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同种异体通用嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法的出现，需要强化且可放大的生产流程，并辅以代表性的规模缩小模型 (SDM)，以实现高效的工艺开发和未来大规模生产即用型疗法。本文介绍了一种 7 天 CAR-T 细胞扩增工艺，该工艺通过在 2 L Univessel® 一次性搅拌罐式生物反应器 (STR) 中以灌流无血清培养基进行强化，可稳定达到 30 × 10⁶ cells/mL 的浓度，相当于每批次 113 ± 7 剂抗 CD19 CAR-T 细胞。在 250 mL Ambr® 250 搅拌罐式反应器 (STR) 中进行的平行实验，在等效体积功率输入 ( P/V ) 约为 8.78 W/m³的条件下，展现出可比的工艺性能和最终产品质量。对细胞生长、表型、细胞毒性和细胞因子分泌的单变量和多变量分析验证了 Ambr® 250 作为 2 L 工艺的预测性规模缩小模型(SDM) 的有效性。在 2 L STR 中集成电容传感技术，可实时可靠地监测活细胞浓度，且与离线测量结果高度相关 (R² = 0.98)。在下游工艺中，使用 Ksep® 400 自动化完成 2 L 规模的 CAR-T 细胞收集、浓缩和洗涤，与手动方法相比，产品回收率超过 90%，体积降低9倍，且不影响产品质量。本研究建立了一个可放大的 CAR-T 生产工作流程，并由预测性 SDM 提供支持，为工艺开发和规模放大提供了一个高效的平台，从而能够实现未来大规模生产同种异体 CAR-T 细胞疗法。 简介 自体嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的显著疗效已对血液系统恶性肿瘤的治疗产生了变革性影响。然而，自体CAR T细胞生产的复杂性仍然严重限制了这些疗法的可及性、可负担性和商业可行性。该多步骤流程包括通过血细胞分离术从患者体内采集T细胞，随后进行体外基因修饰和扩增，最后运回临床中心进行再输注。由于患者来源的起始材料通常质量欠佳，因此该流程在物流和生产方面都面临着巨大的挑战。这些独特的限制因素制约了产能，导致生产周期延长至3-6周，使得每剂CAR-T疗法的成本上升至40-50万美元。因此，亟需更精简、更具规模化的生产方法，以降低成本并改善患者的治疗机会。 异体通用CAR-T疗法的开发为克服自体生产所面临的独特挑战提供了一条充满希望的途径。通过基因工程改造健康供体来源的T细胞，使其表达治疗性CAR受体，并通过敲除T细胞受体（TCR）和人类白细胞抗原（HLA）等基因来逃避免疫排斥，CAR-T产品可以预先大规模生产，从而消除漫长的生产周期，并使患者能够立即接受现成的、可普遍使用的治疗。 研究性异体抗CD19 CAR-T细胞疗法在治疗B细胞血液系统恶性肿瘤方面已展现出早期疗效，I期临床试验报告显示其安全性良好，总体完全缓解率与已获批准的自体产品相当。目前，II期临床试验正在进行中（WU-CART-007，NCT06514794；ALLO-501A，NCT06500273），生产制造科学和技术必须与临床进展保持同步，才能实现异体CAR-T疗法的大规模生产，并支持未来的商业转化。要实现广泛可及、即用型CAR-T疗法，并降低单剂量成本，就需要可放大的上游和下游生产工艺，以规模经济的方式生产大量高质量剂量。 搅拌罐式生物反应器（STR）几十年来一直被广泛用于生物制剂的大规模生产，并为单克隆抗体和疫苗等重磅药物的普及做出了重大贡献。尽管专为单剂量自体CAR-T产品设计的生产平台（例如CliniMACS Prodigy）的可放大性本身就存在局限性，但STR反应器具有诸多优势，例如已证实其可放大性超过10,000升、操作灵活，以及在蛋白质、病毒载体和日益增多的细胞疗法生产方面拥有丰富的生物工艺和监管方面的先验知识。CAR-T细胞的扩增已在0.015-0.25升的STR反应器中得到证实，但更大规模（0.5-1升）的示范应用仅限于未修饰的T细胞培养物。同样，能够实现生物反应器自动化收获和最终CAR-T产品浓缩的可放大下游解决方案也仅使用未修饰的T细胞进行了评估。因此，仍需表征可放大的多升上游和下游生产流程对CAR-T细胞关键质量属性（例如CAR转基因表达和细胞毒性）的影响。此外，能够实现对CAR-T细胞浓度等关键参数进行实时过程监测的过程分析技术（PAT）的整合应用也尚未得到验证。 为了进一步支持大规模CAR-T工艺开发，仍然需要验证能够精确模拟CAR-T生物反应器生产规模工艺的代表性缩小模型（SDM）。SDM广泛应用于商业生物制剂生产，是实现高通量、小规模工艺开发并降低成本的关键工具。它们使疗法开发人员能够系统地筛选和优化关键工艺参数，并根据质量源于设计（QbD）原则评估其对产品质量属性的影响。鉴于目前缺乏经过验证的CAR-T生产SDM，且大规模工艺开发难以实施，验证稳健且具有预测性的SDM对于加速开发可放大的同种异体CAR-T生产流程至关重要。 为满足这些需求，本研究对一种通过在2升一次性搅拌罐式反应器（STR）中灌流无血清培养基强化CAR-T细胞扩增工艺进行了表征，并评估了关键质量属性，包括CAR-T细胞生长、表型、细胞毒性和细胞因子分泌。