Dofetilide

Theranostics · 全文中文翻译 斑马鱼幼鱼搏动心脏中钙信号与收缩的同步成像 Jussep Salgado-Almario、Manuel Vicente、Yillcer Molina、Antonio Martinez-Sielva、Pierre Vincent、Beatriz Domingo、Juan Llopis 西班牙卡斯蒂利亚-拉曼查大学阿尔瓦塞特医学院 · 生物医学区域研究中心（CRIB）巴黎第一大学（Sorbonne Université）CNRS UMR 8256 生物适应与衰老研究所 Theranostics. 2022;12(3):1012–1029　|　doi:10.7150/thno.64734收稿 2021-07-08　接收 2021-11-22　出版 2022-01-01　|　© The author(s). 开放获取（CC BY 4.0） ◆ 一句话读懂 ◆ 要在「跳动的心脏」里同时测钙和收缩，传统办法是先把心停掉——但心脏一停，运动伪影没了，机械-电反馈、正常发育和离子表达也全丢了。本文的做法很巧：换用比率型（FRET）钙传感器 Twitch-4，因为「比值」天然抵消运动、放大钙——心脏照跳不误，钙信号照读不误。再配一个自写程序自动从图像里量心室直径，就能在同一个时间轴上把钙与收缩对齐，画出一条条「钙-收缩相图」，直接看出药理作用与心律失常的机制。 ◆ 核心要点 ①核心创新：建立 Tg(myl7:Twitch-4) 转基因斑马鱼品系，在心肌细胞中表达基于 FRET 的比率型钙传感器 Twitch-4。无需用肌球蛋白抑制剂或 tnnt2a 吗啡啉把心脏停掉，即可在搏动心脏中读钙。 ②运动伪影被比值抵消：构建了对照品系 Tg(myl7:ECFP-16aa-EYFP)（无钙结合域的 FRET 构造），其荧光波动全部来自运动。实测：3 dpf 幼鱼中心房部位的运动贡献占 Twitch-4 比值方差的 18%，心室仅 2.3%——心室中特异信号占绝对主导，自发荧光可忽略。且用肌球蛋白抑制剂 para-amino blebbistatin 停跳的心脏，其 Twitch-4 比值变化与搏动心脏完全一致。 ③传感器本身「无害」：3 与 5 dpf 的 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼，其心室分数缩短率（FS）、面积变化率（FAC）、心室舒张/收缩末面积、心率均与不表达 Twitch-4 的同窝无差异——排除了传感器作为外源钙缓冲的干扰。 ④发育阶段差异：5 dpf 相比 3 dpf，钙水平与钙瞬变振幅更大、心率更快、上升与衰减时间更短，但分数缩短率不变（3 dpf 25.9 ± 3.9%，5 dpf 25.3 ± 4.3%）。独立方法 GFP-Aequorin 生物发光验证了 5 dpf 心室钙水平更高。 ⑤同步测量钙与收缩：用同一批 FRET 通道图像自动追踪心室壁位移生成时空图（kymogram），得到连续的心室直径与 FS。5 dpf 时「收缩峰值 Ca²⁺ → 最大 FS」的延迟显著长于 3 dpf（44 ± 15 ms vs 17 ± 6 ms，p < 0.0001）；5 dpf 的「钙-收缩相图」迟滞更大、斜率更小。 ⑥药理验证：L 型钙通道阻断剂硝苯地平使钙水平、心率与收缩力全降（FS 仅为基线的 35% 与 40%）；激动剂 Bay K8644 反向升高钙与收缩；咖啡因（3 mM）引起心动过缓、舒张期钙水平大幅下降、钙瞬变振幅增大，并在部分幼鱼中诱发逸搏心律（房室传导方向改变，甚至心室先于心房激动）——提示窦房结起搏失效。 ⑦方法学附加价值：作者自写的 IGOR Pro 分析程序 「Ratioscope 8.31」（含 Pulse 模块）已公开（DOI: 10.25493/5G5V-HBC），可自动完成比值计算、ROI 加权、Ca²⁺ 瞬变动力学参数提取与心室直径追踪——可直接用于心脏毒性筛查与心律失常机制研究。 一、引言：为什么要在「会跳的心脏」里测钙 在心脏中，电兴奋触发 L 型电压依赖性钙通道（LTCC） 引起的 Ca²⁺ 内流（ICa,L）。这一内流又通过雷诺丁受体（RyR）诱发肌浆网（SR）释放 Ca²⁺。Ca²⁺ 与肌丝结合导致收缩期收缩与射血。Ca²⁺ 瞬变的幅度与持续时间受通道、转运体与众多调控蛋白高度精细地控制，决定了收缩强度与整体心脏功能。此外，肾上腺素能输入可提升心率并增强肌原纤维对 Ca²⁺ 的反应；血容量与外周阻力等系统因素（前负荷与后负荷）同样影响心输出量。 心脏中的 Ca²⁺ 失调参与遗传性与获得性心律失常的发病机制。在心力衰竭中，肌细胞 Ca²⁺ 处理失常可通过多种机制发生：SR Ca²⁺ ATP 酶（SERCA）摄取减少、SR Ca²⁺ 漏增加、Na⁺/Ca²⁺ 交换体（NCX1）活性升高——这些都会降低 SR Ca²⁺ 储备量；或因「孤儿」RyR 而失去同步性。这些失衡的共同后果是Ca²⁺ 瞬变减弱与收缩功能障碍。作为治疗充血性心力衰竭的手段，Ca²⁺ 增敏剂（相对于 Ca²⁺ 动员剂）有时其作用会超出正性肌力作用，还可在其他器官上带来对患者有益的额外效应。研究 Ca²⁺ 水平与收缩力之间相互关系，是评价心脏收缩功能障碍、储备容量与治疗效率的关键。而舒张与心室充盈又取决于 Ca²⁺ 衰减速率、肌丝对 Ca²⁺ 的敏感性、心室壁的被动力学性质以及房室压力差。因此，舒张期和/或静息 Ca²⁺ 调控的改变，被认为是射血分数保留型心衰（舒张功能障碍）的重要因素。然而，关于决定舒张末期 Ca²⁺ 的机制，人们知之甚少——因为多数测量 Ca²⁺ 的方法依赖于收缩期相对于舒张期的荧光变化。另一个原因是，许多研究在人为偏低的起搏频率下进行，此时只有肌膜通量影响舒张期与静息 Ca²⁺。 鉴于 Ca²⁺ 在心脏中的关键作用，多数研究（主要在分离心肌细胞中开展）已对生理状态下的 Ca²⁺ 处理机制给出细致认识。在体模型无法以同等精度研究细胞机制，但保留了心肌细胞与心脏中其他细胞类型之间的相互作用，维持其旁分泌调控；它们还保留了心脏与循环系统及其他器官的联系，允许测量射血分数、每搏输出量与心输出量等心脏终点指标。因此，在体心功能模型与分离灌流器官、单细胞研究是互补的。 尽管斑马鱼与人类形态差异明显，斑马鱼的胚胎、幼鱼与成体仍被广泛用作心脏病学的在体动物模型。在这一小型脊椎动物中开展发育、病理生理、药物筛选或毒理学研究是可行的，构成对哺乳动物模型的有吸引力的替代方案，并有助于减少研究中哺乳动物的使用。斑马鱼与人心率相近，尤其是 QT 间期相似。斑马鱼心室动作电位同样具有长的平台期，人类参与动作电位的许多通道在斑马鱼中也都存在，尤其是在复极过程方面。