Loncastuximab tesirine

摘要：抗体-药物偶联物是近年来在医学领域引起广泛关注的尖端生物技术。与药物分子结合的抗体可以将药物精确递送到病灶部位，这在治疗肿瘤和免疫疾病方面显示出巨大的潜力。本文概述了当前流行的抗体偶联技术，并总结了各种常见的抗体偶联技术，包括抗体偶联的小毒性分子、抗体偶联寡核苷酸、抗体偶联细胞和抗体偶联聚合物。它为靶向药物递送技术提供了一种新的治疗策略和手段。最后讨论了抗体-药物偶联物的挑战和未来发展。【NO.1】引言本综述重点介绍了过去几年抗体偶联技术取得的最新进展。并指出不同技术的差异和特点。图1：抗体偶联技术。有四种标准方法可以修饰抗体，包括ADC、AOC、ACC和ABC。ADC可以通过毒性分子的杀伤作用、抗体依赖性细胞细胞毒性和旁观者效应使癌细胞凋亡。AOCs可以通过寡核苷酸的基因沉默作用和抗体依赖性细胞毒性使癌细胞凋亡。ACC可以通过杀死受影响的细胞来使癌细胞凋亡。ABC经常通过抗体依赖性细胞细胞毒性使癌细胞凋亡。ABC，抗体偶联聚合物;ACC，抗体偶联细胞;ADC，抗体偶联的毒性小分子;AOC，抗体偶联的寡核苷酸。【NO.2】抗体偶联小毒性分子ADC包括一种小分子药物和一种通过化学接头连接的抗体。1983年，通过将抗癌抗体与Vindesine偶联进行了第一次成功的临床试验。第一代ADC经常使用鼠抗体，很容易引起抗鼠抗体。此外，少量抗体可触及肿瘤，不稳定的连接子在血浆中释放毒素，导致效力不足。第二代ADC的抗体是人源抗体，可改善肿瘤细胞靶向性并减少与健康细胞的交叉反应性。更重要的是，在第二代ADC中发现了更有效的小分子物质。与第一代ADC相比，第二代ADC具有更好的化学、制造和控制特性。然而，大多数第二代ADC具有赖氨酸和半胱氨酸残基的马来酰亚胺基团，这些基团在血清中容易发生脱钩反应，导致脱靶细胞毒性。因此，大多数第二代ADC具有未结合的抗体，显示出较窄的治疗窗口。此外，大多数第二代ADC的药物抗体比（DAR）为8，但DAR>4的ADC表现出低耐受性、低体内疗效和高血浆清除率。到目前为止，第二代ADC难以满足患者的需求。位点特异性偶联被认为是第三代ADC成功开发的关键。第三代ADC使用位点特异性结合来提高稳定性和药代动力学、低偶联脱落率、高药物活性和低抗原水平下的高细胞活性。截至2023年，有15个ADC（见图2）。图2：已上市的15款ADC的信息摘要ADC通常利用巯基和氨基作为连接位点，将单克隆抗体与小分子偶联（见表1）。通过与巯基偶联制备了几种已上市的ADC，如Adcetris、Polivy、Padcev、Enhertu、Blenrep、Trodelvy和Zynlonta。表1.ADC中常用有毒小分子的性质和机制目前，用于位点特异性修饰的偶联技术很多，如半胱氨酸偶联技术、工程突变体非天然氨基酸偶联技术、糖基偶联技术、多肽酶偶联技术等。2.1.半胱氨酸的定点偶联链间二硫键连接抗体的重链和轻链。打开抗体的链间二硫键对抗体的结构和功能影响不大，可以获得反应性半胱氨酸。因此，抗体-药物的定点偶联可以通过修饰链间二硫键来实现。选择合适的还原剂来减少抗体的链间二硫键，然后将还原的抗体与与二磺酸盐或二溴比甲烷连接的小分子毒素反应，以实现抗体-药物的位点特异性偶联。也可以使用噬菌体展示方法筛选抗体Fab表面的抗原结合位点的反应性半胱氨酸突变。基因泰克为曲妥珠单抗选择了LC-V110和HC-A114半胱氨酸突变，使用三（2-羧乙基）膦或二硫苏糖醇选择性地减少链间二硫键。突变半胱氨酸的游离巯基被还原，然后使用CuSO4或脱氢抗坏血酸重新连接链间二硫键。最后，游离巯基与药物接头反应，实现位点特异性偶联。2.2.非天然氨基酸的位点特异性偶联在天然氨基酸中，只有赖氨酸和半胱氨酸可用于偶联。非天然氨基酸可以掺入重组蛋白中，获得可与小分子药物发生化学反应的侧链。因此，非天然氨基酸为开发ADC提供了一种新的技术途径。核糖体上的蛋白质合成是通过识别带有mRNA密码子的tRNA反密码子进行的。安博生物公司推出了能够特异性识别非天然氨基酸的tRNA和相应的氨酰基-tRNA合成酶，使非天然氨基酸能够整合到多肽链中，合成重组抗体。引入的非天然氨基酸通常是乙酰苯丙氨酸（1）、氨基甲基-L-苯丙氨酸（2）和酸性赖氨酸（3）。非天然氨基酸上的酮和叠氮化物官能团可以与药物接头发生化学反应，获得具有均匀DAR的ADC。酮基能与羟胺基团形成肟键，叠氮化物基团在铜的催化下能与炔烃发生环加成反应，生成1,2,3-三唑。叠氮化物基团也可以在不存在铜催化的情况下与环辛炔结合，进行叠氮化物-环辛炔环加成反应。通过非天然氨基酸与接头偶联的抗体可以位点特异性和定量偶联。DAR具有良好的均匀性、有效性、稳定性和安全性。2.3.糖基的位点特异性偶联抗体在Fc区含有聚糖链，可用于聚糖重塑和糖基化以进行位点特异性偶联。研究人员利用β-1,4-半乳糖基转移酶（GalT）和α-2,6-唾液酸转移酶（SialT）将半乳糖和唾液酸残基转移到抗体的天然聚糖上。然后，用高碘酸钠（NaIO4）氧化半乳糖或唾液酸中的邻二醇基团，引入醛基。利用醛与含有肼或伯胺官能团的分子的反应来实现位点特异性偶联，从而产生具有均匀DAR的ADC。糖转移酶还可以引入叠氮化物基团，然后与环辛炔反应形成稳定的ADC。2.4.酶的位点特异性偶联酶促偶联具有位点特异性偶联的优势。转谷氨酰胺酶（TGase）催化谷氨酰胺与赖氨酸及其衍生物之间的反应。野生型TGase将药物接头的胺转移到抗体的去糖基化重链Q295上，抗体和药物的位点特异性偶联也可以实现。Innate Pharma公司突变重链聚糖的N297残基，然后使用TGase偶联抗体药物。辉瑞公司提议将谷氨酰胺标记的LLQGA肽序列插入抗体中。通过TGase对LLQGA肽序列中谷氨酰胺的特异性识别，药物与其偶联。ADC中的抗体特异性结合靶抗原并促进受体介导的内吞作用，导致ADC内化为酸化的富含蛋白水解酶的内体囊泡，随后递送到溶酶体中（见图3）。对于具有可切割接头的ADC，其切割过程（如水解、蛋白酶消化或二硫键还原）可能发生在内体阶段。然而，具有不可切割接头的ADC会导致溶酶体中的蛋白水解降解。此外，ADC发生分解代谢以释放细胞毒性分子，这些分子通过DNA损伤或抑制微管聚合引起细胞凋亡。靶细胞死亡后，细胞毒性分子也可能从靶细胞中排出，通过旁观者杀伤效应杀死邻近的肿瘤细胞和周围的基质组织，这一过程取决于细胞毒性药物的疏水性。图3：ADC在体内的代谢过程。当ADC注射到血液中时，ADC会通过抗体富集癌症，抗体可以通过抗体依赖性细胞毒性收集效应细胞。同时，ADC可以被内吞到癌细胞中并释放出小的毒性分子，从而使癌细胞凋亡。此外，小的有毒分子可以穿过细胞并通过旁观者效应杀死其他癌细胞。可裂解接头可分为三种类型（见表2）：（1）酸响应性腙键;（2）氧化还原响应二硫键;（3）酶促可切割的肽键。酸响应性肼连接子在中性pH值（pH7.3–7.5，相当于血液pH值）下表现出稳定性。然而，在内化到酸性区室（如内体（pH5.0-6.5）和溶酶体（pH4.5-5.0））后，接头会发生水解。这种类型的接头已用于与阿霉素、卡奇霉素和大杂烩素偶联。氧化还原响应性二硫键已被用于偶联新型metan衍生物DM1和DM4。发现肿瘤细胞质中还原型谷胱甘肽的表达高于正常细胞质中的表达。二硫键偶联物质在整个心血管周期中保持完整，在与肿瘤细胞中的高浓度谷胱甘肽结合后，抗体在溶菌酶内被降解和激活，导致代谢物形成Matan衍生物接头化合物。接头的后续降解是否发生取决于二硫键化合物的附着碳原子施加的空间位阻。理想的接头应保持ADC药物在血浆中的高稳定性，并在释放和代谢之间取得最佳平衡。肽接头，如缬氨酸-瓜氨酸二肽，用于偶联阿霉素、丝裂霉素C、喜树碱、他雷霉素、奥司他汀和双胞胎素衍生物的偶联。这些接头表现出组织蛋白酶B和纤维蛋白溶解酶的选择性水解。含有硫醚键的不可裂解接头已在临床研究中被广泛研究，用于偶联DM1和MMAF以形成ADC。进入溶酶体后，单克隆抗体发生降解，释放出有毒药物。此外，毒性药物仍然附着在氨基酸残基和接头上。这种代谢物带有电荷，不能渗透穿过细胞膜;因此，它不能通过旁观者杀戮来发挥其细胞毒性作用。表2.ADC中常见的连接子类型和机制在过去几年中，ADC有所增加，已在临床试验中测试了100多种不同的ADC。然而，由于不可接受的毒性和过于狭窄的治疗窗口，许多ADC已退出临床试验或市场。这些ADC通常受到各种因素的限制，最重要的因素是肿瘤内和肿瘤间异质性。为了提高ADC的效果，双旁位ADC、前体-药物偶联物、免疫刺激抗体偶联物和双药ADC已进行临床研究，这对于克服临床挑战至关重要。