通过在250毫升STR中平行进行相同工艺，并使用匹配的体积功率输入（P/V），评估了该工艺的可放大性，并将工艺性能进行比较，以评估250毫升系统作为代表性SDM的性能。此外，本研究还探讨了在2升规模下通过介电谱法进行电容传感，以实时监测CAR-T细胞浓度。该研究还包括在2升规模下集成和表征Ksep® 400系统，用于自动化生物反应器收获、CAR-T产品浓缩和洗涤步骤。 详细的实验操作和结果，请参考原文。 结果 在 250 mL 和 2 L 生物反应器中进行可比的 CAR-T 细胞扩增 为了评估先前优化的灌流式 CAR-T 细胞扩增工艺的可放大性和可重复性，将来自同一健康供体的抗CD19 CAR-T 细胞平行培养于 250 mL（Ambr® 250 高通量灌流系统）和 2 L（Univessel® 一次性）搅拌罐反应器（STR）中。培养在无血清培养基中进行 7 天，从第 2 天开始以每天 1.0 个罐体积（VVD）的固定速率进行交替式切向流（ATF）灌流。2 L STR 中的搅拌速率经过调整，以保持与 250 mL STR 工艺相同的P/V，使用公式 1计算约为 8.78 W/ m³。STR灌流工艺与 G-Rex® 24 透气孔板培养（作为静态对照）进行对比（图 1）。 图 1. CAR-T 细胞扩增实验在 250 mL 和 2 L 灌流式搅拌罐生物反应器以及静态孔板中的概览。慢病毒转导后一天，抗 CD19 CAR-T 细胞在静态 T 型培养瓶中预扩增 2 天。第 0 天，将 CAR-T 细胞平行接种到 Ambr® 250和 Univessel® 2 L 搅拌罐生物反应器 (STR) 以及 G-Rex® 24 孔板中，并扩增 7 天。第 1 天，STR 的工作体积增加 110%，第 2 天开始灌流 ATF，每天换液 1 VVD，直至实验结束。第 7 天，使用 Ksep® 400 从 2 L STR 中自动收集、洗涤和浓缩细胞。在孔板中，于第 4 天进行 75% 的培养基置换。所有实验均使用来自同一健康供体的细胞进行三次重复（n = 3）。 250 mL 和 2 L STR 灌流培养过程中的细胞生长曲线高度相似（图 2）。培养起始细胞密度为 0.5 × 10⁶ cells/mL，最终细胞密度分别达到 29.0 ± 1.5 × 10⁶ cells/mL 和 29.6 ± 1.9 × 10⁶ cells/mL（图 2A），对应的最终扩增倍数分别为118.4 ± 2.4 倍和 126.8 ± 5.4 倍（图 2B）。这些数据仅反映了 0-7 天 STR 中 CAR-T 细胞的生长情况，不包括在 T 瓶中进行的激活、转导和预扩增步骤（-5 天至 0 天）期间观察到的细胞生长情况。综合12天培养过程中细胞的生长情况，STR中细胞的平均扩增倍数为409-437倍。细胞活力趋势在两种STR规模下均保持一致，整个培养期间平均活力均超过90%，且尽管250 mL（注射泵）和2 L（隔膜泵）规模下使用了不同的ATF灌流设备，细胞活力仍保持相近水平（图2C）。这些结果共同表明，基于匹配的P/V值，250 mL和2 L STR灌流过程具有高度相似性，并提示生物反应器规模和灌流机制均不影响CAR-T细胞的生长或活力。STR过程与静态孔板对照组之间细胞活力无显著差异，进一步强调了CAR-T细胞对ATF灌流过程或STR中搅拌桨搅拌产生的剪切应力具有良好的耐受性。 图 2. 250 mL 和 2 L 灌流生物反应器中 CAR-T 细胞的生长情况。概述：(A)每日活细胞密度和(B)倍数扩增。(C)七天平均细胞活力和(D)每日细胞生长速率。(E)每日葡萄糖和(F)乳酸生物反应器浓度。(G)每日细胞活力，(H)总活细胞产量和(I)总 CAR+ 细胞产量，并标明每批次产生的代表性 CAR-T 剂量总数，计算方法为：将第 7 天的总细胞产量乘以图 5B中所示的相应第 7 天 CD3 + CAR 转导效率，并假设一个剂量为 150 × 10⁶个CAR+ 细胞。G-Rex® 24 孔板的剂量产量计算假设 24 个孔中填充 8 mL。数据以均值±标准差（SD）表示，每个实验重复n=3次，使用一名健康供体；孔板数据以每个实验重复n=3个技术重复孔的均值表示（n=9）。统计分析采用Welch方差分析和Dunnett T3多重比较检验，第7天的数据中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns表示无统计学意义。 在搅拌罐式生物反应器中进行灌流可促进CAR-T细胞的扩增 与仅在第4天进行一次75%培养基置换的静态孔板培养相比，灌流培养能够持续置换培养基，显著提高了CAR-T细胞的扩增效率（图2A、B）。校正不同的接种细胞浓度（STR中为0.5 × 10⁶ cells/mL，孔板中为0.125 × 10⁶ cells/mL）后，灌流STR培养的细胞扩增倍数比孔板培养高出34%（约123倍 vs. 约90倍；p < 0.05）（图2B）。这种优异的细胞生长与STR培养早期（第0-4天）更高的生长趋势相关（图2D）。 STR 中优异的生长速度可能是由以下因素共同驱动的：通过灌流持续供应营养物质，通过搅拌桨式搅拌增强混合和气体传递，以及控制培养 pH 值和溶氧 (DO)，而所有这些在静态孔板培养中都不存在。 每日葡萄糖和乳酸浓度分析证实，STR培养中更优的细胞生长得益于更稳定的代谢环境。