然而，斑马鱼与人的兴奋-收缩偶联也存在差异：成年斑马鱼心肌细胞中 SR 释放 Ca²⁺ 对收缩的贡献仍有争议——由于其 ICa,L 电流密度被发现约为猪或人心肌细胞的 5 倍，SR 对 Ca²⁺ 瞬变的贡献很可能小于哺乳动物；另一项研究则发现动作电位诱发的 Ca²⁺ 瞬变中仅 20% 由 SR 释放介导；但在成年斑马鱼心脏切片中的一项研究发现 SR Ca²⁺ 释放在产生力中起实质作用（52% 至 54%）。为克服鱼模型与人类之间的这些差异，已有研究提出将斑马鱼「人源化」的做法。 许多心肌病与心律失常具有遗传学基础。斑马鱼基因组与人类有 70% 相似度，且易于应用基因编辑技术。因此斑马鱼是检验在体疾病候选基因、揭示基因型与表型联系的合适模型（例如 GWAS 之后的功能研究）。斑马鱼中阐明的若干病理生理机制已在人多能干细胞来源的心肌细胞中得到证实。此外，心血管毒性是药物研发过程中药物淘汰与临床阶段撤市的重要原因。斑马鱼因适于高通量筛选而被提议用于早期药物发现与心脏毒性研究；一项研究发现，斑马鱼幼鱼对人类心血管毒性的预测能力优于细胞系统。 斑马鱼还有一个优势：心脏发育迅速，而幼鱼此时仍然透明，因而特别适合用光学探针成像心脏功能。已有多项研究在生理条件与病理建模下对心脏采用非侵入性 Ca²⁺ 成像技术，方法是表达基因编码的钙指示器（GECI），如单荧光蛋白 GCaMP 系列，并已成功用于胚胎心脏的 Ca²⁺ 动态成像。虽然 GCaMP 成像技术上简单，但其测量对运动极为敏感，因此必须使用针对肌球蛋白 II 的吗啡啉反义寡核苷肽来停止心脏搏动。然而，由于吗啡啉会在细胞内被降解，这就把成像时间限制在受精后 3 或 4 天（dpf）——此后心脏会重新开始跳动。另一种选择是使用 blebbistatin 等肌球蛋白 II 抑制剂来解耦收缩与 Ca²⁺ 瞬变，但该方法也有局限：光敏性与降解问题。 重要的是，抑制收缩会妨碍上述机械参数的研究，并可能影响心脏生理与发育。我们由此推断：比率型 Ca²⁺ 生物传感器同时采集两个波段，可以评估运动中心脏的 Ca²⁺ 水平——因为比值能抵消两幅图像中「共有」的部分（运动），同时保留「相异」的部分（Ca²⁺）。此外，这种方法还允许在心动周期中把 Ca²⁺ 水平与运动、收缩相关联，同时保留机械-电反馈、正常发育与离子表达。在更早的一篇报道中，我们已在斑马鱼幼鱼心脏的瞬时表达实验中筛选了多种不同亲和力与动力学特性的比率型 Ca²⁺ 传感器。其中 Twitch-4（一种源自海蟾蜍（Opsanus tau）肌钙蛋白 C 的生物传感器）提供了心动周期中最大的比值变化与良好的信噪比。本工作中，我们建立了转基因品系 Tg(myl7:Twitch-4)，用以在搏动心脏中刻画 Ca²⁺ 瞬变与收缩，并通过在两个发育阶段（3 与 5 dpf）测试已知作用于心脏的药物来验证该模型。 二、方法 斑马鱼饲养与品系构建 斑马鱼饲养于阿尔瓦塞特医学院动物实验中心，光暗周期 14/10 小时。受精卵按标准方法获取，置于 E3 培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM MgSO₄、0.33 mM CaCl₂，pH 7.4，双蒸水配制）中于 28.5 °C 培养。E3 中不添加亚甲基蓝以降低幼鱼自发荧光。全部动物操作符合国家与欧盟法规（批准文件日期 2020 年 3 月 16 日，西班牙卡斯蒂利亚-拉曼查自治区农业、水利与农村发展局）。 Ca²⁺ 传感器 Twitch-4 与不结合钙的 FRET 构造 ECFP-16aa-EYFP（由 ECFP 与 EYFP 经 16 个氨基酸的柔性连接肽相连）被克隆入 pT2A-Tol2-myl7 转座子载体。构建稳定转基因品系时，将 pTol2-myl7:Twitch-4 或 pTol2-myl7:ECFP-16aa-EYFP 的 cDNA 与转座酶 mRNA（各 12.5 ng/µL）混合注入单细胞期野生型 AB 胚胎。转座酶 mRNA 由 pCS-zT2TP 载体经 ApaⅠ 线性化后用 mMESSAGE mMACHINE SP6 试剂盒体外转录制备。注射胚胎（F0）按心脏荧光筛选并养至成体；成体 F0 与野生型 AB 杂交，依据 F1 后代的心脏荧光鉴定生殖系插入的创始鱼。Tg(myl7:Twitch-4) 品系经 F1 荧光鱼与野生型杂交、F2 胚胎表达 Twitch-4 并养至成体后互交产生 F3；F3 成体 Tg(myl7:Twitch-4) 与透明品系 Casper（roy−/−; nacre−/−）杂交获得 F4 胚胎。成像使用 F1 Tg(myl7:ECFP-16aa-EYFP) 与 F4 Tg(myl7:Twitch-4) 杂合幼鱼。 显微成像与数据采集 装片：不用麻醉，将幼鱼包埋于 100 µL 0.3% 低熔点琼脂糖（E3 配制，预热至 42 °C）中，在 96 孔方形孔平底透明板（ibidi，德国）中每孔一条幼鱼凝固。3 dpf 幼鱼腹侧朝下、5 dpf 幼鱼右侧朝下装片，以在两个阶段都更好地显示心房与心室。凝固后加入 100 µL 28 °C 的 E3 培养基。装片后幼鱼在显微镜载物台上于 28 °C 孵育 30 分钟以获得稳定心率。必要时，幼鱼在装片前用 75 µM 肌球蛋白抑制剂 para-amino blebbistatin 处理 2 小时。 比率型荧光成像：使用配备 sCMOS 相机（2048 × 2048 像素，ORCA-Flash 4.0，滨松光子）的宽场荧光显微镜（DMIRE-2，徕卡），由 Aquacosmos 2.6 软件控制。成像速率为 50 Hz（每幅 20 ms 积分），持续 5–10 秒，部分幼鱼以 100 Hz 成像。显微镜载物台上的幼鱼置于 28 °C 恒温培养箱（PeCon GmbH，德国）中。激发光源为 LED（Sutter Instrument），配合 440AF21 nm 带通滤光片（Chroma）与 455DLRP 分光镜（Omega Optical），连续照明 5–10 秒；物镜为 10× 空气镜头（HC PlanApo 0.45 NA）。供体（CFP）与受体（FRET）图像通过分像器（W-View Gemini，滨松光子）同时采集，分像器将相机视野分为分别对应供体与受体发射的两半；发射光经 509-FDi01 分光镜（Semrock）与 483/32 nm、542/27 nm 发射滤光片分离。图像以 16 位、2 × 2 binning 采集，最终分辨率 1.45 μm × 1.45 μm/像素。FRET 图像对应供体激发（440AF21 nm）下的 cpCitrine174 或 EYFP 发射（542/27 nm），供体图像对应同一激发下的 ECFP 发射（483/32 nm）。 药物处理 硝苯地平（Sigma-Aldrich N7634）、(±)-Bay K8644（Tocris 1544）与雷诺丁（Tocris 1329）母液以二甲基亚砜配制，浓度分别为 10、20 与 25 mM；咖啡因（Sigma-Aldrich N7634）以水配制，浓度 50 mM。