Loncastuximab tesirine

新一代ADC药物的开发是在传统经典ADC药物的基础上展开的，ADC新范式也是站在传统ADC巨人肩膀上才有了今天百花齐放的精彩。今天为大家解读一篇关于传统经典ADC介绍的文章，一起重温经典。1.1 引言1.1.1 ADC的概念自癌症治疗首次采用以根除肿瘤组织为目标的细胞毒性药物以来，肿瘤学家始终致力于拓宽这类药物的治疗窗口。Frei等人开创性的联合化疗策略，旨在通过使用具有非重叠剂量限制性毒性的药物组合，在不大幅增加患者整体毒性的前提下提升细胞毒性药物的抗肿瘤疗效。然而，这类治疗方案在达到最大耐受剂量时仍效果有限，其根本瓶颈在于所用细胞毒性药物严重的副作用。将细胞毒性效应分子与抗体偶联形成抗体-药物偶联物（ADC），通过抗体组分与肿瘤特异性细胞表面分子的选择性结合，实现了细胞毒性载荷的精准递送。这一简洁理念（如图1.1所示）被视为拓宽细胞毒性药物治疗窗口的理想解决方案。从药物化学视角看，ADC具有双重优势：首先，将小分子细胞毒素与亲水性抗体蛋白偶联后，可限制毒素穿透抗原阴性正常细胞的细胞膜；其次，抗体赋予小分子毒素体内分布特性，从而降低其系统毒性。本质上，ADC是一种前体药物，其激活严格限于肿瘤细胞内，而正常细胞因无法摄取抗体复合物得以规避毒性作用。 图1.1 通过将细胞毒性药物与抗体偶联来提高治疗指数1.1.2 将抗体转化为强效抗癌化合物ADC这一简单概念还可从另一视角解读。自单克隆抗体技术问世以来，癌症研究的核心方向之一便是开发治疗性抗体。事实上，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗和贝伐珠单抗已成为商业化最成功的抗癌药物代表。然而，更多针对不同靶点抗原的抗体在临床前及临床试验中，均因抗癌活性不足未能转化为治疗药物。究其根源，抗体与肿瘤细胞表面抗原结合所诱发的免疫杀伤机制，在多数情况下难以显著降低肿瘤负荷。正因如此，研究者提出通过偶联细胞毒性药物为这些抗体附加杀伤机制，从而突破其效价局限。在免疫学家看来，构建ADC不仅能保留抗体对肿瘤细胞的高度特异性，更能充分释放其治疗潜能——这种"精准制导+强化弹药"的策略，恰似为精确制导武器装配高爆弹头。1.1.3 ADC是什么，又是怎么工作的？典型ADC的结构包含以下关键特征（如图1.2所示）：1). 载药结构：- 每个单克隆抗体分子平均偶联2-6（8）个强效细胞毒性药物分子- 通过共价键连接至抗体特定氨基酸残基的侧链2). 连接子化学特性要求：-体外稳定性，体内释放性-血液循环期需保持高度稳定，确保抗体完成组织分布-同时必须在ADC被肿瘤组织内的癌细胞摄取后，能够释放出活性细胞毒性化合物3). 作用机制时序：① 靶向定位：抗体组分特异性结合肿瘤细胞表面抗原② 内化过程：抗体-抗原复合物被肿瘤细胞内吞③ 药物释放：经细胞内转运至特定区室后，活性细胞毒素从ADC解离图1.2 ADC的组成结构及其作用机制1.1.4 概念很简单，但实施起来却很复杂ADC研究领域的最初设想源于一个突破性理念：通过将长春碱类和阿霉素等传统化疗药物与特异性单克隆抗体偶联，可以拓宽这些药物的治疗窗口。这一构想延续了早期将细胞毒药物与血清免疫球蛋白偶联以增强靶向性的探索。虽然部分临床前研究结果令人振奋，但这类偶联物的临床试验数据却遭遇滑铁卢。直到1980年代，随着放射性标记抗体临床剂量学研究的深入，研究人员才揭开了失败背后的关键机制：抗体肿瘤富集率：仅0.01%ID/g（给药24h后）根本矛盾点：传统化疗药物的中等细胞毒性（如阿霉素IC50~10⁻⁷M）与抗体极低的肿瘤递送效率形成不可调和的矛盾。研究发现，在给药24小时后（此时药物浓度达到峰值），各类抗体在不同肿瘤患者中的靶向富集效率仅为每克肿瘤组织0.01%的注射剂量。这一关键数据揭示了早期ADC疗效不佳的根本原因：1). 递送效率瓶颈：- 传统化疗药物（如阿霉素）作为载荷- 抗体介导的肿瘤递送量严重不足- 无法达到有效治疗浓度（需10⁻⁶~10⁻⁵M）2). 技术路线革新：-放弃中等活性药物（IC₅₀~10⁻⁷M）-采用超高活性化合物（IC₅₀~10⁻¹²M）-确立"低载药量+高毒性"的新范式1.2 ADC的组成模块一个理想的ADC需要三大核心组分的协同优化。1). 