Glycine

摘要:配方设计是用于注射途径给药剂型的药品产品开发的组成部分。特别是对于冷冻干燥配方，辅料的选择至关重要，直接关系到冷冻干燥循环性能和最终产品质量。本章聚焦于冷冻干燥蛋白配方的开发，例如单克隆抗体配方。疫苗、寡核苷酸以及基因和细胞治疗产品不在本章讨论范围内。总结了用于注射冷冻干燥生物制药的典型辅料及其功能，并提供了近期商业配方的示例。讨论了在冷冻和解冻过程中的稳定机制、固态中的分子动力学、关键质量属性以及产品属性与冷冻干燥循环性能之间的联系，并在案例研究中举例说明了依赖配方参数的冷冻干燥一般规则。 1.辅料选择 辅料是配方中非治疗活性成分，用于在配方基质中稳定蛋白质。辅料的选择至关重要，因为它直接影响最终药品产品的关键质量属性。辅料需要无毒性、无免疫原性，并在应用的临床剂量下安全。辅料必须获得预期给药途径的批准，并符合药典要求。这尤其适用于通常通过注射途径给药的生物制药，这限制了辅料的选择。此外，辅料应在制造、运输和药品产品的整个保质期内稳定，理想情况下应易于处理 。 1.1.辅料的作用 表 1 提供了近期单克隆抗体冷冻干燥配方中通常使用的辅料概览，包括它们的功能、具体示例和注意事项。可以在 Constantino 和 Pikal发布的生物制药产品辅料小手册中找到更多示例。 一般来说，辅料的作用包括蛋白质稳定、产品可制造性（填充剂、降低粘度剂）、确保人类耐受性（缓冲系统、等渗剂）、确保正确和安全的药物给药，以及提供使用中的稳定性（防腐剂、加速重构、表面活性剂、降低粘度剂）。重要的是，辅料可能同时执行多个功能。特别是对于冷冻干燥配方，辅料的选择也与冷冻干燥过程性能相关，如下节所述。配方的定量组成，例如总固体含量或蛋白质与糖的比例，结合填充体积，显著影响冷冻干燥蛋糕的阻力和最终冷冻干燥过程性能以及产生的关键质量属性，如蛋糕外观、残留水分和重构时间。 1.1.1.蛋白质稳定 对于冷冻干燥配方，辅料首先需要在冷冻干燥前稳定溶液中的蛋白质，然后在冷冻干燥过程中，最后在药物产品运输和干燥状态下的储存期间稳定蛋白质。缓冲液用于防止显著的 pH 变化，否则可能会破坏蛋白质折叠，从而影响生物活性。蛋白质配方通常在它们的等电点远离几个 pH 单位处制备，以避免基于电排斥的蛋白质聚集。在许多情况下，pH 的选择是在物理和化学稳定性之间以及在配方开发活动中筛选的，连同生理耐受性，如下文进一步概述。对于单克隆抗体，典型配方的 pH 值在 5 到 7 之间。此外，对于冷冻干燥配方，缓冲系统在冷冻过程中不应结晶，从而失去功能，如磷酸盐或琥珀酸盐缓冲液的情况。表面活性剂是两亲分子，是蛋白质配方的重要组成部分。它们通过优先占据相同的竞争位点来保护蛋白质免受各种类型的界面应力，从而保护蛋白质。表面活性剂防止蛋白质在液体状态下的填充完成过程中吸附，例如吸附到无菌过滤器或管道上，并保护在液体-空气界面上的扰动。在冷冻和干燥过程以及随后的储存期间，表面活性剂对冷冻干燥配方的相关性较小，因此可以比等效液体配方使用更低的浓度。对于注射剂型，只有少数批准的表面活性剂（例如，聚山梨酯 20、聚山梨酯 80、solutol 和泊洛沙姆 188）。它们各自都有其特定的挑战。聚山梨酯容易发生氧化和水解降解，后者可能是由酶引起的，这些酶是药物物质制造过程中的残留宿主细胞蛋白，泊洛沙姆可能会与蛋白质聚集体和硅胶形成可见颗粒，正如最近报道的那样。由于这些是长期事件，通常发生在液体状态下的产品保质期内，因此表面活性剂降解对冷冻干燥配方的相关性较小。然而，在进一步稀释产品到输液袋中时，表面活性剂在药物给药期间很重要，以防止蛋白质吸附；下面将进一步阐述这种情况。与冷冻干燥配方相比，氧化事件在液体溶液中加速。尽管如此，为了保护蛋白质免受氧化应激，包括在填充完成过程中由于制造区域的消毒周期中可能残留的过氧化氢，可以向配方中添加抗氧化剂，如蛋氨酸。抗氧化剂也可以添加以保护其他辅料免受氧化。在冷冻干燥配方中，辅料需要在冷冻和干燥过程中稳定蛋白质。虽然冷冻浓缩到最大冷冻浓缩液导致分子拥挤和通过产生新的冰/配方界面的界面应力，干燥步骤通过升华和脱附冰层或剩余吸附水对蛋白质造成压力。特别是，水/冰分子与蛋白质之间的氢键的破坏可能导致蛋白质展开。过去几十年中为蛋白质稳定建立的最常见辅料是糖，如蔗糖和海藻糖。这些辅料被认为通过优先排除、玻璃化和水替代来稳定蛋白质，如下节进一步阐述。由于它们能够糖化蛋白质，因此不鼓励使用还原糖。辅料影响最大冷冻浓缩液的玻璃化转变温度（Tg'）、冷冻干燥循环中的塌陷温度（Tc）以及冷冻干燥后产品的玻璃化转变温度（Tg），因此也从加工角度来看也很重要。Tg' 和 Tc 有助于优化冷冻干燥循环时间，在保持冷冻干燥蛋糕完整性的同时获得短的冷冻干燥循环。Tg 与产品储存温度相关，如下节 3 更详细地概述。尽管海藻糖在 Tg'/Tg 方面优于蔗糖，但由于其在冷冻状态下辅料结晶的潜力，例如在药物物质储存期间，带来了挑战。为了进一步减少冷冻干燥循环时间，并在保持蛋白质稳定性和优雅蛋糕外观的同时允许更高的产品储存温度，探索了如 2-羟丙基-β-环糊精、聚维酮或与蔗糖等冷冻/干燥保护剂混合的葡聚糖等辅料，以提高玻璃化转变和塌陷温度（在表 1 中称为塌陷温度修饰剂）。尽管葡聚糖在保持蛋糕外观方面是一个有前景的辅料，但已证明它会导致蛋白质糖化，特别是在升高温度下储存时。 1.1.2.可制造性 冷冻和干燥保护剂以足够高的浓度使用，以在产生完整的冷冻干燥蛋糕的同时稳定蛋白质。然而，在药物负荷低的情况下，可能需要填充剂来生产优雅的产品。填充剂可以是蔗糖或海藻糖等糖，但由于有利的工艺性能，可能更倾向于其他辅料。例如，经常使用甘露醇，它产生优雅的蛋糕并能够快速和容易的冷冻干燥循环。然而，甘露醇的冷冻干燥可能导致包括无定形和结晶形式在内的不同多晶型，后者影响蛋白质稳定性。因此，建议在使用基于甘露醇的配方时进行退火步骤，以允许一种转化为另一种。此外，最近表明，高填充体积、快速冷冻速率和高甘露醇浓度依赖于基于甘露醇的配方的目标冷冻温度可能导致小瓶破裂，这可以通过工艺参数优化来避免，例如退火。对于高浓度蛋白质配方，可能需要添加降低粘度剂以避免在无菌过滤、填充或随后的药物给药过程中遇到挑战，但也由于增加的粘性流动和蛋糕阻力而在冷冻干燥过程中遇到挑战。高粘度是由分子拥挤产生的，特别是由非共价蛋白质-蛋白质相互作用产生的。这些通常在中等蛋白质浓度（例如，约 50 mg/mL）时由长期的、在许多情况下是静电相互作用主导，过渡到在更高蛋白质浓度（例如，约 200 mg/mL）时短期相互作用，如疏水相互作用占主导。前者可以通过添加不同的反离子来筛选，后者可以通过添加氨基酸来筛选。已证明精氨酸盐和衍生物最为有效。 1.1.3.耐受性 注射产品通常配制成等渗渗透压和等水性pH值，以在患者中获得最佳耐受性。耐受性，包括注射时的疼痛，取决于给药途径，Roethlisberger及其同事最近回顾了相关豁免情况。如上所述，等水性条件由缓冲系统调整，与物理和化学稳定性相妥协。为了维持酸碱平衡，由于血液的自我缓冲能力，对于较大体积的静脉输液配方，缓冲系统被放弃。可以通过不同的辅料获得等渗性。然而，在许多情况下，它们是基于一个或多个额外功能而被选中的。特别是对于冷冻干燥配方，冷冻和干燥保护剂或填充剂因此有资格作为等渗剂。 1.1.4.药物给药 由于微生物生长的考虑，注射产品通常作为单剂量剂型供应。然而，如果通过添加防腐剂、初级包装容器的设计，或立即由预期使用者使用来防止从初级包装容器多次抽取时的潜在微生物污染，药物产品也可以作为多剂量小瓶供应。冷冻干燥产品的准备包括在无菌条件下重构产品，随后直接注射或进一步稀释到输液袋中。重构时间应快速，即立即或在几分钟内，因此对最终用户来说很方便，理想情况下无需额外设备。如果在实现快速重构时间方面遇到挑战，建议对蛋糕结构进行初步彻底表征，并密切审视冷冻干燥过程参数和循环性能。此外，通过降低冷冻干燥后的顶空压力可以加速重构。如有必要，可以通过添加辅料如叔丁醇进一步加快重构。在注射时，重构的配方需要能够通过通常的25-27G（皮下）或31G（眼部）针头进行注射，这可能需要上述的降低粘度剂。在输液过程中防止蛋白质吸附到给药材料上，添加表面活性剂是必不可少的。 1.2.商业冷冻干燥药品产品的示例 为了举例说明上述辅料的选择及其作用，表2提供了一个非穷尽的本章范围内的冷冻干燥生物制药的上市配方列表。Constantino和Pikal之前发布的出版物中可以找到包括单克隆抗体以外的生物分子和2004年之前的全部注射、冷冻干燥产品的完整列表。特别是，表2中突出了配方成分，为表1中列出的辅料提供示例。此外，还总结了首批进入欧洲和美国市场的两种参考产品，Herceptin®和Remicade®的生物类似药的配方。 表2显示，大多数商业抗体基配方包含组氨酸或磷酸盐缓冲液，pH值在5.0到7.2之间，结合蔗糖或海藻糖作为冷冻/干燥保护剂/等渗剂，以及聚山梨酯作为稳定剂。一些配方由甘露醇、甘氨酸或葡聚糖作为填充剂组成。有趣的是，相同参考产品的生物类似药配方并不相同，例如，在英夫利昔单抗生物类似药Zessly®和Ixifi®的情况下包括了如山梨醇和甘氨酸等稳定剂。 2.