Glycine

*仅供医学专业人士阅读参考我们知道，β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积导致的淀粉样斑块，以及tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结，是阿尔茨海默病（AD）的两个典型病理特征。但是近期，佛罗里达大学Lien Nguyen和Laura P.W.Ranum团队发表的研究则发现，除Aβ病理和tau病理外，聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）蛋白聚集可能也是AD的一个病理特征。具体来说，研究人员先是在AD患者大脑海马区中发现了polyGR蛋白聚集的现象，随后利用基于CRISPR-Cas9系统的dCas9技术发现，CASP8（Caspase-8，凋亡启动因子）基因中出现的一段重复扩展序列（CASP8-GGGAGAEXP）是导致polyGR蛋白聚集的主要原因。此外，遗传学关联分析显示，CASP8-GGGAGAEXP及其变体CASP8-GGGAGA-AD-R1可能是AD的一种新型遗传风险因素。随后研究人员进一步在多个队列中验证了，携带该变体的人罹患晚发性AD的风险比同龄人要高出2.2倍。研究发表在Proceedings of the National Academy of Sciences上[1]。论文首页截图既往研究显示，在肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆症中，C9orf72基因非编码区出现的重复序列GGGGCC，会产生不依赖启动密码子ATG的翻译方式（RAN翻译），最终生成聚合型RAN蛋白（异常翻译产物），如聚甘氨酸-丙氨酸（polyGA）和聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）等等。这些蛋白会在神经元中形成聚集，从而导致疾病发生。基于此，研究人员猜想AD患者大脑中可能也存在聚合型RAN蛋白。为了验证这一猜想，研究人员先对AD患者大脑海马切片（尸检）进行了免疫组织化学染色，结果发现了polyGR蛋白明显聚集的现象。随后在80例散发性AD大脑的海马切片中，研究人员还观察到，有45例AD患者大脑中都存在polyGR聚集体，而在18例同龄对照组中则未观察到polyGR聚集的现象。polyGR聚集体在AD尸检大脑中积累进一步，通过与AD病理，如tau病理、Aβ病理以及p-TDP43聚集体进行比较后，研究人员发现，polyGR聚集体会呈现出不同的积累模式。这表明，polyGR聚集体可能是AD的一个病理特征。接下来，研究人员想知道导致polyGR聚集体出现的重复扩展序列，通过排除已知相关基因C9orf72和SCA36后，研究人员利用基于CRISPR-Cas9系统的dCas9技术（即dCas9READ，可从单个基因组DNA样本中识别重复扩展序列），成功识别出一段位于CASP8基因的内含子中的GGGAGA重复扩展序列CASP8-GGGAGAEXP。重复扩展序列识别进一步，研究人员发现，该扩展序列不仅会产生polyGR聚集体，还会产生聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）、聚精氨酸-谷氨酸（polyRE）和聚甘氨酸-谷氨酸（polyGE）的融合RAN蛋白，且这些蛋白会在CASP8-GGGAGAEXP阳性AD患者大脑（尸检）中积累。最后，通过遗传学关联分析，研究人员发现，CASP8-GGGAGAEXP及其变体CASP8-GGGAGA-AD-R1可能是AD的一种新型遗传风险因素，并进一步在多个队列中验证了，携带该变体的人罹患AD的风险比同龄人要高出2.2倍（OR=2.2）。队列验证综上，该研究发现，CASP8基因中出现的一段重复扩展序列CASP8-GGGAGAEXP导致的polyGR聚集体的积累，可作为AD的一个新的病理特征。同时，本文作者也指出，该研究结果可以用于开发基于这一病理特征的生物标志物，并找到清除polyGR聚集体的治疗方法，这也为AD的治疗提供了一个新的方向。参考文献：[1]Nguyen L,Ajredini R,Guo S,et al.CASP8 intronic expansion identified by poly-glycine-arginine pathology increases Alzheimer's disease risk.Proc Natl Acad Sci U S A.2025;122(7):e2416885122.doi:10.1073/pnas.2416885122本文作者丨张金旭

摘要：动态喷雾冷冻干燥结合了喷雾冷冻和旋转冷冻干燥，用于生成均匀、自由流动的冷冻干燥珠粒作为散装中间产品。这使得按需填充成为可能，可以选择剂量强度以及多种活性物质的组合。因此，供应链变得高度灵活。这种散装中间产品的处理特性可以显著缩短上市时间。通过使用更高浓度的液体，同时保持快速复溶，实现了生产效率的提升。可以进一步使用已建立的固体制剂技术进行加工，例如在诊断应用中为防止光照或氧气影响而进行薄膜包衣。该技术已在实验室、中试和生产规模中建立并测试，包括用于注射剂的生产，整个过程是全封闭的。该技术的工业应用领域包括制药、诊断和医疗器械以及特种化学品应用。 1 引言通常能够挽救生命的药品，与将产品推向市场的一般关注点相比，有额外的要求。将合适的材料以正确的配置放置在正确的位置已经足够具有挑战性。与其它供应链一样，制药供应链在二十一世纪已成为一个相互交织的全球网络。由于2019年开始的新冠疫情，这种供应链的脆弱性以及对供应链的需求变得尤为突出。喷雾冷冻干燥能够储备稳定的散装材料，在临床研究确定正确的剂量范围时灵活填充剂量，并快速提供这些药物。这种改进的能力有可能挽救数十万人的生命。即使在正常时期，这里描述的制药供应链优势也能对业务运营产生重要的积极影响。冷冻干燥是一种众所周知的用于保持食品质量的方法。在冷冻干燥的条件下从食品中去除水分，可以保持其颜色和质量。鉴于许多药品对热量、水分以及这两种因素的组合都很敏感，同样的技术也适用。术语冷冻干燥、冷冻脱水和冷冻干燥基本上可以互换使用。小分子、大分子蛋白质，甚至使用脂质体的复杂配方都已通过这种技术进行保存。 1.1 传统冷冻干燥的挑战冷冻干燥大约在1890年被引入，并在20世纪50年代发展为工业应用[10]。含有溶解产品的液体必须被冷冻并暴露在真空条件下。温度和真空条件在各个阶段进行调整，以影响干燥周期，通过升华实现干燥。产品处理可以通过简单地填充到托盘上完成。更有可能的是，液体被倒入初级包装中，例如注射用小瓶或单位剂量的泡罩腔。当使用小瓶时，瓶塞在小瓶顶部是松动的，以便在处理过程中让水蒸气逸出，并在干燥周期完成后进行密封。冷冻干燥周期可能很长，例如几天，因此开发起来很困难，因为周期时间很长。还存在与规模相关的效应，较小的腔室可能无法代表更大规模的工艺，这进一步使周期时间开发变得复杂。在真空环境中控制热传递是众多挑战之一。有许多研究讨论了由于小瓶形状、小瓶与温控搁板之间的热传递、在干燥机几何形状上均匀分布热量或暴露在所需腔室环境中的困难，以及在过程中测量产品属性的困难等。在无菌或无菌条件下进行处理时，这些挑战会增加。典型冷冻干燥产品的努力和复杂性促使人们重新审视该工艺。材料的冷冻以及随后在控制温度条件和真空下的干燥都经过了检查。 1.2 改进工艺的期望属性形成目标产品概况并按此设计是质量源于设计（QbD）的核心。对于任何药品来说，批次之间的均匀性和一致性是期望的属性。冷冻干燥被选用于对加工过程中的冷冻条件敏感的产品。