三位一体设计要素：- 靶向抗体：保留其天然药代动力学特征和生物分布特性- 细胞毒性载荷：提供强效肿瘤杀伤机制- 连接子化学：实现循环稳定与靶点释放的动态平衡（关键设计原则）必须同时满足：-载荷的强效杀伤性（picomolar级活性）-抗体的完整生物学功能（包括潜在的内源性抗肿瘤活性）-靶点匹配性（抗原表达水平＞10⁵ copies/cell）2). 靶点选择黄金标准：-肿瘤特异性表达（T/N＞10:1）-高效内化率（＞50%/4h）-均匀的组织分布（避免异质性）注：本章虽不深入探讨靶点分子特性，但需要强调靶点选择与ADC设计的高度适配性直接决定临床疗效。最新临床数据显示，符合上述标准的靶点（如HER2、TROP2）其ADC客观缓解率可达40-60%，反之则不足15%。1.2.1 AntibodyADC技术发展史上，抗体人源化演进可分为三个关键阶段（图1.3)。1). 第一代抗体（鼠源抗体）：- 应用范围：早期ADC及免疫毒素（如蓖麻毒素/白喉毒素衍生物）- 主要缺陷：人抗鼠抗体反应（HAMA）发生率＞50%- 典型案例：首个进入临床试验的美登素ADC（cantuzumab mertansine）2). 人源化技术突破：-嵌合抗体技术（保留鼠源可变区）-CDR移植（仅转移互补决定区）-表面重塑（variable domain resurfacing）-免疫原性降低至＜5%3). 全人源抗体时代：-转基因动物平台（如XenoMouse®）；-噬菌体展示技术-酵母表达系统图1.3 小鼠（绿色）与全人源（蓝色）单克隆抗体示意图，同时展示嵌合抗体、通过互补决定区（CDR）移植和可变域表面重塑技术人源化的抗体（绿蓝混合色）。抗体亚结构域在小鼠抗体上标注如下：包括Fab片段、Fc片段、重链（vH）与轻链（vL）可变区、重链（cH）与轻链（cL）恒定区，以及CDR区域。图示中轻链采用比重链更浅的色调。源自鼠抗体的CDR以红色标示，基于人IgG骨架序列生成的CDR则标为紫色。 1.2.1.1 Isotype 抗体在ADC中的应用在ADC研发中，抗体亚型的选择呈现以下关键特征（基于67个临床阶段ADC的统计分析）：1). IgG1亚型主导地位（占比89.6%）• 使用数量：60/67个（含约20个已终止项目）• 结构特点：保留天然FcγR结合域• 功能优势：- 激活效应细胞杀伤（ADCC）- 引发补体依赖的细胞毒性（CDC）• 典型案例：去岩藻糖基化改造的IgG1（增强FcγRIIIa结合力，ADCC提升10倍）2). 其他亚型应用现状IgG4亚型（3个临床ADC）：- 代表药物：吉妥珠单抗奥唑米星、伊珠单抗奥唑米星- 设计目的：消除FcγR介导的毒性IgG2亚型（3个临床ADC）：- 技术特征：转基因小鼠平台制备的全人源抗体- 结构特点：重链恒定区基因置换3). 亚型选择的技术权衡 IgG1优势：-双重免疫效应机制（ADCC+CDC）-成熟的产业化平台IgG4/IgG2适用场景：-需避免Fc介导的副作用时-靶向免疫检查点等特殊通路1.2.1.2 抗体在ADC中的功能活性ADC抗体功能可超越传统免疫效应（ADCC/ADCP/CDC），其设计策略主要分为三类（图1.4）：1). 多功能抗体型ADC（以获批药物为例）曲妥珠单抗-美坦新偶联物（T-DM1）：抗体功能：阻断HER2信号通路（抑制肿瘤增殖）载荷功能：微管抑制剂（直接杀伤）协同机制：信号阻断+细胞毒作用（临床ORR达43.6%[26]）2). 凋亡诱导型ADC（以CD37靶向ADC为例）• 开发流程：1) 初筛：筛选能直接诱导CD37+ B细胞瘤凋亡的抗体2) 优化：偶联载荷增强活性（IMGN529进入临床）• 作用特点：双重凋亡机制（抗体自身+载荷）3). 单纯靶向型ADC（占在研ADC的70%+）- 靶点特征：无信号转导功能（如FRα）- 设计要点：高效内化（＞80%/24h）溶酶体靶向（如mirvetuximab soravtansine）载荷释放动力学匹配（t1/2=2-4h）图1.4 ADC潜在的细胞杀伤机制示意图。展示了抗体偶联药物(ADC)实现细胞死亡的多种作用途径。对于某些靶点和抗体，仅通过有效载荷递送机制即可实现细胞杀伤；而对于其他靶点和抗体，一种或多种生物或免疫机制也可能增强ADC的整体活性。在ADC开发中，抗体亲和力的优化需要平衡多重因素：1). 