蛋白质的工艺和储存稳定性：在冷冻、干燥和储存期间的稳定 2.1.理论考虑 蛋白质在冷冻干燥和随后干燥状态下的稳定机制通常可以通过以下三个概念来描述： • 水替代理论描述了蛋白质原生结构的热力学稳定。根据这一理论，辅料与蛋白质相互作用形成氢键，从而作为在干燥过程中被移除的水分子的替代品。需要辅料在蛋白质表面形成单层，以在所有氢键位点替代水，从而充分稳定蛋白质。通常需要辅料与蛋白质的最小摩尔比为360:1，以确保冷冻干燥产品中蛋白质的稳定性。 • 玻璃动力学和玻璃化理论描述了动力学稳定，其中蛋白质被固定在无定形辅料的玻璃基质中。玻璃化被认为有助于蛋白质在冷冻和干燥过程中的稳定性，以及在干燥状态下的储存。更精确地说，这一机制描述了通过增加粘度（在冷冻过程中通过冷冻浓缩和温度降低，在干燥过程中通过水的移除）来降低流动性，从而减缓动态降解过程。由于增加粘度导致的这种固定与玻璃转变有关，对于最大冷冻浓缩溶液称为Tg'。在干燥状态下的玻璃转变温度称为Tg，代表整体流动性（α松弛或慢运动）。最近，多项研究进一步证实了局部流动性（β松弛或快运动）在固态中的重要性。关于局部和整体流动性与干燥状态下蛋白质稳定性的作用将在下面的3.5节中更详细地讨论。 • Timasheff等人发展的优先排除理论描述了蛋白质的热力学稳定，其中溶质从蛋白质表面被排除，从而使蛋白质优先保持在其水合形式。虽然这一机制主要描述了在液态中通过共溶剂稳定蛋白质，但它也对在冷冻步骤开始时的蛋白质稳定性有所贡献，当时溶液尚未玻璃化。 2.2.实际考虑 玻璃化和水替代理论都与干燥状态下蛋白质的稳定性有关。这两个理论的极端重要性已在Tonnis等人的研究中得到证实。他们研究了一种用不同类型的糖冷冻干燥的抗体：二糖海藻糖、4 kDa的菊粉作为灵活的寡糖，以及不同分子量的葡聚糖。所有配方都在60°C下储存，这远低于它们的玻璃转变温度（Tg），因此通过玻璃化来稳定。尽管如此，在配方中观察到了稳定性差异，这不能通过玻璃化来解释。每种辅料都有羟基，因此预期通过水替代来稳定。这项研究表明，仅玻璃化不足以确保蛋白质的稳定性。此外，该研究进一步完善了水替代理论，强调了立体障碍的重要性。辅料的立体属性是确定糖是否能够通过水替代来稳定的一个重要参数。Tonnis等人发现，与缺乏在蛋白质表面形成紧密单层能力的刚性糖相比，灵活的糖是更好的稳定剂。随着糖分子大小的增加，关于蛋白质相互作用的立体障碍的相关性变得越来越重要。最后，Tonnis等人的研究表明，蛋白质稳定性是由水替代而不是玻璃化来决定的。这与文献一致，文献指出，在比玻璃转变温度低10-20°C的储存温度下，蛋白质稳定性是由玻璃化决定的，而在远低于Tg的温度下，水替代是主要机制。水替代、立体障碍和玻璃化之间的这种相互作用进一步通过图1中所示的数据得到证明。当用二糖蔗糖或灵活的寡糖2-羟丙基-β-环糊精（HPβCD）在摩尔蛋白质与糖比例分别为1:3485和1:794的情况下冷冻干燥一种抗体时，抗体配方得到了很好的稳定。相比之下，当用刚性多糖葡聚糖500 kDa在摩尔比为1:3068（基于葡萄糖单元计算）的情况下配方时，观察到了可溶性聚集体的增加，表明立体障碍的影响。然而，当使用葡聚糖500 kDa和蔗糖的混合物时，小的二糖（摩尔蔗糖与蛋白质比例>360:1）能够通过氢键与蛋白质紧密相互作用，而葡聚糖可以通过玻璃化来稳定。在40°C储存9个月后的稳定性数据显示了玻璃化的重要性。蔗糖配方的Tg约为43°C（残留水分约为4%），而HPβCD配方的Tg约为200°C。因此，当在40°C储存时，蔗糖配方中的抗体没有得到充分固定，显示出高度聚集，而HPβCD配方在远低于其Tg的条件下储存，观察到的聚集要少得多。 2.3.辅料属性及其对冷冻干燥过程的相关性 冷冻干燥是一种成本高且耗时的药品产品制造过程。因此，一个最优的冷冻干燥开发过程旨在开发短的冷冻干燥循环，在确保蛋白质稳定性的同时，制造出优雅的冷冻干燥物。要做到这一点，一个先决条件是对配方的Tg'的知识，这是设计冷冻干燥过程的一个重要特征。 图1 冷冻干燥前（pre-FD）和冷冻干燥后（post-FD）通过尺寸排阻色谱法显示的可溶性聚集体，用于配制总量为80 mg/mL糖的10 mg/mL单克隆抗体。 2.3.1.辅料属性的分析 Tg'通常使用差示扫描量热法（DSC）确定，通过在冷却和加热循环期间对样品和参考皿的热容进行比较测量。与其他吸热（例如，熔化）或放热（例如，结晶）事件不同，玻璃转变不是一个相变，而是一个动力学现象，可以检测为基线上的一个台阶，由于热容的变化。一般来说，加热或冷却速率越高，在DSC测量中检测软台阶的灵敏度越高。然而，更快的速率涉及台阶的展宽，并且通常将玻璃转变温度向更高温度移动。因此，首先在较高速率（例如，5°C/min或10°C/min）进行筛选，然后在较低的加热和冷却速率（例如，1-3°C/min）下进行第二次运行，以准确确定Tg'，可能会有所帮助。对于冷冻干燥过程开发，除了DSC测量外，通常还使用冷冻干燥显微镜来确定配方的塌陷温度（Tc）。 如上所述，DSC还可以确定结晶事件，如共晶温度（Teu），在甘露醇等结晶填充剂的情况下变得重要。冷冻干燥后，当使用甘露醇等结晶辅料时，可能需要X射线粉末衍射（XRPD）作为额外的技术来表征冷冻干燥物的形态，这也可以使用XRPD确定可以形成不同多晶型的结晶辅料。 结晶辅料通常被用来克服蔗糖或海藻糖基配方的低玻璃转变温度相关的挑战，特别是对于低浓度蛋白质配方，但确实增加了额外的复杂性，不仅需要额外的分析，而且对冷冻干燥过程也是如此。 2.3.2.辅料特性与冷冻干燥工艺参数之间的联系 2.3.2.1.冷冻 配方的玻璃化转变温度（Tg’）显著影响冷冻干燥周期的冷冻步骤，主要影响初级干燥步骤。对于冷冻步骤，选择一个低于非晶态配方的Tg’和/或低于共晶配方的共晶温度（Teu）的最终冷冻温度至关重要，同时要保证足够的保持时间，以确保蛋白质在进入初级干燥步骤之前完全固化。因此，配方的Tg’越低，最终冷冻温度也应越低。 2.3.2.2.初级干燥前的退火处理 退火是一种引入冷冻协议中的热处理过程，样品在此过程中保持在Tg’以上和冰的熔点以下一定时间。当使用像甘露醇这样的结晶填充剂时，通常会应用此步骤，因为退火可以促进其结晶。当作为填充剂使用时，必须确保甘露醇完全结晶，以便在低于其共晶温度下进行干燥，并确保后续储存过程中蛋白质的稳定性不受影响。如果在冷冻干燥过程中甘露醇保持非晶态，它会与蛋白质相互作用并稳定蛋白质。在储存过程中结晶的甘露醇将不再与非晶态蛋白质相互作用，从而危及蛋白质的稳定性。 2.3.2.3.初级干燥 在初级干燥过程中观察到的塌陷（结构丧失）的温度称为塌陷温度（Tc）。在初级干燥过程中，通过升华去除水分，产品温度应保持在Tg’以下或至少低于Tc。如果初级干燥在Tg’和/或Tc以上进行，会诱导粘性流动，可能导致冷冻干燥产品的塌陷。塌陷是关于蛋糕外观的不良质量属性，因此应避免。塌陷可能会或可能不会影响蛋白质稳定性，这取决于塌陷的程度。因此，建议选择导致产品温度低于Tc的初级干燥条件。然而，对于常用的冷冻/干燥保护剂如蔗糖和海藻糖，这会导致冷冻干燥过程漫长且成本高昂，因为这些二糖的Tg’较低。对于高浓度抗体配方，糖的低Tg’被蛋白质本身的高Tg’所补偿。此外，由于随着抗体浓度的增加，粘度增加，Tg’和Tc之间的差值增大。Colandene等人发现，对于100 mg/mL的蛋白质配方，完全塌陷发生在Tg’以上约13°C。虽然对于高浓度蛋白质配方，可能可以在Tg’以上进行冷冻干燥，但对于低粘度配方，Tg’和Tc通常非常接近（Tc比Tg’高1-3°C）。为了使低浓度蛋白质配方能够快速冷冻干燥，通常会在配方中添加如甘露醇这样的填充剂来补偿非晶态配方的低Tg’。填充剂通常是像甘露醇这样的结晶化合物，它们不会对蛋白质稳定性做出贡献，但可以使冷冻干燥产品外观优雅。最近，Horn等人研究了作为甘露醇替代品的结晶氨基酸作为填充剂。这样的填充剂可能优于甘露醇，因为它们可以以比甘露醇低得多的浓度添加，同时交换更高的稳定剂含量，同时仍显示出完全结晶 。然而，这样的辅料通常需要退火以确保完全结晶，从而增加了冷冻干燥过程的复杂性。 2.3.2.4.次级干燥 次级干燥的目的是通过解吸去除未冻结的结合水，并实现低残留水分，通常小于1%。低残留水分对于确保在干燥状态下后续储存期间蛋白质的稳定性至关重要。较高的残留水分与冷冻干燥产品的Tg呈负相关，从而导致全球流动性增加，这对蛋白质稳定性不利。 2.4.冷冻干燥的一般配方“规则” 辅料的选择影响冷冻干燥工艺设计并影响工艺性能。此外，对于冷冻干燥配方，还应考虑以下方面： • 蛋白质与糖的比例 • 总固体含量 • 填充高度 蛋白质与糖的比例对确保蛋白质稳定性的影响已经讨论过。此外，这个比例还影响配方的总固体含量，进而影响冷冻干燥工艺性能。较高的固体含量通常会促进更高的过冷度，从而产生许多通常尺寸较小的孔隙，因此显示出更高的干层阻力 。较高的干层阻力限制了质量传递，因此增加了初级干燥时间。从可制造性的角度来看，通常更倾向于较低的总固体含量。因此，对于较高的蛋白质浓度，应避免使用不贡献于蛋白质稳定性的填充剂，以及超出蛋白质稳定性所需的冷冻/干燥保护剂浓度。