鉴于对现有工艺中热传递的关注以及对热传递风险的补救，更均匀地将产品暴露在各种温度和压力条件下也是一种期望。许多冷冻干燥产品是在其最终容器中填充的，甚至是单位剂量容器。能够通过单一工艺大量生成散装材料，然后灵活地填充到所需的最终容器和呈现形式中，将是非常理想的。这种散装固体的形成需要形成机械稳定、自由流动且均匀的固体，以便后续可以将其填充到所需的容器中。最后，产品的复溶能力需要与冷冻干燥产品的蛋糕形式相似。与冷冻干燥蛋糕相比，冷冻干燥颗粒的比表面积更大，这将有助于确保这一期望的质量属性：快速复溶为溶液或悬浮液。通过这种方式，通过对产品需求的简单检查，设定了新工艺的要求。这些考虑因素复制了现有工艺。然而，通过解决现有范式中的一些挑战，新的机会是可能的。一个优势在于单元操作的顺序。因为最终的或单位剂量的容器是在新工艺的末尾引入的，所以只需要开发一个单一的周期就可以提供多种产品呈现形式。消除为多种呈现形式重复开发周期的成本和更重要的时间节省，应该能够更快地将药物推向市场。产品的需求预测是具有挑战性的，而且预测结果可能高度多变。能够灵活地在正确的时间填充正确的剂量组合，可以为患者提供更好的可及性和供应效率。以另一个例子来说，许多患者需要多种药物联合使用，然而许多药物彼此不相容，以至于在单一的冷冻干燥过程中形成组合无法得到稳定的产物。当一个过程能够产生每种药物的独立固体颗粒，并且这些固体颗粒由于其流动性和机械完整性可以按正确的比例组合时，组合产品可能是可行的，因为两种成分在溶液中的接触时间最小——仅仅是复溶和给药的时间。可以填充到传统小瓶中，也可以直接填充到注射器、小袋或设备中（图1）。 图 1 注射瓶中的冷冻干燥颗粒 1.3 喷雾冷冻干燥的发展许多方法已被用于将材料冷冻成颗粒，以便在低温下进行后续干燥。直接沉积到氮气中已在食品工业中以各种形式尝试过，随后在腔室中的托盘上进行干燥。然后，通常需要清洁（甚至是无菌的）液氮。即便如此，形成的颗粒可能并不完全呈圆形或均匀。一些小组将溶液沉积在冷却的基底上形成薄膜，然后从井中收获材料或将薄膜破碎成颗粒。尽管这是一种有效的冷冻技术，但材料可能不具备这里描述的目标所需的理想粒度特性。大气喷雾冷冻消除了与清洁液氮接触的需要，并可以为后续加工准备球形或近球形颗粒。从20世纪80年代开始，巴塞尔大学在流化床设备制造商Glatt的赞助下，研究了将大气冷冻与流化床干燥过程相结合的方法。流化床系统以其热传递和质量传递效率为特征，因为每个颗粒的整个表面都暴露在干燥过程中。实验使用（加热的）喷嘴将液体引入流化床装置内的低温气流中。二元喷嘴中的液体和雾化气体产生液滴，这些液滴在接触其他颗粒或设备壁之前必须凝固。流化气体的温度低于-60°C，相对较高的气流速度用于将液滴冷冻成所需的形态。这种方法的一个优势是，颗粒生成和冷冻干燥（在常压下）在一个工艺腔室中进行（单一锅处理）。正如Plitzko所述，该系统在实验室规模运行时可以工作。这种方法的局限性在于，在干燥过程中，液滴会显著减轻重量。在气体流速足以流化刚刚形成的液滴时，接近干燥的颗粒部分会被困在上部过滤器中。一旦颗粒被困在过滤器中，流化对粉末的优势就不再存在，干燥速率降低。由于流化气体的温度非常低，其携带水蒸气的能力大大降低。可以通过气体流速部分补偿气体温度，然而，高流速也会使颗粒被困在过滤器中，消除了流化的效果。使用“单一锅”流化床工艺在常压下处理用于注射的无菌药品，从经济可行性和技术可行性角度出发，被证明是不切实际的。一个解决方案是将冷冻和冷冻干燥过程分开，因为它们有不同的处理要求。通过这种方式，可以识别出针对每个形成和干燥阶段的液滴/颗粒特性的最佳条件。在喷雾冷冻的条件下形成液滴并非易事。喷嘴必须能够在不结冰的情况下形成液滴。即使液滴生成速率很高，液滴在形成稳定的冷冻外壳之前也不能相互接触（融合在一起/形成团聚体），或者接触壁（形成冷冻涂层）。在冷冻发生后，可以使用多种机器配置来处理散装材料。在食品工业中，已经使用了非常大的批量干燥腔室或传送带系统，将材料通过各个干燥阶段移动。在制药加工中，还考虑了其他方法，例如振动托盘、传送带，甚至是将小瓶从一个腔室移动到另一个腔室。成功模仿已建立的连续制造片剂的方法是将颗粒化材料在滚筒装置中进行后处理。通过从同一个喷雾冷冻机向多个滚筒供料，可以实现连续制造。 1.4 与冻干散料相关的一般产品和工艺考量  在固体剂型中，一个成熟的生产工艺概念是使用散装颗粒状、颗粒化或球形化的材料进行进一步加工。无论是用于压片的颗粒化，还是用于填充到小袋或胶囊中的粉末/颗粒，该工艺都基于在下一步工艺之前可用的中间体。在连续化生产中，基于中间体的概念得到了扩展，通过在缓冲容器中保留某些中间体，以在工艺的小幅波动期间保持生产线的运行。在本讨论中，我们选择使用“散料”一词来反映将均质冻干产品以自由流动的颗粒形式保存以供进一步加工的能力。散料概念在满足不同剂量需求的变化以及扩大应用范围方面提供了灵活性，例如：组合产品。  在传统冷冻干燥中，散料概念仅限于在冷冻干燥之前的填充步骤中的悬浮液或溶液。一旦完成填充，就无法进一步灵活调整剂量、交付的组分数或改变初级包装。这里的特征是，在冷冻干燥之前进行填充。  在喷雾冷冻干燥中，散料的使用得到了扩展，并且将填充步骤放在了工艺的最后，从而提供了额外的灵活性。可以根据需要准备散装溶液并进行喷雾，形成作为散料生成的稳定且可填充的冻干球体。在冷冻干燥之后进行填充，从而为最终产品展示提供了最大的灵活性。  这为制造物流以及产品创新带来了许多选择。冻干散料可以转移到另一个地点或国家。填充时间、填充剂量以及每个容器中的剂量数量可以根据需求选择；初级包装也是如此，不再需要适合冷冻干燥。同时，市场要求的满足速度要快得多，因为冷冻干燥步骤的开发仅与材料有关，而不是剂量或容器。在加速开发中，更重要的是在大流行情况下，即使剂量尚未确定，也可以通过冷冻干燥开始生产。一旦确定剂量，就可以根据需要对已经冻干的散料进行填充，从而减少到达患者的时间（见图2）。  图 2 注射器中填充的冷冻干燥颗粒组合 供应链获得的灵活性伴随着注册工作量的减少，相同的制造步骤可以生成相同的“基础材料”，这些材料可以用于非常不同的产品、剂量或批量大小；以患者为中心的制造通过更快的交付得以实现，甚至打开了个性化用药的可能性，即为个别患者填充特定的一组冻干球体。在产品创新方面，不仅组合产品更容易获得。还可以处理更高度浓缩的液体，例如，200 mg/l的蛋白质负载量，仍然具有良好的冷冻干燥特性和快速复溶特性。  喷雾冷冻颗粒的高表面积对热质传递的优势也发挥了作用。对于典型填充高度为1 cm的西林瓶，冻干蛋糕内的最大水蒸气扩散距离为10,000 μm。一个大约600 μm的冷冻球体的最大距离为300 μm，即减少了97%。高度浓缩液体的扩散过程受到的阻碍通过显著缩短扩散距离得到了补偿。不是只有一个冻干蛋糕，而是有许多小的、球形的冻干蛋糕，它们形成了多颗粒剂型的概念，模仿了固体剂型领域的散装中间体。  高表面积如此有效地改善了干燥过程，以至于必须谨慎考虑条件。有可能快速形成一个干燥的外壳，该外壳的导热性较低，与传统的基于蛋糕的干燥工艺相比，降低了颗粒几何形状的干燥效率。正确选择工艺条件可以确保最佳干燥。  作为球形颗粒形式的冻干制剂的可用性也为固体剂型技术中已知的进一步应用打开了大门，例如流化床包衣。这使得可以生成受保护的冻干散料，以防止例如光照、湿度或氧气的影响，或者具有控释功能（见图3）。  图 3 采用流化床 Wurster 技术涂覆聚合物涂层的冷冻干燥球体 2 喷雾冷冻干燥  2.1 一般设计特点和工艺特性  喷雾冷冻干燥包括两个独立的工艺步骤：喷雾冷冻用于从基质液体中生成冷冻球体。然后使用动态冷冻干燥均匀地冻干冷冻散料。  2.1.1 喷雾冷冻  在喷雾冷冻步骤中，通过一个安装在喷雾冷冻塔上盖的专用喷嘴将液体喷出，从而产生液滴。