亲和力标准范围- 临床阶段ADC的典型KD值：0.1-1.0 nM- 肿瘤滞留阈值：需维持＞72小时的有效靶点占据2). 亲和力与渗透性的权衡超高亲和力（KD＜0.1nM）可能导致•肿瘤边缘"结合屏障"效应       •组织穿透深度下降30-50%最佳实践：根据靶点特性调整• 血液肿瘤：可接受更高亲和力• 实体瘤：优先选择中等亲和力（0.5-5nM）3). 内化效率关键指标- 最低要求：＞50%抗原-抗体复合物在4小时内内化- 优化策略：•筛选高内化率表位（如HER2膜近端域）•避免阻碍内化的糖基化修饰1.2.2 PayloadADC要展现强效抗肿瘤活性，其细胞毒性载荷必须满足以下关键要求：1). 效力门槛（基于抗体递送效率计算）：- 必需活性范围：皮摩尔级（10⁻¹² M）- 理论依据：• 肿瘤组织抗体递送率仅0.01%ID/g• 癌细胞摄取效率约1-5%• 要求载荷的IC₅₀＜100 pM2). 临床转化悖论：图1.5所示高活性化合物（除卡奇霉素外）：-SJG-136（DNA交联剂）-其他化合物（美登素/奥瑞他汀等）：-单药治疗时治疗指数＜2-MTD下抗肿瘤活性有限3). 技术突破方向：• ADC平台价值：将剧毒化合物（TI＜1）转化为可控药物（TI＞10）• 典型案例：- 卡奇霉素（TI=0.3）→ 吉妥珠单抗（TI=8.7）- 美登素（TI=1.2）→ T-DM1（TI=12.4）（术语说明：ID/g=每克组织注射剂量百分比；TI=治疗指数；MTD=最大耐受剂量）图1.5 作为抗体偶联药物(ADC)有效载荷开发的高细胞毒性化合物结构。卡奇霉素类抗生素通过自由基机制导致DNA双链断裂，SJG-136（一种吡咯并苯二氮卓二聚体）可使DNA烷基化并交联，而杜卡霉素（阿多泽辛）则能使DNA烷基化。海兔毒素10和美登素是强效的微管相互作用化合物，可破坏微管动力学。1.2.2.1靶向DNA的payload作为首个获FDA批准的ADC药物，吉妥珠单抗奥唑米星（Gemtuzumab ozogamicin）的研发历程堪称ADC领域的里程碑事件，其技术特征与市场命运值得深入分析：1). 药物设计突破• 载荷机制：卡奇霉素（calicheamicin）通过Bergman环化反应产生自由基，导致DNA双链断裂• 靶点选择：CD33在AML原始细胞表达率＞90%• 历史地位：开创DNA损伤型ADC先河2). 市场撤回事件（2010年）•撤回原因：-验证性III期研究未达终点（CR率仅26% vs 标准治疗30%）-致命性肝窦阻塞综合征发生率＞15%•剂量反思：原方案9mg/m²单次给药毒性过大3). 科学重生（2017年再批准）•关键改进：分次给药（3mg/m²，d1/d4/d7）•疗效提升：CR率提高至45%•新适应症：CD33阳性AML巩固治疗另一类重要的DNA靶向载荷是基于吡咯并苯二氮卓（PBD）二聚体SJG-136的衍生物（图1.5），其独特作用机制和临床开发现状如下：a). PBD二聚体类•作用机制：形成DNA链间交联（每分子可产生2个交联位点）•临床进展：-3个ADC进入临床试验（靶点包括CD33等[38,42]）-代表药物：Loncastuximab tesirine（靶向CD19）b). 其他DNA靶向载荷• 喜树碱类似物SN38：- 作用特点：拓扑异构酶I抑制剂- 应用案例：2个ADC进入临床（如Sacituzumab govitecan）[43]• 杜卡霉素类：- 机制：DNA小沟烷基化- 创新ADC：SYD985（靶向HER2）[44]-采用前药技术保护活性基团c). 最新突破性进展吲哚啉苯二氮卓二聚体：• 优势：强效烷基化能力（IC50＜10 pM）• 首创新药：IMGN779（靶向CD33）• 里程碑：2016年启动I期临床试验（技术注解：PBD二聚体与DNA的共价结合常数为10⁹ M⁻¹量级）1.2.2.2 靶向微管蛋白的payload尽管DNA靶向细胞毒素具有皮摩尔级超高活性的优势，但作为ADC载荷仍存在显著局限性，这直接影响了其在临床开发中的应用格局：1). DNA靶向载荷的技术瓶颈理化性质缺陷：-高疏水性（LogP＞5）：导致抗体偶联困难-水溶液稳定性差（如杜卡霉素半衰期＜2h）-需采用前药保护策略2). 