【NO.3】抗体偶联寡核苷酸在过去的25年中，超过16种寡核苷酸疗法已被批准用于治疗适应症。然而，siRNA疗法面临三个主要挑战：选择性、稳定性和递送。其中，选择性可以通过生物信息或化学修饰来解决，稳定性可以通过化学改性来解决。然而，由于各种器官存在独特的障碍，递送过程带来了挑战。当核酸与抗体相互作用时，它们可以利用基于核酸的药物的精确靶向和抗体的特异性递送优势。抗体和细胞表面受体之间的特异性相互作用可以将它们递送到组织或细胞亚群，并且几种受体已成功用于siRNA的靶向递送，包括HIVgp160蛋白、HER2、CD7（T细胞标志物）、CD71（转铁蛋白受体，在心脏和骨骼肌中高度表达）和TMEFF2。AOC的结构类似于ADC，具有三个主要成分：抗体、接头和核酸有效载荷。AOC的核酸有效载荷可以是单链或双链，并且可以对其进行修饰以抵抗核酸酶、降低毒性、提高细胞摄取效率、防止核内逃逸，并最大限度地减少TLR刺激或避免模式识别受体。AOC有几种偶联方法，包括离子相互作用、亲和结合、直接偶联以及使用双链作为偶联部分（参见图4）。寡核苷酸的负电荷为偶联反应提供了一条有前途的途径。聚阳离子基团可以通过离子静电相互作用有效地与寡核苷酸骨架偶联（参见图4A）。这种方法用途广泛，适用于各种类型的寡核苷酸，因为它不需要任何化学修饰。鱼精蛋白是最常用的聚阳离子基团，是一种在精子中发现的内源性蛋白质，已被用于调节胰岛素活性。此外，sulfo-SMCC作为一种双功能交联剂，通过结合胺和巯基反应性，促进通过酰胺键和硫醚键形成扩展间隔区。可以通过杂交技术合成AOC以掺入双链寡核苷酸（参见图4B）。最初，单链寡核苷酸与抗体偶联，然后通过互补链杂交形成双链AOC。AOC的直接耦合类似于ADC中采用的耦合技术（见图4C）。在AOC中，寡核苷酸应进行化学修饰以与接头结合，然后与抗体中的赖氨酸、半胱氨酸或工程氨基酸偶联。这种方法在AOC中使用短接头，对偶联物的影响最小。此外，接头技术必须在DNA或RNA退火过程中表现出相容性和稳定性。生物素标记的寡核苷酸和亲和素之间的相互作用也成功产生了AOC（图4D）。图4：抗体和寡核苷酸的常见偶联方法。（A）当裸抗体整合一个多阳离子基团时，化合物可以通过离子相互作用连接寡核苷酸。（B）单链寡核苷酸与裸抗体偶联，然后另一个寡核苷酸可以通过互补链杂交连接。（C）寡核苷酸可以通过直接化学偶联在裸露的任何人体内连接。（D）生物素标记的寡核苷酸和亲和素之间的相互作用产生AOC。目前，在研的抗体偶联核酸药物主要来自Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、Tallac、Denali等四家公司，其中Avidity是开发AOCs的先行者。第一个进入临床的抗体偶联核酸药物是Avidity BiosciencesAOC1001。AOC1001由三部分组成：靶向转铁蛋白受体1（TfR1）的mAb、接头和靶向DMPKmRNA的siRNA，适用于强直性肌营养不良症I型（DM1）。TfR1在细胞表面广泛表达以将铁输送到细胞中，而肌肉细胞需要大量的铁，这使得靶向TfR1将药物输送到肌肉细胞非常有效。AOC1001靶向TfR1递送siRNA并敲低突变DMPK表达水平，从而释放MBNL以发挥其治疗疾病的正常功能。Avidity Biosciences AOC1020也于2022年9月进入临床，包括靶向DUX4mRNA的TfR1、接头和siRNA。AOC1020适用于面部肩肱肌营养不良症（FSHD），它通过减少DUX4的表达来治疗FSHD。目前全球正在开发的抗体偶联核酸药物的详细信息如表3所示。表3.AOC进入临床试验AOC面临许多挑战。当AOC进入体内时，它们会由内体运输，然后到达多泡，最终被溶酶体降解。在整个过程中，寡核苷酸的pH值会发生变化（从7.4到4.5）。考虑到寡核苷酸是聚阴离子大分子，它们从内体脂质双层逃逸进入细胞内部构成了相当大的挑战。因此，通过结构修饰提高寡核苷酸的稳定性和生物利用度以及解决内体逃逸已成为克服其治疗效果障碍的关键决定因素。迄今为止，很少有研究成功克服这些障碍；此外，内体逃逸的潜在机制可能导致内体膜破裂，随后其大量内容物释放到细胞质中。该事件可以激活先天免疫反应和其他毒性途径，同时缩小基于寡核苷酸的疗法的治疗指数。此外，ADC面临的挑战可能比AOC更大，包括接头异质性、疏水性、聚集性、不稳定性和有效载荷大小。值得注意的是，虽然ADC中小分子药物的分子量小于2kDa，但AOC中的寡核苷酸部分可以超过10kDa。因此，寡核苷酸对共轭实体物理和化学性质的影响超过了小分子。【NO.4】抗体偶联细胞ACC技术代表了一种新型的细胞免疫疗法。与CAR-T和TCR-T细胞疗法不同，ACC技术能够将任意肿瘤靶向抗体附着在人类免疫细胞上，例如自然杀伤（NK）细胞和γ-δT细胞。ACC将精确靶向的抗体与细胞相结合，可以改善细胞的许多固有功能，例如红细胞中的长循环、伤口靶向能力以及穿越血脑屏障的能力。代谢葡萄糖工程和生物正交反应经常用于ACC的设计（见图5A）。代谢糖工程意味着非天然单糖类似物被同化到细胞中，转化为活化的膦核苷酸供体，并通过糖基转移酶掺入特定的聚糖结构中。这项技术能够将糖单元精确地组装到糖萼上，糖萼是细胞膜上的一种结构，在那里它们可以与化学基团相互作用。随后，抗体可以通过生物正交反应附着在细胞表面。基因工程是将治疗性蛋白质掺入细胞成员的另一种有用方法，通常通过电穿孔或基因递送（病毒、脂质和聚合物载体）。慢病毒和逆转录病毒载体在体外具有很高的转染效率，可以将目标基因整合到宿主细胞基因组中，以实现持续的蛋白质表达。图5：ACC耦合策略。（A）代谢糖可以通过代谢工程类似于细胞，然后抗体可以连接特定的聚糖结构。（B）基因工程可以将治疗性蛋白质整合到细胞成员中。NK细胞，包括脐带血来源的NK细胞和人NK-92细胞系，对实体瘤具有有效的细胞毒性。由于缺乏克隆扩增，患者没有免疫介导的alloNK细胞排斥反应。因此，不太可能发生严重的副作用，例如细胞因子释放综合征（CRS）或移植物抗宿主病。基于NK细胞的强大功能，InBio开发了抗体偶联的NK细胞平台，并开发了IBR854、IBR733和IBR822等多个通用斑点型细胞治疗产品。IBR854治疗目前没有或没有耐受标准疗法（由抗5T4抗体和NK细胞偶联）的不起眼的局部晚期或转移性实体瘤患者。IBR733用于急性髓系白血病，并于2024年第一季度开始临床注册。IBR733通过接头将双靶向CD33/CLL1抗体化学共价偶联至NK细胞，具有极高的安全性和有效的肿瘤细胞杀伤能力。IBR822由Trop2抗体和NK细胞组成，适用于晚期实体瘤，并于2024年开始I期临床试验。IBR854、IBR733和IBR822这三个产品都由两个接头耦合。第一个接头与抗体偶联，第二个接头与NK细胞偶联，第一个接头与第二个接头偶联形成抗体-NK偶联物。第一个接头是反应性酯，例如五氟苯基酯，能够与抗体的赖氨酸残基反应形成酰胺键。第二种接头是水性相稳定分子，特异性共价结合唾液酸修饰的膜蛋白。在细胞培养阶段，第二个接头可以通过细胞的代谢途径转移到唾液酸修饰的膜蛋白上。第二接头的联氮乙酰基可以与第一接头的碳-碳三键发生环化，形成稳定的三唑五元环，类似于图5A和6A。图6：细胞偶联抗体的情况。（A）抗体与NK细胞偶联，NK细胞通过抗体靶向癌细胞。（B）抗体与红细胞偶联，抗体通过激活T细胞来治疗癌细胞。（C）抗体与血小板偶联，血小板通过凝血功能到达癌症部位。并在癌症部位富集抗体，从而激活T细胞在治疗癌细胞中发挥作用。NK，自然杀手。红细胞具有天然生物相容性、高通量负荷、低免疫原性、完全生物降解性和长周期（120天）。网状内皮系统可以去除衰老或受损的红细胞，并可以实现完全生物降解。红细胞没有细胞核，没有线粒体和DNA。因此，无论红细胞前体的基因工程修饰如何，它们在去核后都会被消除，这样细胞在导入受体后不会导致异常生长或肿瘤形成。红细胞可以在脾脏中有效分布，脾脏中富含反应性T细胞，并且还保留了大量的免疫抑制细胞。因此，治疗性抗体可以激活脾脏中的免疫细胞。Westlake Therapeutics基于第三代红细胞转化技术开发了WTX-212产品（用PD-1抗体改造红细胞）。该产品将PD-1抗体与红细胞偶联，有效分布在脾脏和外周组织中，激活外周免疫效应细胞发挥肿瘤杀伤功能。预计这种方法将克服免疫抵抗。WTX-212产品已进入临床研究阶段。WTX-212在慢病毒表达载体中构建了靶序列，随后对其进行慢病毒包装以产生用于慢性病治疗的高滴度浓缩物。