐酸苯海拉明注射液 化学药 148 腰痛片 中成药 149 重酒石酸间羟胺注射液 化学药 150 替米沙坦胶囊 化学药 151 痔速宁片 中成药 152 甲硝唑栓 化学药 153 酒石酸美托洛尔片 化学药 154 氯化钙注射液 化学药 155 注射用乳糖酸红霉素 化学药 156 左乙拉西坦口服溶液 化学药 157 多潘立酮片 化学药 158 抗病毒口服液 中成药 159 利丙双卡因乳膏 化学药 160 腺苷钴胺胶囊 化学药 161 奥美沙坦酯氨氯地平片 化学药 162 苯磺顺阿曲库铵注射液 化学药 163 布美他尼注射液 化学药 164 厄贝沙坦氢氯噻嗪片 化学药 165 富马酸伏诺拉生片 化学药 166 甘露聚糖肽口服溶液 化学药 167 氯化钾颗粒 化学药 168 美索巴莫注射液 化学药 169 米诺地尔搽剂 化学药 170 盆炎净胶囊 中成药 171 清肺抑火片 中成药 172 他克莫司软膏 化学药 173 注射用美罗培南 化学药 174 苯磺酸左氨氯地平片 化学药 175 复方乳酸钠葡萄糖注射液 化学药 176 富马酸福莫特罗吸入溶液 化学药 177 氢溴酸伏硫西汀片 化学药 178 硝酸异山梨酯注射液 化学药 179 盐酸左沙丁胺醇雾化吸入溶液 化学药 180 盐酸左西替利嗪口服溶液 化学药 181 注射用七叶皂苷钠 化学药 182 阿戈美拉汀片 化学药 183 狂犬病人免疫球蛋白 生物制品 184 孟鲁司特钠颗粒 化学药 185 莫匹罗星软膏 化学药 186 破伤风人免疫球蛋白 生物制品 187 普瑞巴林口服溶液 化学药 188 乳核内消液 中成药 189 吸入用复方异丙托溴铵溶液 化学药 190 盐酸金霉素眼膏 化学药 191 盐酸尼卡地平注射液 化学药 192 注射用氯诺昔康 化学药 193 富马酸比索洛尔片 化学药 194 环孢素软胶囊 化学药 195 罗沙司他胶囊 化学药 196 蒲公英片 中成药 197 普拉洛芬滴眼液 化学药 198 盐酸胺碘酮注射液 化学药 199 氨甲环酸片 化学药 200 复方大青叶合剂 中成药 201 接骨续筋片 中成药 202 拉考沙胺口服溶液 化学药 203 氯沙坦钾氢氯噻嗪片 化学药 204 马来酸阿伐曲泊帕片 化学药 205 葡萄糖粉剂 化学药 206 葡萄糖酸锌颗粒 化学药 207 前列安通胶囊 中成药 208 维生素K1注射液 化学药 209 溴芬酸钠滴眼液 化学药 210 依折麦布片 化学药 211 注射用甲磺酸加贝酯 化学药 212 注射用亚胺培南西司他丁钠 化学药 213 壮骨酒 中成药 214 左卡尼汀口服溶液 化学药 215 复合磷酸氢钾注射液 化学药 216 富马酸喹硫平缓释片 化学药 217 肌氨肽苷注射液 化学药 218 卡络磺钠注射液 化学药 219 泊沙康唑注射液 化学药 220 清热化毒丸 中成药 221 小儿退热合剂(小儿退热口服液) 中成药 222 血塞通注射液 中成药 223 盐酸倍他司汀片 化学药 224 盐酸曲美他嗪片 化学药 225 注射用醋酸卡泊芬净 化学药 226 左炔诺孕酮片 化学药 227 低钙腹膜透析液(乳酸盐-G1.5%) 化学药 228 低钙腹膜透析液(乳酸盐-G2.5%) 化学药 229 复方灵芝颗粒 中成药 230 红花注射液 中成药 231 拉坦前列素滴眼液 化学药 232 瑞巴派特片 化学药 233 酮咯酸氨丁三醇注射液 化学药 234 头孢克肟颗粒 化学药 235 硝酸甘油片 化学药 236 注射用盐酸万古霉素 化学药 237 氨氯地平阿托伐他汀钙片 化学药 238 丙戊酸钠口服溶液 化学药 239 跌打红药片 中成药 240 黄体酮注射液 化学药 241 卡贝缩宫素注射液 化学药 242 前列舒乐片 中成药 243 双氯芬酸钠缓释片 化学药 244 羧甲司坦口服溶液 化学药 245 硝苯地平缓释片(Ⅱ) 化学药 246 盐酸非索非那定片 化学药 247 盐酸伊托必利片 化学药 248 依帕司他片 化学药 249 乙酰半胱氨酸颗粒 化学药 250 益母草片 中成药 251 多巴丝肼片 化学药 252 骨折挫伤胶囊 中成药 253 红细胞保存液 化学药 254 磷酸特地唑胺片 化学药 255 硫酸羟氯喹片 化学药 256 麦考酚钠肠溶片 化学药 257 尼麦角林片 