临床开发现状（基于51个ADC的统计分析）• DNA靶向型：11个（21.6%）- 代表：卡奇霉素（首款ADC载荷[35]）- 局限：制剂稳定性挑战• 微管靶向型：37个（72.5%）-奥瑞他汀类（60%）：Dolastatin 10衍生物-美登素类（35%）：Maytansine衍生物• 未公开型：3个（5.9%）3). 微管抑制剂主导的技术逻辑核心优势：• 水溶性改良（引入磺酸基等）• 血浆稳定性（t1/2＞7天）• 可预测的释放动力学典型结构：•奥瑞他汀：含四肽结构的合成类似物•美登素：硫醇修饰的天然产物衍生物1.2.3 Linker理想连接子的设计需满足双重药代动力学要求：1). 动态稳定性平衡血液循环期：维持稳定（半衰期＞7天）肿瘤细胞内：高效释放（释放率＞80%）2). 技术分类与机制a). 不可切割型连接子• 释放机制：-抗体在溶酶体完全降解-释放氨基酸-载荷复合物（赖氨酸/半胱氨酸残基保留）• 开发要求：- 靶点必须高表达（＞10⁵/细胞）- 内化率＞70%/24h- 溶酶体转运效率是关键筛选指标b). 可切割型连接子（后续段落展开）3). 结构-功能关系不可切割型典型结构：• 硫醚键（MC连接子）• 释放形式：Lys-maytansinoid/Cys-auristatin药效影响：• 降低旁观者效应• 提高治疗指数2-3倍可切割连接子的关键特性与设计策略  定义与作用机制可切割连接子通过特定化学键的断裂，释放活性细胞毒素，使其脱离抗体残基（如氨基酸侧链）。其切割机制主要包括以下三类： 酸敏感型-作用环境：细胞内酸性区室（pH 4.5-5.5）  -化学键：腙键、碳酸酯键等  -特点：依赖溶酶体低pH环境，但部分可在内体阶段提前切割  酶敏感型-作用酶：组织蛋白酶B（Cathepsin B）等  -设计：含Val-Cit、Phe-Lys等可切割肽段  -优势：肿瘤选择性高（胞内蛋白酶富集）  还原敏感型-作用条件：胞内高谷胱甘肽（GSH）环境（2-10 mM vs. 血浆2-20 μM） -化学键：二硫键（需空间位阻调控稳定性）  4). 释放形式分类5) 理性设计策略疏水性调控-增加疏水性（如引入芳香环）：促进溶酶体逃逸，增强胞内扩散  - 增加亲水性（如磺酸基修饰）：延长胞内滞留，减少“旁观者效应”  临床优化案例-Mirvetuximab soravtansine：磺酸基修饰连接子，降低毒性。-Sacituzumab govitecan：pH敏感连接子，提高肿瘤选择性。6).技术挑战与趋势-精准切割控制：避免血浆中提前释放（如优化二硫键位阻） -新型切割机制：外源性激活（如光照、肿瘤特异性酶） 连接子可以是"独立式"双功能试剂：其第一个功能基团设计用于与抗体上的功能基团（通常是赖氨酸残基的氨基或半胱氨酸残基的巯基，见图1.6）发生反应，第二个功能基团则能与细胞毒性有效载荷的互补功能基团反应。采用美登素平台构建ADC即运用了这种策略。另一种方式是将连接子化学结构整合到有效载荷中形成单一化学实体，该实体仅含一个能与抗体蛋白反应的功能基团——仍主要靶向赖氨酸残基的氨基或半胱氨酸残基的巯基（图1.6）。采用auristatin平台构建的ADC（如本妥昔单抗 vedotin）正是这种策略的典型代表。图1.6 抗体在偶联反应中常用的功能基团示意图。该带状图展示了IgG1抗体的结构，其主链颜色根据插图进行编码。图中用空间填充原子球体标示了赖氨酸残基（紫色）以及参与链间二硫键的半胱氨酸残基（绿色）。N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂（NHS-linker）通常用于两步偶联反应，例如在ado-曲妥珠单抗-美坦新偶联物制备过程中，将美登素类化合物（红色空间填充）连接到赖氨酸残基上。马来酰亚胺接头-奥瑞他汀类化合物（品红色空间填充）则通常用于通过部分还原链间半胱氨酸-半胱氨酸二硫键形成的游离巯基，将奥瑞他汀衍生物与抗体偶联，例如在brentuximab vedotin的制备过程中。类似的偶联化学方法也可通过蛋白质工程技术，将有效载荷连接到引入抗体结构的半胱氨酸残基巯基上。1.3 ADC分子的构建1.3.1 赖氨酸残基偶联抗体中赖氨酸残基的表面可及氨基是连接子-载荷的理想偶联位点，因为在不破坏蛋白质结构完整性的前提下可对相当比例的赖氨酸进行修饰，从而保留抗体的天然功能和良好药代动力学特性。