从外周血单核细胞中分离并富集Lin-CD34细胞，并诱导Lin-CD34细胞分化为红系并扩增。最后，使用慢病毒浓缩物感染Lin-CD34细胞并去核以获得成熟的抗PD-1scFv-红细胞这与图5B和6B相似。YixinWang等人抗PD-1抗体与血小板的联合治疗（图6C）。通过将抗PD-1抗体上的胺基与血小板表面的巯基与磺酸盐-SMCC接头上的巯基偶联来制备偶联物。在共聚焦显微镜下观察到来自小麦杂物蛋白（WGA）594标记血小板的红色信号与来自异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体的绿色信号之间的重叠，表明aPD-1在血小板上成功修饰。当肿瘤部位出血时，血小板会主动聚集在血管损伤部位进行止血。同时，它们响应凝血信号并参与血栓形成，迅速富集肿瘤部位的抗体，以确保基于细胞的递送系统的靶向性和可控性。虽然ACC具有良好的治疗效果，但仍有许多困难需要克服。首先，经过修饰的细胞可能被免疫系统清除，导致体内有效作用的时间有限，难以维持抗肿瘤效果。一些抗体偶联细胞可能会内化到细胞中，导致细胞表面的抗体减少，从而影响它们识别和杀死靶细胞的能力。此外，抗体偶联细胞依赖于信号通路，肿瘤细胞可能通过各种机制干扰这些信号，从而阻止抗体偶联细胞有效激活。患者免疫状态不同，对ACC的反应也不同。免疫功能较弱的患者可能无法提供足够的协同作用，也可能增加感染等并发症的风险。【NO.5】抗体偶联生物聚合物聚合物因其生物降解性、生物相容性、机械强度、导电性和刺激反应而被广泛用于生物材料和其他领域。当一些抗体与聚合物偶联时，溶解度、免疫相容性、药代动力学或稳定性会得到改善。抗体与聚合物偶联意味着由于循环半衰期更长、靶抗原识别得到改善、细胞摄取效率更高或细胞内稳定性更高，因此体内疗效比踝抗体显着增加。在体外，与聚合物偶联可以提高蛋白质稳定性，减少蛋白质聚集，增强蛋白质检测灵敏度，并有效地分离蛋白质。PEG因其低毒性而被广泛用于与抗体偶联和优异的水性能。PEG还表现出优异的生物分布和药代动力学特性，同时通常保留偶联抗体的构象和活性。PEG与抗体片段的偶联导致后者在循环中的半衰期延长，这主要是由于聚合物贡献的大分子尺寸。例如，虽然PEG偶联片段的理论分子量为135kDa，但由于偶联物的流体动力学尺寸，通过尺寸去除色谱法测量的复合物的实际分子量约为1600kDa。PEG还可以阻止抗体激活宿主免疫系统，导致清除率降低和半衰期延长。此外，scFv的聚乙二醇化降低了其对蛋白水解酶的敏感性。因此，抗体片段的临床效用与PEG有关，PEG可以在体内提供免疫保护并延迟肾脏清除。Cimzia®是一种PEG偶联的人源化抗TNFFab抗体片段，在欧盟、美国和加拿大被批准用于治疗类风湿性关节炎。此外，Cimzia®在瑞士和美国接受了克罗恩病的治疗。迄今为止，临床数据显示，在一系列临床、影像学和患者报告的结果方面取得了成功。热响应聚合物会随着温度的变化而发生可逆相变。因此，它们在低温下仍可溶于水性溶剂，但当温度升高到较低的临界溶液温度（LCST）以上时，它们变得不溶（图5）。聚合物的LCST在很大程度上取决于组成单体单元的氢键能力，可以通过改变其亲水或疏水共聚物含量来改变LCST，从而改变其相变。对PH值敏感的聚合物是通过质子化/去质子化改变分子中的电荷，从而导致相变的聚合物。相变通常发生得很快，pH值变化为0.2-0.3个单位。共聚物聚（甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸酯）在pH值为5时发生急剧的构型变化并塌陷，而聚（甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯）共聚物在低pH值下可溶，但在碱性条件下塌陷和聚集。其他聚合物包括响应电场变化而收缩或膨胀的聚合物或磁场。【NO.6】总结本文讨论了ADC、AOC、ACC和ABC的结构、特性和优势。所有这些抗体-药物偶联物都与抗体、接头和活性药物结合，但它们之间的作用机制非常不同。总而言之，抗体有两种主要的设计策略。第一种策略涉及利用抗体本身作为治疗剂并对其进行修饰以增强其疗效。第二种策略使用抗体作为载体分子，使其能够将活性剂直接运输到癌症部位。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

-01-引言抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成,兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。ADC对抗原的识别导致ADC通过内吞途径进入细胞内，通过溶酶体降解后，有效载荷以生物活性形式释放并发挥作用，导致癌细胞死亡。细胞内有效载荷的数量由每个细胞表面抗原的数量、每个ADC的药物有效载荷分子的数量（也称为药物抗体比率，DAR）以及抗原返回细胞表面所需的时间决定。有效载荷可能在癌细胞死亡和降解后逃逸，也可能从胞浆中透膜而出。这种释放的后果可能是有益的（也称为旁观者效应），也可能是有害的，导致全身毒性。ADC中有几个变化的部分，成功显然没有通用的公式。因此，如何选择合适的抗体、抗体的内吞机制如何、在何处以及如何将连接子连接到抗体、每个抗体连接多少药物分子、如何连接连接子和药物有效载荷、最佳药物有效载荷是什么样的？这些问题需要我们深刻理解ADC各个组分的生物学和化学特性，才能获得满意的答案。-02-一、有效载荷1. 微管破坏药物金盏花素Auristatins是ADC中使用的重要有效载荷，最著名的家族成员MMAE存在于两种上市药物Adcetris和Polivy中。目前，超过10种以金盏花素（如MMAE）或一甲基金盏花素F（MMAF）为有效载荷的ADC正在进行临床试验。上图描述了auristatine及其常用的连接位点。金盏花素的构效关系（SAR）已被广泛研究，主要集中在末端亚单位：P1（N-末端）和P5（C-末端），最常见的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。2015年，西雅图遗传学的研究人员将ADC有效载荷的范围扩大到包括叔胺，特别是N-二甲基auristatine，首次通过铵键将药物与单克隆抗体结合。所得ADCs在生理条件下稳定，体内外活性高，免疫特异性强。这些结果扩大了ADC可用于靶向给药的药物种类。最近，Agensys公司通过调节中心亚基P2-P3-P4，将叠氮化物基团引入P2和P4亚基，在与蛋白酶可裂解的连接子偶联后，产生了在体外和体内效力提高的亲水性衍生物，这为连接子的连接提供了新途径。一般来说，在同时含有胺和醇反应的auristatin中，首选的连接点是胺通过氨基甲酸酯键偶联。西雅图遗传学开发了一种新的策略，将含醇的有效载荷与亚甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶联。为了稳定MAC键，碱性基团和吸电子基团都靠近氨基键，结果表明，该偶联物在生理条件下是稳定的，具有很高的效价，并且在体内外都具有免疫特异性。此外，乌普萨拉大学的研究人员还开发了AZASTATIN，作为一类新的强有力的auristatin衍生物，包含一个中心胺侧链的抗体结合位点。他们的研究结果证实，这些auristatin衍生物是一类新的细胞毒性有效载荷，适合ADC开发。美登素衍生物（DM2，DM4）美坦辛是一种非常有效的微管组装抑制剂，可诱导细胞的有丝分裂停止。但是这种结构很难共轭，因为它没有反应性官能团，为了克服这个问题，一系列含有SMe基团的非常有效的衍生物被创造出来。这一类分子的第一个例子是DM1和DM4，它们带有甲硫丙酰基而不是天然N-乙酰基。从有效载荷DM1和DM4中，通过使用二硫键与连接子偶联。稳定的二硫键连接子在血液循环中表现出良好的稳定性，同时在细胞内保持有效的分裂。此外，几种基于maytansine的ADC利用相同的二级羟基作为附着点，并在大多数情况下携带转谷氨酰胺酶生物结合的连接子。例如，一种基于Daratumumab的ADC被证明能向CD38过度表达的癌细胞特异性地传递DM4。最近ImmunoGen开发了一种新型的ADC，它包含一种含硫的maytansinoid，通过一种高度稳定的三肽连接体连接到抗体上，附着点与上述羟基相同。与先前的美登素ADC相比，增加连接物中亚甲基单元的数量增加了旁观者杀伤活性，并提高了小鼠体内的疗效。在类似的方法中，保持核心大环不变，Regeneron和Abzena的研究人员研究了N-甲基丙氨酸氮取代的影响，也改变了大环上侧链的长度，以及通过伯胺和仲胺连接的连接子。