持续灌流新鲜培养基稳定了葡萄糖水平，STR培养中葡萄糖浓度在第4天达到约24 mmol/L的平台期，而孔板培养中葡萄糖浓度在第6天降至该阈值以下（图2E）。在孔板培养中，乳酸水平在第7天逐渐积累至约24 mmol/L，而在灌流STR培养中，乳酸水平在第4天达到峰值15 mmol/L，随后被灌流清除，并在培养结束时逐渐下降至约9 mmol/L（图2F）。250 mL和2 L STR培养的代谢谱非常相似，葡萄糖消耗和乳酸积累均在第4天达到峰值，随后逆转（图2E、F），葡萄糖消耗和乳酸生成速率也随时间推移呈相似的下降趋势。值得注意的是，尽管在细胞持续扩增过程中灌流速率保持不变，但第4天后葡萄糖消耗和乳酸积累的逆转表明培养基供应超过了代谢需求。这提示未来在后续实验中，后期灌流速率或许可以降低，以节约培养基并降低成本。 接种后，所有生物反应器系统中细胞活力在培养第一天均下降了2%–7%，随后在第二天恢复至93%–96%（图2G）。鉴于在静态孔板中也观察到了这种下降和恢复现象，我们认为搅拌罐式反应器（STR）中搅拌桨驱动搅拌可能产生的负面影响不太可能是造成这种现象的原因，尤其是在第0-4天，STR的细胞活力高于孔板。我们假设，早期活力下降反映了细胞对pH值变化的适应，即细胞从酸性较高的预扩增培养瓶中转移到碱性较高的生物反应器新鲜培养基中。在预扩增培养瓶中，由于第-2天至第0天期间增殖产生的乳酸积累降低了pH值。然而，由于缺乏预扩增阶段的pH值和代谢物测量数据，我们无法证实这一假设。 在2 L搅拌罐式反应器（STR）中，细胞活力从第3天开始逐渐下降；而在250 mL搅拌罐式反应器中，细胞活力则从第4天开始下降（图2G）。这种下降的开始与乳酸浓度超过10 mmol/L并达到接近15 mmol/L的峰值相吻合（图2F），该浓度范围已被报道为T细胞培养的毒性阈值。为了评估细胞活力是否能够恢复，我们将250 mL生物反应器中的培养时间延长至10天，结果显示，细胞活力最终在第9-10天稳定在87%。此外，这证实了 CAR-T 细胞在第 7 天之后持续扩增至最终浓度约为 47 × 106 cells/mL，表明延长培养时间可以进一步提高 2 L STR 培养物中的总体产量。 将CAR-T细胞灌流培养工艺与使用未转导T细胞（n = 1）的初步补料分批培养工艺进行进一步比较，突显了灌流培养的优势。在250 mL和2 L两种规模下，灌流培养工艺的最终细胞浓度均比补料分批培养工艺提高了3.4倍，并在整个培养过程中维持了更高的生长速率。值得注意的是，补料分批培养的细胞活力从第2天开始下降，这与乳酸水平超过10-15 mmol/L相关，从而进一步支持了乳酸浓度在此范围内存在毒性阈值的假设。需要指出的是，在补料分批培养工艺中使用未转导T细胞是一个混杂因素，因为未转导T细胞和CAR-T细胞的细胞代谢和激活状态可能存在差异。因此，这并非直接比较，这些结果应被视为指示性的而非完全可比的。我们之前曾使用 250 mL STR 系统，专门针对 CAR-T 细胞，对补料分批培养和灌流培养模式进行了更严格的比较，结果观察到最终细胞产量有 3-4.5 倍的类似提升。综上所述，这些结果支持灌流培养能够增强CAR-T 细胞扩增，从而最大限度地提高最终细胞产量。 2升灌流放大工艺每批次可产生100剂以上的CAR-T细胞 将灌流工艺放大至 2 L STR 后，第 7 天最终细胞产量达到 49.7 ± 3.2 × 10⁹个活细胞（图2H）。基于该规模下收获时 34% 的转导效率（图 5B），这相当于 16.9 ± 1.1 × 10⁹个CAR-T 细胞（图 2I）。假设治疗剂量为 150 × 10⁶个CAR⁺ 细胞，则 2 L STR 扩增工艺每批次可产生 112.8 ± 7 个 CAR-T 剂量，表明工艺放大可实现显著的剂量数量。在250 mL STR扩增过程中，剂量数的计算方法与上述类似，均基于该规模下实现的CAR转导效率，结果为每批次16.8 ± 0.8剂。考虑到在G-Rex24孔板中进行的7天培养过程中的牺牲性取样，理论总细胞产量和剂量产量的计算假设24个孔，每个孔的工作体积为8 mL，结果为7天内每个孔板的总剂量为5.1 ± 0.6剂。作为参考，每个孔板接种了24 × 10⁶个细胞，而250 mL STR中接种了50 × 10⁶个细胞。为了弥补这一差异并与250 mL STR工艺进行比较，将接种量标准化至等效接种量后，理论孔板产量增加至10.6剂。 250 mL 和 2 L 生物反应器之间可比的环境控制 为确保不同规模下混合强度和剪切条件的一致性，2 L规模的搅拌桨搅拌速率根据250 mL搅拌罐式反应器（STR）的P/V进行调整。为评估基于P/V的缩放是否能实现相似的氧气传递，在两种规模的生物反应器中均监测了溶氧（DO）水平。 在两种搅拌罐式反应器（STR）工艺中，溶氧（DO）水平自然下降至50%，之后通过顶空通入氮气和氧气，以容器体积归一化的流速维持在该设定值（图3A、B）。然而，初步的2升实验表明，仅靠顶空通气不足以在第3天之后维持50%的DO设定值，表明氧气传递存在限制。这凸显了基于P/V的搅拌放大与250毫升工艺相比，并未实现完全等效的气液传质，这可能是由于两种生物反应器规模的顶空几何形状存在细微差异。