大多数针对赖氨酸氨基设计的连接子/连接子-载荷复合物采用N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS酯），这类活性酯能优先与伯胺快速反应，在连接子与赖氨酸侧链氨基之间形成稳定的酰胺键。已获批的抗体偶联药物（ADC）ado-trastuzumab emtansine（图1.7），其他处于临床开发阶段的美登素类ADC、以及包含卡奇霉素的ADC（如gemtuzumab ozogamicin和inotuzumab ozogamicin）均采用赖氨酸作为偶联位点。图1.7展示了通过赖氨酸残基偶联的典型ADC结构实例，包括：采用酸敏感肼键连接子的ADC（卡奇霉素偶联物）、不可裂解连接子的ADC（ado-trastuzumab emtansine）、以及通过二硫键还原激活的空间位阻型二硫键连接子ADC（mirvetuximab soravtansine）。图1.7 典型赖氨酸残基偶联ADC示例。吉妥珠单抗奥佐米星与奥英妥珠单抗均采用卡奇霉素作为有效载荷，其连接子含有酸不稳定的腙结构单元（灰色阴影部分），同时包含一个可通过还原反应断裂的空间位阻二硫键（这些ADC的平均药物抗体比值为2至4，为简化图示仅展示一种连接子-载荷结构）。两种美登素类ADC分别展示了不同连接方式：一种是通过美登素DM1的巯基与连接子的马来酰亚胺基团反应形成不可断裂的硫醚键（如ado-曲妥珠单抗美坦新，灰色阴影部分）；另一种是含有可被还原断裂的空间位阻二硫键（如mirvetuximab soravtansine，二硫键以灰色标示，每个抗体携带3至4个美登素分子，对应图示中的n和m值）。mirvetuximab soravtansine的连接子还带有亲水性带电磺酸基团。典型的人源化IgG1抗体在其氨基酸序列中含有80至90个独特的赖氨酸残基。抗体与连接子/连接子-载荷的修饰反应条件（如试剂浓度、反应pH值）必须严格控制，以将平均载荷偶联数限制在每抗体分子约3至4个偶联位点的典型范围内。例如，ado-trastuzumab emtansine的美登素与抗体平均摩尔比（DAR）约为3.5。该比例的选择基于以下考量：(i) 最小化未偶联抗体的含量；(ii) 避免混合物中出现高DAR组分，这类组分因疏水性增强、溶解性降低可能导致生产和制剂工艺问题。此外，高DAR组分可能改变药代动力学特性，疏水性增加会导致清除速率加快。通过质谱分析可估算不同载荷数的ADC组分相对丰度。以DAR≈3.5的美登素类ADC为例（图1.8展示了三种不同连接子-美登素组合的质谱分析），约70-80%的抗体分子携带2至5个美登素，>90%的抗体分子DAR值分布在1至6范围内。在此平均偶联水平下（DAR~3.5），仅约3%的抗体未发生偶联，DAR值≥7的抗体分子比例同样极低。实验观测到的不同DAR组分分布模式具有可预测性，可通过泊松分布或二项分布等统计模型描述。这些发现表明，在偶联反应过程中，通过监测和控制DAR值本身即可有效调控ADC制剂中未修饰抗体的含量。  图1.8 三种去糖基化ADC的解卷积质谱图。展示的是三种不同抗体分别与三种不同连接子-美登素类似物偶联的实例，每种偶联物的平均DAR值为3.5（通过分光光度法测定）。(a) 单抗1-SMCC-DM1；(b) 单抗2-SPP-DM1；(c) 单抗3-磺基-SPDB-DM4。质谱分析也是解析ADC抗体组分中实际偶联位点的重要工具，可通过色谱肽图分析实现。以美登素类ADC技术为例，根据检测灵敏度差异，约有40至70个独立赖氨酸残基（超过总潜在位点半数）会发生部分修饰。例如在ado-trastuzumab emtansine中，单个赖氨酸残基的修饰率分布范围约为25%至＜1%，中位值约4%。这类肽图分析技术可生成特征性指纹图谱，用于比对不同批次ADC产品，从而确保工艺放大至商业化生产时的过程一致性与稳健性。 1.3.2 半胱氨酸残基偶联专为抗体半胱氨酸残基巯基设计的连接子-载荷复合物，利用马来酰亚胺基团与巯基快速反应形成硫醚键的特性实现偶联。已获批ADC药物brentuximab vedotin的载荷auristatin（MMAE），以及当前临床开发中采用同类载荷（MMAE与MMAF）的其他ADC药物，均被合成为带有马来酰亚胺基团的连接子-载荷化合物以便与蛋白巯基反应。