目标是实现单分散的液滴尺寸，以帮助颗粒流动和一致性（见图4）。  图 4 喷雾冷冻室的俯视图，喷嘴安装在可旋转的盖子上（实验室规模） 液滴穿过喷雾冷冻塔内的冷气区。在穿过塔的时间内，液滴冷却得足够多，以在到达过程室的下端之前凝结成冷冻球体。喷雾冷冻步骤在常压条件下进行。  过程室的下端呈圆锥形，用于收集并转移冷冻球体，要么将其转移到收集容器中以保存为散料以供进一步加工，要么直接转移到动态冷冻干燥机中，形成干燥的散料以供填充。  2.1.2 旋转冷冻干燥  旋转冷冻干燥在典型的冷冻干燥真空条件下进行。将冷冻散料放置在一个双层壁的鼓中，该鼓沿其纵向轴旋转，前后两端开放。鼓具有双层壁，由硅油温度控制，以提供冷却和加热能力。它可以与传统的冷冻干燥相比较，即将水平搁板设计成圆形，并让其在真空室内围绕水平圆柱轴旋转。由于鼓的缓慢旋转，产品床处于持续的温和混合状态，形成床表面的颗粒产品处于持续运动中，将新鲜物料带到表面。在产品床表面，颗粒暴露于沿干燥鼓中心附近全长运行的装置发出的红外（IR）能量。除了鼓壁温度外，IR辐射还为干燥颗粒提供了能量来源（见图5）。  图 5 生产规模旋转冷冻干燥机中的红外加热装置和双层鼓 2.1.3 设备配置选项  通过重力将冷冻散料装入干燥机。通过鼓的反向旋转以及鼓内的卸料铲来卸出产品。  喷雾冷冻和旋转干燥可以独立进行，使用独立的设备。必须特别注意喷雾冷冻散料的储存特性，如在涉及连续操作方面的部分所述（见图6）。  对于密闭和无菌加工，将两个工艺步骤结合起来。将喷雾冷冻塔放置在动态旋转冷冻干燥机的顶部，施加真空，并开始冷冻干燥步骤。干燥后，再次以容器的方式在真空下将鼓卸入干燥机下方的中间料斗；只有在这里，真空才会被释放，然后产品可以转移到IBCs（见图15和第4节下面的讨论）。  图 6 喷雾冷冻单元和旋转冷冻干燥机作为独立设备（均为实验室规模） 这样的生产线是为蒸汽灭菌和就地清洗而设计的。值得一提的是，将喷雾冷冻室与任何类型的散料冷冻干燥机以封闭但可分离的方式组合起来的设置，受到知识产权的保护。可以使用多个旋转干燥机来提高效率，因为干燥步骤所需的时间比喷雾冷冻步骤更长（见图7）。  图 7 完全封闭的喷雾冷冻生产线，配有就地清洗（CIP）和就地灭菌（蒸汽） 2.2 喷雾冷冻：喷雾冷冻中的特定设计和工艺考量  2.2.1 开场白  喷雾冷冻通常用于学术研究和开发领域，通过将喷嘴，通常是二元喷嘴，放置在充满液氮（LN2）的工艺容器上方，有时还包括搅拌器。对于工业用途，这一概念存在各种限制： 直接使用LN2将要求该介质必须符合适用于产品的质量要求。对于无菌生产，这将需要使用无菌LN2，这相当昂贵，并且还带来了相当大的资质认定和验证挑战。 为解决使用无菌LN2的挑战，喷雾冷冻塔的工业设计采用常压，以冷气作为冷冻介质。该腔室包括一个双层壁的冷冻腔室。在这个过程中使用LN2时，它从未与产品接触，它是通过各种选项引入的主要冷却介质，包括底部、切向或顶部注入LN2或GN2/LN2混合物到喷雾塔的双层空腔中。通过过程室的内壁来冷却喷雾塔内的过程气体。过程气体的冷却时间通常低于1小时。与含有LN2池的过程容器相比，这种工艺设计对过程容器的热应力较小。  在工业设计中，过程气体——通常是氮气——通过经过无菌过滤器引入，这是在无菌或无菌产品制造中常用的方法。通过使用过滤气体，在过程室内保持无菌条件，并且只需要技术级LN2用于加工。  直接喷入LN2的技术的其他限制： • 当将液体直接喷洒到液氮（LN2）上时，通常会发生莱顿弗罗斯特效应，使液滴悬浮在表面。液滴表面的温度高于液氮的沸点，液氮在表面界面上蒸发形成气体外壳，从而使液滴悬浮在液氮上方。只有当液滴（或冻结的球体）足够冷时，才会沉入液氮中。在此之前，液滴有很高的风险被另一个指向液氮表面的液滴击中，这会导致液滴合并，从而导致不受控的颗粒生长，降低冻结块体的整体均匀性。合并反过来又会影响随后的干燥步骤，以及在将冻干块体填充到初级包装时的剂量准确性。 • 另一个使用液氮直接冻结液滴的方面是，对于直径大于约1毫米的大颗粒，内部机械应力可能会导致颗粒开裂，因为外壳已经冻结并固定了体积，而核心仍然是液体，并且在进一步冻结过程中可能会膨胀。 • 通常使用的喷嘴产生的液滴尺寸分布相对较宽，可能会产生上述的负面影响。高压喷嘴、双喷嘴或超声喷嘴可能会使用剪切力，这对基底是有害的。因此，在设计的工业过程中，使用了一种不同的、温和的液滴生成原理，称为“受控层流射流断裂”或瑞利断裂。它通过在细液体射流上施加共振频率来工作，此时射流会在该点分解成相同大小的段。在彼此分离时，由于液体的表面张力，这些段会呈现球形，如图1所示。通常，在动态喷雾冷冻干燥中，液滴尺寸选择在400微米到1000微米的范围内，也取决于密度，这在冻干过程中是相关的。选择液滴尺寸还应考虑冻干球体的密度和单剂量填充技术的准确性要求（见图8）。 图 8 通过控制层流射流断裂形成液滴：频闪灯显示以 3500 Hz 生成的单个液滴，即每秒生成 3500 个液滴 需要指出的是，如频闪视图所示，将液滴在一条线上冻结，要么会导致团聚，要么会限制过程效率。根据使用的频率，每秒会产生数千个液滴，即液滴之间的距离最小。如果液体射流的速度高于液滴的下落速度，液滴之间的间距会变得更小。在极端情况下，会发生液滴合并，改变液滴尺寸并降低尺寸均匀性。另一种选择是降低喷雾速率，使射流速度低于液滴的下落速度；然而，这将不必要地限制产量。热传递是另一个需要考虑的因素。每个单独的液滴都会在前一个液滴的尾流中行进，从而减少了与冷却剂（即工艺气体）的接触。此外，每个液滴都会加热其周围的气体。这会在气体中形成温度高于期望值的通道。结果是热传递减少，在这种情况下，喷雾冷冻塔的高度将不得不增加以考虑这种现象。因此，建议在离散单个液滴形成后立即将垂直液滴线展开，从而形成一个喷雾模式，增加液滴之间的距离，并使每个液滴都能接触到冷气体。这个过程被称为偏转。可以通过使用静电场使液滴彼此分离，或者通过基于气体射流的偏转方法来实现。使用静电场效果很好，尽管静电场可能会留在产品中，并在转移冻结块体甚至在冻干过程中对流动特性产生负面影响。 2.2.2 喷雾冷冻设备设计、工艺和产品参数 2.2.2.1 塔 喷雾冷冻塔的基本设计是一个双壁圆柱体，顶部有盖子，喷嘴安装在盖子上，下部有一个锥体，用于引导冻结的珠子离开工艺室。直径必须考虑偏转喷雾锥体的尺寸，避免喷雾模式重叠和接触壁的风险。一个中心设计参数是高度。基本任务是确保对于给定的配方，液滴的冻结得以实现。各种参数都会发挥作用。在配方方面，有液体的固体含量、液体的粘度和Tg'。在工艺方面，有喷雾速率、液滴尺寸、液滴频率、工艺气体温度，当然还有塔的高度。在给定的下落速度下，高度对暴露时间有直接影响，而在给定的一组工艺条件下，这是冻结一个液滴所需的。这些因素及其相互依赖关系已被很好地描述、研究，甚至进行了模拟（见图9）。 图 9 喷雾冷冻塔的示意图，显示为独立执行（非作为生产线的一部分），配有冷却的中间料斗容器 从外部看，喷雾冷冻塔基本上是一个封闭系统。工艺室内的压力受到控制，没有显著的工艺气体输入或输出，诱导气体流动方向等。然而，只要喷雾冷冻塔的壁比塔内的气体冷，并且气体不断被喷雾干扰和加热，就会产生显著的内部自然对流。这种气体运动的一部分在液滴冻结的计算机模拟研究中有所体现。通常，使用的工艺气体温度在-100°C到-140°C之间，下落高度范围从1.5米到3.5米，使用Tg'在-30°C到-40°C范围内的配方。较低的工艺气体温度会增加向液滴的热传递并降低液滴的下落速度。 2.2.2.2 喷雾 喷雾液体的总固体含量通常在10%到40%之间，具体取决于溶液或悬浮液产生高粘度的倾向。