化学药 258 双黄连口服液 中成药 259 碳酸司维拉姆片 化学药 260 替莫唑胺胶囊 化学药 261 头孢克肟分散片 化学药 262 血液保存液Ⅲ 化学药 263 盐酸米诺环素胶囊 化学药 264 注射用重组人凝血因子Ⅷ 生物制品 265 地诺孕素片 化学药 266 复方牛黄消炎胶囊 中成药 267 骨化三醇软胶囊 化学药 268 黄杨宁片 中成药 269 苹果酸舒尼替尼胶囊 化学药 270 泊沙康唑肠溶片 化学药 271 亚叶酸钙注射液 化学药 272 盐酸布比卡因注射液 化学药 273 盐酸伐地那非片 化学药 274 药艾条 中成药 275 注射用氨苄西林钠舒巴坦钠 化学药 276 艾地骨化醇软胶囊 化学药 277 奥卡西平片 化学药 278 比索洛尔氨氯地平片 化学药 279 地高辛注射液 化学药 280 夫西地酸乳膏 化学药 281 聚乙烯醇滴眼液 化学药 282 宁嗽露 中成药 283 妥布霉素地塞米松滴眼液 化学药 284 血液保存液Ⅱ 化学药 285 盐酸多柔比星脂质体注射液 化学药 286 盐酸精氨酸注射液 化学药 287 注射用阿糖胞苷 化学药 288 注射用盐酸头孢甲肟 化学药 289 b型流感嗜血杆菌结合疫苗 生物制品 290 阿达木单抗注射液 生物制品 291 阿莫西林克拉维酸钾干混悬剂 化学药 292 碘佛醇注射液 化学药 293 二甲双胍恩格列净片(Ⅵ) 化学药 294 复方鲜竹沥液 中成药 295 甲苯磺酸索拉非尼片 化学药 296 甲型H1N1流感病毒裂解疫苗 生物制品 297 美沙拉秦肠溶片 化学药 298 盐酸地尔硫䓬片 化学药 299 增光胶囊 中成药 300 注射用阿扎胞苷 化学药 301 注射用紫杉醇(白蛋白结合型) 化学药 302 左甲状腺素钠片 化学药 END 内容沟通：Xinmeitizhongxin- 商务合作：13810647732

前言        近年来，大量研究致力于探索非经典调控细胞死亡的各种途径，其中主要聚焦于氧化性细胞损伤。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖的程序性细胞死亡方式，由Stockwell于2012年提出，其在形态学和生物化学特征上与凋亡、自噬及坏死明显不同。铁死亡在多种疾病中发挥关键作用，包括癌症、急性肾损伤、心血管疾病、神经退行性疾病以及肝脏疾病等。此外，研究也表明铁死亡是耐药性的重要调控因子。铁死亡主要受铁代谢和脂质过氧化信号调控，其特征是细胞内铁的积累，导致大量脂质过氧化，最终引起细胞死亡。因此，诱导铁死亡已成为癌症治疗中一种新兴的潜在治疗策略。        谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），也称为磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx），能够清除膜脂氢过氧化物产物。它是含硒GPX家族的重要成员，其催化活性位点含有硒代半胱氨酸。如图1A所示，抗铁死亡酶GPX4通过将多不饱和脂肪酸在铁催化氧化过程中产生的有毒脂质氢过氧化物（LOOH）转化为无毒的脂质醇，对保护细胞免受氧化损伤和维持膜脂双层稳态至关重要。作为铁死亡的关键调控因子，GPX4在多种肿瘤类型中高表达，表明GPX4是癌症治疗的潜在靶点。通过靶向GPX4诱导铁死亡以实现癌症治疗，可通过以下两种途径实现：（1）将硒代半胱氨酸突变为半胱氨酸（使GPX4活性降低90%）；（2）抑制GPX4活性或促进GPX4降解。近期，已有多种小分子抑制剂被报道具有GPX4抑制活性，例如RSL3、ML162、ML210、JKE-1674和BCP-T.A（图1B）。然而，目前临床上尚无特异性的GPX4小分子抑制剂或铁死亡诱导剂可用。因此，开发新型有效的铁死亡诱导剂仍是当前所需。        尽管与凋亡相比，铁死亡被认为是一种独特的细胞死亡形式，但近期研究揭示了二者之间通过内质网应激信号通路存在相互作用。除了能强力抑制肿瘤生长外，小分子铁死亡诱导剂还能增强化疗药物的敏感性。将阿霉素、替莫唑胺和顺铂等化疗药物与铁死亡诱导剂erastin联用，在肿瘤治疗中产生了显著的协同效应。此外，多项研究表明，同时靶向凋亡和铁死亡可有效克服或绕过化疗耐药性。