采用DNA交联载荷PBD的ADC也可通过此方法构建。图1.9展示了brentuximab vedotin的结构及一个MMAF偶联物的结构示例。brentuximab vedotin所含的缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄醇连接子是蛋白酶可切割连接子的典型代表，其二肽与对氨基苄醇部分间的酰胺键可被溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B切割。该连接子同时属于"无痕迹连接子"，因为酰胺键断裂后会触发对氨基苄醇部分的自消除反应并释放二氧化碳，最终代谢产物为游离MMAE。其他载荷也采用类似的释放机制。而MMAF偶联物采用不可切割连接方式，因此细胞内释放的最终代谢产物仍保留连接子结构及半胱氨酸残基。图1.9 典型半胱氨酸残基偶联ADC示例。获批用于治疗霍奇金淋巴瘤和急性大细胞淋巴瘤的Brentuximab vedotin（本妥昔单抗维多汀），是一种含有缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基-MMAE连接子-载荷的ADC实例，该连接结构包含可被细胞蛋白酶组织蛋白酶B切割的马来酰亚胺-己酰-二肽-对氨基苄基键（灰色阴影部分）。图中还展示了一种单抗-马来酰亚胺-己酰-MMAF偶联物的结构，其中带电的奥瑞他汀衍生物MMAF通过不可切割的连接键（灰色阴影部分）与半胱氨酸残基相连。每种情况下n值通常约为4。抗体通常不含游离的、溶剂可及的巯基，其半胱氨酸残基的巯基往往通过氧化形成二硫键（见图1.6）。IgG1抗体包含16个二硫键：其中4个为链间二硫键（两条重链间2个，每条轻链与重链间各1个），12个为链内二硫键。在非氧化条件下，这4个链间二硫键可被还原并维持为游离巯基对，从而可作为与马来酰亚胺-连接子-载荷化合物反应的位点。在典型的auristatin（澳瑞他汀）偶联物中，需严格控制链间二硫键的还原程度，从而将药物抗体比（DAR）平均值限制在4左右。如先前赖氨酸偶联所述，选择每个抗体分子偶联约4个auristatin的比例，既能最大限度减少未偶联抗体的含量，又可降低DAR值为8的ADC组分（即IgG1抗体链间二硫键完全还原后，所有游离巯基均与马来酰亚胺-连接子-载荷反应形成的产物）的比例。这种"全载"auristatin偶联物的抗肿瘤活性反而低于低DAR值的ADC，这可能是因为其在体内血液循环中被快速清除所致。通过疏水相互作用色谱法对brentuximab vedotin进行的组分分布分析显示，其成品混合物中主要包含每个抗体携带2、4和6个auristatin分子的组分，同时含有少量未偶联抗体（约8%）和DAR值为8的组分（约8%）。抗体与马来酰亚胺-连接子-载荷偶联导致的链间二硫键断裂，可能以牺牲体内稳定性为代价，这种影响因抗体而异——当修饰程度达到极限（IgG1所有四个链间二硫键均被还原，产生携带八个连接子-载荷的ADC）时尤为显著。DAR值为8的auristatin偶联物体内半衰期极短，这可能是其疗效不佳且潜在毒性增加的原因。 一种解决方案是通过基因工程改造抗体，将溶剂可及区域的氨基酸突变为半胱氨酸，利用其未配对的巯基作为载荷偶联位点。该方法可制备DAR值约为2的ADC，且偶联主要发生在每个半抗体的单一特定位点（见图1.6）。这种位点特异性偶联能最大限度减少DAR值≥3的ADC组分生成，这对偶联高疏水性载荷尤为重要。然而，前期筛选合适的抗体突变位点并非易事，且100%的修饰集中于单一特定位点可能增加ADC引发不良免疫反应的风险。目前已有数个采用半胱氨酸位点特异性偶联的ADC进入临床试验阶段。1.4 传统ADC的特征1.4.1 传统ADC的结构特性典型DAR值在3.5至4.0范围内的ADC，其分子量比相应"裸"抗体组分大约增加2%。理想的ADC应保持与未修饰抗体相似的生化特性：在尺寸排阻色谱中主要表现为完整单体分子，且聚集体含量极低。但载荷的引入确实会改变表面疏水性，从而影响溶解性和聚集倾向——这种效应的程度取决于DAR值及载荷的相对疏水性，需深入研究以设计合适的制剂配方来最小化聚集。