对于某些高分子量化合物，为了产生理想的液滴，总固体含量不能超过10%，甚至更低。固体含量还决定了球体在动态冻干步骤和后续过程（如填充）期间的机械稳定性。较高的固体含量会产生密度较高的颗粒，这种颗粒通常具有更好的机械完整性。关于颗粒特性的更多细节将在冻干部分给出。就粘度而言，可以处理高达300毫帕斯卡的溶液，用于上述的液滴/颗粒尺寸范围。也可以处理悬浮液，只要悬浮颗粒的大小得到良好控制，以防止喷嘴堵塞。通常，所有颗粒的大小在50微米以下，对于用于产生600微米液滴的300微米喷嘴孔径是可行的。悬浮液中较大的固体颗粒会导致喷嘴处桥接和堵塞。喷雾冷冻干燥中典型的液滴尺寸在600-800微米范围内。下限尺寸取决于后续的冻干步骤；小液滴，例如在冻干过程中失去约70-90%重量的400微米以下的液滴，容易受到即使是小的气流/蒸汽流的捕获或静电场的影响，并且会丢失到工艺中，降低产量。尽管可以处理小颗粒，但由于对低产量的担忧，建议使用600-800微米的颗粒尺寸（见图10）。 图 10 喷雾冷冻的球体，直径约为 600 μm 尺寸范围的上限由冻结材料的能力决定。超过大约1000微米的液滴可能需要在冻结过程中显著增加下落高度，因为必须冻结更多的材料体积。一种情况是液滴的外壳冻结，使得冻结的外壳解体，液滴的液体核心溢出，没有形成颗粒。每个喷嘴的喷雾速率通常在每分钟10-35克之间，频率在1000-5000赫兹范围内。液体流动应该是稳定的，没有大的脉动，这会干扰液滴的形成。目标液滴直径通常是产生液体射流的喷嘴孔径的两倍。在将块状液体转化为冻结块体时，由于颗粒间孔隙的存在，块体体积将增加约1.6-1.9倍。在冻干步骤中，可以观察到一些直径的减小。当然，喷雾模式的几何形状必须考虑与单个喷嘴执行相同的标准。对于任何设备尺寸，特别是在无菌条件下处理时，建议对喷嘴性能进行在线控制。通过使用基于光传输的集成液滴计数器的喷嘴，可以验证所应用的频率是否转化为相同数量的液滴。在已知和控制的喷雾速率和给定的液滴数量的情况下，这同时也是对液滴尺寸的间接测量和控制。 2.2.3 喷雾冷冻的放大 喷雾冷冻过程的放大遵循上述相同的总体设计原则。在放大或缩小过程中保持不变的设计参数是高度；与特定液滴尺寸相关的冻结条件，无论是来自一个喷嘴的几个液滴还是来自多个喷嘴的许多液滴，都保持不变。因此，放大主要集中在提供所需产量的相关喷嘴数量上，并增加直径以容纳这些喷嘴。喷嘴的设计和参数设置保持不变。当然，必须考虑喷雾模式的几何形状，使用与单个喷嘴使用时相同的标准。必须考虑限制，以确保喷雾冷冻塔壁的热交换足够高，以补偿由于液体液滴增加的加热而产生的任何热影响。基于Sebastiao等人的工作的计算机模拟建模将降低任何放大过程中不可避免的风险。在过去十年中，与计算机模拟模型相关的时间和成本大幅下降，许多组织能够访问基于云的计算资源或聘请可靠的CRO组织，这些组织可以构建模型并进行计算机模拟实验。 2.3 动态旋转块体冻干 无论是最终产品（就患者剂量而言）还是中间块体（就准确填充最终包装而言），其关键属性是均匀性。为了确保最终产品和块体的均匀性，液体进料采取了预防措施以确保其均匀。在确保液体进料均匀性方面投入了大量关注，以确保在所需的尺寸范围内具有均匀的液滴分布，从而确保均匀的材料被冻结在喂入动态旋转冻干机的颗粒中。冻干步骤本身，由于其围绕高比表面积颗粒设计，有助于确保材料均匀暴露于干燥条件，从而确保批次的均匀性。 2.3.1 一般设备设计、工艺和产品参数 利用在真空条件下进行冻干的优势是将喷雾冷冻操作与块体冻干步骤分开的驱动力。因此，对于动态旋转冻干，其设计和加工与传统冻干有许多相似之处。动态旋转冻干机由一个圆柱形滚筒组成，该滚筒围绕水平放置的纵向轴旋转。滚筒是双壁的，类似于传统冻干机中的搁板，并通过循环硅油进行温度控制。滚筒放置在一个圆形真空工艺室内，滚筒支撑和轴承采用悬臂设计。滚筒的前端和后端是开放的，以便水蒸气通过。工艺室的前壁配备有一个或多个红外辐射器，这些辐射器突出到滚筒内，并将红外能量向下引导到产品床表面，由于滚筒旋转，产品床表面处于不断运动状态。 与工艺腔室相邻的是使工艺得以运行的外围设备。为了防止真空泵被物料污染，紧邻工艺腔室的是冷凝器，用于将蒸汽重新转化为液态。冷凝器之后是真空撬，它诱导蒸汽流动并将压力降低到所需的值。此外，这一系列外围设备还包括用于控制循环传热流体（硅油）温度的装置。整个辅助设备和仪器仪表的区域与传统冷冻干燥设备相当相似。 在设计方面，特别是针对旋转鼓技术的使用，包括使用像红外线（IR）（或微波）辐射这样的能源、影响产品在鼓内运动的混合挡板、用于测量体积温度（也称为浸入式产品温度）的传感器，或者从喷雾冷冻单元到中间散装容器的集成产品处理功能，这些是动态旋转冷冻干燥技术的特征（见图11）。 图 11 旋转冷冻干燥机的示意图；未显示红外加热器和硅油回路 从工程角度来看，旋转冷冻干燥有一些特定的部件。旋转馈通装置和鼓轴承的悬臂设计避免了因支撑轴承或支撑轮的磨损而产生的清洁挑战或任何潜在的颗粒形成。轴承还包括一个真空陷阱，该陷阱保持的压强低于工艺腔室内的操作压强，从而将轴承与工艺隔离。这对于无菌加工具有特别重要的意义。发出辐射能量的红外辐射器完全由玻璃覆盖，可以通过CIP（就地清洗）工艺进行清洁。红外棒的表面以一种方式冷却，使得红外能量可以穿透到产品中，但表面温度低于确保与基底接触时不超过材料温度限制的温度。 将冷冻散装物料通过重力装入干燥机的预冷鼓中。通过反转鼓的旋转（例如，逆时针与顺时针）以及鼓内的卸料铲，实现物料的卸出。这样，旋转冷冻干燥机可以以完全封闭的方式进行装料和卸料，即通过重力实现物料处理，无需特定的物料输送设备。 与位于干燥机上方的喷雾冷冻室结合使用时，该概念允许整个工艺线的完全封闭操作。在这样的无菌加工设置中，液滴在喷雾冷冻室的顶部生成，通过重力穿过冷气区，在那里凝结，然后通过装料管通过重力转移到干燥机的预冷鼓中。经过冷冻干燥后，通过反转旋转和重力将物料转移到中间料斗中，该料斗可以与屏障（RABS）或隔离系统对接，用于填充到中间散装容器（IBCs）中。这样，该设计特别适合就地清洗（CIP）和蒸汽灭菌工艺（SIP）。 2.3.2 旋转冷冻干燥的特定方面：与搁板冷冻干燥的比较 由于传统冷冻干燥用于广泛的产品，因此将传统冷冻干燥参数与旋转冷冻干燥进行比较的通用方法是困难的。然而，有一些在冷冻干燥中众所周知的通用规则，用于设计冷冻干燥循环。 2.3.2.1 Tg’ 在进行冷冻干燥实验之前，确定Tg’值是最重要的分析之一，以确定合适的冷冻干燥参数。根据这个值，传统冷冻干燥机中的参数被选择为使材料的温度不超过Tg’值太多，否则产品蛋糕可能会塌陷。通常指定的是：压力和搁板/硅油温度。搁板温度选择在Tg’值以上5–10°C，压力则根据水蒸气表选择，对应于比Tg’值低5–10°C的温度。这些值可用于比较传统冷冻干燥工艺和动态冷冻干燥循环。 2.3.2.2 压力 在传统冷冻干燥中，选择的压力应尽可能高。升华所需的大部分能量是通过对流传递的，这一过程非常依赖于压力。在传统冷冻干燥中，非常低的压力会停止通过对流的热传递，只剩下传导和辐射作为可能的热传递途径。 动态冷冻干燥对通过对流的热传递的依赖性要小得多。高压力会导致对粘性和微观塌陷的高度敏感性。压力越低，颗粒部分塌陷的风险就越小。在托盘干燥过程中，通过降低压力延长干燥时间的现象在旋转干燥过程中并未观察到，这为后者提供了显著的优势。选择的压力应有一定的限制，以实现良好的压力控制（例如，30–50微巴）（见图12）。 图 12 不同条件下的产品流动行为 2.3.2.3 搁板和鼓表面温度 在传统冷冻干燥中，搁板温度选择在配方的Tg’值以上几度。安瓿中的填充高度是一个关键参数，可能会进一步限制搁板温度的水平。通常选择大约1厘米的填充高度。