例如，Liu等人报道铂(IV)配合物可通过诱导铁死亡和凋亡，干预结肠癌对奥沙利铂的耐药性。通过诱导凋亡/铁死亡混合通路，ent-kauranes衍生物在使A549/CDDP细胞对顺铂耐药性增敏方面显示出巨大潜力。同样，凋亡剂与铁死亡剂的共递送也被证明是克服或规避化疗诱导凋亡通路耐药性的一种有前景的策略，相关案例如下，包括但不限于Fu等人开发了一种超声可激活的DFHHP纳米药物，可通过诱导肿瘤细胞发生协同的凋亡和铁死亡来克服化疗耐药并抑制肿瘤生长；Chen等人也提出了一种主动靶向的小分子自组装纳米前药，用于共递送化疗药物（CPT）、二茂铁（Fc）和GPX4抑制剂（RSL3），该策略通过联合凋亡与铁死亡疗法，在克服化疗耐药性方面显示出潜力。这些发现表明，铁死亡与凋亡在癌症治疗和克服耐药性方面具有协同作用。目前已报道的大多数GPX4抑制剂选择性和药代动力学性质较差，但可作为先导化合物用于进一步开发。其中，铁死亡诱导剂ML162在细胞水平上表现出显著的GPX4抑制活性和相对较高的抗肿瘤效力。基于ML162，研究人员已开发出许多性能更优的GPX4抑制剂或降解剂。例如，Luo等人报道了一种GPX4降解剂（dGPX4），其诱导铁死亡的效率相比ML162提高了五倍，这表明ML162是一种可供进一步修饰的重要先导化合物。        醌基团是一种关键的凋亡诱导药效团，存在于许多目前使用的抗癌药物中，例如蒽环类抗生素（柔红霉素、阿霉素、伊达比星和米托蒽醌）、放线菌素D和丝裂霉素C。受ML162的铁死亡诱导潜力与醌类衍生物活性抗癌效应的启发，本研究采用药效团杂合与生物电子等排策略，设计并合成了一系列ML162-醌偶联物，旨在通过铁死亡与凋亡双重细胞死亡过程，获得活性更强的抗癌药物。设计铁死亡与凋亡双重作用药物的目的，主要基于大量证据表明，凋亡与铁死亡的联合代表了一种极具吸引力的策略，可用于根除肿瘤细胞并解决与凋亡相关的耐药问题。研究者评估了所有合成化合物对铁死亡敏感的人纤维肉瘤HT1080细胞的抗增殖活性。随后，对其中最具潜力的化合物（GIC-20）进行了铁死亡及凋亡相关表型评价。最后，初步评估了该化合物对胰腺癌细胞的抗增殖及耐药逆转效应。 图1.(A)Gpx4在铁死亡过程中的作用；(B)具有代表性的Gpx4抑制剂的结构；(C)具有代表性的喹诺酮类化合物的结构；(D)铁死亡和诱导细胞凋亡的双重化合物的设计。 结果与讨论 1.化学合成 标题化合物GIC-1~13 和 GIC-16~22 的合成路线如方案1所示。以市售的苯乙胺 (1) 为起始原料，制得浅油状异腈 (2)。以异腈 (2)、对苯二胺 (3)、2-噻吩甲醛 (4) 和氯乙酸 (5) 为原料，通过Ugi 四组分反应得到 ML162 的关键衍生物 α-氯代酰胺类似物 (6)。将蒽醌、萘醌或氯化萘醌衍生物 (7) 与含氨基的羧酸衍生物反应，得到关键中间体 (8)，随后与 ML162 衍生物(6) 进行缩合反应，以不同产率得到目标化合物 GIC-1~13 和 GIC-16~22。 方案1. 化合物GIC-1~13，16-22的合成试剂和条件：a)CF2ClCOONa，K2CO3，DMF，100CFCOOC，12h；b)CH3OH，12h，20%；c：H2O，CH3CH2OH，24h；d)CH3CN，TCFH，nmi，12h。 标题化合物 GIC-14~15 的合成路线如方案2所示。为制备用于 Ugi 四组分反应的关键胺中间体 (12)，将市售的 4-氨基-2-氯苯酚先与二碳酸二叔丁酯反应对氨基进行保护，再与 3-溴丙炔进行亲核取代，随后用三氟乙酸脱除 Boc 保护基得到该中间体。在异腈 (2)、胺衍生物 (12)、2-噻吩甲醛 (4) 和氯乙酸 (5) 存在下，通过Ugi 四组分反应制得 ML162 衍生物（ML162-yne, 13）。萘醌衍生物 (14) 先与不同胺类反应，再用三氟乙酸脱除 Boc 保护基，得到关键中间体 (15)；随后该中间体在 TCFH 存在下与 2-叠氮基乙酸进行缩合反应，得到化合物 (16)。最后，通过铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成点击反应，将先前制备的 ML162-yne (13) 与中间体 (16) 结合，得到目标化合物 GIC-14~15。 方案2. 