多数情况下，ADC可采用与母本"裸"抗体相似的制剂形式，临床药房可提供液体剂型（如coltuximab ravtansine）或冻干剂型（如ado-trastuzumab emtansine）。建立精准检测方法至关重要，用于测定未偶联"游离"载荷（包括小分子连接子-载荷衍生物）的含量，这些杂质通常不超过总偶联载荷的百分之几。如前述，质谱分析和疏水相互作用色谱等分析技术是ADC产品表征的关键手段，辅以其他生化与生物物理技术：基于电荷分离的成像毛细管等电聚焦技术、液质联用肽图分析等。这些检测工具多数已广泛用于"裸"抗体产品的表征——抗体本身也是存在糖基化模式、谷氨酰胺/天冬酰胺脱酰胺程度、C端赖氨酸含量等异质性的分子。1.4.2 传统ADC的功能特性1.4.2.1 体外特性理想情况下，每个抗体偶联3.0-4.0个载荷分子时，ADC中抗体组分对其细胞表面靶标的结合特异性及表观结合亲和力应基本不受影。ADC在体外效力评估中还应表现出细胞毒性的特异性和选择性。例如，采用不可裂解SMCC-DM1连接子-载荷形式构建的靶向FRα的美登素类ADC，相较于同型匹配的非结合对照偶联物，能特异性杀伤细胞表面表达人FRα的细胞（图1.10）。图1.10同时展示了采用可裂解sulfo-SPDB-DM4连接子-载荷形式（IMGN853）构建的靶向FRα美登素类ADC的杀伤曲线——通过添加过量未修饰"裸"抗体可阻断其细胞毒效应，证实了抗原介导杀伤的选择性。因此，对于靶向FRα的美登素类ADC，采用可裂解（本案例为二硫键）与不可裂解连接子构建的偶联物，在体外细胞毒性试验中通常难以区分。但根据靶标生物学特性的不同，其体内效力可能存在差异。图1.10 体外细胞毒性测试结果显示：FRα阳性KB细胞经过5天暴露后，(i)采用可裂解磺酸基SPDB-DM4连接子-载荷形式（IMGN853）的靶向FRα美登素抗体偶联药物（虚线开环符号表示加入2μM阻断浓度的"母体"非偶联抗FRα抗体M9346A；实心闭环符号表示未加入阻断抗体）与(ii)采用不可裂解SMCC-DM1连接子-载荷形式的靶向FRα美登素抗体偶联药物M9346A-SMCC-DM1（实心三角符号）的细胞毒性对比，同时与非靶向huIgG1-SMCC-DM1的细胞毒性曲线（虚线开三角符号）进行参照。需要特别指出的是，在这些体外实验中，抗原介导杀伤与非结合对照ADC的效力差异幅度（如图1.10所示约100倍）主要取决于抗体与靶标的结合亲和力。若抗体表观解离常数（KD）仅在5-10nM范围内，其体外实验显示的特异性差异将十分有限。然而，抗体的表观结合亲和力可能只是影响抗体/ADC体内效价的因素之一——在某些情况下，过高亲和力反而可能降低肿瘤组织对药物的总体摄取和滞留。1.4.2.2 体内有效性当ADC达到生化质量标准（单体分子状态、低水平聚集体和游离载荷）并显示适当的体外活性后，应在其相关适应症对应的多种人体肿瘤体内模型中进行抗肿瘤活性评估。这些临床前模型可以是人源肿瘤细胞系建立的异种移植模型，或患者来源的肿瘤异种移植模型（PDx模型）。显然，无论采用何种体内模型评估抗肿瘤活性，都必须预先测定其靶抗原表达水平。通常采用免疫组化方法进行检测——这些方法需经过校准，使其动态范围能够覆盖与ADC细胞杀伤能力相匹配的相关抗原表达水平，并且应尽可能与临床癌症患者样本的检测方法保持一致。图1.11展示了ADC药物mirvetuximab soravtansine（IMGN853）在两种模型中的体内药效评估结果：一种源自FRα阳性Ovcar-3细胞系的异种移植模型（图1.11a），另一种为FRα阳性PDx模型（图1.11b）。研究显示，该偶联物在两种模型中均表现出显著活性——当荷瘤小鼠单次静脉注射5mg/kg（抗体剂量，约合90-100μg/kg偶联美登素）时，可观察到部分或完全肿瘤消退。同型匹配的人源IgG1对照偶联物（相同连接子-载荷结构及DAR值）在此剂量下未显示活性（图1.11b）。在PDx模型中，较低剂量的FRα靶向偶联物（约2.4mg/kg）可产生10-15天的肿瘤生长延迟；而在Ovcar-3异种移植模型中仍能观察到部分及完全缓解。研究还评估了重复给药的效果：图1.11c显示，在FRα阳性KB细胞系异种移植模型中，单次给予2.8mg/kg剂量可产生部分缓解，而每周给药一次、连续三周后则实现肿瘤异种移植物的完全消退。