为了解决这个问题，从第3天开始，在2升生物反应器中根据需要引入纯氧鼓泡，以补充顶空通气，并成功地将DO维持在目标设定值（图3B）。尽管氧气控制策略有所不同，但在两种规模的STR中，溶氧（DO）水平均维持在50% ± 10%以内。在2 L规模下进行鼓泡通气比在250 mL规模下仅进行顶空通气能实现更精确的控制。重要的是，CAR-T细胞能够耐受鼓泡通气带来的额外剪切应力，这从两种规模下细胞活力相当（图2C）即可看出。 图 3. 250 mL 和 2 L 灌流式生物反应器中 pH 值和溶氧的变化趋势。(A) Ambr® 250 和(B) Univessel® 2 L 搅拌罐式生物反应器 (STR)中溶氧 (DO) 的在线点测监测。 (C) Ambr® 250 和(D) Univessel® 2 L STR中 pH 值的在线点测监测。 (E) Ambr® 250集成式中空纤维灌流过滤器跨膜压 (TMP)，(F) 2 L STR XCell® ATF2 灌流装置的 TMP，以及( G)交替切向流速。数据来自 n = 3 次实验重复。水平虚线表示参数设定点死区。 在250 mL和2 L搅拌罐式反应器（STR）中，通过一次性添加碱液和顶空充入二氧化碳，成功地将pH值维持在目标值7.35 ± 0.05（图3C、D）。在第3天至第5天之间的两次运行中，pH值短暂低于7.25，但生物反应器的pH控制系统迅速将其纠正。从接种到第4天，pH值总体呈下降趋势，随后进入恢复期，这与乳酸积累和后续清除的趋势相一致（图2F）。 为了研究0.2 µm中空纤维灌流过滤器的潜在污染情况，我们在整个培养期间监测了跨膜压力（TMP）。虽然在暂时停止灌流以更换新鲜培养基和废液瓶期间观察到瞬时TMP峰值，但在两种生物反应器规模下均未出现持续的压力升高，表明过滤器污染程度极低（图3E、F）。在2 L规模下，XCell® ATF2灌流流速控制在650 mL/min（图3G），以匹配使用公式6估算的Ambr® 250灌流系统产生的约1500 s⁻¹的剪切速率。250 mL和2 L工艺中细胞平均活力的相似性支持了以下结论：两种灌流工艺均实现了相似的剪切条件（图2C）。另外，对无细胞滤液组分的分析证实了滤液中不存在细胞，验证了生物反应器内有效的细胞截留和浓缩。 多频电容测量可实现对 CAR-T 细胞浓度的实时监测 为了实现对CAR-T细胞浓度的实时监测和评估，我们在2升STR工艺中集成了一个电容探针。电容反映了物体储存电荷的能力。在活细胞中，完整的磷脂膜作为绝缘体包裹着导电的细胞质，使得细胞在暴露于交变电场时发生极化。这种极化会产生可测量的生物电容信号，该信号可以在一个或多个频率下进行测量。电容受培养体积以及活细胞的数量、大小和形态的影响，可用于推导活细胞密度。单频电容测量依赖于与活细胞浓度的固定相关性，因此容易受到细胞大小变化的影响，例如T细胞活化后观察到的变化（图4A）。为了解决这个问题，我们采用了多频扫描来提高活细胞密度预测的准确性。 图 4.多频电容传感技术能够准确预测 2 L 生物反应器中 CAR-T 细胞的浓度。(A)每日估算的细胞直径（NucleoCounter® NC-3000™）。数据以 n = 3 个实验重复的平均值±标准差表示，其中包含一名健康供体。孔板数据以每个实验重复中 n = 3 个技术重复孔的平均值表示（n = 9）。(B)代表性的 2 L Univessel® 搅拌罐式生物反应器 (STR) 培养中的多频电容测量结果，颜色代表根据离线细胞计数确定的细胞密度。每条线代表在与离线细胞计数对应的特定时间点进行的测量。(C)来自 n = 3 个 2 L STR 实验重复的多频电容数据的主成分分析得分图；每个点都标有离线测量培养时间（小时）。得分图椭圆代表基于 Hotelling T²值的 95% 置信区域。(D)通过电容测量多元分析预测的 2 L STR 细胞浓度与离线细胞计数的线性回归。(E)代表性 2 L STR 实验的细胞浓度模型预测值（蓝色），叠加离线取样的细胞计数（粉色）。(F)通过电容测量多元分析预测的 2 L STR 细胞活力与离线细胞计数的线性回归。 在2升STR培养系统中，我们测量了CAR-T细胞培养物在7天灌流过程中25个离散频率（50–20,000 kHz）下的介电特性。图4B展示了代表性2升STR培养物在所有频率下的细胞培养电容，并根据离线细胞计数确定的活细胞密度进行颜色编码。14条趋势线分别代表每次离线取样时采集的多频电容测量值，在7天的培养过程中，每天取样两次。在较低频率下测量时，电容差异最为显著，较高的细胞密度（黄/红线）对应的电容值高于低密度样本（蓝线）。在高于7,368 kHz的频率下，所有时间点的电容值趋于相似，表明测量对细胞密度的敏感性降低。在这些较高频率下，细胞膜仅发生部分极化，导致电容信号减弱。 对来自三个重复2升培养实验的7天内的电容数据进行主成分分析（PCA），结果显示电容数据呈现基于时间的聚类（图4C），这与观察到的活细胞密度趋势一致（图2）。为了定量地将电容测量值与细胞密度联系起来，我们构建了一个正交偏最小二乘（OPLS）回归模型，该模型以多频电容测量值为预测因子，离线活细胞计数值为响应因子。结果表明，该模型与离线细胞计数具有很强的相关性（R² = 0.98）和较高的预测性能（Q²= 0.96）（图4D）。 