化合物GIC-14~15的合成试剂和条件：a)(Boc)2，THF/H2O，12 h；b)3-溴丙炔，K2CO3，DMF，12 h；c)TFA，DCM，6 h；d)CH3OH，12 h，20%；e)H2O，CH3CH2OH，24 h；TFA，DCM，6 h；f)CH3CN，TCFH，NMI，12 h；g)H2O，DMF，CuSO4，抗坏血酸钠，6 h。   2.生物评估 2.1 合成化合物对HT1080细胞的细胞毒作用 首先，选用对铁死亡敏感的人纤维肉瘤HT1080细胞系，通过Cell Counting Kit-8 (CCK-8)实验评估所有合成化合物的细胞毒性。实验以ML162作为参照药物，结果见表1。将蒽醌结构单元连接至ML162骨架后，所得的两个化合物GIC-1和GIC-2，其细胞毒性与ML162相比有所下降。分析其结构发现，连接ML162骨架与醌骨架的连接体（connector）对细胞毒性影响显著（IC50值分别为10.7 μM与3.7 μM），这表明该连接体是后续优化中的关键部分。接下来，研究者用甲氧基取代了稠合的苯环，得到的五个萘醌类化合物GIC-3~7对HT1080细胞表现出不同程度的细胞毒性，其中GIC-6活性最强（IC50 = 2.0 μM）。然而，将甲氧基从6位移至5位（GIC-7）导致活性相对于GIC-6降低了6倍（IC50值分别为13.7 μM与2.0 μM），这表明5位取代可能不利于细胞毒性。为了探究醌环核心上的取代基对细胞毒性的影响，研究者在醌基团的3位引入了甲基或氯原子。所得化合物GIC-8~13对细胞生长的抑制活性相近，IC50值在1.4 μM至3.4 μM之间，这显著削弱了不同连接体对活性的影响。基于GPX4抑制剂ML162本身含有一个氯原子的观察，为了验证在ML162骨架中引入氯原子是否能改善细胞毒性，研究者合成了另外两个化合物GIC-14~15。然而，它们的细胞毒性未发生显著变化。通过分析上述构效关系，研究者发现连接体的类型比R1和R2取代基在影响细胞毒性方面起着更为关键的作用。因此，研究者进一步合成了在R1或R2位无取代基的化合物GIC-16~22。正如预期，化合物GIC-19和GIC-20仍显示出相对较高的细胞毒性，其IC50值低于2 μM。总体而言，尽管研究者尝试对醌基团、连接体和ML162骨架部分进行了优化，但将凋亡相关的萘醌或蒽醌结构单元引入ML162骨架，并未增强其对HT1080纤维肉瘤细胞的细胞毒性。鉴于GPX4具有较浅的活性位点，可以推测在ML162骨架中引入体积较大的醌基团可能会阻碍ML162与GPX4的结合，从而导致由铁死亡途径触发的细胞毒性下降。值得注意的是，与ML162相比，所有化合物的Log P值均有所降低，这表明相对较高的Log P值可能有利于对HT1080细胞的细胞毒性，尽管在本研究中细胞毒性与Log P值之间并未观察到严格的正相关性。 表1. 合成化合物对HT1080细胞的细胞毒性。 2.2 GIC-20通过铁死亡过程诱导细胞死亡        考虑到不受控的脂质过氧化是铁死亡的一个标志性特征，研究者从中筛选出IC50值低于4 μM的14个化合物，使用对氧化敏感且对脂质过氧化特异的荧光探针BODIPY™ 581/591 C11，评估它们在HT1080细胞中诱导脂质过氧化（LPO）的水平。如图2A和B所示，在10 μM浓度下处理6小时后，其中三个化合物GIC-20、GIC-6和GIC-2表现出相对较高的诱导LPO积累的能力。鉴于ML162的选择性较差，而化合物的毒性是药物发现中的重要参数之一，研究者选择这三个化合物进一步评估它们对人正常胰腺HPNE细胞的毒性。结果如图2C所示，ML162对正常HPNE细胞同样具有很强的杀伤作用（IC50 = 0.75 μM，选择性指数（SI）= 1.25），而所选三个化合物对HPNE细胞的活性均低于ML162。其中，GIC-20对HPNE细胞的细胞毒性显著降低，IC50值为9.55 μM，是选择性最高的化合物（SI = 5.96）。因此，研究者选择GIC-20进行后续的生物学评价。接下来的浓度依赖性实验中，用不同浓度的GIC-20（0.5、1、2和4 μM）处理HT1080细胞12小时（图2D）。观察到GIC-20在低至1.0 μM的浓度下即可增加细胞内LPO水平，且在2 μM和4 μM时LPO显著升高。 