微管溶素Tubulysins是微管聚合的有效抑制剂，可导致分裂细胞的细胞骨架迅速解体，并导致细胞凋亡。它们是一个天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3=OH或Tup，R3=H。利用Tubulysins作为ADC有效载荷，其广泛的附着点已被充分开发。这种结构中一个明显的附着点是Tut或Tup模块的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通过酰肼部分连接到连接子。Oncomatryx公司也采用了同样的方法，以同样的方式安装了可切割的PABAValCit马来酰亚胺连接子。阿斯利康、百时美施贵宝和辉瑞使用的另一种方法依赖于Tup或Tut中苯环的衍生化。连接子与Mep基团的连接也得到了广泛的研究。Ingenica研究人员报告说，去甲基Mep类似物保留了强大的细胞毒性活性，可被视为有价值的有效载荷，允许在仲胺上引入不可切割的马来酰亚胺己基连接子。Oncomatryx的研究表明，当Mep被另一个拥有仲胺的基序取代时，通过氨基甲酸酯键引入可切割的连接体是产生ADC的有效途径。特别有趣的是，基因泰克关于通过季铵基团将连接子连接到含叔胺的有效载荷上。在有效载荷上引入mc-Val-Cit-PABA连接子导致更多亲水性结合物并改善了血液中的稳定性。西雅图遗传学也采用了同样的方法，通过过度表达葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸连接子也可以改善亲水性和选择性的细胞内切割通过癌细胞中过表达的β-葡萄糖醛酸酶。隐粘菌素隐粘菌素（Cryptomycins，CR）是一个具有抗肿瘤活性的六元大环二肽家族。已有的临床试验的结果表明，在达到治疗效果所需的剂量下，其毒性水平是不可接受的。几个小组尝试将CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶联位点，目前，有两种不同的方法通过引入其它基团，使得能够连接ADC的连接子。一种是由基因泰克的研究人员将苯转化为苄胺以产生有效的有效载荷，这种有效载荷适合通过氨基甲酸酯键连接。在第二种方法中，四川大学的研究人员利用了隐霉素-52的前药形式（CR55），它可以在生理条件下重新环化为CR52。 抗有丝分裂EG5抑制剂纺锤体驱动蛋白（KSP，也称为Eg5或KIF11）是一种ATP依赖性运动蛋白，参与细胞周期中心体的分离。因此，用KSP抑制剂（KSPis）阻断有丝分裂中的这一重要事件可产生抗肿瘤效力。拜耳发现了一个新的吡咯亚类的KSPis，他们研究了该分子不同位置与保持对KSP强亲和力的连接子的连接兼容性。同样，诺华的研究人员使用含咪唑的KSP抑制剂作为Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他们安装了带有马来酰亚胺端基的不可裂解连接子。当与靶向HER2和c-KIT的抗体偶联时，得到的ADC显示出优于Kadcyla的体内疗效。2. DNA损伤药物吡咯苯并氮卓类和吲哚氯苯并氮卓类吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂卓（PBD）是一类具有抗肿瘤活性的天然产物。它们的作用方式是在DNA的小凹槽中进行选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD上的亲电N10/C11亚胺形成共价键。西雅图遗传学使用SGD1882的苯胺作为附着点，模仿可切割连接子中常用的PAB单元，释放自由的PBD有效载荷。StemCentrx与Spirogen合作，利用PBD的N-10位置连接一个氨基甲酸酯的连接子。同样的氨基甲酸酯键也被Immunogen用于结构相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚体（IBD）有效载荷。他们还报道了同一类IBD的不同方法，其中一个取代的苯环被用作两个IBD单体的C8/C8'位置之间的连接物。以类似的方法，Spirogen和Genentech设计了一种碘苯连接的PBD，允许在过渡金属催化反应中引入不同的连接子。通过使用Sonogashira偶联、Buchwald–Hartwig偶联或叠氮化物-炔烃点击反应，分别获得炔烃、哌嗪或三唑连接的连接子有效载荷共轭物。杜卡霉素杜卡霉素是一种强大的细胞毒性物质，通过其高活性的环丙烷环与DNA的小凹槽结合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非环化的，卤甲基形式的杜卡霉素细胞毒性活性显著降低。由于分子中苯酚基团可作为内消旋体激活剂，从而形成亲电环丙烷，因此杜卡霉素ADC开发中的连接策略集中于酚官能团的连接子连接。在Synthon开发的SYD985中，苯酚基团是通过双氨基甲酸酯连接连接子与Mc-val-cit-PABC有效载荷的位置。组织蛋白酶B裂解后，游离苯酚促进分子内重排成亲电环丙基形式。Medarex采用了一种不同的方法，通过分子非烷基化部分的芳香胺连接连接子，并用N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前药。在体内，苯酚将被释放，随后活性环丙烷将在羧酸酯酶的作用下形成。喜树碱喜树碱（CPT）及其衍生物是拓扑异构酶I抑制剂的经典例子。它们稳定了拓扑异构酶诱导的DNA单链断裂，当三元DNA-TOP1-抑制剂复合物遇到复制叉时，DNA发生双链断裂。天然喜树碱是一种五环结构，其极低的溶解性阻止了其作为癌症治疗药物的广泛应用。其水溶性前药伊立替康获得了转移性结直肠癌的上市许可。SN-38是伊立新坦的活性代谢物，通过人体肝脏羧酸酯酶的作用在体内生成，其可通过打开内酯环而失活。Immunomedics建立了两种不同的策略，通过其羟基部分结合SN-38。在一个例子中，连接子通过反应性更强的C-10苯酚基团连接，从而产生稳定的氨基甲酸酯键，而在另一个例子中，通过C-20羟基，同时稳定内酯形式，而C-20羟基对体内效力至关重要。另一种适合ADC的非常有效的药物是依沙替康（DDX-8951f）。这种喜树碱类似物在其环己烷环上具有胺取代基，桥接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而环己烷环赋予的刚性被认为有利于活性内酯形式与非活性水解羟基酸的平衡。氨基羟基乙酰化生成DXd（1），而4-氨基丁酰化生成DXd（2），这两种化合物都保留了依沙替康的生物活性。悬垂的羟基和氨基是明显的附着点，可使用酶可切割的Gly-Gly-Phe-Gly四肽连接子连接有效载荷。与抗HER2抗体偶联产生的ADC在临床环境中显示出对抗HER2表达癌症的巨大潜力。DXd的环己胺环虽然被认为稳定了生物活性内酯形式，但它携带了一个手性中心，使合成工作和SAR研究复杂化。为了克服这一困难，Immunogen的研究人员研究了一组新的喜树碱类似物，这些类似物能够与单抗偶联。并且在这里，这个环被打开，额外的手性中心被消除。从一种常见的中间产物开始，研究人员尝试了三种类型的结构，并随后使用不同的聚苯胺连接子连接有效载荷。当与抗人表皮生长因子受体（HuEGFR）的抗体偶联时，产生的ADC对EGFR阳性的HSC-2肿瘤异种移植模型有效。卡奇霉素卡奇霉素是一类被广泛研究的烯二炔类抗生素，其结构和作用机制特别有趣和复杂，使其成为ADC有效载荷领域的一类抗生素。在ADC中连接calicheamicin的策略以市场上的adc Mylotarg为例，还有Besponsa。有效载荷的释放分两步进行：在酸性细胞内环境中对腙进行敏感的裂解，然后通过细胞内谷胱甘肽还原二硫键。释放的硫醇发生分子内1，4-加成的烯酮触发伯格曼环化反应，产生一个二自由基。这种活性中间体能够从脱氧核糖骨架中提取氢原子，产生双链DNA断裂，进而导致细胞死亡。最近，从不列颠哥伦比亚地衣中发现的链霉菌中分离出一种新的烯二炔类天然产物，称为uncialamycin。这种结构通过全合成得到证实，从那时起，一些高效的合成类似物被制备成ADC的潜在有效载荷。BMS的研究人员表明，由于在各种肽偶联条件下反应活性较低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一个合适的连接点。研究人员合成了一种类似物，其中一个氨基直接引入到芳香环上，但这种苯胺的反应性也太弱，不能作为连接子引入的基团。