由于实验次数较少（n = 3），我们进行了模型诊断，以评估过拟合风险并评价 OPLS模型的可靠性。交叉验证得分图显示，三个生物反应器运行的预测行为存在重叠，表明模型在不同实验间表现一致。随后，我们计算了 X 空间中与模型的距离 (DModX)，以识别潜在的 X 异常值，并将超过临界值 (Dcrit = 0.05) 的观测值视为具有统计学意义的异常值。除两个样本外，所有样本的 DmodX 值均低于此阈值，表明模型能够很好地拟合大多数样本的电容谱，且未出现异常大的 X 残差。Hotelling T²分析也显示，除一个观测值外，所有观测值均在 95% 临界值范围内，表明模型在不同运行间表现出稳定一致的多元行为，且不存在系统性异常值。 Y残差服从正态分布，表明预测误差表现得更像随机噪声，而非系统性模型偏差。此外，置换检验结果显示，置换模型的R²和Q²值均低于原始模型，证实了观察到的预测结构强于预期，而非监督式过拟合的产物。综上所述，这些诊断结果表明，在有限数据集（n = 3次运行）的限制下，OPLS模型表现出一致的内部行为和合理的预测可靠性。 为了进一步评估模型在不同生物反应器批次间的泛化能力，我们采用留一批次交叉验证法对OPLS模型进行了验证。具体而言，我们使用三个生物反应器批次中的两个批次训练OPLS模型，并预测第三个批次的数据。结果表明，该模型在应用于未见过的生物反应器批次时仍保持较高的预测精度，且其性能不依赖于任何单一数据集（图4E）。最后，考虑到电容部分受细胞活力的影响，我们也评估了该模型预测细胞活力的潜力（图4F）。虽然回归分析显示模型拟合度良好（R² = 0.78），但较低的预测能力（Q² = 0.62）表明，需要进一步改进模型才能可靠地追踪细胞活力。 在 250 mL 和 2 L 生物反应器中扩增的 CAR-T 细胞具有相似的表型和细胞毒性 为了比较不同生物反应器工艺制备的最终CAR-T产品的质量特性，我们对从250 mL和2 L灌流式STR反应器以及静态孔板中收集的CAR-T细胞进行了流式细胞术、细胞毒性和细胞因子分泌测定。在接种时（第0天）和收获时（第7天）评估了细胞表面标志物的表达，以分析T细胞亚群、CAR表达、耗竭、活化和分化情况（图5）。 图 5. 250 mL 和 2 L 灌流式生物反应器与静态孔板中 CAR-T 细胞表型、细胞毒性和细胞因子分泌的比较。细胞表型通过流式细胞术在生物反应器接种和收获后进行分析。(A) CD4+/CD8+ 比值，(B) CD3+ 细胞上的 CAR 表达，(C) CD4+ 和 CD8+ 细胞。(D) CD3+ 耗竭标志物共表达（PD-1、LAG-3、TIM-3），(E) CD3 +早期激活标志物（CD69），(F) CD3 + 中期激活标志物（CD25），以及(G) CD3+ 晚期激活标志物（HLA-DR）表达。(H) CD8+细胞按幼稚型（CCR7+CD45RO−）、中央记忆型（CM）（CCR7+CD45RO+）、效应记忆型（EM）（CCR7−CD45RO+）或效应型（CCR7−CD45RO−）进行分类的比例。数据以均值±标准差（SD）表示，n = 3个实验重复，使用同一供体，孔板数据以每个实验重复中n = 3个技术重复孔的均值表示（n = 9）。(I)通过荧光显微镜，将收集的CAR-T细胞与Nuclight Green NALM6靶细胞以1:1的比例共培养，在体外评估其细胞毒性。 (J) 48小时后，在细胞毒性试验培养基中测定肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和(K)干扰素-γ (IFN-γ) 的细胞因子分泌。数据以平均值±标准差的形式呈现，每个技术重复n=4，每个实验重复n=3（n=12），使用一名健康供体。统计分析采用Welch方差分析和Dunnett T3多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。 在所有实验过程中，CD4+/CD8+ 细胞比例均从接种时以 CD4 细胞为主（约 3:1）转变为收获时约 1:1 的比例（图 5A ），这主要是由于 CD8 +细胞比例随时间持续增加所致。收获时，各实验过程中最终的CD3+ CAR 转导效率在 32% 至 41% 之间。在 250 mL STR 培养体系中，CAR+ 细胞的比例与接种时观察到的比例相当（41.4%± 2.4%），而在 2 L STR 培养体系（33.6% ± 3.2%）和静态孔板培养体系（32.0% ± 1.3%）中，CAR+ 细胞的比例则显著下降（图 5B）。尽管这些 CAR 表达差异性下降的原因尚不完全清楚，但可能与不同实验过程中未修饰 T 细胞的扩增动力学差异有关。对CD4+/CD8+ 亚群中 CAR 表达的进一步分析表明，在所有过程和时间点，CD8+ 细胞的转导始终优于 CD4+/CD8+ 细胞（图 5C）。 以PD-1、LAG-3和TIM-3表面标志物共表达为特征的耗竭细胞比例，从接种到收获显著下降了约60%，导致所有条件下最终耗竭水平均较低，约为3%（图5D）。激活标志物的表达谱符合预期趋势，早期（CD69）和中期（CD25）标志物的表达随时间推移急剧下降（图5E、F），而晚期（HLA-DR）标志物的表达在收获时增加（图5G）。有趣的是，与STR培养相比，孔板培养中早期、中期和晚期激活标志物的表达更高，这与更大的平均细胞体积相关（图4A），可能表明静态培养中激活状态持续时间更长。