图2. (A)用BODIPY™581/591C11进行细胞内脂质过氧化的流式细胞术分析；(B)图A所示的过氧化脂质的定量分析；(C)所选化合物对正常人胰腺HPNE细胞的细胞毒性；(D)经不同浓度的GIC-20处理后的过氧化脂质的定量分析，通过使用BODIPY™581/591C11的流式细胞仪测定。 考虑到活性氧（ROS）的积累是铁死亡的另一个重要标志，研究者随后应用2',7'-二氯荧光素二乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针来评估细胞内活性氧（ROS）的水平。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测发现，使用4 μM的GIC-20处理HT1080细胞后，细胞内ROS水平升高，其结果与ML162处理组相当（图3A）。此外，铁死亡会诱导细胞内线粒体形态发生显著改变，例如线粒体浓缩或肿胀、膜密度增加以及线粒体嵴减少。研究者通过透射电子显微镜（TEM）研究了4 μM GIC-20诱导HT1080细胞发生铁死亡的情况。如图3B所示，细胞表现出与铁死亡相关的典型形态学变化，包括线粒体破裂、线粒体肿胀、线粒体嵴减少或消失以及外膜破损，这些变化与铁死亡诱导剂ML162所诱导的变化相似。总体而言，所有结果表明GIC-20通过铁死亡过程诱导细胞死亡。为了进一步证实这一观察结果，研究者使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）来验证化合物GIC-20的细胞杀伤作用是否源于铁死亡。正如预期，当化合物GIC-20（4 μM）与Fer-1（1 μM）联合使用时，细胞存活率百分比发生了显著变化，从30%增加至66%（图3C）。这些结果表明，化合物GIC-20的有效细胞毒性至少部分是通过诱导HT1080细胞发生铁死亡来实现的。 鉴于观察到GIC-20对HT1080细胞具有明显的铁死亡诱导效应，研究者因此对其潜在机制进行了初步探索。除基于配体的结构药物设计（LBDD）方法获得的GIC-20可能具有GPX4抑制效应外，受近期研究发现——将合适的共价官能团引入蛋白质靶向配体可诱导蛋白质降解（分子胶降解剂）——的启发，并且考虑到GIC-20本身含有一个共价性的醌基团，研究者也检测了其对GPX4的降解作用。正如预期，在2 μM的低浓度下处理24小时后，即可观察到GIC-20引起明显的GPX4下调，且该效应呈剂量依赖性增强；而在相同2 μM浓度下，ML162并未诱导此类GPX4下调效应（由于其高细胞毒性，无法在4 μM浓度下获取足够蛋白进行分析）（图3D和E）。为进一步确认GIC-20下调GPX4的效应是否由蛋白酶体降解途径介导，而非通过调控其上游相关蛋白实现，研究者使用了蛋白酶体抑制剂MG132来阻断该降解通路。结果发现，联合使用MG132（5 μM）完全阻断了GIC-20在2 μM和4 μM浓度下介导的GPX4降解（图3F和G）。这些结果表明，GIC-20可能不仅仅是一个GPX4抑制剂，还能作为靶向GPX4的分子胶降解剂来触发铁死亡。无论主要触发铁死亡的机制是哪种，GIC-20与GPX4的结合都至关重要。因此，研究者进行了一项共价分子对接研究，以深入探究GIC-20在GPX4中潜在的结合模式。如图3H和I所示，除了共享的共价相互作用（与Sec46残基结合）外，与ML162相比，GIC-20在GPX4活性位点内显示出不同的结合姿态。简而言之，ML162可与Trp136、Gln81和Gly47残基形成三个氢键，而在活性位点中，GIC-20仅观察到一个氢键相互作用（与Gly45）和一个面对面π-π堆积相互作用。此外，萘醌部分朝向溶剂区，与蛋白质的接触较少。这些发现或许可以部分解释为何观察到的GIC-20对HT1080细胞的抗增殖活性低于ML162。 图3.激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内ROS；4μM GIC-20或ML162处理后细胞内线粒体形态变化；(C)GIC-20铁死亡选择性评价；(D)GIC-20剂量依赖性下调Gpx4水平；(E)ML162对Gpx4水平无明显影响；(F)GIC-20通过蛋白酶体降解途径剂量依赖性下调Gpx4水平；(G)图F所示灰比定量分析；(H)Gpx4与ML162络合物的晶体结构(氢键用黄色虚线表示，金色：Se原子，与ML162共价键)；(I)GIC-20与Gpx4的共价分子对接(氢键用黄色虚线表示，金色：Se原子，与GIC-20共价键)。 