与较高的固体含量类似，较高的填充体积也会增加干层阻力。在升华过程中，随着瓶子中干燥部分的增加，获得的干层更厚，从而导致蛋糕阻力高。这通常需要更长的初级干燥时间，甚至可能导致熔化回流和/或显著的蛋糕收缩问题，除非对干燥条件进行优化。应选择与填充体积相适应的适当瓶子尺寸。作为一个经验法则，应避免填充体积超过瓶子尺寸的一半。 2.5.固体状态动力学 冷冻干燥的蛋白质配方可能是非晶态或结晶态，这取决于配方组成和/或冷冻干燥加工条件。非晶态配方缺乏长程有序，因此通常在固态中的反应性比结晶配方更高。一般来说，生物制剂（例如，单克隆抗体）的冷冻干燥配方本质上是非晶态的。除了配方组成外，玻璃动力学也影响冷冻干燥蛋白质配方的稳定性。动力学可能是全局的（⍺-松弛）或局部的（β-松弛）。玻璃化转变温度，Tg，是全局分子流动性的指标，传统上用于预测非晶态配方在固态中的稳定性。如前所述，Tg标志着粘性流动的开始。低于Tg时，非晶态配方表现为不可移动的玻璃态固体，而高于Tg时，非晶态配方转变为橡胶状或“流体状”状态。在许多情况下，观察到Tg与固态稳定性之间有很好的相关性。Duddu等人强调了Tg相对于储存温度的重要性。蔗糖配方（Tg≈59°C）在60°C时表现出不稳定性，与海藻糖配方（Tg≈80°C）不同。然而，在其他情况下，观察到的相关性较差。例如，像葡聚糖这样的高Tg辅料，并没有显示出比具有较低Tg的玻璃对于抗IL-1抗体配方更好的稳定性。同样，额外添加少量增塑剂（例如，山梨醇）降低了Tg，但改善了IgG1抗体蛋白配方的稳定性。全局流动性也可以通过结构松弛时间（τ）来评估，在某些研究中，与τ的观察到的相关性更好。τ是焓松弛中分子流动性的度量，代表非晶态固体的动力学。结构松弛代表从非晶态“玻璃态”到过冷态的玻璃松弛。Kohlrausch-William-Watts（KWW）方程表示结构松弛为： 其中τ代表结构松弛时间，β是伸展函数，表示松弛状态的分布。具有更高τ值的配方代表更好的稳定性。然而，在许多情况下，观察到与结构松弛参数的相关性较差，而局部（快速）运动与稳定性行为相关。局部（快速）运动可能在低于Tg的温度下主导分子流动性。快速动力学已通过多种技术进行了表征，包括中子散射，它测量氢在纳秒时间尺度上的运动的均方振幅，通过固体核磁共振（ssNMR）测量晶格自旋松弛时间，或者通过正电子湮灭寿命光谱学（PALS），它测量作为正电子寿命函数的自由体积。多项研究评估了快速局部运动（β松弛），与冷冻干燥蛋白质配方的储存稳定性相关。Wang等人评估了蔗糖水平对蛋白质储存稳定性的影响，以了解二糖对蛋白质稳定的贡献。蛋白质的物理稳定性随着蔗糖含量的增加而增加。通过中子背散射测量的快速局部流动性以及通过密度测量的自由体积随着配方中蔗糖水平的增加而减少，与稳定性趋势相匹配。Chang等人同样评估了含有蔗糖、海藻糖或与山梨醇与蔗糖或海藻糖混合的配方的影响。结构α-松弛时间τ，作为分子流动性的指标，也得到了表征。在基于蔗糖的配方中添加少量山梨醇导致保留更多天然结构，松弛时间更短，稳定性更高。对于基于海藻糖的配方，山梨醇对蛋白质结构没有影响，但显示出与基于蔗糖的配方相似的松弛时间减少和稳定性增加。 稳定性与基于蔗糖的配方的天然结构保留相关，但对于基于海藻糖的配方，结构松弛时间或天然结构无法预测稳定性。假设快速（β）松弛而不是慢速全局（⍺）松弛可能对稳定性更为关键。Chieng等人测试了人生长激素的冷冻干燥配方，作为非晶态羟乙基淀粉/二糖（蔗糖或海藻糖）配方，有和没有添加多元醇（山梨醇和甘油），并通过真实密度测量测量“自由体积”，通过中子背散射和PALS测量快速动力学（局部流动性）。自由体积变化、快速动力学局部运动和PALS孔径数据均与羟乙基淀粉/二糖系统的稳定性相关。ssNMR是另一种用于研究蛋白质在冷冻干燥状态下的动力学以及表征冷冻干燥蛋白质配方中快速运动的方法。自旋晶格松弛时间（T1，ns-s时间尺度）、旋转框架中的自旋晶格松弛时间（T1⍴，s-ms时间框架）和自旋-自旋松弛时间（T2，ms-s时间框架）都已用于确定快速运动，进而提供固体状态下分子流动性的信息。 Yoshioka等人评估了冷冻干燥的牛血清白蛋白（BSA）和γ-球蛋白（BGG）中质子的ssNMR自旋-自旋松弛时间（T2）作为水合水平的函数。当水分含量大于0.2 g/g蛋白质时，冷冻干燥的BSA和BGG容易聚集。冷冻干燥蛋糕中蛋白质的质子T2随着水分含量的降低而增加。随着水分含量的增加，聚集敏感性增加，这与蛋白质中质子的T2增加相对应。Mensink等人同样评估了IgG模型蛋白和糖（海藻糖、菊粉和葡聚糖）的ssNMR松弛时间（作为快速运动的度量），以与蛋白质储存稳定性相关。通过比较两个时间尺度上的ssNMR松弛时间来评估相容性，以提供2-5 nm和20-50 nm长度尺度上的相容性信息。相似的松弛时间表明相容性。较小的糖（例如，海藻糖）显示出与IgG蛋白更好的相容性，表明较小的糖与蛋白质之间有良好的相互作用。较大的糖（例如，菊粉和葡聚糖）表现最差，并在NMR长度尺度上发生相分离。固体状态氢-氘交换（ssHDX）也已用于与冷冻干燥状态下的稳定性相关。将冷冻干燥粉末中的蛋白质暴露于在特定湿度和温度下的重水。氘化水平反映了蛋白质-辅料相互作用以及构象稳定性。Moorthy等人评估了肌红蛋白配方的ssHDX-MS，并将ssHDX-MS趋势与固体状态下的储存稳定性相关。蔗糖配方显示出比含有甘露醇或氯化钠的配方更低的氘吸收和更好的稳定性。随着蔗糖含量的增加，ssHDX-MS交换减少，并与稳定性很好地相关。相比之下，稳定性趋势与傅立叶变换红外光谱（FTIR）的带强度不相关。在其他研究中，ssHDX-MS趋势与单克隆抗体的稳定性很好地相关。在一项关于牛血清白蛋白和重组人血清白蛋白的研究中，添加小电解质（LiCl、NaCl、KCl、RbCl和CsCl）改善了配方的稳定性。没有观察到与二级结构或全局流动性相关。然而，通过中子背散射或PALS观察到快速动力学与稳定性之间有很好的相关性。随着新技术的出现，对快速运动及其与蛋白质配方稳定性的相关性的理解引起了相当大的兴趣。对全局和局部运动的全面理解最终可能帮助配方师和工艺工程师开发出最佳的冷冻干燥配方。 3.产品质量属性 从监管角度来看，冷冻干燥产品必须符合注射剂产品的质量要求。冷冻干燥产品的质量要求可以进一步区分为重新配制后和在干燥固态中的要求。典型的药典重新配制后测试包括无菌性、内毒素和微生物限度、颗粒物质、颜色、浑浊度、pH值、纯度、效力和容器封闭完整性（CCI）。对于干燥的冷冻干燥产品，剂量单位的均匀性、外观（例如，颜色和质地）、重新配制时间和水分水平被列出。在产品和工艺开发研究中，识别影响期望产品质量的产品属性作为关键属性。关键质量属性（CQAs）需要根据预先定义的控制策略进行监测和/或控制。根据ICH Q8，关键质量属性是物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，应在适当的限制、范围或分布内，以确保期望的产品质量。反过来，期望的产品质量是由对安全和有效药物产品的需求驱动的。如上所述，进行典型的药典测试以测试冷冻干燥产品的潜在关键质量属性（pCQAs）。除了稳定性外，蛋糕外观和残留水分特别表明了工艺的稳健性。对于干燥的冷冻干燥产品的pCQAs，没有太多指导可用。根据21CFR610.13，每批干燥产品都应测试残留水分，并应符合并不得超过生物制品许可申请中备案的批准方法所规定的既定限度。在FDA关于注射剂冷冻干燥的检查指南的“冷冻干燥产品的成品测试”小节中，除了水分含量外，只提到了蛋糕外观，或者更准确地说是“熔化回流”，与产品稳定性有关。此外，由于水分较高和剂量挑战，熔化回流与稳定性问题相关，因为用户阶段的更高重新配制时间可能导致不完全溶解。以下部分关注重新配制前的冷冻干燥产品的属性；水分含量、比表面积（SSA）、蛋糕外观和重新配制时间被讨论，以考虑它们对产品稳定性和冷冻干燥工艺稳健性的影响。 3.1.残留水分 3.1.1.水对蛋白质稳定性的影响 水和蛋白质在分子水平上相互作用，涉及蛋白质的亲水性、疏水性和离子基团。在蛋白质的疏水区域附近，水分子形成排列良好的水簇。相比之下，与特定极性基团形成氢键。在水溶液中，与蛋白质没有直接接触的水分子（本体相）表现为自由水，对蛋白质分子没有影响。基于蛋白质与水的各种分子内相互作用机制，水分子与蛋白质分子的结合可以分为三个区域： • 首先，水分子结合到高度活性位点，即带电和极性基团，并在蛋白质周围形成单层。 • 其次，当水分子与较弱吸附位点相互作用时，从单层到多层发生转变，例如肽链主干或由于膨胀效应而暴露的极性基团。 • 第三，多层区域，水分子在弱结合位点凝聚，松散结合的水层形成。不同层的出现取决于可用的水分，即水分含量。在冷冻干燥过程中，首先冷冻的本体水升华。接着，围绕蛋白质分子的水（作为多层）被去除，而蛋白质周围残留的单层依然存在。进一步干燥也将去除单层水。据推测，由于与蛋白质分子的强烈相互作用，单层水表现出较低的热力学活性。相应地，多层水被认为比单层水保持更高的自由水活性，这取决于其与蛋白质分子的距离。