母液用 28 °C 的 E3 稀释。记录基线图像后，向孔中加入 100 µL 药物，终浓度为硝苯地平、(±)-Bay K 8644 与雷诺丁各 100 µM，咖啡因 3 mM，随后按图示时间重新记录图像。 图像处理与数据分析 比率图像与比值数据由作者在 IGOR Pro 环境中编写的分析程序（Ratioscope）处理与分析。首先校正 FRET 与供体图像之间的像素位移，再对每个时间点逐像素计算 FRET 图像/供体图像的比值。在舒张期的心房与心室壁上绘制 ROI；ROI 的比值按供体与 FRET 通道的平均荧光强度加权计算所有像素值的平均。由于接近背景的像素比值可趋于无穷，比值小于最小显示比值/4 或大于最大显示比值 × 4 的像素被截断。必要时使用 Savitzky–Golay 平滑滤波降低原始比值轨迹的噪声。 自动提取的动力学参数包括：舒张期比值（心动周期中最低比值）、收缩期比值（最高比值）、比值振幅（ΔR = 收缩期比值 − 舒张期比值）、心率（HR，bpm）、上升时间（收缩期 Ca²⁺ 上升 10% 至 90% 的时间）、衰减时间（舒张期 Ca²⁺ 衰减 90% 至 10% 的时间）、上升斜率（10% 至 90% 值的 ΔR 除以上升时间）与衰减斜率（90% 至 10% 值的 ΔR 除以衰减时间）。Ca²⁺ 瞬变与图 1F 所示的观察点由 Igor Pro 提供的边缘检测功能自动识别，并在定制的分析模块（Ratioscope 包中的「Pulse」模块）中实现。每条幼鱼的数据代表 5 或 10 秒连续记录中所有心动周期的平均。 为监测 Tg(myl7:Twitch-4) 的收缩参数，作者另在 IGOR Pro 中编写了自动检测收缩事件并记录心动周期中心室直径变化的分析程序。在荧光图像中沿心室画一条直线以追踪壁的移动，心室壁的位移以时空图（kymogram）表示。分数缩短率（FS）定义为舒张末期与收缩末期直径之差除以舒张末期直径。由于内壁对比度不足，测量心室直径时采用外壁。用于计算上述全部测量的 IGOR Pro 程序以「Ratioscope 8.31」公开于数据存储库（DOI: 10.25493/5G5V-HBC）。透射光图像则按既往描述在 ImageJ 中手动分析，计算 FS、面积变化率（FAC）与 HR。FAC 定义为舒张末期与收缩末期面积之差除以舒张末期面积。 GCaMP 荧光成像（对照方法）：Tg(myl7:GCaMP)s878 成体斑马鱼与野生型杂交，1 细胞期胚胎注射 2 ng tnnt2a 吗啡啉反义寡核苷（5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACA CGCA-3′）。受精后 24 小时（hpf）起的胚胎置于 0.003% N-苯基硫脲中以防止色素沉着。幼鱼包埋于 1% 低熔点琼脂糖并转移至 8 孔玻璃底板（ibidi）。荧光图像以 200 Hz 在 CSU X1 旋转盘共聚焦显微镜（蔡司）上采集，配 Hamamatsu ORCA Flash4.0 sCMOS 相机，16 位、2 × 2 binning。分析时在心房与心室绘制 ROI 取平均强度值，应用平滑因子 0.7 的指数加权移动平均平滑，数据转换为 ΔF/F₀ = (Ft − F₀)/F₀，其中 Ft 为给定时间的荧光，F₀ 为最小舒张期荧光值。Ca²⁺ 瞬变特征用 Clampfit 10.7 分析以确定 10%–90% 上升时间与 90%–10% 衰减时间。 心脏生物发光：使用 Tg(myl7:GFP-Aequorin) 品系，以既往描述的发光法比较 3 与 5 dpf 幼鱼的平均 Ca²⁺。共聚焦显微镜：3 dpf 的 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼在 0.3% MS-222 中孵育 5 分钟处死，按比率成像相同方式包埋于琼脂糖，用倒置式 Axio Observer LSM710 共聚焦显微镜（蔡司，PlanApo 20×/0.8 NA）成像，激光激发 488 nm，发射带宽 520–560 nm。 统计学：使用 GraphPad Prism 8 与 Igor Pro 完成。独立实验数（实验天数，N）与幼鱼数（n）在各图中标注。用 Shapiro-Wilk 检验正态性。两组间比较：参数数据用非配对 Student t 检验，非参数数据用 Mann-Whitney 检验。实验组间比较：参数数据用单因素重复测量 ANOVA 附 Dunnett 事后多重比较，非参数数据用 Friedman 检验附 Dunn 事后多重比较。数据以均值 ± SD 表示。p < 0.05 视为具有统计学意义，显著性以 * 表示 p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，ns 表示 p > 0.05。补充数据 1 文件给出全文统计学分析的细节。 三、结果 1. 建立斑马鱼心脏中表达 Twitch-4 的转基因品系 比率型 Ca²⁺ 传感器 Twitch-4 属于以海蟾蜍（Opsanus tau）肌钙蛋白 C 的 C 端结构域作为 Ca²⁺ 结合域的 GECI 家族，其体外测定的 Kd 为 2.8 µM，衰减时间常数为 0.5 秒。它在 N 端含有荧光蛋白 ECFP 作为 FRET 供体，在 C 端含有 cpCitrine174（一种 YFP）作为 FRET 受体（图 1A）。我们生成了在 myl7 启动子控制下表达 Twitch-4 的转基因斑马鱼品系 Tg(myl7:Twitch-4)。该启动子驱动心肌细胞（心房、心室与房室管）中的特异表达，不包含心内膜与心外膜细胞。表达 Twitch-4 的鱼发育正常，胚胎自 24 hpf 起出现特异的心脏荧光。由于心室壁更厚，心室的荧光强于心房（图 1B）。3 dpf 幼鱼腹侧朝下、5 dpf 幼鱼右侧朝下装片，以使心房与心室处于同一平面。3 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼的共聚焦成像证实了生物传感器预期的胞质定位（图 1C）。 化学 Ca²⁺ 指示剂与 GECI 可作为外源缓冲剂，潜在改变 Ca²⁺ 动态与下游事件。因此我们检验了 Twitch-4 的表达是否影响斑马鱼幼鱼心脏的某些功能参数。心室分数缩短率（FS）与面积变化率（FAC）代表收缩期心室直径与面积的相对变化（定义见方法）。用透射光测得的 3 与 5 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼的 FS 与 FAC，与不表达该蛋白的同窝相似（图 S2A）。此外，我们发现心室舒张末期与收缩末期面积（图 S2B）以及心率（HR，图 S2C）均无差异。因此，Twitch-4 在斑马鱼胚胎心脏中的表达似乎并未影响心脏收缩性、心脏大小或心率。 