2.3 GIC-20通过细胞凋亡过程诱导细胞死亡        众所周知，细胞凋亡在抑制肿瘤发生和癌症治疗中至关重要，因此激活凋亡是大多数化疗药物杀伤癌细胞的主要机制。许多研究表明，1,4-萘醌衍生物可通过多种途径发挥优异的抗肿瘤活性，例如增加ROS水平、诱导细胞氧化应激以及激活线粒体凋亡通路。鉴于萘醌部分在诱导线粒体凋亡中的作用，研究者推测化合物GIC-20也可能具有促凋亡效应。为验证这一假设，研究者首先通过蛋白质印迹法检测了GIC-20对两种凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平的影响。如图4A所示，GIC-20以浓度依赖的方式增加了HT1080细胞中促凋亡蛋白Bax的水平，同时降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平。相反，ML162在2 μM和4 μM浓度下显著下调了促凋亡蛋白Bax的水平，这表明GIC-20杀伤HT1080细胞的机制除了铁死亡外，还涉及独特的凋亡途径。随后，研究者以ML162为对照，通过Annexin V-FITC/PI染色实验进一步探究GIC-20诱导癌细胞凋亡的能力。如图4B、C和E所示，流式细胞术分析结果表明，用不同浓度（1、2和4 μM）的化合物GIC-20处理HT1080细胞24小时后，细胞早期与晚期凋亡的总百分比随着浓度增加分别上升至6.96%、13.23%和17.03%；而在ML162处理组中未观察到这种浓度依赖性效应。值得注意的是，尽管ML162诱导的早期与晚期凋亡总百分比高于GIC-20，但在各测试浓度下，与各自对照组相比，ML162显著增加了晚期凋亡，而GIC-20则在诱导早期凋亡方面表现出更大潜力。为进一步确认该现象，研究者将孵育时间延长至48小时，结果同样表明ML162主要触发晚期凋亡，而GIC-20则主要引发早期凋亡（图4D和E；需特别指出，当处理时间延长至48小时时，ML162与GIC-20在凋亡总百分比方面未观察到显著差异）。晚期凋亡主要涉及细胞膜损伤、细胞死亡和解体过程，且在此检测方法中无法区分晚期凋亡与同样伴随细胞膜损伤和完整性破坏的铁死亡。GIC-20诱导的早期凋亡率升高，可能为将其与铁死亡区分提供线索。综上所述，这些结果证实了化合物GIC-20在HT1080细胞中具有浓度依赖性的凋亡诱导活性。 作为一种评价癌细胞贴附、存活与增殖能力的重要指标，平板克隆形成实验被广泛用于评估细胞生长成集落并进行“无限”分裂的能力。为深入探究GIC-20通过诱导凋亡与铁死亡的双重效应对HT1080细胞克隆形成能力的抑制作用，研究者进行了平板克隆形成实验。如图4F所示，HT1080细胞暴露于浓度低至1 μM的GIC-20后，其形成的克隆数量与大小均以浓度依赖的方式显著减少。结果表明，GIC-20能有效抑制HT1080细胞的增殖。细胞迁移是肿瘤转移的另一个重要生物学特征，与癌症治疗的恶性进展及复发密切相关。为研究化合物GIC-20是否能抑制这一转移过程，研究者通过伤口愈合实验评估了HT1080细胞的迁移能力。如图4G和H所示，与处理组相比，未处理细胞在48小时后的划痕区域面积显著减小，这表明经GIC-20处理后，HT1080细胞的迁移能力受到显著且浓度依赖性的抑制。 图4.用ML162和GIC-20处理HT1080细胞24小时后，用免疫印迹法检测Bcl一2和Bax的蛋白水平；(B)用指示浓度的GIC-20处理HT1080细胞24小时后的细胞凋亡率分析；(C)以指示浓度的ML162处理24小时的HT1080细胞的细胞凋亡率分析；(D)用指示浓度的GIC-20和ML162处理HT1080细胞48小时后的细胞凋亡率分析；(E)重复三次后的凋亡率统计图；(F)指示浓度的化合物GIC-20对HT1080细胞克隆形成的影响；(G)创伤愈合实验显示指示浓度的化合物GIC-20处理HT1080细胞24小时或48小时的代表性光学显微镜照片；(H)重复三次后图G的迁移区域统计图。 