因此，决定蛋白质稳定性的不是绝对的残留水分含量，而是具有高水分活性的水量。将水分活性概念应用于冻干蛋白药物中残留水分的作用，低残留水分含量应是有益的，通过减少化学反应（如断裂、氧化、脱酰胺、变性或聚集）的可能性。相反，随着残留水分含量的增加，由于蛋白质分子的构象灵活性增加、水的流动性增加以及水作为反应伙伴的可用性增加，例如对于水解反应，化学反应的可能性增加。此外，水可能作为增塑剂降低玻璃化转变温度，导致流动性增加，如上文详细阐述。维持蛋白质稳定性的适当水分水平因产品而异，也取决于蛋白质及其降解途径。表3列出了并描述了调查水分含量对蛋白质稳定性影响的相关案例研究。从这些研究中可以得出结论，水分含量需要仔细平衡。一方面，过度干燥可能会导致结构水的去除，从而暴露蛋白质表面，可能导致聚集和活性丧失。另一方面，在超过单层的水分水平下，流动性和反应性增加，可能会损害构象和化学稳定性。流动性的增加可能导致构象变化，例如展开，这反过来又可能导致由疏水氨基酸残基暴露引起的不可逆物理聚集。由于水作为反应物导致化学不稳定的例子是脱酰胺反应和水解反应，高水平的水增加了反应速率。一个基于增加的构象灵活性和松散结合的水使反应物活化的化学降解例子是蔗糖制剂中的美拉德反应，更高的残留水分含量促进蔗糖水解，导致“褐变反应”。因此，将水分含量保持在略低于或等于单层水平似乎最为有益。 3.1.2.水分含量与工艺性能的关系 由于水分含量影响冻干产品的稳定性，因此为水分含量定义了规格限制。确保批次内和批次间的一致性也很重要。在一个批次内，冻干机内的热传递差异，例如边缘小瓶效应或搁板的温度不均匀性，应该被考虑，因为如果工艺不够稳健，它们可能会导致小瓶与小瓶之间的异质性。此外，优化次级干燥过程对于实现最终冻干药物产品的目标水分含量很重要。Vollrath等人比较了在1小时和6小时次级干燥后，受控成核（CN）蛋白制剂与随机成核（RN）处理的搁板的水分含量均匀性。他们使用频率调制光谱学来确定顶空水分压力，并计算相对标准偏差作为均匀性的替代指标。在1小时次级干燥后，他们发现CN样本（RSD为7.6%）和RN样本（RSD为13.1%）之间的均匀性存在显著差异。结果显示，对于稳健的工艺，允许完成次级干燥（在设定的次级干燥温度达到平衡）至关重要，这可以平衡冻干机依赖的干燥不均匀性。 3.2.比表面积 冻干产品的比表面积（SSA）受到制剂组成、冰成核温度（TN）以及在冷冻步骤和干燥过程中应用受控成核的影响。Konstantinidis等人报告说，较高的TN导致形成少量大冰晶，从而产生具有大孔和相应低SSA的冻干产品。相反，在较低的TN下，观察到大量小冰晶，导致SSA更高。在初级干燥过程中，大孔具有低产品阻力，导致初级干燥更快。相比之下，低SSA阻碍了次级干燥过程中的脱附，导致相对较高的残留水分水平。由于蛋白质通常对界面敏感，SSA成为一个重要的质量属性，特别是对于低蛋白质制剂。理论上，较低的SSA可能是有益的，因为产品暴露于降解反应的程度较低。然而，为了克服脱附受阻并实现低残留水分含量，次级干燥需要在更高的温度下进行。几项研究表明，较低的SSA改善了产品质量和/或稳定性： • Hsu等人显示，随着蛋糕SSA的增加，乳光率增加。不同SSA的产品之间的残留水分和玻璃化转变温度被描述为相当。 • Schersch等人发现，由初级干燥期间的塌陷产生的低SSA对药学相关蛋白质（例如，单克隆抗体型IgG1、LDH）的稳定性有益。 • Awotwe-Otoo等人观察到，通过CN与较低SSA相比，随机成核（RN）产生的较高SSA的冻干物中IgG1-糖基化程度较低。此外，SSA可以用于研究工艺性能。如上所述，显著低于Tg’的干燥可能导致漫长且昂贵的冻干过程。因此，尽可能接近Tg’或Tc进行干燥是理想的。然而，需要确保工艺的稳健性。通过确定产品的SSA，可以检测到微观塌陷。由于微观塌陷不一定导致不优雅的蛋糕，因此不会通过视觉检测到，但它可能会影响质量属性，如残留水分含量和蛋白质稳定性。因此，确定产品的SSA有助于开发稳健的冻干工艺。 3.3.蛋糕外观 蛋糕外观是冻干产品中最不具体且最具争议的属性。通常通过肉眼检查冻干产品的外观，这本质上会导致由于主观评估而产生的变化。通常，从一个标准到下一个标准也没有明确的界限。在一篇评论中，Patel等人提供了一份详细的列表和描述，列出了各种蛋糕变形或缺陷，如塌陷、回流、气泡、雾化、冻干环、裂纹蛋糕、火山口、膨胀或产品位于小瓶和塞子之间。需要分析方法来定性和定量地表征冻干蛋糕。Haeuser等人评估了三种不同的成像技术：三维激光扫描、聚二甲基硅氧烷嵌入和微型计算机断层扫描（μ-CT），以评估蛋糕外观。结果与视觉检查或扫描电子显微镜进行了比较。根据他们的评估，μ-CT是一种工具，它不仅能够定性和定量地评估蛋糕的外部，还能够评估蛋糕的内部结构。使用改进的μ-CT方法，Haeuser等人表明，通过玻璃小瓶非侵入性地对蛋糕和内部蛋糕结构进行表征是可行的，因此提供了一种有前景的技术，以支持冻干工艺开发、放大和工艺转移。一般来说，优雅且均匀的蛋糕是首选。然而，不均匀或不优雅的蛋糕并不一定意味着稳定性问题。Schersch等人已经表明，在相似的残留水分水平下，塌陷的蛋糕可能比其优雅的对应物更稳定。除了变形蛋糕可能对稳定性产生的影响外，从批次到批次具有可重复的蛋糕外观至关重要。对于最终用户来说，均匀的蛋糕外观也是可取的，以避免不确定性和投诉。 3.4.重构时间 根据美国药典（USP），重构的终点是在固体完全溶解且无法检测到可见残留物时达到的。因此，重构时间的确定通常基于视觉检查。正确确定重构的结束是一个关键的安全方面，因为不完全溶解可能导致剂量不准确，特别是对于通过在线过滤器给药的注射产品；此外，还存在注射固体的风险。冻干产品的重构时间取决于多种因素，如总固体含量、初级包装配置、制剂、SSA和水分含量。较高的固体含量会导致蛋糕密度增加，因此重构时间更长。对于较高的固体含量，使用更大的小瓶尺寸以减少蛋糕高度可能是有益的。SSA对重构时间的影响之前已经讨论过。理论上，较高的SSA应该有助于蛋糕润湿，因此改善重构。然而，SSA并非影响重构时间的唯一决定因素。 • Cao等人研究了减少Fc融合蛋白重构时间的方法。他们研究了润湿剂，如聚山梨酯和酒精，并将其添加到稀释剂中。此外，还涉及了诸如退火等工艺参数。这些策略被发现对重构时间的减少影响较小。然而，使用减少的稀释剂体积进行重构显示出显著的四到七倍的重构时间减少。在这种策略中，通过冷冻干燥较低浓度的溶液，然后用较小体积重构以达到所需的蛋白质浓度，从而降低了蛋糕密度。 • Schersch等人没有观察到由于塌陷导致重构时间增加，尽管产品的SSA显著降低。 • Geidobler等人发现较低的SSA对高浓度蛋白质溶液的重构有益。他们推测较大的孔径有助于在粘性溶液中润湿蛋糕。 • Beech等人将重构行为与蛋糕曲折度相关联，以便于液体流动。他们还提出了基于达西定律和哈根-泊肃叶方程的孔径与重构时间之间的幂律关系，以及可能存在的孔径“截止值”，低于此值时，冻干制剂的重构时间变得不切实际地长。冻干产品的重构时间是一个尚未完全理解的产品属性。此外，其确定的主观性构成了一个主要挑战。Cao等人表明重构协议可以对重构时间产生影响。由于终点是通过视觉确定的，操作者方法的变异性增加了挑战。因此，定义一个清晰的重构协议和时间在包装插页中至关重要，以确保患者安全。 4.结论 由于其对冻干工艺性能以及药物产品质量的影响，设计最佳的蛋白质制剂需要谨慎选择辅料。本章介绍了冻干蛋白质制剂设计的一般概念，包括典型的辅料、蛋白质辅料稳定机制，包括对固态动力学的影响，以及冻干药物产品的质量属性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：为了增强水敏感分子的储存稳定性，常见的做法是采用冻干（冷冻干燥）工艺来制造干燥的玻璃态剂型。冻干工艺在加工过程中并非不会施加压力，而且由于制剂中的成分决定了加工条件的设计，制剂和工艺都应设计得使药物实体，特别是蛋白质分子，在冻干的各个步骤或阶段中能够良好地抵抗压力，即在加工过程中的稳定性、长期储存稳定性以及重新溶解后直至给患者使用前的足够稳定性。理解蛋白质分子的关键属性/缺陷以及辅料的选择和工艺参数的设计是关键，以确保能够生产出具有足够稳定性、质量和商业制造可行性的产品。本章的目标是简要讨论有助于设计稳健制剂和冻干工艺的概念与策略。 1.引言 众所周知，发现和研究确定治疗实体的努力和投资，直到它以确保至少2年货架期并满足患者依从性的正确剂型交付，才能带来充分的回报。随着小分子和大分子新形式的爆发，科学家们在配方它们时面临着越来越多的挑战，以解决这些实体在液态中的边缘稳定性。教条表明，大多数分子的稳定性通常按溶液 < 玻璃态固体 < 晶态固体的顺序增加，这是由于反应物种在固态中的运动越来越受限。冻干（冷冻干燥）作为一种干燥技术脱颖而出，与其他如喷雾干燥、喷雾冻干、真空干燥和超临界流体技术等干燥技术相比，能够提供一种能够增强储存稳定性的固态产品。然而，所有这些技术都有其优缺点，无论是与加工条件、可扩展性、产量还是制造成本（COGM）有关。