另一方面，使用氨基乙基延伸物安装脂肪族胺，为连接子提供了合适的连接点。从后一个有效载荷中，他们使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的连接子制备前体。CD70-ADC具有可切割连接体，对肾癌细胞株具有高度特异性的细胞毒活性，而相应的不可切割ADC在同一细胞株上不具有活性。最近，为了继续这项工作，BMS的研究人员在设计的、高效的、化学稳定的uncialamycin类似物中使用苯酚基作为附着点。使用新开发的苯酚烷基化，在有效载荷的苯酚基团上添加了一个经典的可裂解连接子。将产生的有效载荷与抗体偶联，其在体外和体内均显示抗原特异性抗肿瘤活性。3. 创新药物凋亡诱导剂（Bcl-xL抑制剂）抗凋亡Bcl-2家族成员（包括Bcl-xL）的过度表达是癌细胞获得凋亡抵抗的机制之一。能够阻断Bcl-xL上BH3结合域的药物可以触发癌细胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL-xL抑制剂的有效载荷，其靶向表达EGFR的特定细胞或组织。有趣的是，研究人员在有效载荷上使用了三个不同的连接点来连接可切割的连接子。氨基烷基延伸的核心修饰用于在需要时建立合适的连接位点。泰兰司他丁及其类似物靶向剪接体是一种参与mRNA加工的大型核糖核蛋白复合物，为靶向癌症治疗提供了一种有希望的治疗选择。有几种天然产物能够通过与不同的剪接体亚单位结合来抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以与剪接体的SF3b亚单位结合，从而阻止RNA剪接。Thailanstatin A缺乏一个适合连接连接子的基团。为了解决这个问题，将羧酸与乙二胺偶联以引入含有胺的间隔基，该间隔基通常用于连接子的安装。将这种天然产物用于ADC的另一个困难是存在多种反应性功能。例如，中心核中的二烯可以通过Diels–Alder反应与用于生物结合的马来酰亚胺部分反应。这个问题是通过使用另一个共轭部分，卤代乙酰胺来解决的。结合这两种修饰并包含可切割连接子的ADC首次在专利文献中报道，并且声称它们在几个表达HER2的细胞系中具有适度的活性。最近，辉瑞报告说，羧酸直接与抗体的有效表面赖氨酸（无连接子偶联）结合导致迄今为止最有效的Thailanstatin ADC。这些赖氨酸偶联物的活性与药物负载有关，而其他有效载荷类通常没有观察到这种特性。ADCs在胃癌异种移植模型中显示出良好的作用。鹅膏毒素在ADC技术领域，使用类似amatoxins的转录抑制剂是一种相对较新的方法。九种天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架结构，一个由八个L-构型氨基酸组成的大环，通过亚砜部分连接在色氨酸和半胱氨酸残基之间。amatoxins的三个侧链是羟基化的，OH基团具有良好的水溶性并与目标分子结合。两种肽，α-鹅膏糖蛋白和β-鹅膏毒素，占所有毒素的90%。在amatoxins上共使用过三个附着点产生ADC。第一次尝试是将β-鹅膏毒素的羧基偶联到IgG上赖氨酸的氨基，这种连接具有良好的血浆稳定性和高细胞毒性，但这种生物偶联的产率很低。二氢异亮氨酸的羟基也被认为是一个连接点，引入谷胱甘肽作为连接子，然后通过赖氨酸结合，可获得体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性优异的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解连接子，导致其循环稳定性差。第三种方法，附着于色氨酸的6-羟基代表了目前的标准程序，苯酚与各种连接子的醚化导致了高度稳定和有效的ADC。由于鹅膏毒素其它氨基酸要么不具化学活性，要么是与RNA聚合酶II结合的关键，因此不能将其它的鹅膏毒素氨基酸（即羟脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸）用于偶联。基于amanitin的代表性的ADC为HDP-101。有效载荷本身是一种合成的金刚烷醇衍生物，优化了稳定性。与天然天麻素相比，两个差异是色氨酸中没有6′-OH，硫醚链取代亚砜。通过天冬氨酸侧链上酰胺的形成，引入组织蛋白酶B-裂解连接子。最近，Park及其合作者为含苯酚的有效载荷设计了一种新的连接基序（OHPAS）。它是一种二芳基硫酸盐，一个芳基部分来自有效载荷，另一个来自连接基序的潜在苯酚基团。将该技术应用于曲妥珠单抗ADC中的a-鹅膏毒素，在体外和体内表现出强大的细胞毒性。烟酰胺磷酸核糖转移酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是一种负责将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的酶，其抑制剂在各种临床前和临床研究中显示出有效性，但其临床应用受到靶向毒性和剂量限制性毒性的限制，如血小板减少和胃肠道不良反应。诺华公司的研究人员在NAMPT抑制剂有效载荷中的苯环对位中引入哌嗪部分，确定了合适的连接子附着点。这种分子在c-Kit和HER2表达细胞系上表现出纳摩尔水平的效力，并且耐受性良好，在体内表现出靶向依赖性。卡马霉素从库拉索菌中分离得到两种新的蛋白酶抑制剂，卡马霉素A和卡马霉素B。两者都具有亮氨酸衍生的α,β-环氧酮弹头直接连接到甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜。他们被发现能抑制酿酒酵母20S蛋白酶β5亚单位活性（糜蛋白酶样活性）。此外，它们对肺癌和结肠癌细胞株具有很强的细胞毒性。然而，由于它们的高效价，它们的选择性较差，经常表现出毒副作用。因此，剧毒的卡马霉素衍生物适合作为ADC的弹头，可以保持所需的效力，并获得更好的耐受性。所设计的类似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡马霉素B），而不是卡马霉素A中的亚砜甲硫氨酸，因为这消除了亚砜基立体异构体混合物产生的结构复杂性。第一代类似物在P4末端含有胺基，不幸的是，这个附着点并不合适，因为有效载荷显示细胞毒性活性降低。第二代卡马霉素类似物在P2侧链上含有一个胺基，当短乙基氨基链延伸磺酰基时，效果最好。在第三代类似物中，芳基连接砜和胺，因此降低了它的碱性。第二代和第三代有效载荷都显示出强大的体外活性，并用可切割或不可切割的连接子连接。不幸的是，没有一种ADC对受试癌细胞系表现出比曲妥珠单抗更高的细胞杀伤能力。-03- 二、连接子连接子不仅是抗体与小分子有效载荷之间形成共价连接的分子部分，而且是靶向药物治疗中具有设计性质的关键元件。连接子的加入不应诱导聚集，并且需要确保可接受的PK特性，同时限制有效载荷在血浆中的过早释放（稳定性），并使活性分子在靶向作用位点有效释放。连接子分为两类：不可切割型和可切割型。1. 不可切割连接子基于不可切割的连接子的ADC必须被内化，抗体部分需要被溶酶体蛋白酶降解以释放活性分子。在ADC开发过程中已经探索了许多不可切割的连接子，最具代表性的是N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC），Kadcyla就是使用的此类型连接子。这种结构的分解代谢导致Lys-SMC-DM1成为主要的肿瘤代谢物。此外，与这种连接子相连的药物通常不能发挥旁观者效应，因为释放的分解代谢产物通透性较差。目前的研究主要集中在可切割的连接子上。使用可切割连接子对于具内化和不具内化ADC的设计同样可行，因为释放是由切割位点（溶酶体和/或肿瘤环境）的性质触发的。连接子可以分为两大类：酶依赖性和化学（即非酶）依赖性。2. 化学依赖性连接子含有二硫键的连接子受到硫醇的亲核攻击以释放活性载荷。尽管血浆中人血清白蛋白（HSA）的还原形式就是最丰富的硫醇，但它对大分子的反应性很差。胞浆中还含有高水平的谷胱甘肽（GSH），这是一种含有巯基的三肽，很容易与S-亲核蛋白发生反应。血液（微摩尔范围）和细胞质（毫摩尔范围）中GSH浓度的差异以及癌细胞引起的氧化应激有助于药物在癌细胞内的优先释放。含有二硫键的连接子主要与maytansinoid类有效载荷相关。二硫键的反应性可由空间位阻调节：α-甲基替换显著影响还原速率和对硫醇-二硫键交换的抗性，如SAR-3419的连接子通过偕二甲基替换获得SPDB-DM4最佳的抗肿瘤活性。腙连接子显示出依赖于pH的稳定性，在中性pH下稳定，并在酸性介质中水解（内体的pH<6，溶酶体的pH<5），形成相应的酮和肼。