2.4 GI-C20的体内抗肿瘤作用        受化合物GIC-20通过铁死亡与凋亡双重过程对HT1080癌细胞表现出有效抗癌活性的鼓舞，研究者进一步在携带HT1080肿瘤的异种移植BALB/c裸鼠模型中评估了其抗肿瘤效果。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组5只），包括生理盐水对照组、ML162（20 mg/kg）组、GIC-20（20 mg/kg）组和GIC-20（40 mg/kg）组。小鼠按指定剂量每天腹腔注射给药一次，持续19天，并每2天测量其体重和肿瘤体积（图5A）。治疗结束后处死小鼠，记录肿瘤重量并拍摄肿瘤照片。如图5B~5D所示，与对照组相比，各治疗组小鼠的肿瘤生长均受到显著抑制。GIC-20表现出剂量依赖性效应，较高剂量的GIC-20具有更好的肿瘤生长抑制效果，在40 mg/kg的腹腔注射剂量下，肿瘤生长抑制率（TGI）达到63%。尽管在20 mg/kg剂量下，GIC-20与ML162观察到相似的肿瘤生长抑制效果，但ML162治疗组小鼠的体重与GIC-20组相比出现显著下降，提示GIC-20的毒性较低（图5E）。此外，从每个治疗组的五个肿瘤样本中随机采集一个，通过免疫组织化学（IHC）染色检测铁死亡相关蛋白GPX4和4-HNE（4-羟基壬烯醛，一种脂质过氧化标志物）以及抗凋亡标志物Bcl-2的水平。正如预期，与溶剂对照组相比，GIC-20治疗组的GPX4和Bcl-2水平呈剂量依赖性降低，而4-HNE水平则有所升高（图5F）。 图5.(A)所选化合物的体内抗肿瘤效果研究示意图；(B)不同组裸鼠皮下移植瘤的图像；(C)不同组小鼠体内肿瘤重量的比较；(D)HT1080荷瘤小鼠经不同治疗方法后的肿瘤体积生长曲线；(E)治疗期间小鼠体重的变化；(F)不同组(比例尺=20μm)Gpx4、4-HNE和Bcl一2的代表性免疫组织化学染色分析。 为进一步确认GIC-20的毒性特征，研究者通过苏木精-伊红（H&E）染色检查了主要器官的病理变化。如图6所示，与对照组相似，GIC-20治疗组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织学形态均保持完整，未观察到明显的细胞炎症、水肿或坏死，这表明GIC-20对主要器官无明显毒性。 图6. 主要器官切片的H&E染色(比例尺=20μm)。 2.5 GIC-20对AMG510耐药的MIA-PACA-2细胞耐药性的逆转作用        胰腺癌作为最具致死性的癌症类型之一，是一种难治性恶性肿瘤，其五年生存率处于最低水平。KRAS癌基因在胰腺肿瘤的发生与维持中起着关键作用，是治疗干预的主要靶点。因此，近年来已开发出多种靶向KRAS^G12C癌蛋白的共价抑制剂，并在临床中显示出良好疗效，例如AMG510和MRTX849。然而，肿瘤细胞对化疗产生耐药性已成为普遍现象和棘手难题，严重影响了化疗疗效。同样，获得性耐药也迅速出现并削弱了KRAS^G12C抑制剂的活性。新兴研究表明，近年来铁死亡为治疗对化疗不敏感的肿瘤提供了新思路，尽管目前对耐药癌细胞敏感于铁死亡的确切机制尚未完全阐明。此外，铁死亡诱导剂如erastin已被证明能增强包括阿霉素、顺铂、替莫唑胺和阿糖胞苷在内的传统抗癌药物的化疗效果。同时，与正常细胞相比，癌细胞表现出更高的铁需求，这种铁依赖性使得癌细胞对铁死亡更为脆弱。综上所述，越来越多的证据支持铁死亡可作为应对化疗耐药的一种潜在策略。鉴于铁死亡诱导剂在克服耐药性方面的多重作用，研究者进一步评估了GIC-20对AMG510耐药的MIA-PaCa-2细胞（简称MIA-PaCa-2-AMG510R）的影响。        耐药性MIA-PaCa-2-AMG510R细胞系由本实验室通过将亲代MIA-PaCa-2细胞在6个月内持续暴露于浓度递增的AMG510中而获得。为验证MIA-PaCa-2-AMG510R细胞是否对AMG510产生耐药性，研究者采用CCK-8法检测了细胞暴露于不同浓度AMG510 48小时后的活力。如图7A和B所示，AMG510对亲代MIA-PaCa-2细胞（简称MIA-PaCa-2-WT）的IC50值约为10 nM。