图 1 | 在 Tg(myl7:Twitch-4) 斑马鱼幼鱼的搏动心脏中对 Ca²⁺ 动态的在体记录。 a Ca²⁺ 传感器 Twitch-4 的结构示意及其作用原理（FRET，Förster 共振能量转移）。 b 3 与 5 dpf 幼鱼透射光与荧光图像的叠加，显示装片后心脏的腹侧与侧面取向（At—心房，Vt—心室）。比例尺 100 μm。 c 3 dpf 幼鱼的共聚焦图像，显示 Twitch-4 在心肌细胞中的胞质定位。比例尺 50 μm。 d 3 dpf 幼鱼心脏处于心室收缩期时的供体与 FRET 通道荧光强度图像。在心房与心室上手工绘制 ROI（感兴趣区），并在每个时间点获取其平均像素值。轨迹显示供体与 FRET 通道荧光强度的时间过程。 e 3 dpf 幼鱼心房收缩期与心室收缩期的发射比值图像（FRET 图像/供体图像）伪彩色图。标定方格表示以 μm 为单位的距离，色相编码发射比值，亮度编码荧光强度。轨迹显示随时间变化的心房与心室 Ca²⁺ 水平（发射比值）。 f 由比值时间过程数据计算的动力学参数（定义见方法）。 2. 搏动心脏中的比率型 Ca²⁺ 成像可校正运动伪影 为确定 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼中观察到的比值变化是否确实反映心脏 Ca²⁺ 波动，以及受心脏运动影响的程度，我们生成了一个在心脏中表达不含 Ca²⁺ 结合域的 FRET 构造的转基因斑马鱼品系（ECFP 与 EYFP 由 16 个氨基酸残基的柔性连接肽相连）。在 Tg(myl7:ECFP-16aa-EYFP) 中，所有荧光波动都必然完全来自运动，因此该伪影应在发射比值中被抵消。我们观察到 Tg(myl7:ECFP-16aa-EYFP) 相比 Tg(myl7:Twitch-4) 只呈现幅度很小的周期性比值变化（图 2A–B），且该变化源于心脏下方的卵黄自发荧光（图 S3），主要影响较暗的心房。我们比较了两种构造的发射比值方差，以估计运动对所记录比值的贡献：3 dpf 幼鱼中，ECFP-16aa-EYFP 的发射比值方差为 Twitch-4 方差的 18%（心房）与 2.3%（心室）（ECFP-16aa-EYFP：n = 9 条幼鱼，N = 2 次实验；Twitch-4：n = 9，N = 4）。因此，运动影响了心房，却几乎不影响心室的 Twitch-4 发射比值——心室中特异的 Twitch-4 荧光占主导，自发荧光可忽略。 由于 5 dpf 胚胎的卵黄囊更小且不与心脏重叠，运动效应理应减弱。又因卵黄自发荧光在空间上并不均一（图 S3），在 Twitch-4 成像中未做减除。作为上述论断的支持，搏动心脏与用肌球蛋白抑制剂 para-amino blebbistatin 停跳的心脏之间，Twitch-4 比值变化没有差异（图 2A–B）。我们还把搏动心脏中 Twitch-4 比值变化的动力学与用 tnnt2a 吗啡啉停跳心脏中强度型 GECI GCaMP 的结果做了比较（图 2C）：在心率匹配的幼鱼中，两种生物传感器在心房与心室测得的上升时间与衰减时间相似，Ca²⁺ 瞬变的形状也相似。结论是：基于 Twitch-4 的比率测量在很大程度上校正了运动伪影，反映了搏动心脏中 Ca²⁺ 水平的变化。 图 2 | Tg(myl7:Twitch-4) 报告心脏 Ca²⁺ 振荡并在 3 dpf 幼鱼中校正运动伪影。 a Tg(myl7:ECFP-16aa-EYFP) 与 Tg(myl7:Twitch-4) 搏动心脏，以及用 75 µM para-amino blebbistatin（PAB）停跳的 Tg(myl7:Twitch-4) 心脏的发射比值图像（代表性实验）。图中示出心房（At）与心室（Vt）收缩期。 b 由 a 中幼鱼计算得到的随时间变化的归一化发射比值轨迹（R/RDiast）。以每条记录中最低的舒张期比值（RDiast）作归一化。 c Tg(myl7:GCaMP)s878 不收缩心脏（tnnt2a 吗啡啉）与 Tg(myl7:Twitch-4) 搏动心脏的代表性心房与心室 Ca²⁺ 瞬变。图中示出心房与心室 Ca²⁺ 瞬变的上升与衰减时间（Tg(myl7:GCaMP)s878：n = 9 条幼鱼，N = 2 次实验；Tg(myl7:Twitch-4)：n = 7，N = 5）。数据以均值 ± SD 表示，采用双尾非配对 Student t 检验。 3. 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼的基础心脏 Ca²⁺ 动力学特征 我们用 Tg(myl7:Twitch-4) 品系刻画两个发育阶段（3 与 5 dpf）的心脏 Ca²⁺ 动力学。5 dpf 的比值水平与振幅均高于 3 dpf（图 3A、3B 与影片 S1），提示心脏 Ca²⁺ 水平存在差异。我们尝试用离子霉素（高 Ca²⁺ 的 E3 培养基）或 EGTA（零 Ca²⁺）孵育幼鱼，将发射比值标定为胞内游离 Ca²⁺ 浓度，但结果并不确定，可能是离子载体未能完全到达心肌细胞膜。尽管如此，由于 Twitch-4 的发射比值与 Ca²⁺ 水平成正比，我们的结果提示 5 dpf 的心脏 Ca²⁺ 水平有所升高。这一结论用独立方法得到确认：在我们构建的 Tg(myl7:GA) 斑马鱼品系中，用生物发光钙指示剂 GFP-Aequorin 测得 L/Lmax 值（与 Ca²⁺ 水平成正比）在 5 dpf 幼鱼心室中高于 3 dpf（图 3C）。 电兴奋起始于窦房结并传播至心室，中间存在延迟以允许心房与心室交替收缩与舒张，从而使心室得以充盈。这种不同步在心房与心室的 Ca²⁺ 变化中也可观察到（图 3B 与影片 S1）。我们用李萨如（Lissajous）图将心室与心房 Ca²⁺ 相关联（图 3D）：当心房 Ca²⁺ 水平升高时，心室 Ca²⁺ 水平下降，反之亦然；心室 Ca²⁺ 达峰后，两个腔室的水平同时短暂下降，在环上表现出迟滞（hysteresis）。图 3E 展示了 3 与 5 dpf 幼鱼在一个心动周期中的这些环。相邻箭头尖端间距为 20 ms（每个箭头代表一幅图像），指示时间方向与各阶段的相对速度。就 Ca²⁺ 瞬变的动力学参数而言，5 dpf 的振幅更大、心率更快、上升与衰减时间更短（图 3E–F）。在两个发育阶段，心房上升时间均短于衰减时间，而在心室两者相当，这与既往报道一致。 图 3 | 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼的基础心脏 Ca²⁺ 动力学。 a 代表性 3 与 5 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼心房收缩期与心室收缩期的发射比值图像。 b 由 a 中幼鱼计算得到的心房与心室 Ca²⁺ 水平（发射比值）随时间的变化。 