该方法已成功应用于IMMU-110，包含一个可裂解酰基腙连接子，由4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC）的酰肼与阿霉素中存在的酮基反应中形成。腙连接体也经常用于卡利霉素家族的有效载荷，在这种情况下，释放是由两步活化过程触发的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫键被GSH还原，使巯基中间体环化。这种连接子已经在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它们在血浆中的稳定性不如预期，也不如其他可切割连接子吸引人。3. 酶依赖性连接子为了限制有效载荷在内化前的释放，从而防止或最小化目标细胞外的降解，溶酶体的蛋白质组分成为寻找能够降解ADC并以高浓度存在的酶的合理场所。组织蛋白酶-B组织蛋白酶B是一种半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳动物的晚期内体和溶酶体中，在许多癌细胞中也过度表达。最初，一种可切割的二肽作为组织蛋白酶B的底物用作阿霉素前药，这项工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要亲水性残基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的亲脂性残基增强血浆稳定性（苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸）。此外，还引入了一个自降解间隔子来促进酶的进入，从而限制了有效载荷的空间位阻：对氨基苄基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介质中自发1,6-消除，释放二氧化碳、对氮杂醌甲酰胺和阿霉素。最终，这一发现从前药转移到ADC领域，证明了Val-Cit和Phe-Lys二肽连接子的抗原驱动的细胞活性。Val-Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解连接子，目前有多达25个分子处于临床阶段，可能是因为其整体良好的血浆稳定性、释放行为和化学可牵引性。两个已获批的ADC药物（Adcetris和Polivy) 都使用了相同的连接子mc-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺基间隔子、作为组织蛋白酶底物的标准Val Cit二肽序列和PABC自降解间隔子。Val-Ala二肽也被广泛应用，有7个分子处于临床阶段，进展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一个聚乙二醇化间隔子，以平衡属于PBD二聚体家族的有效载荷SG3199的亲脂性。研究表明，由于沉淀和聚集，Val-Cit很难实现高DAR。相反，Val-Ala连接子允许DAR高达7.4，且聚集有限（<10%）。与Val-Cit相比，Val-Ala的疏水性较低，这解释了为什么这种连接子在亲脂性的有效载荷（如PBD二聚体）方面表现卓越，7个临床候选ADC的Val-Ala连接子都连接PBD。一些研究将Val-Cit和Val-Ala二肽结构与MMAE的有效载荷连接进行了比较。在非内化抗体的情况下，结合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala连接子都表现出类似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg类似物表现出更好的性能。在使用随机半胱氨酸结合的抗Her2 ADC的情况下，与Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR结构中显示出较少的聚集性。另一方面，两种连接子显示出相似的缓冲稳定性、组织蛋白酶B释放效率、细胞活性和组织病理学特征。四肽Gly-Gly-Phe-Gly显示出稳定和有效的可切割连接子的所有特性，已上市的ADC药物Enhertu使用了此类连接子。第一三共的Enhertu是一种血浆稳定的ADC，DAR为7.7，在溶酶体中发生蛋白酶降解，释放DX-8951f，这是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，来源于exatecan。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的DAR是非常可观的，因为它与广泛确立的原理相矛盾，即高DAR结合物可能具有较差的药代动力学特征。这里使用的自降解间隔子是简单和紧凑的半胺化，而不是Val-Cit连接子使用的PABC。磷酸酶和焦磷酸酶与组织蛋白酶一样，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶体中选择性表达的水解酶。2016年，默克公司的研究人员设计了含有磷酸和焦磷酸的连接子与组织蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在传递糖皮质激素：磷酸盐/焦磷酸盐部分结合在自降解间隔子PABA和有效载荷之间。内化后，有效载荷可通过组织蛋白酶B、自降解间隔子和磷酸酶（n=1）的顺序释放。对于焦磷酸酯（n=2），可能需要另一个涉及焦磷酸酶的步骤。这种亲水性和永久性带电基团的优点是溶解性，不仅能够与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，而且促进ADC纯化， ADC中的残余连接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在体外都具有活性。默克公司的同一组研究人员还开发了一种独特的基于焦磷酸酶的连接子，用于释放含羟基有效载荷地塞米松和丙酸氟替卡松。此外，羟基附着点的性质对有效释放至关重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一个缩醛间隔子，从而实现可接受的释放。两种ADC在体外均表现出良好的稳定性，对肿瘤细胞系具有较强的活性。β-葡萄糖醛酸酶β-葡萄糖醛酸酶是一类糖苷酶，催化β-葡萄糖醛酸残基的水解，它在溶酶体和肿瘤间质中高表达。西雅图遗传学的研究人员于2006年发表了一项开创性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的连接子，葡萄糖醛酸附着在自降解间隔子上。这种连接子表现出低水平的聚集、高血浆稳定性、以及强大的体内功效。该连接子还通过一个额外的二甲基乙二胺（DMED）自降解间隔子应用于其他含胺的有效载荷，如喜树碱类似物、SN38、杜卡霉素和苦参碱。释放顺序从水解β-葡萄糖醛酸到自降解间隔子，DMED的另一个环化反应自发发生，形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，并最终释放含羟基药物。由于连接子的亲水性，与组织蛋白酶敏感连接子相比，该技术使ADC的DAR=8制备更为容易。β-半乳糖苷酶最近报道了一种使用β-半乳糖苷酶裂解连接子的ADC，其中包含PEG10间隔子。间隔子被硝基取代，以提高自降解速率。类比β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它赋予化学前体亲水性。另一个优势是β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中表达，也在实体瘤的微环境中表达。研究证明，在抗HER2-ADCs释放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶连接子的 ADC在体外和体内均比T-DM1更为有效。硫酸酯酶最近，出现了硫酸酯酶裂解的连接子，硫酸酯酶在几种癌症类型中过度表达，表现出潜在的选择性。研究涉及以MMAE为有效载荷的抗Her2抗体，与经典的可切割Val-Cit和Val-Ala连接子相比，硫酸酯酶连接子对Her2+细胞系显示出相似的效力。此外，靶向VEGF可以进一步设计成联合靶向肿瘤细胞上的PD-L1或T细胞上的PD-1，从而将抗血管生成与肿瘤免疫学方法联系起来。例如靶向PD1和VEGF的ivonescimab（AK112），其目前已在中国获批用于。