尽管在生物制药和制药行业中，冻干被认为是稳定水敏感分子的首选技术，但它提出了几个挑战和要求，制剂科学家在着手制剂设计之前必须了解。本章的目标是简要讨论有助于克服这些挑战并设计稳健制剂的概念与策略。 2.冻干产品的要求和期望 冻干工艺的一般要求和期望是生产出具有足够稳定性、质量和商业制造可行性的产品，制剂设计直接影响或间接影响所有这些属性。如上所述，冻干工艺在加工过程中并非不会施加压力，而且由于制剂中的成分决定了加工条件的设计，制剂和工艺都应设计得使药物实体，特别是蛋白质分子，在冻干的各个步骤或阶段中能够良好地抵抗压力，即在加工过程中的稳定性、长期储存稳定性以及重新溶解后直至给患者使用前的足够稳定性。它还应具有低残留水分含量、快速/易于重新溶解和易于给药的特点；并且应与装置（重新溶解套件）兼容。从患者和市场合规性的角度来看，冻干产品的外观也很重要，因此应看起来药学上优雅，无塌陷或回熔；该工艺应高效，即总周期时间应在几天内，通常不超过4–5天，易于扩展，无需“主要设备限制/修改”，并且足够稳健，可以在任何典型生产冻干机上实施。 3.前制剂 通常，制剂开发始于前制剂评估，涉及药物实体的强制降解与物理化学特性分析，其发现旨在指导制剂设计。在生物制品的情况下，药物实体是蛋白质，将其置于适当水平的压力条件下，如高温、极端pH、光照暴露、氧化剂、冷冻和解冻和/或机械压力，该研究的目的有两个。首先，理解和阐明其降解途径，化学和/或物理降解/不稳定性。其次，开发/验证未来制剂开发工作所需的稳定性指示分析方法。此机会还可用于识别初步的关键质量属性（CQAs），随着开发工作从早期阶段向晚期阶段发展，这些属性可能会发生变化。 3.1.强制降解/压力研究 通常推荐用于强制降解/压力研究的条件总结如下 • 温度压力：升高温度（至少比ICH Q1A推荐的加速测试温度高10 °C，且低于最低熔点Tm）。 • 冷冻解冻压力：相关的冷冻和解冻循环（3×）&条件（-40 °C，-20 °C&2–8 °C或室温（RT）） • 低pH和高pH压力：（例如，低于pH 4和高于pH 8，如需要也可结合升高温度，以促进脱酰胺） • 氧化压力：氧化条件（化学试剂，如过氧化氢或相关金属） 对于蛋氨酸 – 叔丁基过氧化氢（t-BHP） 对于色氨酸 – 2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐（AAPH） • 光照压力：紫外和可见光（例如，使用ICH Q1B规定的条件或根据分子更温和的条件） • 搅拌压力：相关的搅拌条件 为了“从一开始就聪明”，并避免在晚期开发中出现意外和失败，越来越重要的是在候选筛选和选择过程中尽早进行一些这些前制剂活动，以便提前识别缺陷并通过突变解决（如果可能），同时确保分子具有合适的药物特性（例如，可接受的降解概况、高溶解性和低粘度） 3.2.化学不稳定性  如上所述，在着手制剂开发之前，必须对分子进行强制降解，以了解分子具有何种化学和物理缺陷。所指的化学不稳定性是指涉及双键断裂导致化学修饰的反应，简要描述如下： 氧化  根据位置，发生氧化的残基主要是蛋氨酸和色氨酸，但偶尔组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸也相当容易被氧化。当分子暴露于光照、过氧化物、大气中的氧气或氧化还原活性金属离子（如铁、铜或镍）时，会发生氧化。最强大的氧化剂是羟基自由基和/或活性氧种类（ROS），它们容易与易受影响的氨基酸发生反应。蛋氨酸的氧化导致形成化学修饰的蛋氨酸亚砜，而色氨酸的氧化通过羟基色氨酸中间体形成犬尿氨酸。重要的是要对药物活性物质（蛋白质分子）进行表征，并确定是否存在任何氧化倾向，并相应地解决这一缺陷，因为氨基酸侧链的氧化可能导致蛋白质构象发生变化，影响稳定性、效力（效应功能）并减少血浆半衰期。  建议在商业初级包装中进行氧化研究，使用已确定的制剂成分，并在暴露于相关的氧化压力条件后进行测试，如过氧化氢、紫外线、相关的LUX小时数和适当过渡金属的相关量。 脱酰胺  天冬酰胺（Asn）脱酰胺是蛋白质分子中发生的一种化学修饰，通过琥珀酰亚胺中间体，导致形成天冬氨酸（Asp）或异天冬氨酸（iso-Asp）残基。它通过引入负电荷的羧酸代替中性酰胺，从而产生酸性电荷变体。某些序列，如Asn-Gly或Gly-Asn，更容易发生脱酰胺，并且对pH敏感。天冬酰胺脱酰胺更可能在高pH下发生，离子交换色谱、等电聚焦、质谱，如果需要位点识别，则可能需要胰蛋白酶肽图谱（TPM）。Asp异构化更可能在低pH下发生，高通量生物发光分析已用于定量iso-Asp的形成。如果易受影响的天冬酰胺位于结构和/或功能上有影响的位置，则可能影响效力和/或稳定性。 二硫键交换（错配） - 未配对的半胱氨酸残基  二硫键负责通过连接远处的区域来维持蛋白质在紧凑的三维结构中的稳定性。它们也容易通过水解和氧化降解途径形成非天然二硫键和其他反应性物种。二硫键可以通过氧化在两个相邻半胱氨酸残基上的巯基（-SH）之间形成。蛋白质的自由半胱氨酸巯基可以改变现有的二硫键，导致二硫键交换。这种现象称为二硫键错配，可以在分子内和分子间发生，导致构象变化，从而形成聚集体。 糖基化  糖基化是一种反应，其中蛋白质、脂质和核苷酸的自由氨基被单糖修饰。在反应过程中，形成了希夫碱、阿马多里产物、各种中间化合物，最终形成晚期糖基化终产品（AGEs）。这一序列也被称为“非酶糖基化”或“美拉德反应”。  糖基化是最不希望发生的翻译后修饰（PTM）之一，它修饰蛋白质三维装饰并触发其异常。附着在蛋白质上的大亲水性碳水化合物部分已涉及各种生物过程，包括对蛋白质折叠的修饰、调节蛋白质稳定性、寡聚化和聚集以及调节酶活性。 N-末端焦谷氨酸  N-末端谷氨酰胺环化为焦谷氨酸是一种翻译后或共翻译事件，由谷氨酰胺环化酶大大促进，其中N-末端谷氨酸（Glu）环化形成焦谷氨酸（pGlu）。作为制剂科学家，需要意识到这一修饰在pH 4和8时受到青睐，但在中性pH时较少见；然而，人们认为这种类型的N-末端修饰不会对产品的结构稳定性、效力和安全性产生重大影响。 3.3.物理不稳定性  与化学不稳定性不同，物理不稳定性不涉及化学键，而是表现为聚集体（可溶性和不可溶性）或片段化或吸附。  最常见的两种物理不稳定性形式是片段化（剪切）和聚集。只要片段化不是CDR区域的一部分，影响效力/生物活性，通常不是主要问题；然而，聚集无论如何都是高度不希望的。聚集会危及（1）生物功能（效应功能）（2）潜在的免疫原性影响，因为它可以通过打破B细胞耐受性来诱导免疫反应，在体内引发抗体清除机制，形成抗药物抗体（药物中和）以及在“显示单体重复的聚集体”和“触发高效免疫反应的抗原的重复性质”之间画出概念上的平行线 - 由过度活跃的免疫反应引起的细胞因子释放综合征（CRS）。因此，上述缺点使得控制蛋白质/抗体聚集在开发成功治疗药物的道路上至关重要。  制剂科学家应该意识到，化学修饰，如IgG1 Fc区域中的蛋氨酸氧化，会导致二级和三级结构改变，可以通过质谱、圆二色谱和核磁共振进行评估，在热应力下具有更高的聚集倾向，抗体中的组氨酸可能被氧化并形成共价连接的聚集体，含有未配对半胱氨酸的抗体可能在搅拌过程中通过分子间二硫键形成可还原的聚集体，并且脱酰胺和糖基化促进聚集。最近，据报道蛋白质羰基化与抗体聚集爆发率呈正相关。  一般来说，聚集有两种形式或途径，即胶体不稳定性与构象不稳定性。 3.3.1.胶体不稳定性  在这种不稳定性形式中，蛋白质保持其天然状态或构象，但由于其固有属性，特别是蛋白质表面的电荷分布，倾向于聚集。它取决于溶液中分子之间的吸引和排斥相互作用，其中涉及非共价力，如静电力、范德华力、疏水力和水合作用力，导致自关联/松散关联。这些弱溶质-溶质相互作用导致的自关联是蛋白质浓度依赖的，这意味着它只在超过临界蛋白质浓度时自关联，并且是可逆的，即在稀释时恢复为单体。胶体不稳定性或聚集体形成在热力学上是不稳定的，但在动力学上是稳定的（见图1），并且通常伴随着粘度增加和乳光现象。它可以表现为亚微米（可溶性）聚集体、亚可见和可见颗粒或其他相行为。 图 1 自由能与胶体不稳定性 胶体稳定性的指标  渗透第二维里系数（B22）是一种基本的物理化学属性，用于描述溶液中蛋白质之间的分子相互作用，可能导致聚集，通常用作胶体稳定性的指标，其中以蛋白质-蛋白质胶体相互作用占主导地位。  静态光散射（SLS）是最常用且已建立的技术，用于实验确定B22。其他技术，如自相互作用色谱（SIC）、膜渗透压仪（MO）和分析超速离心（AUC）也可以使用，并且它们提供同样可比的结果。负的B22值表示净吸引的蛋白质-蛋白质相互作用，这意味着潜在的/倾向聚集体形成，而正的B22值表示总体排斥相互作用，这意味着稳定。  广泛用于评估/衡量胶体稳定性倾向的另一个参数是扩散相互作用参数，Kd。它由扩散系数与浓度的线性关系的斜率表示，并且可以通过动态光散射以高通量方式进行测定。如果由于蛋白质-蛋白质距离减小，扩散系数随蛋白质浓度增加而增加，则表明排斥相互作用。当由于蛋白质-蛋白质距离减小，扩散系数随蛋白质浓度增加而减少时，可以怀疑吸引相互作用或聚集倾向。