c 用发光法测量的 3 dpf（n = 22，N = 8）与 5 dpf（n = 13，N = 5）Tg(myl7:GFP-Aequorin) 幼鱼的心室 Ca²⁺ 水平（L/Lmax）。 d b 中 3 dpf 幼鱼轨迹的多个心动周期中心室 Ca²⁺ 对心房 Ca²⁺ 的李萨如图。箭头指示心动周期的各阶段。 e b 中 3 与 5 dpf 幼鱼（一个心动周期）心室 Ca²⁺ 对心房 Ca²⁺ 水平的关系图。环上相邻箭头尖端间距为 20 ms，显示时间方向与各阶段的相对速度。 f 从 3 dpf（n = 100，N = 12）与 5 dpf（n = 68，N = 7）Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼心房与心室 Ca²⁺ 轨迹中提取的动力学参数（参数定义见方法）。统计学分析见补充数据 1。数据以均值 ± SD 表示（*** p < 0.001，**** p < 0.0001）。 4. 心脏 Ca²⁺ 水平与收缩功能的同时测量 由于 Tg(myl7:Twitch-4) 的比率成像是在搏动心脏上进行的，我们同时测量了心室 Ca²⁺、心室直径与 FS（作为收缩力的替代指标）。用于测量 Ca²⁺ 的同一批 FRET 通道图像，也被用于连续监测心室形状的变化。为此我们编写了分析程序，在荧光图像中自动追踪心室壁以构建时空图并获得随时间变化的直径（见方法）。由此我们得到了心室直径的连续记录（图 S1），从而可连续计算 FS（图 4A、4C）。符合预期，5 dpf 幼鱼的舒张末期与收缩末期直径大于 3 dpf，但 FS 无统计学差异（3 dpf 为 25.9 ± 3.9%，5 dpf 为 25.3 ± 4.3%；图 4B）。 把 Ca²⁺ 与 FS 随时间叠加绘制显示，Ca²⁺ 上升之后紧接着出现收缩，中间有一个短暂延迟（图 4C）。「收缩期 Ca²⁺ 峰值」与「最大 FS」之间的间隔在 5 dpf 显著长于 3 dpf（5 dpf 为 44 ± 15 ms，3 dpf 为 17 ± 6 ms，均值 ± SD，p < 0.0001，图像以 100 Hz 采集）。不过由于 Twitch-4 自身的动力学特性，这些数值存在一定不确定性（见讨论）。绘制 FS 对 Ca²⁺ 的曲线（Ca²⁺-收缩曲线）显示出一个环，含收缩支与舒张支（图 4D）。Ca²⁺ 上升与心脏缩短之间的延迟导致 5 dpf 的这些环具有更大的迟滞；此外，收缩-Ca²⁺ 环的斜率在 5 dpf 更低，提示要获得同样的 FS 需要更大的 Ca²⁺ 水平变化。这些结果展示了 Twitch-4 相比强度型 Ca²⁺ 传感器的另一优势：实时关联 Ca²⁺ 变化与心脏机械功能的能力。 图 4 | 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼中心室 Ca²⁺ 水平与收缩功能的同时测量。 a 代表性 3 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼的 FRET 通道图像，显示心室收缩末期与舒张末期直径。时空图显示直径随时间的变化（红线与绿线之间的距离）。轨迹显示从时空图中提取的心室直径。 b 3 dpf（n = 100，N = 12）与 5 dpf（n = 68，N = 7）Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼的心室舒张末期与收缩末期直径，以及心室 FS。数据以均值 ± SD 表示，统计学分析见补充数据 1（**** p < 0.0001）。 c 代表性 3 与 5 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼的 FS 与心室 Ca²⁺ 随时间的变化。 d c 中幼鱼在多个心动周期中心室 FS 对心室 Ca²⁺ 水平的关系图。箭头指示时间方向。 5. L 型钙通道阻断剂与激动剂对心脏 Ca²⁺ 与心室缩短的影响 为评估 Tg(myl7:Twitch-4) 品系检测 Ca²⁺ 水平变化的灵敏度，我们测试了 LTCC 阻断剂与激动剂对 Ca²⁺ 动力学和心脏收缩性的影响。由于加入浴液的药物必须穿过琼脂糖层与皮肤才能到达内部介质，硝苯地平在 1、10 与 100 µM 三个剂量下测试。它在所有剂量下都降低心率与 Ca²⁺ 水平；我们比较了 3 与 5 dpf 时 100 µM 硝苯地平的作用：心房与心室的 Ca²⁺ 水平及心率均下降，在 5 dpf 时尤为明显，且 Ca²⁺ 瞬变振幅的下降在心房比在心室更明显（图 5A–C 与影片 S2）。Ca²⁺ 动力的改变使心室对心房 Ca²⁺ 图中的环形状发生变化（图 5D）。此外，收缩末期直径增大（即缩短减少），与 Ca²⁺ 水平下降相伴随（图 5E）。因此硝苯地平显著降低了收缩力：FS 在 3 与 5 dpf 分别仅为基线值的 35% 与 40%（图 5E）。 图 5 | L 型 Ca²⁺ 通道阻断剂硝苯地平对 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼心脏 Ca²⁺ 水平与心室缩短的影响。 3 dpf（n = 11，N = 4）与 5 dpf（n = 12，N = 4）的 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼用 100 µM 硝苯地平处理 1 小时。 a 代表性幼鱼在硝苯地平孵育前（基线）与孵育后心室收缩期的发射比值图像。轨迹显示这些幼鱼的心房（红）与心室（黑）Ca²⁺ 水平（发射比值）。 b 硝苯地平处理幼鱼心率相对基线的倍数变化。 c 心房（At）与心室（Vt）中平均 Ca²⁺ 水平及 Ca²⁺ 瞬变振幅相对基线值的倍数变化。 d 代表性幼鱼在硝苯地平孵育前（基线）与孵育后心室对心房 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）（注意 3 与 5 dpf 的坐标尺度不同）。 e 代表性幼鱼在硝苯地平孵育前（基线）与加入硝苯地平后心室直径对心室 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）。图中示出 FS 相对基线的倍数变化。全部数据以均值 ± SD 表示，采用双尾非配对 Student t 检验（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。 与硝苯地平相反，LTCC 激动剂 Bay K8644（100 µM）显著升高了 3 与 5 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼的 Ca²⁺ 水平（图 6A 与影片 S3），并在 10 分钟后达到最大效应（图 6B）。这些变化在 5 dpf 的两个腔室中都更为明显（图 S4A）。