图1.11 米妥昔单抗索拉坦新（IMGN853）在三种FRα阳性异种移植模型中的体内疗效。(a)和(b）图分别展示了IMGN853治疗携带Ovcar-3卵巢癌细胞系异种移植瘤小鼠，以及源自卵巢癌患者的LXFA-737异种移植瘤的剂量反应曲线。荷瘤小鼠（肿瘤体积约130mm³）接受单次静脉注射IMGN853、载体对照（实心菱形，虚线）或非靶向huIgG1-sulfo-SPDB-DM4偶联物（后者仅用于LXFA-737模型；空心圆圈）。荷瘤小鼠分别接受1.2±0.1mg/kg（三角形）、2.4±0.2mg/kg（圆形）或5.0±0.3mg/kg（正方形）的IMGN853治疗，相当于24±3、49±2和98±4µg/kg偶联美登素类似物。非靶向huIgG1-sulfo-SPDB-DM4偶联物注射剂量为5.0mg/kg（90µg/kg偶联美登素类似物）。(c)展示了每周给药IMGN853对KB异种移植瘤抗肿瘤活性的影响。荷瘤约130mm³的小鼠在接种后第6天静脉注射单次载体对照（实心菱形）或50µg/kg偶联美登素类似物的IMGN853（相当于2.8mg/kg抗体；空心三角形），或在接种后第7、14和21天进行多次注射（qw×3；实心圆形）。需要强调的是，典型ADC的抗肿瘤活性应在满足以下两个条件的剂量下显现：(1)小鼠达到的血浆浓度不超过人体临床试验最终可实现的最大血浆浓度；(2)所用剂量对小鼠不显示任何毒性迹象。鉴于小鼠与人类血浆容量与体重的比例相近（分别为40-43mL/kg），这类剂量比较可采用mg/kg单位进行近似估算。尽管还需考虑ADC在小鼠与人体内药代动力学特性的潜在差异，以及（对于不与小鼠抗原交叉反应的抗体）正常组织抗原表达差异可能导致的抗原介导清除率变化，但以mg/kg为单位评估抗肿瘤活性仍能为ADC的开发潜力提供有价值的初步判断。以美登素类ADC为例，其临床试验中达到的最大耐受剂量为个位数mg/kg范围，其中部分药物在该剂量下已显示出明确抗肿瘤活性。值得注意的是，虽然美登素类ADC在小鼠中的最大耐受剂量可>80mg/kg，但临床前评估中显示高效力的活性剂量应与人体可能达到的最大剂量（个位数mg/kg范围）相近，这样才能为临床试验成功提供最佳机会（参见图1.11示例）。1.4.2.3 ADC的PK为准确建立活性-暴露量关系模型，还需在临床前模型中表征ADC的药代动力学特性。常规检测指标包括：总抗体（不考虑DAR值，含未偶联抗体）、完整偶联物及游离载荷。不同偶联物的药代参数存在差异——并无"典型"参数组合——因其取决于抗体特性、正常组织靶标表达（抗原介导清除）、连接子化学性质以及载荷类型与DAR值。以美登素类ADC为例：采用可裂解空间位阻二硫键连接子的coltuximab ravtansine在非霍奇金淋巴瘤II期临床试验中显示约7天的半衰期；而采用不可裂解连接子的ado-trastuzumab emtansine在乳腺癌患者中因抗原介导清除效应，半衰期约为3-4天。1.5 总结为增强抗癌药物的抗肿瘤活性，肿瘤学家评估了多类高效细胞毒剂，包括强效微管蛋白抑制剂（如美登素、海兔毒素10）以及高效DNA损伤剂（如杜卡霉素类的adozelesin、bizelesin）。然而，这些强效化合物的临床评估均未能显现疗效优势——因其治疗窗不足而无法用于癌症治疗。 随着非免疫原性单克隆抗体（工程化抗体或源自表达人免疫球蛋白基因的转基因生物）的出现，药物化学家得以利用抗体的肿瘤靶向性作为载体，将这些高效细胞毒剂定向递送至肿瘤部位。这一理念的临床验证随着两种ADC药物的获批而实现：2011年FDA加速批准的微管蛋白抑制剂brentuximab vedotin（用于治疗霍奇金淋巴瘤和大细胞淋巴瘤）以及2013年FDA完全批准的ado-trastuzumab emtansine（用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌）。 这些成功案例重新激发了学术界和生物制药行业对ADC的研究热情。ADC发展前景令人振奋——这些药物既能提供卓越的抗肿瘤活性，又可避免传统细胞毒化疗常见的严重毒性，有望为癌症患者带来突破性治疗选择。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。