如果在安瓿中填充了更多的量，水蒸气通过已经干燥的产品层的扩散长度会限制升华速率和由于升华而对产品进行的自我冷却。在这种情况下，必须选择较低的搁板温度，以避免任何产品塌陷。 在动态冷冻干燥中，鼓表面温度的选择与传统冷冻干燥非常相似，并且也将设置在Tg’以上5–10°C。与传统冷冻干燥相比，在正在进行的冷冻干燥循环期间，颗粒周围形成了干燥外壳，冰前沿向颗粒中心移动。这种干燥外壳对较高温度的敏感性低于传统冷冻干燥中产品蛋糕的冷冻部分，并且具有略高的Tg’值和较低的热导率。由于颗粒干燥表面的保护特性，在初级干燥步骤中可以提高鼓表面温度。当产品床温度接近产品的Tg’时，可以观察到产品的粘性。为了避免任何塌陷，在这种情况下建议将鼓表面温度降低几度。这样，可以避免颗粒的熔化或塌陷。2.3.2.4 旋转冷冻干燥中的红外功率 红外功率是一个在传统冷冻干燥机中通常未知的参数。辐射对传统冷冻干燥机中的干燥速度也有影响，但主要是由比搁板温度低的搁板上方的瓶子产生的。由于几何形状和温度差异较小，辐射在传统冷冻干燥中不是主要因素，但可能会造成不均匀性。在搁板装载研究中，边缘效应经常出现。 在动态冷冻干燥中，位于产品床表面的颗粒对热量和质量传递的暴露最大。由于颗粒的水蒸气扩散长度较短，与蛋糕相比，可以在产品床顶部施加大量的能量，而无需担心熔化的风险。必须考虑到一定量的辐射热被产品反射并被鼓表面和混合挡板吸收。鼓表面是温度控制的，所有额外的热量都通过硅油移除。如果将红外能量应用于机器的所有内表面，所有其他不锈钢部件都会被加热。为了实现最大效率和温度控制，红外热应集中在产品表面区域。2.3.2.5 旋转冷冻干燥中的鼓旋转速度 旋转速度是一个确保产品适当混合和运动的参数。希望尽可能快地旋转以确保良好的混合。选择速度的上限以避免物料磨损。如果产品由于初始溶液中固体干物质含量低而易碎，则通常使用较低的速度。必须在足够的混合和减少机械应力之间找到折衷，这一折衷在初级干燥阶段的范围为1–2.5转/分钟（与规模无关）。在低热量输入阶段（启动阶段、次级干燥），旋转速度可以降低到0.3–1转/分钟（由于几何形状，与规模无关）。2.3.2.6 终点检测（通过比较压力测量或压力上升） 传统和动态冷冻干燥使用相同的原理进行初级干燥的终点检测，因为它们直接与产品的材料属性以及与其接触的蒸汽的热力学有关。比较气压法和压力上升测试在两种类型的工艺中都最常被应用。 在比较气压法中，观察皮拉尼和电容式压力计的指示压力。由于测量原理，在水蒸气存在的情况下，皮拉尼压力计显示的压力值比电容式压力计高1.6倍。这一原理也可以应用于动态冷冻干燥。颗粒中的残余水分应该已经很低（<1–5%），皮拉尼传感器值才会接近电容式压力计的值。这是由于颗粒的高表面积和水蒸气从颗粒中扩散的短扩散长度，即使在初级干燥结束时，也会导致高脱附速率。由于初级干燥结束时水分含量低，只需要一个较短的次级干燥阶段。 压力上升测试也常用于终点检测。如果仍有冰存在，会观察到快速的压力上升。在初级干燥结束时，速度显著降低。同样，必须考虑到产品表面积与传统冷冻干燥相比更大。因此，与表面积较小的搁板冷冻干燥相比，会看到更快的压力上升。产品温度也可以用于终点检测，但由于压力和红外加热器对温度探头值的影响，其精度较低。该值显著增加大约比比较气压法提前1–3小时，表明初级干燥接近终点（见图13）。 图 13 动态冷冻干燥过程中的工艺数据2.3.2.7 配方方面 如在喷雾冷冻部分所述，喷雾液体中的固体含量对喷雾过程有影响，并对最终散装产品的机械稳定性有强烈影响。例如，在传统冷冻干燥中，可以冷冻干燥2%的蔗糖溶液。得到的冷冻干燥蛋糕将非常多孔且机械强度弱，尽管作为安瓿中的单剂量可能是可行的。在传统冷冻干燥中选择低固体分数主要是因为水蒸气通过冷冻干燥蛋糕的扩散距离长。低固体分数值会导致更大的孔隙，这可能有助于缩短干燥时间。 在喷雾冷冻干燥中，低固体配方在初始喷雾冷冻过程中很容易实现。然而，在第二步，即动态冷冻干燥过程中，以及随后的填充过程中，可能会出现高磨损甚至颗粒完整性的问题。 高固体含量对于加工和后处理都是理想的属性，前提是加工可行且最终的复溶性能适当。喷雾冷冻干燥允许显著更高的固体含量，同时仍然显示出良好的复溶性能和正常的冷冻干燥过程时间，这是由于表面积增大和水蒸气扩散距离减少（见图14）。 图 14 旋转冷冻干燥后的 600 μm 球体（含 20% 蔗糖）；群体与单个颗粒（扫描电子显微镜图像） 为了在喷雾冷冻干燥过程中实现足够的机械稳定性，溶解物质（如填充剂、蛋白质、其他添加剂）的总量应在10%左右或更高；喷雾冷冻干燥已成功处理固体含量高达40%（重量百分比）的液体。在动态冷冻干燥中通常使用的较高固体分数不会导致过程时间延长，因为水蒸气的扩散长度较短。 最终配方的等渗性应在复溶后立即实现。由于喷雾冷冻干燥过程的散装颗粒中固体含量更多，因此可以在复溶时通过更高的体积稀释度来实现等渗性。影响机械性能的典型冷冻干燥填充剂是糖类，如海藻糖、蔗糖和甘露醇、氨基酸、缓冲剂、等渗调节剂和塌陷温度调节剂。 关注颗粒的机械稳定性时，可以根据其机械性能选择配方成分，例如，脆性材料和弹性材料。脆性物质通常是结晶产品，可能无法在非晶态下干燥甚至冷冻（例如，甘露醇、甘氨酸、氯化钠）。即使是这些物质的10%固体干物质，也无法提供足够的机械稳定性。 像海藻糖和蔗糖这样的糖类以及一些更复杂的氨基酸，如精氨酸，可以在非晶态下冷冻干燥，并在10%固体干物质及更高含量时提供足够的机械稳定性。蛋白质和其他多糖，如右旋糖酐，由于其弹性，会增加机械稳定性，甚至低于10%的固体分数也是可行的。在动态冷冻干燥中，固体干物质的浓度可以高达40%。由于其水分含量低，喷雾冷冻所需的能量较少，从而可以实现更高的喷雾速率。此外，在初级干燥过程中需要升华的水分较少，从而实现更短且更节能的干燥循环。并非所有填充剂都能提供足够的溶解度以实现40%的固体干物质。最常用的填充剂是蔗糖和海藻糖，用于高固体分数配方。 2.3.2.8 喷雾冷冻散装物料在动态冷冻干燥中的流动特性  冰的存在  冷冻散装颗粒本质上是均匀的球体。在设计输送管道时需要格外小心，因为产品通过重力从喷雾冷冻塔流向旋转冷冻干燥机。尽管这些颗粒在冷冻干燥过程后由于其形状和表面结构具有良好的流动性，但在喷雾冷冻后或在冷冻干燥过程的开始阶段，其流动性主要受到微小冰晶的阻碍，这些冰晶位于颗粒之间。这些冰晶的尺寸小于10微米。这些颗粒在喷雾冷冻过程中产生，由纯冰组成，即它们不含任何喷雾配方的成分，这一点通过喷洒有色配方并观察到冰晶呈白色得到了证实。  冰晶是在喷雾冷冻塔中喷雾冷冻过程中形成的。液滴的温度处于其水蒸气分压显著的范围内。即使只有少量水蒸气蒸发，也会使喷雾冷冻塔内的大气饱和。这种大气几乎无法吸收水分。所有蒸发的水蒸气会立即冻结，形成非常细小的冰晶雾。这些冰晶会附着在喷雾冷冻塔的内表面，部分“雪花”会在一段时间后与冷冻球体一起转移到干燥室。“雪花”本身的流动性非常差，会降低产品的流动性。需要强调的是，由于“雪花”导致的流动性降低只有在喷雾液体量较大且经过一定时间后才会显现。在实验室规模的短时间冷冻测试中，“雪花”量过低，无法在壁面上沉积——会看到一种非常流动的产品。只有在经过一定时间的喷雾冷冻后，冰晶才会积累，大量“雪花”会与产品一起转移，从而导致产品流动特性预期的降低。喷雾冷冻过程中冰晶的形成可以通过控制温度和喷雾冷冻塔与旋转冷冻干燥机之间输送管道内的流动路径来解释。  对于均匀的散装冷冻干燥，良好的流动性是必不可少的。由于这一要求，需要一定的工艺条件顺序来建立良好的流动性。这通常是在第一步低温干燥中完成的，同时减少滚筒的运动。可以观察到，非常轻的细小冰晶会被水蒸气流动吹出产品和滚筒。如果不去除冰晶，粘性差、流动性差的产品存在产量损失的内在风险，因为运动无法控制。