心室对心房 Ca²⁺ 环的振幅与迟滞均增大（图 6C）。3 与 5 dpf 幼鱼的 Ca²⁺-收缩曲线显示收缩末期直径缩短，与 Ca²⁺ 水平升高一致（图 6D 与 S4B）。不过，舒张末期直径在 3 dpf 下降 6%，而 5 dpf 没有下降（图 S4B），且 FS 在 5 dpf 增加更多（图 6D）。在斑马鱼中，心房收缩而非来自静脉的被动充盈，是心室充盈的主要决定因素。由于 Bay K8644 同时升高了心房 Ca²⁺ 水平（图 6A），更强的心房收缩可能促成 5 dpf 幼鱼更大的 FS。总之，Bay K8644 增大了 Ca²⁺ 瞬变振幅、心脏缩短幅度与收缩力。 图 6 | L 型 Ca²⁺ 通道激动剂 Bay K8644 对 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼心脏 Ca²⁺ 水平与心室缩短的影响。 3 dpf（n = 13，N = 3）与 5 dpf（n = 10，N = 3）的 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼用 100 µM Bay K8644 处理。 a 代表性幼鱼在基线与 Bay K8644 孵育 10 分钟后心室收缩期的发射比值图像。轨迹显示其心房（红）与心室（黑）Ca²⁺ 水平（发射比值）。 b Bay K8644 对心房与心室中平均 Ca²⁺ 水平及 Ca²⁺ 瞬变振幅的影响。数据以均值（黑线）± SD（灰带）表示。 c 代表性幼鱼在基线与 Bay K8644 孵育 10 分钟后心室对心房 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）。 d 代表性幼鱼在基线与 Bay K8644 孵育 10 分钟后心室直径对心室 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）。图中示出用 Bay K8644 处理 10 分钟的幼鱼 FS 相对基线的倍数变化。采用双尾非配对 Student t 检验（*** p < 0.001）。 6. 雷诺丁与咖啡因对心脏 Ca²⁺ 水平与心室缩短的影响 我们考察了作用于 RyR 的化合物对 Ca²⁺ 水平与心脏缩短的影响。首先测试了 3 与 5 dpf Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼对 RyR 抑制（1、10 与 100 µM 雷诺丁孵育）的反应。只有在 100 µM 时才观察到效应，且在 2 小时时达到最大。与 DMSO 处理 2 小时的幼鱼相比，3 与 5 dpf 幼鱼心室中 Ca²⁺ 瞬变振幅下降（图 S5A–C），但 FS 未显著改变（图 S5D）。雷诺丁使 Ca²⁺ 水平略微下降，心室直径无差异（图 S5A、E 与补充数据 1）。雷诺丁效应相对较小，可能是因为在斑马鱼中 SR 对 Ca²⁺ 瞬变的贡献相较哺乳动物较小；不过由于我们并不知道本实验中 RyR 抑制的确切程度，因此无法对这一争议下结论。 咖啡因在结构上与腺苷相关，作为 A1 与 A2A 腺苷受体拮抗剂、磷酸二酯酶的非选择性竞争性抑制剂而发挥作用，提高胞内 cAMP 浓度。虽然它被用于分离心肌细胞中释放 SR 内 Ca²⁺，但在斑马鱼幼鱼体内它可能作用于多个靶点与器官，包括中枢神经系统。我们测试了咖啡因对 3 与 5 dpf 自发心脏 Ca²⁺ 瞬变与心脏收缩的影响。0.1 mM 咖啡因效应轻微；1 mM 在 1 小时后引起轻度心动过缓（图 S6 与补充数据 1）。3 mM 时，心率出现明显的时间依赖性下降，舒张期 Ca²⁺ 水平大幅下降（主要在心室），而收缩期 Ca²⁺ 水平受影响较小（图 7A–B 与影片 S4）。Ca²⁺ 瞬变振幅增大，在心室尤其明显（图 7B）。心率与振幅的变化在心室对心房 Ca²⁺ 图中清晰可见（图 7C）。咖啡因处理前，与对照幼鱼一样（图 3B–D），心房与心室 Ca²⁺ 相位相反。处理 30 分钟时，由于心率降低，心房与心室 Ca²⁺ 同时下降的阶段被延长，环变宽（图 7C 中的星号）。孵育 1 小时后，心动周期持续时间进一步延长，心房 Ca²⁺ 上升后不久心室 Ca²⁺ 即上升。最终，心房与心室 Ca²⁺ 水平在延长的舒张期同时平行下降（图 7A、C 与影片 S4）。 关于咖啡因对心脏收缩的影响：心室直径减小，但 FS 未见显著改变（图 7D）。与心率变慢一致，收缩期、尤其是舒张期变慢（图 7D；影片 S4）；在图 7E 的代表性幼鱼中，咖啡因加入前的收缩期持续 120 ms（6 个箭头尖端），而咖啡因处理 1 小时后持续 260 ms。在 Ca²⁺ 瞬变衰减过程中，心室直径直到心房收缩开始时（红箭头标示）才明显增大，而这正是心室在舒张期被充盈的过程。斑马鱼的舒张末期容积已知很大程度上依赖心房收缩。 在用 3 mM 咖啡因处理的幼鱼中，12 条 3 dpf 幼鱼中有 4 条、11 条 5 dpf 幼鱼中有 2 条出现了正常的房室传导方向被改变的现象（图 8A 与影片 S5）：心房与心室的 Ca²⁺ 上升变为同时发生（3 dpf 时两个收缩期同相），甚至在心室中更早开始（5 dpf，图 8A 与影片 S5 中的竖直虚线），提示窦房结起搏失效与逸搏心律的出现。因此心房对心室 Ca²⁺ 环的斜率改变了约 90°，显示两个腔室的 Ca²⁺ 上升变为同相。在这些幼鱼中，心房收缩（图 8C 中的红箭头）与心室 Ca²⁺ 上升及缩短同时发生，并未对心室充盈作出贡献。这类分析对于识别由药物或突变引起的异常模式将非常有用。 图 7 | 咖啡因对 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼心脏 Ca²⁺ 水平与心室缩短的影响。 3 dpf（n = 12，N = 3）与 5 dpf（n = 11，N = 4）的 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼用 3 mM 咖啡因处理。 a 代表性幼鱼在基线与咖啡因孵育 0.5 小时、1 小时后的心室舒张期发射比值图像（代表性实验）。轨迹显示相应的心房与心室 Ca²⁺ 水平（发射比值）。 b 咖啡因处理 0.5 小时与 1 小时前后的收缩期与舒张期 Ca²⁺ 水平、Ca²⁺ 瞬变振幅与心率。 c a 中幼鱼（3 dpf）心室对心房 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）。 d 咖啡因孵育 0.5 小时与 1 小时前后的心室直径与 FS。 e 代表性 3 dpf 幼鱼在基线与咖啡因孵育 0.5 小时、1 小时后心室直径对心室 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）。