其他bsAbs靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，该药物正在NSCLC患者的II/III期研究（NCT05756972）中进行评估。-04-三、生物偶联技术1. 基于化学的特异性原位抗体修饰单克隆抗体的天然结构为生物偶联提供了多种可能性，基于化学的、特异性的天然（非工程）抗体偶联具有一些优点。它可以避免抗体特定位点突变的复杂性，以及在细胞培养的放大和优化方面可能面临的挑战。偶联位点根据抗体序列，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等内源性氨基酸在二硫键间的连接位点非常具有吸引力。所有经FDA批准的ADC，直到2021年，都利用这些内源性氨基酸进行偶联。然而，抗体支架还包含聚糖，这是在单克隆抗体生产过程中，FC区域的翻译后修饰所导致的。一些研究报告了糖工程化的新策略，这似乎是一种有趣的生物偶联替代方法。与内源性氨基酸的偶联最常见的偶联方法之一是利用抗体的赖氨酸残基，氨基酸亲核NH2基团与利克有效载荷上亲电的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团发生反应。尽管反应简单，但可利用赖氨酸残基的高丰度导致了许多ADC在随机分布下的不均匀混合物的形成。DAR受药物/抗体化学计量比的控制，该方法得到广泛应用，包括已获批的ADC，如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。最近，同样也报道了对赖氨酸位点和残基的特异性修饰。通过计算机辅助设计，磺酰丙烯酸酯被用作中间试剂，用于在天然蛋白质序列上对单个赖氨酸残基进行修饰。反应的区域选择性归咎于磺酰丙烯酸酯的设计以及每个赖氨酸周围独特的局部微环境。通过计算预测，pKa最低的赖氨酸容易以位点特异性的方式在弱碱性pH下优先反应。即使在其他亲核残基如半胱氨酸存在的情况下也观察到了这种反应。该技术已应用于5种不同的蛋白质和曲妥珠单抗，在偶联后均保留了原有的二级结构和蛋白质功能。2018年，Rai等人报告了另一种利用“化学关键蛋白”的可逆分子间反应进行的位点特异性修饰。该试剂携带多种官能团，这些官能团在所有可获得的赖氨酸残基上可逆地形成亚胺部分。然后，关键蛋白通过试剂中的环氧化物与近端组氨酸残基反应。因此，在生理条件下，关键蛋白从赖氨酸中分离，醛被再生，从而能够通过肟结合标记抗体。这种关键蛋白的定向修饰技术后来发展成单赖氨酸残基标记技术，即使在存在N-末端胺的情况下也具有毋庸置疑的选择性。方法的成功依赖于Fk1-间隔子-Fk2试剂。Fk1官能团与赖氨酸可逆反应，调节Fk2近端赖氨酸部分的微环境。然后通过酰胺键在Fk2处的赖氨酸残基（K169和K395）进行偶联，间隔子的设计调节偶联的位置。该方法已成功应用于ADC（trastuzumab-emtansine）的合成，证明其细胞活性与已获批准的Kadcyla相当。 Merlul等人最近报道了一种不同的结合策略，有效地靶向天然抗体上的组氨酸残基。他们引入了一种基于阳离子有机金属铂（II）的连接子，[乙二胺铂（II）]2+，图中表示为Lx。这种技术基于络合和偶联两个步骤。氮杂环配体如哌啶与Lx配位形成络合物前体，稳定的中间体包含有效载荷和配体上的一个氯离子。该复合物含有带正电荷的Pt（II）中心，这提高了连接子和有效载荷复合物的水溶性并最小化抗体聚集，该方法还扩展到类似的碘络合物。在最近的一份报告中，碘化钠的使用被证明可以显著提高该技术的偶联产率和选择性。Cl-Lx-药物载荷络合物上残留的氯配基与碘化物的交换生成更具活性的I-Lx-药物载荷，从而获得更高的偶联产率。这项技术已被应用于ADC药物的大规模生产。二硫化物重桥接策略IgG抗体包含四个链间二硫键，两个连接轻链和重链，两个位于连接两条重链的铰链区，它们维持着单克隆抗体的完整性。另一个经典的生物偶联途径探索了这些半胱氨酸作为有效载荷连接点的作用。四个二硫键的还原通常会产生八个巯基，它们能够与马来酰亚胺的连接子反应，从而产生DAR为8的ADC。Doronina及其同事报告了嵌合抗CD30单克隆抗体偶联MMAE，DAR=8的 ADC实例。与经典的赖氨酸偶联相比，这种有效载荷加载方式得到了更好的控制。然而，据报道，较高的药物负荷会增加聚集的风险，从而导致高血浆清除率，并降低体内疗效。Badescu和al在2014年报告了一种新的位点特异性重桥接偶联策略，他们是第一个证明新的双砜（bis-sulfone）能够烷基化来自抗体和抗体片段中还原二硫键的两个巯基，对抗原结合的影响最小。后来，Wang和al描述了一种新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），该试剂在没有原位活化的情况下提高了反应活性。它表现出高稳定性、高水溶性和位点特异性。此外，还有巯基炔与末端炔烃和环辛炔生物偶联的再桥接技术，其进一步发展出新一代马来酰亚胺，如二溴-（DBM）和二硫代马来酰亚胺（DTM），用于位点特异性偶联。这些马来酰亚胺类似物在第3位和第4位含有良好的脱离基团，从而实现快速、高效和高产率的偶联。最近报道了结合二溴和二硫代马来酰亚胺性质的杂化硫代溴马来酰亚胺（TBM），这种TBM试剂结合更快，显示出更高的DAR=4的百分比，这可能是由于溴减少了空间位阻。2015年，Chudasama等人引入了一类新的重桥接试剂，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他们证明了它能有效地插入到二硫键中，得到的结构即使在高温下也表现出了极好的水解稳定性。然而，随着还原步骤上的温度升高，也观察到不均一性，这种结构也允许选择性地引入不同的功能基团。二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一种有效的重桥接试剂，能够产生稳定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基杂芳基支架对半胱氨酸再桥接的作用，他们认为用嘧啶取代吡啶可以使杂芳环成为更好的电子受体，从而提高交联效率。他们的工作扩展到二乙烯基三嗪，在高温下，重桥接显示出更高的效率。为了避免与经典马来酰亚胺偶联相关的体内不稳定性的缺点，Barbas等人研究了甲基磺酰基苯基恶二唑，该试剂对半胱氨酸具有特异性反应。与血浆中的半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物相比，他们的稳定性更高。受此启发，Zeglis设计了DiPODS试剂，该试剂含有两个通过苯基连接的恶二唑基甲基砜部分， DiPODS以重桥接的方式与两个硫酸根形成共价键。与马来酰亚胺偶联相比，以这种方式偶联具有优越的体外稳定性和体内性能。聚糖偶联由于IgG是一种糖蛋白，它在Fc片段每个重链的CH2结构域N297位置包含一个N-聚糖，这种糖基化可以作为连接有效载荷的附着点。多糖与Fab区域间远距离定位降低了在偶联后损害抗体的抗原结合能力的风险，此外，与抗体的肽链相比，它们的化学组成不同，允许位点特异性修饰，使它们成为合适的偶联位点。聚糖生物偶联可根据用于靶向碳水化合物的技术来区分：包括聚糖代谢工程化、聚糖氧化后的糖转移酶处理、内糖苷酶和转移酶处理后的酮或叠氮化物标记。Neri等人报道了在IgG抗体的N-糖基化位点处岩藻糖的位点特异性修饰。这种糖含有一个顺式二醇部分，适合选择性氧化。他们用偏高碘酸钠氧化岩藻糖残基，生成一个能够与含联氨的连接子反应的醛基，这样，抗体通过腙键与药物相连。Senter及其同事向细胞培养基中添加硫基类似物，通过代谢将6-硫代岩藻糖带入抗体修饰。他们认为，取代是通过劫持岩藻糖基化途径来完成的，这样就引入了化学位点来实现位点特异性结合。与经典半胱氨酸偶联物相比，这种方法显著降低了异质性水平，并产生具有更可预测的药动学和药效学特性的偶联物。重组IgG中很少含有唾液酸，然而，已经证明，利用半乳糖基和唾液酸转移酶可以酶法改造甘氨酸。通过酶反应添加半乳糖以获得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。这种修饰通过高碘酸氧化生成醛基，可以偶联带羟胺基团的连接子-有效载荷。所得的偶联物具有较高的靶向选择性，体内抗肿瘤活性良好。高碘酸还可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影响与FcRn的结合。