通过检测CCR7和CD45RO的表达来评估CD8+ T细胞的分化，从而量化初始型（CCR7+CD45RO-）、中央记忆型（CCR7+CD45RO+）、效应记忆型（CCR7-CD45RO+）和效应型（CCR7-CD45RO-）亚群的比例。在收获时，所有生物反应器工艺均产生了相似的细胞分化谱，超过90%的收获细胞表达初始型或中央记忆型标志物，而表达效应记忆型或效应型标志物的细胞不足10%（图5H）。值得注意的是，在所有工艺中，中央记忆型CD8+细胞的比例在收获时均增加了约24%。 为了进一步评估体外功能性细胞毒性，将从所有平台收集的CAR-T细胞进行纯化，并与Nuclight Green标记的CD19+ NALM6急性淋巴细胞白血病靶细胞共培养3天。所有培养条件均表现出与未转导T细胞对照组相当的靶向特异性细胞毒性（图5I），荧光显微镜观察结果也证实了这一点。对培养2天后的杀伤实验培养上清液进行分析，进一步证实了靶向特异性细胞因子的释放，CAR-T细胞分泌的TNF-α和IFN-γ水平相当（图5J、K）。综上所述，这些结果表明，在250 mL和2 L生物反应器以及静态孔板中生成的CAR-T产品均表现出相当的抗癌细胞毒性。 总之，在250 mL和2 L STR培养瓶中扩增的CAR-T细胞表现出相似的表型和细胞毒性，表明不同规模培养的最终产品质量具有一致性。此外，与静态孔板培养的结果相似，证实了基于灌流的STR培养扩增不会对CAR-T细胞的质量属性产生负面影响。 多元分析证实 250 mL 和 2 L 生物反应器中 CAR-T 产品的相似性 为了全面评估250 mL和2 L STR工艺生产的CAR-T产品的相似性，并评估其与静态孔板培养的差异，我们整合了所有质量属性数据，并通过主成分分析（PCA）进行分析。细胞生长、活力、葡萄糖/乳酸水平和代谢率的时间序列数据，以及收获质量属性（表型、细胞毒性、细胞因子分泌），均被汇总为每次运行的单个数据点。在所得的PCA得分图（图6）中，点的聚集表明不同生产条件下的统计学相似性。孔板和STR来源的CAR-T细胞之间存在明显的分离，这主要是由于孔板中细胞生长较差（图2），其他因子分析也支持这一结论。相比之下，250 mL和2 L生物反应器的数据聚集紧密，表明CAR-T产品质量属性的总体统计学相似性更高。这些发现支持了先前的单变量结果，显示细胞生长和表型相当（图 2、5），并证实了 CAR-T 细胞质量在两个 STR 规模之间非常相似。 图 6. 250 mL 和 2 L 灌流式生物反应器中 CAR-T 细胞最终产品质量属性的比较。图中展示了从 Ambr® 250 和 Univessel® 2 L 灌流式搅拌罐生物反应器以及 G-Rex® 24 孔板中收获的 CAR-T 细胞的最终结果的主成分分析得分图。每个点代表一个实验重复 (n = 3)，汇总了 7 天生物反应器扩增期间每日细胞生长、活力和代谢物数据，以及在收获时（第 7 天）采集的所有表型、细胞毒性和细胞因子释放测量数据。各点根据其对应的实验重复进行标记。得分图椭圆代表基于 Hotelling T²值的 95% 置信区间。 自动化 2 升生物反应器进行细胞收获、产品浓缩和洗涤，以维持 CAR-T 细胞的质量特性 在 2 L STR 工艺结束时，评估了使用逆流离心机 (Ksep® 400) 实现生物反应器收获、CAR-T 细胞浓缩和洗涤自动化所带来的影响。将收获后CAR-T 细胞的活力、表型、细胞毒性和增殖能力与使用注射器从生物反应器中手动取样的对照细胞进行比较（图 7A）。 图 7.使用 Ksep® 400 实现 2 L 生物反应器中 CAR-T 产品的自动化收获、浓缩和洗涤，可保持产品质量。(A)在 Univessel® SU 2 L 生物反应器中扩增 7 天后，使用 Ksep® 400 收获、浓缩和洗涤 CAR-T 细胞，并与通过注射器手动取样的细胞进行比较。(B) Ksep® 400 的收获回收率，(C)收获前后的工作体积，(D)活细胞浓度和(E)细胞活力。收获后，通过流式细胞术分析手动和 Ksep® 400 收获的细胞的表型。(F) CD4+/CD8+ 比值，(G) CD3+ 细胞上 CAR 的表达，(H) CD3+ 耗竭标志物共表达（PD-1、LAG-3、TIM-3），以及(I) CD8+ 细胞按幼稚型 (CCR7+CD45RO−)、中央记忆型 (CM) (CCR7+CD45RO+)、效应记忆型 (EM) (CCR7−CD45RO+) 或效应型 (CCR7−CD45RO−) 进行分类的比例。数据以 n = 3 个实验重复的平均值 ± 标准差表示，每个实验重复均来自同一供体，孔板数据以每个实验重复的 n = 3 个技术重复孔的平均值表示 (n = 9)。(J)通过荧光显微镜，将收集的 CAR-T 细胞与 Nuclight Green 标记的 NALM6 靶细胞以 1:1 的比例共培养，评估其体外细胞毒性。 (K) 48 小时后，在细胞毒性试验培养基中测定肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和(L)干扰素-γ (IFN-γ) 的细胞因子分泌。 (M)将收集的细胞重悬于添加了 IL-2 的新鲜培养基中，并在静态 T 瓶中扩增 3 天。