红箭头标示心房收缩与心室充盈的起始。b 与 d 中的数据以均值（黑线）± SD（灰带）表示。统计学分析见补充数据 1（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001，**** p < 0.0001）。 图 8 | 咖啡因引起的 3 与 5 dpf 斑马鱼幼鱼兴奋异常。 部分用 3 mM 咖啡因处理的 Tg(myl7:Twitch-4) 幼鱼出现心房与心室 Ca²⁺ 瞬变模式的改变。 a 3 与 5 dpf 幼鱼在基线与 3 mM 咖啡因孵育 1 小时后的心房与心室 Ca²⁺ 水平（发射比值）（代表性实验）。竖直虚线显示 5 dpf 幼鱼中心室 Ca²⁺ 先于心房 Ca²⁺ 升高。 b a 中幼鱼在基线与咖啡因孵育 1 小时后的心室对心房 Ca²⁺ 水平关系图（一个心动周期）。 c 同一批幼鱼心室直径对心室 Ca²⁺ 水平的关系图（一个心动周期）。红箭头指示心房收缩的起始。b 与 c 中每个箭头尖端对应一幅图像，彼此间隔 20 ms。 四、讨论 关于心肌细胞的详细电生理与力学生物学研究，主要在啮齿类与人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞中开展。对于心肌细胞视频显微成像研究，一个目标一直是实现图像分析的自动化，生成心率、搏动时长与幅度、搏动间变异以及肌小节收缩与舒张参数等读数。在斑马鱼心脏功能的报道中，基于明场、宽场或光片（light-sheet）荧光显微镜的多种方法提供了心脏机械与收缩功能的估计值，如心率、收缩末期与舒张末期容积、射血分数、每搏输出量与心输出量。此外，还生成了表达荧光生物传感器的斑马鱼品系，以提供心脏中电压和/或 Ca²⁺ 水平的读出。在本研究中，我们在稳定表达 GECI Twitch-4 的斑马鱼幼鱼中同时获得了机械功能终点与 Ca²⁺ 动力学参数。 生物传感器的响应动力学对于分析动态 Ca²⁺ 浓度变化至关重要。GECI 的动力学慢于合成 Ca²⁺ 指示剂。在 Twitch 系列中，Ca²⁺ 亲和力与动力学之间呈现预期的反比关系：亲和力递减的传感器（Twitch-2B、-3、-4 与 -5）的衰减时间常数分别为 2.8、1.5、0.5 与 0.16 秒。因此我们选择 Twitch-4，其动力学相对较快、Ca²⁺ 亲和力较低（Kd 为 2.8 µM），以尽量减少动力学带来的削弱。 由于文献中的测量条件各异（离子强度、温度等），不同 Ca²⁺ 传感器之间的体外动力学难以直接比较；加之细胞内环境与体外条件差异相当大。Twitch-4 的结合速率常数 kon 可由已发表的 Kd 与 koff 推算得出：为 7 × 10⁵ M⁻¹ s⁻¹，而被认为属于快速 GECI 的各 GCaMP 变体约为 10⁷ M⁻¹ s⁻¹。Twitch-4 与 GCaMP 的解离速率 koff 则更接近（分别为 2 s⁻¹ 与 3–4 s⁻¹）。从这些体外参数来看，GCaMP 荧光理应比 Twitch-4 发射比值更准确地报告 Ca²⁺ 瞬变的起始。然而我们在此显示，Twitch-4 能够像 GCaMP 一样追踪收缩期 Ca²⁺ 瞬变，而 GCaMP 是斑马鱼心脏研究中广泛使用的传感器。图 2C 表明，Twitch-4 在心房与心室（搏动心脏中）的上升与衰减时间，与 GCaMP（吗啡啉停跳心脏中）记录到的完全相同。由于实验在 28 °C 下进行，Twitch-4 与 GCaMP 的动力学很可能比在更低温度下的体外测定更快。体外测定的 Twitch-4 的 Kd（2.8 µM）非常适合检测 Ca²⁺ 水平的上升与下降（图 5 与图 6）。 使用强度型 Ca²⁺ 生物传感器时，荧光随时间的变化通常归一化到舒张期或记录中的最低荧光（F/F₀），因此无法对不同实验或不同幼鱼之间的舒张期水平作出推断。这被认为是「心脏中舒张期 Ca²⁺ 水平的调控机制知之甚少」的原因之一。相比之下，使用 Twitch-4 时，Ca²⁺ 水平的差异不仅在心动周期内或加药后可被观察到，在不同幼鱼之间也可被观察到。比值变化提示 3 与 5 dpf 的 Ca²⁺ 水平不同，我们又用基于 GFP-aequorin 生物发光的独立方法证实了这一论断。 在 GECI 的丰富工具箱中，比率型传感器在成像心脏这样会动的器官时，相比强度型传感器具有独特优势。正如我们在早期研究及本文图 2 中所示，基于 FRET 的比率成像在很大程度上校正了运动伪影，使我们能够对搏动心脏中的 Ca²⁺ 变化成像。这些结果与 Tsutsui 等的报道一致——他们用比率型基因编码生物传感器在斑马鱼幼鱼的搏动心脏中进行了电压映射。由于心脏运动引起的离焦与焦平面变化导致两个荧光通道的波动正相关，这些共模成分在比值中很好地抵消，而由电压依赖性 FRET 引起的互反成分则被放大。FRET 传感器的一个替代方案是把强度型 GECI（如 GCaMP）与一个静态参照（如 DsRed）共表达：其发射比值同样能抵消运动与离焦伪影，只留下 Ca²⁺ 依赖的变化。一个技术细节使我们能够在心房与心室在焦平面内横向移动（以及较小程度上的 z 轴移动）的情况下，仍用固定 ROI 定量 Ca²⁺：每个像素对平均比值的贡献按其荧光强度加权，因此暗像素的影响可忽略，ROI 无需在每一帧中都匹配心脏腔室的形状。 与我们「运动伪影已被抵消」的论断一致，搏动心脏中 Twitch-4 比值变化的时间形状与速率，与被肌球蛋白抑制剂或 tnnt2a 吗啡啉停跳的心脏中所得结果相符（图 2B，Twitch-4 + PAB；图 2C，GCaMP + 吗啡啉），也与既往报道一致。虽然斑马鱼幼鱼在无循环情况下最多可存活至 5 dpf，已有研究表明用 tnnt2a 吗啡啉阻断血流会导致斑马鱼胚胎血管丛中内皮细胞凋亡。此外，一项膜片钳研究发现，机械负荷可能影响小鼠心室肌细胞的动作电位时程、Ca²⁺ 信号与收缩性，这凸显了心肌细胞中机械转导的重要性。因此在本研究中，我们没有使用任何肌球蛋白抑制剂或吗啡啉来停跳心脏，从而完整保留了心脏的机械-电反馈机制。 本项工作的一个关键方面，是用定制编写的分析程序从 Twitch-4 荧光图像中自动提取 Ca²⁺ 与收缩参数。我们在每次实验中同步追踪心室收缩。由于生化触发因素（Ca²⁺）及其机械结果均以 50 或 100 fps（帧/秒）在实时被采集，对二者相平面轨迹（李萨如图）的分析，为发育过程中的变化（图 4D）或药物加入后的变化（图 5E、6D、7E、8C）提供了一张直观快照。Ca²⁺ 与收缩的相关性在分离心肌细胞中已有研究，但据我们所知，这是首次在体内实现这一点。 本研究及斑马鱼同类报道的一个局限是：加入浴液的药物在幼鱼体内的实际浓度通常未知。与体外研究相比，往往必须使用更高浓度才能看到效应。在我们的实验中，幼鱼上方的琼脂糖层厚 1.9 mm，在此距离上扩散很慢。可以去掉部分琼脂糖以增加药物可及性，但由于必须手工操作，这可能在不同幼鱼之间引入变异来源。