在旋转滚筒中，产品可能会粘附在壁面上，并随着滚筒向上移动，一旦偶然松动就会掉落。这种粘滑运动已被观察到会导致一些产品损失。通过减少滚筒的初始运动，直到完全实现流动性，可以防止这种现象。  喷雾冷冻颗粒的储存可以作为立即转移到冷冻干燥滚筒的替代方案。然而，需要考虑的是，产品在储存过程中可能会形成松散的团聚体，这可能是由各种机制引起的： 重结晶：根据配方和储存条件，产品的部分可能会重结晶，并在颗粒接触点之间形成桥接。并不总是容易将这种团聚体分散，有时甚至需要通过筛分进行分散步骤；当然，这将是另一个对控制要求的挑战； 水分冻结：容器中高水汽水平的环境中的水分可能会冷凝并导致松散团聚体的形成。由环境水汽形成的团聚体通常可以通过手动操作轻松解聚，或者在动态冷冻干燥过程中一旦施加颗粒运动，它们就会消失。 超过Tg’：如果储存温度对于配方过高且超过Tg’，分子流动性会使颗粒相互融合。 为了避免在无菌加工过程中出现这些现象，建议从喷雾冷冻到动态冷冻干燥开始时保持产品运动。当考虑制造物流和连续操作时，这一点具有特别的意义（另见3.0 喷雾冷冻干燥中的连续加工：需要考虑的方面）。  动态散装冷冻干燥中的静电现象 如果通过传统工艺以散装形式生产冷冻干燥材料，这主要是作为在静态条件下进行的冷冻干燥过程。通常，大量含有活性成分的溶液会被倒入托盘中。这些托盘被放置在搁板式冷冻干燥机中，产品以托盘形状的大块蛋糕形式进行干燥。如果要利用这种散装冷冻干燥材料的物流优势，产品必须被破碎或研磨。只有在完成粒度调整步骤后，这种材料才能被装入容器。这种低密度产品的研磨程序通常会产生大量的细粉，并且在无菌条件下难以进行。这种类型的研磨过程的控制是一个挑战，静电现象可能会干扰进一步的加工。  为了避免这种情况，自由流动且可分配的产品是首选。只有在干燥过程中移动产品时，这种散装产品的冷冻干燥才有可能。如果产品在固定层中静态干燥，由于热传递有限，这是不可能的。在这种动态系统中，颗粒之间的摩擦无法避免。由于主要和最常见的填充剂是糖，它们没有足够的导电性来消散静电荷，因此这种摩擦可能会产生静电荷。  静电荷是在处理散装产品时众所周知的现象，主要用于固体剂型技术。与这些应用相比，产品的密度远高于散装冷冻干燥，静电作用力被产品的重量抵消，或者通过使周围环境湿润来减少。如果仍然需要防止静电荷的产生，可以通过使用添加剂（如气相二氧化硅）或使用防静电电极来改变配方。  在动态冷冻干燥中，大多数静电荷现象出现在初级干燥的末期，此时水蒸气的比例减少。有一些配方（主要是含有聚乙二醇的）在过程的早期就会产生静电荷。在动态冷冻干燥中，可以通过在配方中使用更高的固体分数值来调整产品的密度，以减少静电荷的影响。与传统冷冻干燥相比，可以干燥固体干物质值约为40%的产品，显著降低了静电荷的风险。对于冷冻干燥产品，像在固体剂型技术中那样湿润环境并不是一个选项。冷冻干燥产品具有吸湿性，在二次干燥的末期，周围环境的湿度非常低。在这个过程中，可能会出现显著的静电荷。防静电电极是防止静电荷的可靠工具，但需要根据低真空和少量气体分子的操作条件进行调整，并且需要设计为能够进行蒸汽灭菌和原位清洗。  与静电学相关的配方方面 含有高蛋白质含量（约3%–10% w/w）的配方有更高的静电荷积累风险。改变填充剂与蛋白质的比例可以防止进一步积累静电荷。此外，观察到保守的干燥条件也可以防止静电荷的产生。保守的干燥条件意味着更低的滚筒温度、更高的旋转速度和更少的红外功率。因此，干燥时间会增加，但观察到由于没有静电荷的产生，过程效率提高了（见图15）。  图 15 不同干燥条件下产品行为，静电充电的影响 2.3.3 退火  2.3.3.1 退火的目标  在传统冷冻干燥中，热处理用于不同的原因。这种热处理有两个典型的目标，称为“退火”。第一个目标是确保填充剂完全结晶。像甘露醇或甘氨酸这样的填充剂的完全结晶很重要，因为非晶态物质可能会降低配方的Tg’值，导致在逐步冷冻干燥周期中发生微观塌陷。另一个潜在影响是长期储存稳定性，除非确保完全结晶的产品以及最终产品的高Tg值，否则会降低。完全结晶还将促进冰晶尺寸的增加，这些冰晶在升华过程中被去除，留下更大尺寸的孔隙，从而在复溶时获得更好的材料性能。  第二个常见目标是冰晶的生长，这些冰晶在升华时被去除，会在产品中留下更大的孔隙。这些更大的孔隙反过来会导致更低的干层阻力（Rp），从而在初级干燥期间允许更快的干燥速度。由于冰晶较大，成分的比表面积也会减少。成分比表面积的减少是主要含有蛋白质、抗体药物偶联物和肽的制药产品的目标。  2.3.3.2 退火过程  退火描述了一个过程，即产品在玻璃化转变温度Tg’以上10–20 K且低于共晶温度Teu（大多在-20...–25 °C之间）的温度下保持一定时间（2小时或更长时间）。根据产品的配方，退火温度要么在冷冻过程中直接设定，要么产品先完全冷冻，然后加热到退火温度。这两种程序都很常见。在一些应用中，会采用在Tg’以上和以下多次加热和冷却的曲线，以实现所需的产品特性。  首先进行完全冷冻作为第一步冷却通常更受青睐；然而，一些填充剂可能会在这个步骤中形成不稳定的玻璃态，导致它们在随后结晶时破坏结构。这种行为需要一个包括退火步骤的过程，而此时蛋糕仍处于柔韧状态。在玻璃化转变温度Tg’以上，冰部分熔化，其熔化速率与冰晶尺寸成反比。在退火样品重新冷冻后，这些大晶体作为再结晶的成核位点，抑制新小晶体的形成，从而形成一个以更大冰晶为特征的冷冻结构。  2.3.3.3 退火在制药应用中的相关性  许多制药产品是非晶态产品，这使得在冷冻干燥过程中通过将活性成分包裹在辅料的三维结构中更好地稳定API。由于配方的非晶态性质，实现更大冰晶及其相关效应的目标比增加结晶度更重要。如上所述，更大的冰晶会导致产品蛋糕的干层阻力降低。这允许在初级干燥期间更快的升华速率，并确保在逐步干燥周期中微观塌陷的风险更低，从而提高过程安全性。  更低的产品阻力将确保足够的水蒸气速度。如果这没有被产品阻力阻碍，产品冰前沿的温度将不太依赖于搁板温度，而高度依赖于良好控制的干燥压力。  退火过程后由于更大冰晶导致的比表面积减少，与近年来市场份额不断增长的含有蛋白质的配方有关。蛋白质倾向于在冷冻过程后存在的固体和冰界面等界面上降解。更大的比表面积会增加降解的风险，导致颗粒数量增加，并且可能会在根据产品规格进行测试时失败。 2.3.3.4 动态喷雾冷冻干燥中退火的相关性 喷雾冷冻产品的冰晶大小与冷冻速度相关。冷冻时间越短，冰晶越小。在喷雾冷冻过程中，颗粒在 1-2 秒内冻结，而传统冷冻干燥的冷冻时间范围为 1-6 小时。 低冷冻速率（约 0.5°C/min）对蛋白质不利，因为冷冻浓缩现象可能会影响蛋白质活性。像喷雾冷冻干燥这样的快速冷冻速度，在考虑冷冻浓缩风险时是有益的。快速冷冻速度会使产品中的冰晶变小。冰晶的大小与比表面积相关（冰晶越小，比表面积越大）。喷雾冷冻步骤本身会产生比传统冷冻产品具有显著更高比表面积的产品。这种快速冷冻速度在某些领域（如微生物和细胞的冷冻）肯定有优势，但可能会增加蛋白质降解的风险。将退火引入喷雾冷冻干燥循环可以克服由于小冰晶形成而导致高比表面积的任何担忧。 2.3.3.5 动态喷雾冷冻干燥中的退火程序 产品将在动态旋转冷冻干燥机中填充，温度显著低于 Tg'，并加热至所需的退火温度。装载温度应在产品 Tg' 以下 10-15 K 的范围内，这比传统冷冻干燥中使用的值稍低。配方的 Tg' 可通过差示扫描量热法测量，定义为最大冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度，超过该温度，分子的流动性显著增加。喷雾冷冻散装产品的流动性在 Tg' 以下得到保证，而在 Tg' 以上则趋于不流动。为了考虑流动性的降低，停止滚筒运动。