数据以平均值±标准差 (SD) 表示，每个技术重复 n = 3，每个实验重复 n = 3（n = 9），使用一名健康供体。统计分析采用 t 检验、Welch 方差分析和 Dunnett T3 多重比较检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 Ksep® 400 系统采用逆流离心洗脱技术，利用离心力将生物反应器中的细胞培养物泵入流化床，从而将收集的细胞浓缩到流化床中，同时洗脱培养基。随后用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤细胞流化床，得到浓缩的最终产品。整个 2 L 生物反应器细胞培养物的自动收集、浓缩和洗涤过程在 30-35 分钟内完成，回收率达到 91.0% ± 1.0%，且在不同批次间具有高度重复性（图 7B）。对废液的取样分析证实存在少量细胞损失，这解释了回收率不完全的原因。生物反应器培养液总体积为 1.68 L，浓缩至 186.7 ± 23 mL，体积减少了 9 倍，最终产品浓度达到 261 ± 46.7 × 10⁶cells/mL（图 7C、D）。收获后细胞活力在统计学上保持不变，维持在 91% ± 1.5%，表明离心、蠕动泵送和浓缩步骤耐受性良好（图 7E）。同样，CAR 转导水平、细胞耗竭和成熟度、细胞毒性和细胞因子分泌水平在手动处理和 Ksep® 400 处理后的细胞之间也保持统计学上的可比性，证实自动化下游处理对 CAR-T 产品质量属性没有不利影响（图 7F-L）。 为了进一步评估自动化收获对细胞增殖能力的潜在影响，将收获的细胞在添加了新鲜IL-2培养基的T型培养瓶中继续培养3天。手动收获和Ksep® 400收获的细胞在收获后的增殖情况相当，两种条件下细胞的扩增均极少，且细胞活力逐渐下降至81%–84%，表明自动化处理和浓缩并未对细胞增殖产生不利影响（图7M）。有趣的是，这种收获后的生长停滞与在250 mL灌流培养中第7–10天观察到的持续增殖形成鲜明对比。这表明，除IL-2之外，生物反应器环境中残留的其他内源性因子（这些因子可能在T瓶中重悬到新鲜培养基中时丢失）可能有助于维持CAR-T细胞在250 mL生物反应器培养中的增殖。 这些结果共同表明，通过 Ksep® 400 进行自动化 CAR-T 细胞产品收集、浓缩和洗涤是高效、可重复的，并且不会影响最终CAR-T 产品质量属性。 讨论 用于大规模CAR-T细胞生产的搅拌罐式生物反应器 异体通用CAR-T疗法的出现为克服自体CAR-T疗法的关键局限性提供了充满希望的契机，这些局限性包括起始材料的不确定性、复杂的物流、较长的交付周期以及较高的单次给药成本。异体疗法能够实现现货供应和大规模生产，有望在显著降低单次给药成本的同时，加速并扩大患者的治疗机会。例如，在近期开展的异体CAR-T ALPHA和ALPHA2 I期临床试验中，患者入组到接受治疗的中位时间仅为2天，与自体CAR-T产品通常需要的4-6周相比，这是一个显著的改进，凸显了异体疗法在为疾病进展迅速的患者提供更及时干预方面的潜力。然而，要充分发挥这一潜力，必须加强和扩大生产工艺，以规模经济的方式生产高产量的高质量 CAR-T 细胞。 迄今为止，异体CAR-T细胞的临床生产主要依赖于摇摆式生物反应器，因为其一次性使用形式便于获取，剪切力低，且在自体CAR-T细胞生产中已有应用历史。尽管摇摆式生物反应器已被用于10升规模的CAR-T细胞培养，但其可放大性有限。在大体积培养中，由于混合不充分、表面积与体积比的限制导致氧气传递受限以及摇摆运动固有的机械限制，其性能可能会受到影响。相比之下，搅拌罐式反应器（STR）通过搅拌桨式搅拌实现卓越的传质效率，并已证实其可放大至20,000升以上。STR可采用批次、补料分批和灌流模式运行，与过程分析技术（PAT）集成良好，并已得到广泛的表征，在单克隆抗体、疫苗和病毒载体的商业化生产中拥有良好的记录。因此，这些特性使STR成为一种稳健且可放大的平台，非常适合实现预计200-2,000升的同种异体批次产能，以满足未来同种异体治疗的需求。 长期以来，人们对T细胞和免疫细胞剪切敏感性的担忧限制了搅拌罐反应器（STR）的应用。然而，我们在此报告了一种通过灌流强化扩增CAR-T细胞的方法，该方法在250 mL规模下，于7-10天内成功实现了30-47 × 10⁶cells/mL的扩增浓度。在2 L规模下，该方法在7天内每批次稳定产生113 ± 7剂功能性CAR-T细胞。在两种生物反应器规模下，尽管细胞暴露于包括蠕动泵、搅拌桨搅拌、氧气鼓泡和ATF灌流在内的剪切应力，但在无血清培养基中，细胞活力仍保持在90%以上的较高水平。这些结果进一步证实了 STR 中T 细胞和 CAR-T 细胞扩增的潜力，证明了这些细胞在优化条件下的韧性，以及STR 平台适合扩大 CAR-T 细胞的生产规模。 虽然之前的研究已证实，在 STR 中可实现高达 1 升的 T 细胞扩增，但本研究首次在多升规模下表征了CAR-T 细胞的特异性质量属性。我们发现，在 2 升 STR 扩增过程中，CAR 转基因表达稳定，最终产品的体外细胞毒性与静态孔板对照组相当。超过 90% 的收获 CD8 +细胞表现出幼稚或中央记忆表型，且耗竭标志物表达极低，这些特征与体内疗效和持久性的提高相关。