此外，药物还必须穿过皮肤才能到达内部器官。Parker 等曾用液相色谱-串联质谱测量幼鱼体内浓度并与浴液浓度比较：肾上腺素与哇巴因的体内/浴液比为 0.004，茶碱为 0.07，维拉帕米与特非那定为 1–2 倍，而西沙必利与氟哌啶醇却高达 20 倍——这凸显了生物分析在解读结果、尤其是在观察不到效应时的重要性。为了跟踪起效缓慢的药物，我们每隔 5–15 分钟重复测量一次（例如图 6B）。另一种方法是使用 GFP-aequorin 的心脏生物发光，可实现长达数小时的连续成像。 已知咖啡因通过使 RyR 对腔内 Ca²⁺ 水平敏化来增加 SR 的 Ca²⁺ 漏，但在我们的体内实验中，它可能作用于多个靶点。咖啡因的主要效应是心率显著下降、舒张期 Ca²⁺ 水平降低以及 Ca²⁺ 瞬变幅度增大（图 7）。这些在加入咖啡因 1 小时后观察到的效应，与「舒张期 Ca²⁺ 受心率调控」以及「稳态下通量平衡的维持」相符。在斑马鱼幼鱼约 4 Hz 的自发心率下，舒张期 Ca²⁺ 水平是升高的，因为 Ca²⁺ 瞬变来不及在下一次瞬变到来前完全衰减。与此同时，Ca²⁺ 瞬变幅度较小，这很可能是 LTCC 电流下降所致。Zhang 等在斑马鱼心肌细胞中报道，ICa,L 会随刺激间隔缩短（从 2 秒缩短到 0.33 秒）而下降，原因是 Ca²⁺ 导致的 ICa,L 失活，并伴随舒张期 Ca²⁺ 水平升高。在我们的结果中，咖啡因处理后心率降至 1 Hz 以下，舒张期 Ca²⁺ 水平下降，很可能接近静息 Ca²⁺ 水平（无刺激时观察到的水平），而 Ca²⁺ 瞬变幅度增大（图 7 与影片 S4）。我们也曾观察到由多非利特（dofetilide）与阿司米唑（astemizole）等药物引起的心率降低伴随大幅心室 Ca²⁺ 瞬变（论文准备中）。 咖啡因在体内的药理学是复杂的：文献中有咖啡因在人类中诱发心动过缓的报道，虽然机制不明，但有证据表明咖啡因抑制腺苷受体导致血压升高，进而诱发自主反射与心动过缓。此外，既往在 2 与 3 dpf 斑马鱼中的报道显示咖啡因可剂量依赖性地降低心率。如前所述，Parker 等报道的茶碱胚胎/浴液比为 0.07；咖啡因与茶碱结构非常相似，仅相差一个甲基，其 XLogP 值分别为 1.55 与 1.68。若假定两者具有相近的胚胎/浴液比，则浴液中 1 mM 咖啡因应对应胚胎内约 70 µM 的浓度，这与在 10–100 µM 浓度下作用于腺苷受体（pKi 4 至 5）的效力一致。 心肌的自动性被认为除 HCN 通道（If 电流）外，还受电压门控钙通道调控。起搏细胞去极化的另一机制涉及 SR 的节律性 Ca²⁺ 释放，通过 NCX1 触发内向电流。在敲除小鼠中，特异性消除心房中的这一电流会消除窦房结起搏活动并导致室性逸搏心律，尽管心房组织仍可兴奋。在我们的研究中，部分咖啡因处理的幼鱼出现了逸搏心律（图 8）：咖啡因造成的窦房结细胞 SR Ca²⁺ 漏，可能消除了局部 Ca²⁺ 释放、随之而来的经 NCX 的内向电流以及窦房结起搏活动。对咖啡因在 Ca²⁺ 水平上作用特征的刻画（图 7 与图 8），凸显了本方法在斑马鱼幼鱼中研究药物诱导性与家族性心律失常及其功能后果的潜力。 五、结论 Tg(myl7:Twitch-4) 品系提供了一种生理性、无创的途径，可在斑马鱼胚胎与幼鱼心脏中成像 Ca²⁺，从而估算收缩期与舒张期 Ca²⁺ 水平，同时完整保留电机械与旁分泌调控机制。收缩能力变化的测量对评估心脏功能至关重要，而本方法可实现 Ca²⁺ 与收缩的同步记录与关联分析。近年来已有多个心力衰竭与心肌病模型在斑马鱼中被报道，而 CRISPR-Cas9 基因编辑允许通过引入正常人源或突变的人直系同源基因来「人源化」斑马鱼模型。表达 Twitch-4 的这一现成品系，将成为刻画这些疾病病理生理的有价值工具——无论是 Ca²⁺ 通量是否参与其中，以及它们对心脏收缩性的影响。此外，还可用本方法开展心脏毒性研究与新药筛选。目前该方法在药物筛查方面的应用仍受限于多孔板中胚胎在琼脂糖内的操作与定位；若该步骤实现自动化，每小时可处理约 60 条幼鱼。将斑马鱼模型的体内数据与心肌细胞及分离心脏领域的大量文献相整合，很可能有助于阐明心脏疾病进展的机制并识别治疗靶点。 缩略语表 At：心房；bpm：每分钟搏动次数；dpf：受精后天数；ECG：心电图；FAC：面积变化率；fps：帧/秒；FRET：Förster 共振能量转移；FS：分数缩短率；GECI：基因编码钙指示器；HCN 通道：超极化激活的环核苷酸门控通道；hpf：受精后小时数；HR：心率；ICa,L：L 型 Ca²⁺ 电流；LTCC：L 型电压依赖性钙通道；NCX：钠-钙交换体；PAB：para-amino blebbistatin；ROI：感兴趣区；RyR：雷诺丁受体；SR：肌浆网；Vt：心室。 分析程序：作者编写的 IGOR Pro 程序「Ratioscope 8.31」（含 Pulse 模块）已公开于数据存储库，DOI: 10.25493/5G5V-HBC，可直接下载用于 Ca²⁺ 瞬变动力学分析与心室直径追踪。 补充材料：补充图与影片图注（v12p1012s1.pdf）、补充信息（v12p1012s2.xlsx，含全文统计学分析细节）、补充影片 S1–S5（心脏 Ca²⁺ 动态、硝苯地平、Bay K8644、咖啡因、逸搏心律）。 资助：MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助的 PID2019-111456RB-100；MCIN/AEI/10.13039/501100011033 与「欧洲区域发展基金——欧洲的一条路」资助的 BFU2015-69874-R 与 EQC-2019-006102-P；卡斯蒂利亚-拉曼查自治区教育、文化与体育局及 ERDF/欧盟资助的 SBPLY/19/180501/000223；卡斯蒂利亚-拉曼查大学及 ERDF/欧盟资助的 2019-GRIN-27019、2020-GRIN-29186、2021-GRIN-31151。 利益冲突：作者声明不存在利益冲突。许可：本文为开放获取文章，采用知识共享署名许可协议（CC BY 4.0）发布。 原文：Salgado-Almario J, Vicente M, Molina Y, Martinez-Sielva A, Vincent P, Domingo B, Llopis J.Simultaneous imaging of calcium and contraction in the beating heart of zebrafish larvae.Theranostics, 2022, 12(3): 1012-1029.　DOI: 10.7150/thno.64734本文为中文编译稿，仅供学术交流参考。原论文以 CC BY 4.0 开放获取，版权归原作者与出版方所有。