然而，对于MIA-PaCa-2-AMG510R细胞，即使AMG510浓度增加至1 μM，其细胞抑制率仍无法达到50%，这证实了该细胞系对AMG510产生了耐药性。值得注意的是，GIC-20在浓度高达5 μM时，并不能显著抑制MIA-PaCa-2-AMG510R细胞的生长，但在10 μM浓度下观察到了明显的抑制作用，这表明GIC-20具有杀伤耐药性MIA-PaCa-2-AMG510R细胞的潜力（图7C）。更有趣的是，当与5 μM（无毒剂量）的GIC-20联用时，MIA-PaCa-2-AMG510R细胞对AMG510的敏感性显著增强：在10 nM AMG510浓度下，细胞存活率从约90%降至约10%（此条件下未观察到AMG510的浓度依赖性效应），这表明GIC-20与AMG510对耐药性MIA-PaCa-2-AMG510R细胞具有增敏或协同作用（图7D）。需要指出的是，与GIC-20不同，ML162在浓度高达3 μM时即能抑制MIA-PaCa-2-AMG510R细胞的生长（图7E）；然而，在1 μM的无毒浓度下，与GIC-20相比，ML162与AMG510联用对耐药性MIA-PaCa-2-AMG510R细胞所展现的增敏效应相对较弱：在10 nM AMG510浓度下，细胞存活率从约90%降至约60%（图7F）。目前，这种增敏作用背后的分子机制尚不清楚，一种可能的解释是铁死亡与凋亡的协同效应。 图7.不同浓度药物作用48小时后的细胞活力。(A)AMG510对MIA-PACA-2-WT细胞的细胞活力；(B)AMG510对MIA-PACA-2-AMG510R细胞的细胞活力；(C)GIC-20对MIA-PACA-2-AMG510R细胞的细胞活力；(D)AMG510联合5μM GIC-20对MIA-PACA-2-AMG510R细胞的细胞活力；(E)ML162对MIA-PACA-2-AMG510R细胞的细胞活力；(F)AMG510联合1μMML162对MIA-PACA-2-AMG510R细胞的杀伤活性。 总结 综上所述，本研究通过药效团杂合与生物电子等排策略，设计并合成了一系列ML162-醌偶联物，旨在通过铁死亡与凋亡双重细胞死亡过程获得活性更强的抗癌剂。大部分目标化合物对HT1080细胞显示出有效的细胞毒性。初步的构效关系研究强调了连接体类型对其抗HT1080细胞增殖活性的重要影响。其中，优选化合物GIC-20在体外和体内均展现出良好的抗癌活性，且与ML162相比无明显毒性。一方面，GIC-20可通过诱导细胞内脂质过氧化物与活性氧积累、破坏线粒体结构来触发细胞铁死亡。除了抑制GPX4活性，机制研究还揭示GIC-20可通过蛋白酶体介导的GPX4降解途径引发铁死亡，提示其可能作为分子胶降解剂发挥作用。另一方面，GIC-20亦能通过上调HT1080细胞中促凋亡蛋白Bax水平、下调抗凋亡蛋白Bcl-2水平来诱导细胞凋亡。上述发现均表明，GIC-20通过细胞内的铁死亡与凋亡双重靶向过程，在体外和体内发挥了良好的抗肿瘤活性。此外，GIC-20还能增强耐药性MIA-PaCa-2-AMG510R细胞对AMG510的敏感性，这提示GIC-20在克服KRAS^G12C抑制剂获得性耐药方面具有巨大潜力。 参考文献： MA F, LI Y, CAI M, et. ML162 derivatives incorporating a naphthoquinone unit as ferroptosis/apoptosis inducers: Design, synthesis, anti-cancer activity, and drug-resistance reversal evaluation[J/OL]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2024, 270: 116387. DOI:10.1016/j.ejmech.2024.116387. 撰写：敬业福 校稿&排版：青玫 版权声明 本文首发于微信公众号：药海撷英 转载请注明出处 征稿启事 药海撷英是一个专注于药物研发的公众号， 面向药学科研工作者，爱好者，探讨新型药物开发和药理实验技术，定时推送相关科研文章，以及一些药物领域资讯 。所以，欢迎大家多多参与投稿。 投稿方式： 邮箱发送进行投稿 。标题备注：公众号投稿  邮箱：chenxiu0725@qq.com The End