这一概念如下图示意（图2）。 图 2 互扩散系数与蛋白质浓度的关系 它们通过哈丁和约翰逊方程相关联。 其中 M 是摩尔质量，ks 是沉降速度的一阶浓度系数，ν 是部分比容。其他技术，如乳光、小角X射线散射（SAXS）以及利用电泳迁移率原理测量净电荷的技术，例如毛细管区带电泳（CZE）、膜限制电泳（MCE）以及一种称为大规模并行相分析光散射（MP-PALS）的新技术、Wyatt的Mobius迁移率仪器以及利用电泳光散射测量有效表面电荷势（zeta电位）的技术，有助于理解电荷分布/胶体稳定性，最终了解聚集倾向。 3.3.2.构象不稳定性 构象不稳定性，定义为蛋白质分子折叠和展开状态之间的自由能差异，是由于界面变性、剪切应力和溶液条件导致疏水相互作用而形成非共价不可逆聚集。与胶体不同，这是一种非天然聚集，意味着构象扰动导致部分或完全展开是先决条件，并且由外部条件触发。它在热力学上是稳定的，但在动力学上是不稳定的，这意味着它会随着时间增长。它不依赖于蛋白质浓度，本质上是不可逆的，并不一定伴随着粘度的增加。它是由外部因素引起的，这些因素包括溶液条件（pH、离子强度、温度等）和加工条件，后者包括界面（即空气-水、冰晶-溶液、中间/产品接触表面）、冻融、机械应力（空化、剪切）、环境光、温度和时间。可以使用各种生物物理技术，如圆二色谱（远紫外区190-250 nm用于二级结构和近紫外区250-350 nm用于三级结构）、分析超速离心/沉降速度实验用于高级别聚集、差示扫描量热法（DSC）、MicroCal用于熔点/热转变中点（Tm），作为各种溶液和加工条件的函数来评估和评价构象稳定性。含有芳香环的残基（如色氨酸）的固有荧光取决于整体三维结构和周围环境。当蛋白质因化学或物理应力导致展开时，疏水基团暴露出来，这总是会导致荧光强度的变化和发射最大值的位移。差示扫描荧光法（DSF）利用这一原理已成为分析蛋白质稳定性、热蛋白质展开和熔点分析的高通量方法。展开转变中点Tm（°C），即一半蛋白质展开的点，用作蛋白质构象稳定性的指标。 4.配方开发 在分子可开发性评估的早期阶段，使用计算机辅助软件工具来识别可能易受化学（例如：氧化、脱酰胺位点）和物理不稳定性（如展开（疏水位点）、自缔合（电荷分布）、聚集以及与高蛋白质浓度相关的高粘度）影响的区域，并对分子进行工程改造以减轻这些问题。由于这种策略有助于缓解问题，但并不总是能够完全消除风险，因为某些残基可能是CDR区域的一部分并需要生物活性，因此需要进行配方开发。 4.1.配方的合理设计 配方开发是选择和优化溶液条件和加工条件与辅料的相互作用。因此，配方开发工作的总体目标是确定最终药物产品组成、初级容器配置的最佳条件，以维持药物在药物物质、药物产品通过各种单元操作以及给药至患者过程中的稳定性、安全性和有效性。由于翻译后修饰、化学修饰/不稳定性以及物理不稳定性最终导致聚集的形成，因此理解蛋白质聚集的机制或蛋白质如何聚集是配方开发的核心。Christ Roberts等人提出的以下示意图提供了导致聚集形成的各种途径的见解（图3）。 图 3 聚集途径示意图，红色箭头表示非天然聚集，深蓝色箭头表示天然聚集。双向箭头表示可逆步骤，单向箭头表示不可逆过程。 4.2.减轻风险和蛋白质聚集的策略 根据上述方案，总体策略将是针对聚集阶段1、2和3的构象稳定性/非天然聚集，其中蛋白质展开和成核是聚集的关键步骤，以及阶段1的胶体稳定性/天然状态聚集。减轻聚集的相应方法将是： • 稳定天然单体，即降低折叠的自由能（GF）或使部分展开的单体不稳定，即增加展开的自由能（GU），以减少阶段I蛋白质展开的潜力； • 改变蛋白质表面电荷分布，以增加阶段II中展开单体与天然单体之间的电子排斥； • 打扰阶段III中展开单体的结构重排，以不利于疏水接触和β折叠的堆积。下面提出了配方设计的分步方法。 步骤1：定义商业目标产品概况 编制目标产品概况（TPP）是产品开发的第一步，因为它定义/总结了产品属性或规格，并描述了最终用户将如何使用该产品。它是新药/生物制品/设备的开发和战略管理中的一个重要工具，并且应由参与产品开发的公司所有部门共同准备。它是一个“活文档”，随着知识和经验的增加而发展和成熟，FDA强烈倡导使用TPP，尽管它并不强制要求。可以使用表1中所示的常见模板来为进入开发的每种产品以及现有药物/生物制品的每种新适应症组装TPP。 步骤2：选择pH值和缓冲剂种类 在定义TPP之后，筛选和确定最佳pH值、缓冲盐和离子强度是一项重要的研究，因为它们影响蛋白质溶液的溶解度、稳定性和粘度。随着溶液pH值远离等电点（pI），溶解度增加。通过常用软件如ExPASy或Sednterp，或通过使用Zetasizer Nano ZSP等仪器进行zeta电位测量，从原序列确定单克隆抗体的pI。溶液pH值改变蛋白质表面电荷，并可能干扰维持天然折叠结构所需的有利静电相互作用。溶液pH值还影响化学降解的各种途径，如图4所示。 图 4 反应速率与 pH 的关系 - 深色表示在指定 pH 范围内反应速率更快 建议在4-7.5的pH值范围内进行研究，增量为0.2-0.5单位，以确定最佳pH值，同时保持其他配方成分不变。在选择缓冲剂种类/盐时，配方科学家需要考虑以下因素：选择pKa值接近所需pH值的缓冲剂种类将提供更高的缓冲容量，并且需要更少的量，15-25 mM的范围可能就足够了。少量的缓冲盐可以防止降低塌陷温度，并且也可以防止增加总固体含量，这两者都有助于冷冻干燥过程。• 在选择缓冲盐时必须谨慎，因为在冷冻过程中（容器或小瓶冷冻干燥过程中的批量冷冻融化）选择性结晶出较不溶的缓冲成分（酸或碱）可能导致冻浓缩液中的pH值发生巨大变化，这比在未缓冲系统中获得的变化要大。图5描绘了缓冲盐的物理状态（无定形或结晶）作为温度的函数，图6显示了pH值变化程度作为温度的函数。 图 5 冷冻和解冻过程中一些常见缓冲液的结晶潜力 图 6 由于缓冲盐结晶导致冻结过程中 pH 值的变化 有趣的是，常用的缓冲盐如磷酸盐、柠檬酸盐和组氨酸会发生pH值变化，其中磷酸盐的变化最为显著。磷酸盐缓冲系统由于碱性缓冲成分Na2HPO4·2H2O的结晶，pH值显著下降约4个单位。相反，磷酸钾系统仅显示出适度的pH值增加，约为0.8个单位（图7）。 图 7 曲线 1 - 磷酸钠，pH 7.0：曲线 2 - 枸橼酸钠，pH 6.2；曲线 3 - 琥珀酸钠，pH 5.5；曲线 4 - 醋酸钠，pH 5.6；曲线 5 - 组氨酸盐酸盐，pH 5.4；曲线 6 - 组氨酸醋酸盐，pH 5.5；曲线 7 - Tris 盐酸盐，pH 7.4 • 缓冲成分在冷冻过程中结晶的原因是由于温度降低导致溶解度降低，从而导致过饱和，结果溶液中析出晶体。避免使用会结晶的盐。如果没有其他选择，使用少量的盐，这将不会导致结晶。例如，少于30 mM的磷酸钠缓冲液倾向于结晶，并且pH值不会发生变化。磷酸钠缓冲液的另一种选择是使用钾盐代替钠盐，这倾向于消除或减轻问题。 • 已经观察到，当使用醋酸钠缓冲液用于冷冻干燥产品时，在填充过程中以及冷冻干燥过程中由于醋酸的挥发性，pH值发生了巨大变化，见表2。 步骤3：选择表面活性剂并确定最佳浓度运输应力、空气-水界面以及蛋白质与玻璃或硅化表面的相互作用会导致生物分子/抗体的表面变性，从而导致亚可见颗粒的形成和/或聚集，这可能会进一步发展为可见颗粒的形成。应进行系统的振荡研究，该研究涉及使用轨道振荡器，速度为250-300转/分钟，有无硅化玻璃珠（喷涂、擦拭：DOW 360, 1000CSt），添加不同水平的0-2倍量，进行实时和加速稳定性测试；喷涂-烘烤：DOW 365, 1-3%的乳液，烘烤，添加不同水平（0-2倍量）进行稳定性测试）在有无表面活性剂的情况下。该研究应包括筛选各种非离子表面活性剂，如聚山梨酯80和20、泊洛沙姆188（Pluronic® F-68）和泊洛沙姆407（Pluronic® F-127）、聚乙二醇十二烷基醚（Brij 35）和FM 1000，浓度范围为0.0001%至0.1%（w/v）。提出的保护机制可能是由于它们的两亲性（极性头部非极性尾部）、非特异性结合即能量驱动而非相互作用驱动、降低表面张力/能量、优先在界面积累/吸附并作为分子伴侣保持蛋白质的折叠状态。该研究的结果应提供对分子与硅油形成颗粒的倾向的见解，如果是，那么在什么水平？以及确定最佳表面活性剂浓度。文献中没有报告任何特定类型的表面活性剂及其水平有负面影响，但通常作为经验法则，建议从冷冻干燥的角度出发，将辅料的固体含量保持在最低限度。 步骤4：筛选辅料/稳定剂以解决不稳定性/风险 通常，配方除了药物实体外还包含几种成分，这些额外的成分称为辅料。它们被添加到配方中以发挥特定功能，要么是提高稳定性，要么是提高加工性能，它们可能构成冷冻干燥固体的主要部分。原则上，这一步应由前配方数据指导，根据识别出的不稳定性将辅料添加到配方中。 化学不稳定性 脱酰胺和天冬氨酸异构化 天冬氨酸（Asn）的脱酰胺是通过琥珀酰亚胺中间体在蛋白质分子中发生的一种修饰，结果产生天冬氨酸（Asp）或异构天冬氨酸（iso-Asp）残基。脱酰胺和异构化既依赖于pH值也依赖于序列，并且可以考虑使用pH值优化和使用二价阳离子。