如果继续以未修改的方式进行滚筒运动，产品可能会在工艺室内走不需要的路径，并可能意外地从滚筒出口离开，降低产量。因此，在动态冷冻干燥中，有必要在退火步骤期间停止或修改滚筒运动（例如，“点动”运动）。退火持续时间与传统冷冻干燥中的持续时间相似。为了在退火后恢复流动性，缓慢启动滚筒运动，并将设备中的真空度降低到更低的值，同时将滚筒夹套中的硅油温度调整到低于 Tg' 但足以引起升华的值（例如，-35...–40°C）。在适当选择退火温度的情况下，产品在 1-2 小时后可以恢复流动性。然后可以将滚筒旋转调整为正常旋转速度，并开始冷冻干燥循环。退火温度的上限应谨慎选择。在非常高的退火温度（约 -10°C）的情况下，产品的分子运动过高，无法再次恢复流动性。总之，退火温度的选择应足够高，以在合理的时间内引发有效的结构变化，但不能过高，以便在退火后再次实现流动性。 2.3.3.6 动态散装冷冻干燥中的进一步退火效应 众所周知，产品表面会吸附气体分子。这一原理用于分析中，通过确定吸附在产品表面上的单分子层中的气体分子数量来确定比表面积。通过知道一个分子所占的体积，可以计算出所需的分子数量，从而得出样品的表面积。喷雾冷冻干燥产品的比表面积通常高于传统冷冻干燥产品。因此，这些产品表面吸附的气体量更多。这些气体体积可能与降低表面张力的两亲分子结合产生影响。在复溶过程中，这些气体在溶剂中释放，可能会产生泡沫，这在护理人员准备复溶溶液之前可能是不希望看到的。传统冷冻干燥产品有时也会表现出这种行为。在这种情况下，西林瓶在冷冻干燥过程中以减压状态封闭，以减少冻干蛋糕表面上的气体量。此外，喷雾冷冻干燥产品是松散的散装物料，在生产物流方面提供了许多机会。然而，松散散装物料的快速复溶可能会因吸附的气体分子数量较多而受到阻碍，产品会在溶剂上漂浮，溶解速度缓慢。为了解决这一问题，可以采用与传统冷冻干燥中类似的技术，将产品装入西林瓶，并在封闭前施加减压，或者通过退火再次降低比表面积。 2.3.4 旋转冷冻干燥的放大 2.3.4.1 传统与旋转冷冻干燥放大比较 在开发、推出和生产加速过程中，产品需求的变化通过增加批次大小和批次数量来满足。通过考虑典型冷冻干燥设备列车中批次托盘干燥操作的一些挑战，可以预见喷雾冷冻干燥设备列车中干燥部分的挑战。比较这两种技术也有助于识别重要的差异和优势。批次托盘过程的放大通常考虑一些材料参数，如 Tg'，以及从单个西林瓶系统的角度来看的西林瓶热传递系数（Kv）和产品阻力（Rp）。随着托盘数量和托盘上西林瓶数量的增加，从之前的单个西林瓶——或仅仅几个西林瓶的工作中预测干燥循环变得更加困难。托盘装载对热传递有影响，因此，升华速率取决于西林瓶的位置。边缘西林瓶的条件可能与托盘中心的西林瓶显著不同。如果改变西林瓶中产品的填充高度，或者需要不同的冷冻干燥机，参数也会发生变化。在传统冷冻干燥中，可以通过多种技术估算单位操作参数的变化，这些技术使用额外的仪器和/或过程模型来正确计算较大冷冻干燥机中的参数和效应。旋转冷冻干燥机是一个动态系统。与典型的冻干蛋糕相比，颗粒的表面积较大，且其不断的运动可用于确保产品更一致地暴露于工艺条件。通过仔细选择工艺参数，可以按比例放大系统中的热传递。由于小颗粒与大蛋糕相比扩散长度较短，因此无需进行产品阻力计算。即使具有颗粒几何形状和运动的优势，也应进行一些理论预测，以选择在不同规模运行过程的第一组参数。例如：在配备旋转干燥机的喷雾冷冻干燥配置中，每种尺寸的旋转干燥机可以高效处理一定范围的产品负荷。超过特定干燥机的最大批次大小，需要使用下一个尺寸的干燥机。与托盘冷冻干燥类似，旋转冷冻干燥中的加工温度很重要。如果产品温度接近 Tg' 值，产品运动将减慢，因为颗粒之间的粘附力增加。在旋转冷冻干燥机的动态系统中，这种产品行为的变化可以很容易地被考虑进去。在循环仍在运行时，可以调整能量输入以降低输入量，产品将恢复正常的流动行为。这种观察和调整参数的能力，保持单次运行的批次质量，可用于加快对旋转冷冻干燥过程操作参数的理解。 2.3.4.2 在同一设备中改变产品负荷 散装冷冻干燥的放大是通过在旋转鼓内填充到更高水平来实现的，当批次大小在设备额定容量范围内时。这类似于传统冷冻干燥中的改变托盘装载或西林瓶填充。然而，在旋转冷冻干燥负荷变化中，预测托盘或西林瓶效应的挑战并不存在。在加工过程中，产品的运动确保了对工艺条件的均匀暴露。在旋转冷冻干燥中，填充操作是在产品处于干燥均匀状态之后进行的。因此，改变西林瓶填充只需对填充机进行简单调整以保持产品质量。在旋转冷冻干燥中，增加产品负荷后保持相同的参数将增加干燥时间。如果要保持相同的干燥时间，则需要进行参数调整，以确保过程时间和产品质量与原始规模一致。如果提高冷冻干燥机滚筒中的负荷，产品床的体积增加与表面积增加遵循不同的函数。与产品体积相比，将暴露较少的产品表面积。在散装冷冻干燥过程中，颗粒主要在产品床的表面上用于热传递和质量传递。通过增加滚筒速度，可以增加产品在床表面的暴露，以保持所需的干燥步骤时间。如果产品具有挑战性的流动特性，可以通过改变滚筒和挡板配置进行额外的修改。由较高旋转速度施加的机械应力，只要颗粒对磨损不过敏，就不会起作用。如果产品颗粒凝聚力较差，可能是由于低固体干物质或易碎成分（如结晶甘氨酸或甘露醇）等因素，那么选择在更温和的条件下接受更长的干燥时间可能是一个更好的选择。需要注意的是，仅仅为更高的产品负荷改变混合速度，并不会导致相同的干燥时间。需要进一步的热输入。在所有类型的干燥原理中，有三种热传递途径可供选择：对流、传导和辐射。在动态冷冻干燥中，大约三分之一的能量通过与干燥机壁的接触传导以及颗粒和蒸汽的运动对流提供，而大约三分之二的能量通过红外加热器的辐射提供。为了有效放大，每种热传递途径都必须与产品负荷成比例增加。通过传导和对流的热传递会自动跟随产品对滚筒的压力和暴露。随着床负荷的增加，更多的产品床与滚筒表面接触，简单的计算可以确定放大因子，通过稍微调整夹套内的硅油温度，在产品限制范围内调整整体传导热传递。最大的加热部分由红外（IR）加热器提供。根据产品负荷量成比例增加功率，以保持加工条件。需要注意的是，在低产品负荷下，由于随机反射，红外加热器的一些能量会丢失，这将需要对估计值进行小的修正因子。通过更快的旋转使产品暴露，可以利用更多的红外辐射来加热产品，为加热部分的放大或传导部分的限制补偿提供进一步的途径。 2.3.4.3 使用不同设备尺寸改变产品负荷 在改变干燥机尺寸以适应所需产品负荷的情况下，产品床的高度是一个重要的参数。改变设备规模并保持相同的产品床高度，参数如硅油温度和旋转速度可以保持不变。由于较大滚筒的周长较长，有时由于高线速度和对产品产生的剪切力以及产品磨损的可能性，无法保持相同的旋转速度。机械稳定的配方允许更高的速度，而机械稳定性较差的配方需要其他类型的调整以保持产品质量。在更大规模（例如，生产规模）中保持相同的产品床高度，将导致非常大的滚筒直径。例如，在试点规模中，对于大约 10 升的液体散装产品（转化为冷冻散装），产品填充了整个（理论）滚筒体积的约 12%。在为 100 升产品设计的生产规模中，如果保持相同的产品床高度，将仅使用 6% 的滚筒体积。即使从工艺角度来看，希望保持相同的产品床高度，也需要妥协，以减小滚筒直径，限制周长处的线速度，并减少在干燥机内部不必要的空间调节。产品床高度和滚筒几何形状之间的竞争因素要求在处理更大批次时，产品床高度需要在一定程度上增加，从而导致过程时间略有延长。参数之间的不同相互作用总结在表 1 中。 3 喷雾冷冻干燥中的连续加工：需要考虑的方面 制药技术和制造领域的创新重点是从批次到连续制造的转变。双方的利弊正在研究中，连续制造何时或如何应用于像片剂、颗粒或颗粒这样的成熟产品形式，已经讨论了数十年。