除这些偶联策略外，半乳糖残基也可以作为修饰位点。多项研究报告了通过使用突变的β- 1，4-半乳糖转移酶，将半乳糖替换为一种含酮或叠氮官能团的半乳糖，这种具有双正交官能团的半乳糖衍生物为高效偶联开辟了途径。这些技术已被开发用于成像和抗癌应用。从化脓性链球菌中发现的内糖苷酶EndoS和EndoS2，这些酶能够水解IgG的N-聚糖，从而使水解后的残基成为生物偶联的有效位点。这种方法有助于使单抗的聚糖结构均匀化，同时它也适用于任何IgG亚型。此类方法应用于trastuzumab-maytansine，制备出具有良好体外和体内药效的糖偶联ADC。2. 工程化抗体的位点特异性生物偶联生物正交化学和蛋白质工程领域的进展有助于产生更均匀的ADC。尽管在天然单抗上有许多可用的附着方法可供选择，但在工程化抗体上的位点特异性生物偶联能够更有效地控制DAR，并且避免改变与抗原结合的亲和力。这样，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有优良药代动力学和药效学特征的同质产品。酶法有效载荷的附着可以通过在抗体序列中插入特定的氨基酸标签以非常有选择性的方式实现。这些标签被特定的酶所识别，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而能够执行位点特异性偶联。Aaron等人探索了一种新的利用醛标记蛋白质的位点特异性偶联。该技术利用了基因编码的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达期间被共翻译氧化为甲酰甘氨酸。这样，工程化抗体通过HIPS（hydrazino-Pictet–Spengler）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）策略也经常被开发用于定位特异性偶联。MTGase催化在脱糖抗体295位置的谷氨酰胺侧链与底物的伯胺之间形成肽键。与其他酶策略相比，MTG是一种灵活的技术，不需要肽供体来实现偶联。只要酰基受体含有一种伯胺，就没有结构限制。谷氨酰胺残基自然存在于单抗的每个重链的Fc区域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺残基通过MTGase介导的反应偶联，可以产生均一的DAR=2的ADC。为了提高效率，可以偶联带支链的连接子，从而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺也可增加DAR。NBE Therapeutics开发了基于S金黄色葡萄球菌转肽酶A介导的偶联。他们的策略利用转肽酶A（SrtA），在LPXTG（X=任何氨基酸）五肽的基序中切割苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键。然后，它催化甘氨酸相关的有效载荷与新生成的C-末端的偶联，在生理温度和pH下生成肽键。该方法应用于不同抗体，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸标记的连接子偶联maytansine和MMAE，两种ADC均显示出与经典偶联相似的体外细胞杀伤活性。酶法产生的trastuzumab-maytansine在体内试验中完全匹配Kadcyla。在另一个例子中，利用转肽酶法生成了高效蒽环素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是，通过这项技术，偶联效率甚至高于Adcetris和Kadcyla类似物。此外，所制备的PNU-159682 ADC具有较高的体外和体内稳定性，并且显示出的效力超过了含有微管蛋白靶向有效载荷的ADC。另一个新兴的新方法是通过酪氨酸标签进行位点特异性抗体标记，酪氨酸标签与单克隆抗体轻链的C末端基因融合。考虑到位点可及性，Bruins及其同事使用了一种工程化的四甘氨酰酪氨酸残基作为标记，它为偶联提供了一个容易触及的位点。酪氨酸酶将酪氨酸氧化成1,2-醌，从而允许与各种双环[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物的环加成反应。这种方法可以与含有BCN连接子的MMAE有效地偶联。半胱氨酸工程：硫单抗技术随机半胱氨酸偶联和重桥接是利用抗体结构内天然存在的半胱氨酸残基的技术。然而，随机半胱氨酸方法的异质性以及重桥接策略中的单抗片段化需要在ADC合成中加以考虑，特别是当疏水性药物被偶联时。与它们不同的是，硫单抗技术通过利用不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，在抗体上实现所需位点的选择性和均匀修饰。一般来说，半胱氨酸突变的设计是为了促进细胞毒性有效载荷偶联的同时，保持单克隆抗体的稳定性、亲和力和最小化ADC聚集。为了确定突变的最佳位置，通常采用几种技术，包括计算建模、模型系统筛选和高通量扫描。Junutula等人首先报道了一种硫单抗策略，用工程化半胱氨酸残基取代了抗MUC16抗体重链114位的丙氨酸（HC-A114），工程化位置内的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子反应。合成的抗MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出效力，在大鼠和食蟹猴中表现出高剂量耐受性，这个发现建立了硫单抗偶联策略的一般性方法。此外，琥珀酰亚胺连接在胞浆内可以经历两个平行反应：反向Michael反应导致连接子-有效载荷的损失，以及琥珀酰亚胺的水解，这两种反应都对体内ADC活性有显著影响。为了提高稳定性，Lyon和合作者设计了一个与马来酰亚胺相邻的碱性氨基整合进来的连接子。在连接子中加入二氨基丙酸（DPR）促进了硫琥珀酰亚胺在中性pH和室温下的快速定量水解，这样，非特异性的去偶联作用被阻止，从而提高了体内的稳定性。除了常用的马来酰亚胺外，还探索了不同的半胱氨酸反应剂，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N-烷基乙烯基吡啶盐。3. 与工程化非天然氨基酸的生物偶联除了硫单抗技术外，非标准氨基酸（ncAA）的加入为位点特异性偶联提供了另一种可能性。该技术使用含有独特化学结构的氨基酸，从而能够以化学选择性的方式引入连接子-有效载荷复合物。该技术需要对抗体序列重组，利用与宿主细胞内所有内源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于响应未赋值密码子将ncAA带入蛋白质。通常，ncAA在发酵过程中被添加到培养基中。选择非天然氨基酸是很重要的，因为它们可能激发免疫原性。常用的ncAA是具有独特基团的天然氨基酸的类似物，如酮、叠氮、环丙烯或二烯。已有研究将对乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗体中。有效载荷Auristin通过肟连接与抗体有效偶联，从而生成化学均一的ADC。该ADC在小鼠体内表现出良好的体外活性和完全清除肺肿瘤的作用。由于肟连接所需的酸性条件和ADC缓慢释放的动力学，另一种选择是加入含ncAA的叠氮化物。广泛应用的对叠氮哌苯胺（pAzF）可在生理条件下快速进行CuAAC或SPAAC反应，利用这种策略成功地在抗CD74抗体上偶联糖皮质激素有效载荷。除了pAcF技术外，还成功地将含叠氮的赖氨酸类似物（AzK）带入到抗体中，以产生具有Auristin、PBD二聚体或微管蛋白有效载荷的位点特异性ADC。此外，赖氨酸的环丙烯衍生物（CypK）以及自然发生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合进入抗体中。所产生的ADC表现出良好的稳定性、选择性以及体外和体内活性。-05-结语尽管第一个ADC在20多年前就获得了FDA的首次批准，但制药行业必须经历一个漫长且乏味的学习过程，才能在市场和临床开发中获得一条稳定的ADC管线。基于ADC的技术进步，该领域正在经历一次爆发，我们在有效载荷，连接子和偶联技术方面获得了多个突破，进一步加深了对ADC这种新型药物的全面认识。相信随着该领域的发展，经过无数次积累的经验，ADC终会迎来真正的春天。参考资料：1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。