Asn脱酰胺更可能在高pH值下发生，而Asp异构化更可能在低pH值下发生。脱酰胺反应是碱催化的，并且在pH 5至8之间增加。防止脱酰胺的最佳pH值通常是pH 3-5。异构化反应是酸催化的，通常在pH 4-6下发生，稳定对抗异构化的最佳pH值是pH > 7。由于pH值对溶解度和聚集也有显著影响，建议在开发早期监测脱酰胺，并确定pH值的甜蜜点。 氧化 尽管许多氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸都容易被氧化；然而，蛋氨酸的氧化速度最快且比其他氨基酸更常见。位于CH2和CH3结构域界面的保守重链蛋氨酸残基的氧化会降低热稳定性、Protein A结合、FcRn结合和循环半衰期。CDR中蛋氨酸残基的氧化可能会潜在影响抗原结合，从而影响分子的效力。因此，必须对药物产品中抗体的结构、稳定性和生物活性的蛋氨酸氧化（如果有）的影响进行特征分析。一旦确定这对稳定性和效力至关重要，调查氧化的根本原因，并确定是否：• 仅在静置储存期间发生 • 由金属表面暴露引起 • 由温度诱导的自由基形成引起 • 由辅料的氧化降解产物引起 • 由光照暴露引起。可以采取一些补救措施或措施来解决或预防氧化降解，简要讨论如下。抗氧化剂，如蛋氨酸、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、BHT、BHA、亚硫酸氢钠、谷胱甘肽和丙基没食子酸酯，被认为可以作为自由基或氧清除剂，并用于减少注射产品中的氧化倾向。在蛋白质治疗产品中，牺牲性抗氧化剂如蛋氨酸是最常用的辅料。抑制温度诱导的氧化所需的最低有效水平（蛋白质与抗氧化剂的摩尔比）通常观察为蛋氨酸和亚硫酸氢钠分别为1:5和1:25。Genentech集团报告说，蛋氨酸和亚硫酸氢钠的化学计量量足以消除由配方中存在的金属离子和过氧化物杂质产生的自由基引起的rhuMAb HER2的温度诱导氧化，其他例子包括Actemra™和Cosentyx™。像Campath®和Ajoyv®这样的某些产品已经成功使用EDTA作为螯合剂来避免羟基自由基的形成。除了使用抗氧化剂外，用氮气覆盖/填充小瓶的顶空，并对原材料中的杂质，特别是聚山梨酯，实施严格的控制策略，也是常用的策略。 物理不稳定性 如前所述，物理不稳定性可以分为构象不稳定性（部分或完全展开）和胶体不稳定性： 构象 如果由于界面变性或剪切应力，或由于溶液条件导致疏水相互作用而形成非共价不可逆聚集而识别出构象不稳定性，则通常会筛选以下辅料，并且它们在历史上已成功应用于多种产品。筛选排除溶质，如二糖——蔗糖或海藻糖，PEG 400，甘油，山梨醇等，以各种浓度或重量比进行筛选，蛋白质与稳定剂的1:1重量比通常推荐并足够。其有效性应通过其诱导三级结构变化的能力通过圆二色谱谱图和/或通过差示扫描荧光法（DSF）的展开转变中点Tu/Tm（°C）来评估。其背后的保护机制被认为是因为溶质被优先从蛋白质域中排除，增加了展开系统的自由能，从热力学角度来看，这导致折叠形式，因为它将具有降低的自由能。这在图8中以图形方式说明。 图 8 溶质的优先排斥 从冷冻干燥的角度来看，多元醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇（PEGs）是不理想的，因为它们具有非常低的玻璃化转变温度（Tg'）值（见表1，“冷冻配方的特性及冷冻干燥属性的确定：案例研究”章节），并且它们显著降低了配方的整体Tg'或塌陷温度。含有这些辅料的配方将需要较长的干燥时间，因为它们需要在非常低的温度下进行冷冻干燥，在某些情况下在商业环境中并不实际可行。二糖如蔗糖和海藻糖是更可取的，因为它们相对具有较高的Tg'值，并且在商业环境中实际可行进行冷冻干燥。从冷冻干燥的角度来看，海藻糖比蔗糖更受青睐，因为它具有以下优势： 1.它比蔗糖具有更高的Tg'和Tg值 2.它作为有效的稳定剂，在广泛的pH范围内（特别是在酸性范围内）不会水解为葡萄糖和果糖，而蔗糖在酸性范围内会水解为还原糖、葡萄糖和果糖，这些可以与蛋白质形成加合物，导致糖基化/美拉德反应或糖的褐变，从而导致蛋糕外观变色。 然而，使用海藻糖的一个缺点是，它的价格是蔗糖的10倍。如上所述，配方设计的主要目标是在实现液体稳定性（至少在室温和2-8°C下维持数周至数月）和冷冻干燥稳定性（≥2年）的同时，谨慎选择辅料，以实现稳定性和加工/可制造性的平衡。  胶体不稳定性（原生蛋白质-蛋白质相互作用导致自聚集）  胶体不稳定性可能是由于疏水和静电相互作用，下面将简要讨论。  疏水相互作用导致非共价聚集  如果确定胶体不稳定性，且认为其原因是由于蛋白质表面存在的疏水基团之间的疏水相互作用导致非共价聚集，通常建议筛选环糊精。两种常见的环糊精形式，通过溶解作用显示出保护效果的是2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）和磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）。它们的溶解和稳定化效果被认为是因为存在亲水和疏水基团以及它们形成包合物的能力。  静电相互作用  当由于蛋白质表面电荷分布不平衡导致吸引作用超过排斥作用时，会发生自聚集，从而形成可逆聚集。  当存在单一等电点（pI）且pI在碱性区域时，建议将pH调整至离pI 2-3个单位。pH离pI越远，即向低pH方向，单克隆抗体（mAb）携带的净电荷越多，导致分子间更强的排斥静电相互作用，溶解度/稳定性越高。在这种情况下添加任何盐或增加离子强度会使情况更糟，因为它已知会屏蔽电荷-电荷相互作用，从而降低接近能。接近能的降低被认为是胶体不稳定性的原因，从而增加聚集。  因此，保持低离子强度≤15-20 mM且pH约为5会有所帮助，如图9所示。  图 9 在离子强度为（a）15 mM 和（b）150 mM 的条件下，mAb-G 和 mAb-R 的相互作用参数 kD 与缓冲液 pH（pH 5 至 pH 8）的关系。 因此，将盐作为生物制药的潜在稳定剂需要从液体稳定性和其冷冻干燥两方面进行仔细评估。含有盐的溶液，特别是氯化钠（NaCl），很难进行冷冻干燥，因为它们显著降低了配方的Tg'，并且在储存过程中倾向于结晶。在pI处于酸性范围或存在多个pI且分布在酸性和碱性范围的情况下，需要筛选pH和盐。添加标准盐如精氨酸盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐，以及CaCl2、Ca(C2H3O2)2、MgCl2和霍夫迈斯特离子，会增加蛋白质分子之间的静电排斥，抑制胶体聚集，并且有助于溶解。在高浓度下，对溶解度和构象稳定性的影响被认为遵循霍夫迈斯特系列。对于阴离子，稳定效果随着从系列的右侧向左侧移动而增加，对于阳离子则是从右侧向左侧，如图10所示。 图 10 霍夫梅斯特系列 精氨酸盐酸盐与钠谷氨酸的组合因其在等摩尔比下结合时似乎具有协同效应而受到关注。  步骤5：填充剂的筛选  一般来说，填充剂在制药中的预期作用仅仅是作为填充物以增加产品蛋糕的密度，防止产品吹出，增强产品外观，并作为惰性物质，不旨在提供增强药物物质的化学或物理稳定性。有两种情况，配方中加入填充剂会使冷冻干燥更容易和更高效。  情况1：每瓶药物量极少  随着更有效药物的出现，无论是小分子世界中的肽类还是大分子世界中的工程抗体（ADCs、DVDs、Diabodies、Bispecific、Fabs等），考虑添加填充剂以缓解与加工、测试和给药系统相关的风险/挑战变得越来越重要。含有1%或更少固体含量的稀释溶液实际上很难在保留蛋糕结构的情况下进行冷冻干燥，因为在初级干燥期间水蒸气的流动可能会对脆弱的蛋糕产生足够的力来破坏蛋糕结构，并可能将一些产品与水蒸气流一起带出瓶子，这种现象称为产品吹出。在这种情况下，加入填充剂变得不可或缺。  情况2：提高/增强塌陷温度  配方开发的主要目标之一是通过筛选辅料（缓冲盐和稳定剂）来实现产品在液态和冷冻干燥状态下的理想稳定性。有时，使用具有高塌陷温度的冷冻干燥友好型辅料来实现所需的稳定性是不可能的/不可行的，结果选择了具有非常低塌陷温度的辅料，这将导致长的冷冻干燥周期，并且在商业环境中可能不实际可行。在这种情况下，尽管总固体含量可能足够多，可以在不发生产品“吹出”的情况下进行冷冻干燥，但从冷冻干燥的角度来看，在配方组成中大量添加塌陷温度增强剂是非常可取的，因为它将实现两个目的：（1）显著缩短冷冻干燥周期，（2）增强产品外观。有几种辅料可以作为填充剂，并可以分为无定形和结晶两类。  无定形填充剂  一些无定形填充剂，如蔗糖（约-34°C）、海藻糖（约-28°C）、乳糖（约-30°C）和PEGs（约-50°C）不适合用作填充剂，因为它们具有低塌陷温度，因此需要低干燥温度和长加工时间。尽管乳糖通常用作小分子的填充剂，除了其低塌陷温度外，它是一种还原糖，可以与蛋白质产品中的胺形成加合物，必须受到质疑。羟乙基淀粉在临床上用作血浆扩张剂，是一种惰性无定形辅料，具有高塌陷温度（-10°C），可以作为无定形填充剂而无需长加工时间。然而，它被认为在干燥过程中会经历一些蛋糕收缩和开裂，因此可能使蛋糕外观不够优雅。  