喷雾冷冻干燥是一种颠覆性的新技术，它在产品和配方方面以及制造物流领域都开辟了新的机会。在制药技术领域，这种高水平的创新不仅提供了新的选择，而且也是一个重要的门槛，这通常阻碍了在高度受监管的环境中的实施。喷雾冷冻干燥的创新影响基于可用的均匀、自由流动和可计量的散装产品。只有这样，我们才能适应新的制造概念，如按需填充、剂量的灵活性以及填充剂量的数量。因此，当研究这项技术的影响时，处于考虑中心的主要任务是可用的中间散装容器（IBC），其中装有这种类型的冻干散装产品，该容器具有对接能力，可连接到填充线。目前，IBC 内的产品是通过批次还是连续过程生成的，这是一个次要问题。主要步骤，实际上是一个重大挑战，是引入这种具有冻干散装产品灵活性的产品处理方式。是否应该优先选择连续过程还是批次过程，取决于规模、技术影响和监管要求等因素。 正如 FDA 官员在 FDA 关于连续加工的研讨会上所说：“问题不是‘批次还是连续’。问题是：‘我们想要解决什么问题’”。然而，在讨论连续与批次加工时，喷雾冷冻干燥中有一些特定方面可以考虑。本质上，喷雾冷冻步骤的速度和总体设计是连续的，而冷冻干燥步骤的长度和成功执行的设计适应性最好由批次型操作来满足。喷雾冷冻步骤是在常压条件下进行的。冷冻干燥步骤是在真空条件下进行的，真空度低至 <50 μbar。因此，在连续操作中，冷冻产品需要从常压转移到所需的真空。由于这不是针对每个单独的冷冻球进行的，因此需要形成通过锁气系统传递的子单元。然而，新鲜喷雾冷冻散装物料的流动特性是有限的。如前所述，在喷雾冷冻过程中，通过从通常为 15°C 的“温暖”液滴中蒸发水分，在通常为 -130°C 的气体区域中形成非常细小的冰晶。在喷雾冷冻部分给出了更详细的背景。这些冰晶起到了一种流动抑制剂的作用，使得跨锁气器的连续传递在技术上相当具有挑战性。考虑的因素包括：密封座的长期稳健性与相关的真空密封性以及在传递机制中冰/产品结垢的积累。冰晶在初始冻干阶段被干燥掉，这引起了冷冻散装物料流动特性的一个显著变化。这种变化必须以适当的方式由所选择的技术来处理。所描述的现象也解释了为什么在冷冻干燥之前不推荐储存冷冻散装物料。即使在几小时后的静态储存，也可能导致松散团聚体的形成——这在动态冷冻干燥过程中不是问题。松散的团块很容易在动态冷冻干燥过程中分解成单个颗粒，从而实现均匀的干燥。从经过冷藏储存的中间散装容器（IBC）中喷雾冷冻物料的流动，容易被冰或团聚体堵塞，这将需要添加带有活动部件的流动辅助机制，而这些机制可能不太适合在无菌、无颗粒的环境中进行亲水性加工，用于生产无菌制剂。在连续操作模式下，也需要考虑这种现象。此外，根据所使用的干燥过程类型，连续操作模式对颗粒大小均匀性有更高的要求。对于干燥步骤，将是一个一次性过程，冷冻球的停留时间以及它们的形态必须保持一致，以确保均匀性。然而，颗粒大小的变化将导致不同的残余湿度；以 600 μm 的目标尺寸为例，±50 μm 的变化意味着一个 650 μm 的球体与一个 550 μm 的球体相比，体积多出 65%，表面积多出 40%。在类似的干燥条件下暴露可能导致湿度不均匀的结果。此外，一次性系统内的流动特性必须是不同大小的颗粒不会更快或更慢地流动，否则该过程将更加难以控制。另一个方面是喷雾液体的稳定性。除非液体制备过程是完全连续的，否则解冻后保质期有限的基质液体需要相应地进行处理，即，喷雾冷冻过程的规模必须是这样的，即材料在给定的时间内被喷雾冷冻。这可能需要比连续冷冻干燥步骤所需的更多的喷雾冷冻能力，从而导致规模不匹配，最终在连续加工中使用较小规模的潜在优势无法实现。鉴于上述喷雾冷冻散装物料的流动挑战，在冷冻干燥之前的中间储存不是一个选项。在开发过程中，早期开发阶段敏感生物分子的可用性有限，这是在考虑连续加工时的另一个方面，特别是当考虑到无菌加工要求与 PAT 实施的需要相结合时。尽管所有这些挑战都可以解决，但将喷雾冷冻干燥作为一种技术引入并将其简化为常规实践，将产生最快的显著价值。在这个技术阶段，引入并简化喷雾冷冻干燥到常规实践将产生最快的显著价值。在后期阶段应用连续制造的原则可以获得另一个价值提升。通过这种方法，喷雾冷冻干燥可以为制造商及其患者提供最有效的价值轨迹。 4 喷雾冷冻干燥的工业应用：集成到无菌工艺线 为了实现密闭和无菌加工，喷雾冷冻和动态冷冻干燥这两个工艺步骤可以结合成一个集成的、完全密闭的工艺线，如图 16 所示。 图 16 商业生产用喷雾冷冻干燥线的布置 在这里，喷雾冷冻塔位于动态旋转冷冻干燥机的顶部。预冷的滚筒接收在喷雾冷冻中使用的常压下冻结的球体。一旦所有液体都被喷雾冷冻，位于塔和干燥机之间转移部分的分离挡板关闭，真空被施加到干燥机部分，冻干步骤开始。干燥后，滚筒在真空下以密闭的方式排空到干燥机下方的中间料斗；只有在这里，真空才会被释放，产品被转移到中间散装容器（IBC）中。这种工艺线的设计用于蒸汽灭菌和就地清洗。作为一种设计选项，可以将一个喷雾冷冻塔与两个或多个动态散装冷冻干燥机结合在一起；由于冻干过程仍然比喷雾冷冻步骤需要更多时间，这可能会提高产量和整体效率。这种可蒸汽灭菌的工艺线的一个相关设计方面是，对于相当的产量水平，整个喷雾冷冻干燥线的重量仅为传统设计的托盘式冷冻干燥机的一半左右。这是因为在工艺中的所有压力容器都可以采用圆形设计，从而减少了所需的厚度和重量。这反过来又节省了能源和加热/冷却时间。如图所示的 100 升生产线的清洗（CIP）、蒸汽灭菌（SIP）和冷却需求大约需要 5-6 小时。与此同时，很明显，高度要求是基于垂直产品处理概念和前面概述的喷雾冷冻液滴的物理要求。使用重力作为免费的产品处理工具的优点是，对于产品处理不需要特定的设备安装，以及相关的验证、清洁和灭菌要求。喷雾冷冻干燥工艺线的高度和空间要求主要限于未分类的非 GMP 技术区域，或者是不需要开放产品处理的区域，这在技术安装和持续验证需求方面都有显著的减少。在这种生产线中的加工是连续以批次模式进行的，喷雾冷冻步骤在常压下进行，直到所有液体都被冷冻成微球，这些微球被收集在冷滚筒中。然后，冷冻室和干燥机之间的分离挡板关闭，干燥机室被抽真空，冷冻干燥开始。干燥后，产品被排放到中间容器中，设备被排放到常压，然后开始向中间散装容器（IBC）排放。在进一步的安排中，为了通过减少闲置时间来提高产量，一个冷冻室可以连接到两个或多个冷冻干燥机，这样提高了两个工艺步骤的利用率，并实现了准连续操作。在这种设计点为 100 升（液体）的生产线中，所获得的产量通常超过 95%。事实证明，设计和影响混合特性的工艺参数决定了产量，特别是对于固体含量低且 Tg' 低的配方。所展示的生产线在典型的冷冻干燥配方（蔗糖/盐/缓冲液/表面活性剂；Tg' 低于 -37°C）以及纯蔗糖（20% 固体干物质）的情况下，产量超过了 97%。最初，在 15% 的溶液和 Tg' 低于 -35°C 的情况下，在相当的工艺条件下，获得了显著的产品损失。在过程中发生的流化现象导致产品在该批次中离开了滚筒。通过优化滚筒设计和工艺条件，能够使用相同的配方实现超过 97% 的产量。 5 总结 大气喷雾冷冻随后进行动态旋转冷冻干燥已经发展成为一项成熟的技术，正在进行工业规模的实施。从实验室到生产规模的信息被呈现出来，以使用基于质量设计的原则，结合工程计算以及建模和模拟，来设计产品、工艺和放大。与传统的填充和托盘干燥冷冻干燥相比，这项技术提供了许多优势和效率。这种新的生产冻干产品的方式开辟了许多产品创新机会，并有可能通过供应链改善处理和灵活性。未来，使用大气喷雾冷冻干燥技术进行新应用和扩展到连续制造的机会众多。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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