二糖，蔗糖和海藻糖通常用作蛋白质产品的稳定剂，并且在药物量少和/或需要调整渗透压以进行皮下给药的情况下也用作无定形填充剂。然而，它们不适合用于增强配方的塌陷温度，因为它们具有低塌陷温度。添加超过稳定蛋白质所需的蔗糖或海藻糖的任何数量都应受到质疑。由于蛋白质的Tg'为-10°C，而蔗糖的Tg'为-34°C，因此明智的做法是使蛋白质浓度/重量比高于蔗糖或海藻糖，因为它已知在浓度>20 mg/mL时开始积极贡献或增强整体塌陷温度。  环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）和磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）与蔗糖或海藻糖作为稳定剂结合使用时，是良好的无定形填充剂。它们具有高塌陷温度，约为-9°C，并且在大量添加时作为塌陷温度增强剂，增强配方的整体塌陷[63]。对于蛋白质产品，以蔗糖或海藻糖作为稳定剂，以及2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）或磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）作为填充剂的配方，将作为冷冻干燥的良好无定形系统，并且具有外观优雅的蛋糕结构。必须注意，为了使塌陷温度增强剂作为塌陷温度增强剂发挥作用，它应该是配方的主要成分，即至少是配方中其他总无定形成分的2倍。  结晶填充剂  最常用的两种结晶填充剂是甘露醇和甘氨酸，它们为蛋糕提供结晶基质。为了结晶，它们应该是主要的溶质成分，至少比所有其他溶质成分的浓度总和高出2倍。它们在许多方面优于无定形填充剂，如下所示：  • 它们具有高塌陷温度（共晶温度），范围在-3°C至-5°C之间，这使得干燥可以在更高的搁板温度/压力下进行，显著缩短冷冻干燥周期。它不会塌陷。  • 为蛋糕提供机械强度，防止蛋糕在运输过程中变成粉末。  • 提供外观优雅的结晶蛋糕，易于复溶。 • 使设计具有较大设计空间的稳健冷冻干燥周期成为可能，为技术转移和操作提供广泛的灵活性，见图11。 图 11 使用计算流体动力学（CFD）和准稳态模型创建的设计空间，用于预测设备和工艺性能并指导操作。 基于甘露醇的配方除了比无定形系统具有多个优势外，还存在两个潜在挑战；一个与瓶子破裂有关，另一个与形成水合物形式有关，过程工程师应该了解。如果冷冻协议设计不当，无法确保在冷冻阶段完全结晶，则可能发生瓶子破裂。如果甘露醇在冷冻阶段没有完全结晶，它将在初级干燥阶段结晶，因为产品温度上升但仍低于0°C。由于结晶过程是放热反应，并且总是伴随着水的释放，这些水转化为冰，这两个因素都导致玻璃不均匀膨胀，导致瓶子从侧面和/或底部（透镜效应）破裂。  为了避免瓶子破裂，建议采取以下步骤：  • 确保首次冷冻温度低于配方的Tg' 10°C，并根据填充体积保持足够的时间以确保形成晶核，然后进行退火步骤（热处理）。退火步骤的最佳时间和温度应通过冷冻干燥显微镜确定，以确保甘露醇完全结晶。  • 避免高填充深度和高浓度的甘露醇。  甘露醇倾向于在冷冻阶段形成水合物形式，水合物晶体在≥50°C的温度下脱溶。在作者看来，这应该是一个小问题，因为对产品质量没有实际影响，因为它与晶体晶格结合，并且不是自由水，除非产品暴露在约50°C的高温下，此时它脱溶并释放水，危及产品的稳定性。  甘氨酸与甘露醇一样效果良好，容易结晶，形成外观优雅的产品，复溶迅速。甘氨酸的一个优势是它不会引起瓶子破裂。然而，甘氨酸蛋糕被认为比甘露醇蛋糕稍微脆弱，通常被认为比甘露醇蛋糕相对不那么优雅。  甘露醇或甘氨酸基础配方是二元系统，其中无定形和结晶组分共存。稳定剂和其他缓冲物种构成次要的无定形成分，而甘露醇或甘氨酸将构成主要的结晶系统。由于甘露醇或甘氨酸是配方的主要成分，并且代表系统的主体塌陷，产品可以在次要无定形成分的塌陷温度以上和主要结晶成分的共晶温度以下进行干燥。因此，冷冻干燥这种基于甘露醇或甘氨酸的配方相当于具有微观或部分塌陷（即无定形相的完全塌陷）的冷冻干燥，但蛋糕结构由结晶成分维持。在这里，药物形式是无定形涂层在结晶甘露醇上，其稳定性通常接近于没有甘露醇冷冻干燥的系统的稳定性。这使得人们能够在实现优雅外观的同时，实现高效干燥，快速复溶时间和低残留水分含量。 步骤 6：前期可制造性评估 技术转移和制造问题未能成功的主要原因有两个：一是设计配方时未考虑工艺因素，二是设计工艺时不了解制造能力和限制。这两者需要紧密结合，有时责任可能通过配方设计更好地解决，也可能通过工艺条件解决，或者两者结合。因此，配方科学家和工艺工程师必须合作，对配方候选进行前期可制造性评估，尤其是在开发冻干产品时更是如此。 本研究的目的是评估配方候选与制造过程的兼容性，以满足目标产品概况（TPP），并根据需要通过微调配方和/或工艺参数来识别和降低任何风险。应将具有最佳溶液条件的前 2 至 3 种配方候选，使用代表制造条件的缩小模型，经过制造的单元操作（冷冻和解冻、混合、过滤、在不锈钢容器或一次性袋子中存放、灌装、冻干和检查）来评估其可制造性。通常，在实验室规模研究加工条件对分子完整性的影响，这些研究可能会产生误导，因为它们不一定代表或模拟大规模过程。因此，这里建议构建代表大规模单元操作的缩小模型，并使用这些模型筛选配方候选，以识别最佳配方和备用配方。 然后，冻干药物产品瓶应使用运输模拟测试系统（TSTS）进行运输条件测试，之后再进行加速和实时储存稳定性测试。对于每种配方，应分析缩小研究中的过程样品和药物产品样品的相关关键质量属性（pCQAs）。最终的商业配方推荐应基于可制造性评估研究中的可制造性和 6 个月稳定性数据来确定。 5.稳定性测试 5.1.非晶态固体中的降解动力学 一般来说，人们从反应级数的角度思考动力学，这没错，但仅适用于液体或气体溶液；对于固体，动力学的阐明指的是评估反应速率的时间依赖性，或者换句话说，是母体损失或降解产物出现的时间依赖性。非晶态固体状态或玻璃态中的降解动力学通常是“拉伸时间”动力学，这意味着母体（或纯度，P）与时间的关系由以下方程控制， 其中k是在拉伸时间尺度t上的速率常数，β是一个介于零和一之间的常数。非晶态固体被认为遵循拉伸时间动力学，因为它们由具有不同降解速率的微观状态组成，这些微观状态不在结构平衡中。通常，可以经验地发现，β≈1/2，动力学是“时间的平方根动力学”。 5.2.加速测试条件、温度和时间的选择 在设计加速稳定性研究时，温度的选择对于成功结果至关重要，否则可能会产生误导。研究中的最高测试温度应至少低于干燥固体的玻璃化转变温度（Tg）10°C，同时应足够高，以便在相对较短的时间内产生在产品货架期内产生的降解水平。测试温度与预期储存温度之间的差异不应过大，以免获得非代表性的结果。 如果存在一个系统，其中两个（或更多）降解途径都很重要，但这些途径具有非常不同的活化能，例如一个系统同时发生假设的氧化反应，活化能为 15 kcal/mol，以及假设的脱酰胺反应，活化能为 25 kcal/mol，可能会发现，在加速测试条件下占主导地位的反应在实际感兴趣的温度下甚至并不重要。在高温下，尤其是在 50°C 以上，反应主要是高活化能反应，但在冷藏储存范围内，脱酰胺反应不显著，氧化反应是主导反应。因此，如果使用高温稳定性数据来优化配方，那么优化的反应在预期的 5°C 储存温度下并不显著发生，测试结果可能毫无意义。显然，需要验证在加速测试条件下产生的降解产物基本上与在预期储存温度下产生的降解产物相同，比例大致相当。在项目初期，这充其量是困难的，因此接受基于非常高温度下运行的加速测试条件的预测存在显著风险。从阿伦尼乌斯方程和假设的降解过程的时间依赖性可以估计出加速测试产生与在预期产品储存条件下货架期末端相同水平的特定降解产物所需的时间。图 9 提供了这样的估计，其中对具有低活化能（15 kcal/mol）和高活化能（25 kcal/mol）的反应都进行了计算。当然，具有较高活化能的反应时间更短，而且对于平方根时间动力学的时间也比指数（有效一级）降解动力学的时间短得多。请注意，即使活化能较低，加速测试温度与预期储存温度之间的差异仅为 10–15°C，等效时间也相对较短，特别是对于平方根时间动力学。这是一个重要观点，因为玻璃态系统中的降解通常遵循平方根时间动力学。这一观察的含义是，不一定需要使用远高于预期储存温度的加速测试温度来确保数据的快速周转。然而，也必须认识到，如果目标是产生足够的降解以允许评估精确的速率常数，进而允许定量评估试验配方稳定性的差异，可能需要在加速测试中产生比产品货架期内更多的降解。在这种情况下，时间显然需要比图 12 所示的时间更长。 图 12 冷藏（5°C）和室温（25°C）储存的加速稳定性测试的等效时间。符号说明：菱形 = 15 kcal/mol，圆形 = 25 kcal/mol；实心符号 = 指数动力学（一级），空心符号 = 时间的平方根动力学。（a）产品储存于 5°C，（b）产品储存温度，°C 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。