这些结果支持基于 STR 的多升灌流工艺能够生产大量高质量CAR-T 细胞。本研究采用单供体进行 n = 3 个技术重复，评估了批次间工艺的一致性和可重复性，但仍需开展纳入多供体的进一步研究，以验证该工艺在更广泛的生物学变异性范围内的稳健性。此外，由于本研究仅使用了自体抗 CD19 CAR-T 细胞，未来的研究应将所提出的工艺流程放大到异体 CAR-T 细胞，以评估相关的质量属性，例如TCR/HLA 沉默和最终 CAR-T 产品的同种异体反应性。同时，进一步的工艺开发工作旨在将细胞解冻、激活和转导等上游工艺步骤直接整合到 STR 中，从而实现更精简的一体化生产流程。这将通过消除本研究在生物反应器接种前使用的手动操作、敞口摇瓶操作和离心步骤，促进该工艺向 GMP 环境的转化。此外，本研究中报告的CAR-T 剂量产量仅反映了生物反应器扩增阶段结束时可用的总原料药产量。收获、浓缩、配制步骤以及质量控制过程中可能发生的产品损失并未计入。未来若能将下游工艺流程中所有环节的产品损失纳入分析，则可提供更具代表性的CAR-T细胞全流程剂量产量估算值。 未来大规模CAR-T细胞生产还需要整合先进的过程分析技术（PAT），以便实时、精确地监测生物反应器内CAR-T细胞浓度等关键工艺参数。传统方法依赖于人工取样和离线细胞计数，这会带来污染风险，并随着时间的推移造成宝贵的产品损失。虽然基于电容的生物质传感技术已在抗体生产流程中得到广泛应用，但其在CAR-T细胞生产工艺中的应用目前仍十分有限。本文首次证明了电容传感技术适用于CAR-T细胞浓度的实时原位监测，并在2升规模下与离线活细胞计数结果高度相关（R² = 0.98）。与单频方法相比，多频光谱扫描对于解释CAR-T细胞活化后直径的动态变化至关重要。单频电容测量主要反映活细胞体积的极化，因此对细胞大小随时间的变化较为敏感。相比之下，多频扫描结合多元数据分析，能够更可靠地反映活CAR-T细胞浓度，并且即使在T细胞激活后形态发生变化的情况下，也能在整个扩增过程中保持测量精度。 除了无需人工取样和改进过程监控外，电容传感技术的集成还为增强CAR-T细胞疗法的工艺控制提供了契机，可通过实时根据细胞生长情况自动调整灌流速率等关键工艺参数。基于电容测量的自动灌流速率控制已成功应用于提高病毒载体和抗体产量，同时降低了15%的培养基总消耗量。将类似的灌流控制技术应用于大规模同种异体CAR-T细胞生产中，使灌流速率与CAR-T细胞激活后生长速率的波动自动匹配，有助于最大限度地降低培养基消耗和总体成本。 搅拌罐式生物反应器有助于实现基于质量设计的CAR-T工艺开发 传统CAR-T细胞生产平台的一个关键局限性在于缺乏经过验证的规模缩小模型（SDM），这些模型能够准确模拟生产规模的条件，从而实现对关键工艺参数及其对产品质量影响的小规模、低成本高通量筛选。在本研究中，我们验证了Ambr® 250 HT作为代表性的SDM，能够预测在2 L Univessel®中观察到的工艺性能和CAR-T产品结果。由于几何形状和基于匹配的P/V值的流体动力学特性相似，250 mL和2 L规模的工艺性能和CAR-T质量属性高度可比，这已通过对细胞产量、表型、细胞毒性和细胞因子分泌的单变量和多变量分析得到证实。这种方法反映了商业生物制药生产中已确立的做法，其中代表性的 SDM 通常用于支持商业工艺开发和优化。 在本研究之前，我们利用 Ambr® 250 HT 系统对灌流工艺进行了广泛的表征和优化，从而实现了本文所示的 2 L 规模的无缝放大。类似地，较小的Ambr® 15 系统（15 mL）最近也被用于在 2 个月内将腺相关病毒生产工艺放大至2,000 L。因此，基于 SDM 的策略为同种异体 CAR-T 疗法的开发者提供了一个强大的平台，可以高效地评估包括细胞来源、培养基、细胞因子、环境控制和灌流方案在内的各种参数，并实现小规模和高通量应用。这种方法可以优化工艺生产率、产品质量和成本，同时加速并降低向临床或商业规模放大的风险。至关重要的是，基于SDM的工艺表征符合FDA在ICH Q8 (R2)指南中概述的、长期以来用于药物生产的QbD原则，并支持FDA近期在CAR-T细胞产品开发指南中强调的工艺理解水平。此外，当与机器人技术、机器学习和数字建模相结合时，诸如Ambr® 250 HT之类的小型并行生物反应器系统非常适合加速自主、自优化工艺开发的新兴趋势，正如最近在基于灌流的抗体生产中所展示的那样。 可放大的CAR-T细胞下游工艺的考虑因素 CAR-T细胞大规模生产的转变需要同样可放大的下游解决方案，以高效处理多升批次的产品。本研究表明，Ksep® 400逆流离心系统成功地实现了从2升生物反应器中自动收集、洗涤和浓缩CAR-T细胞，回收了超过90%的总活细胞，同时实现了9倍的体积缩减，从而使后续的下游工艺更加易于管理。这一回收效率高于先前报道的2升规模T细胞回收率（69%），凸显了优化流速、离心力和处理时间等参数如何显著提高收集效率。重要的是，这些下游操作的自动化并未对CAR-T细胞的活力、表型或细胞毒性产生任何不利影响，证明其适合作为大规模CAR-T细胞生产的可放大自动化解决方案。虽然本研究采用PBS缓冲液清洗和浓缩收获的CAR-T细胞产品，但如果将最终冷冻保存配方直接整合到该工作流程中，则可省去单独的配方单元操作，从而进一步简化最终产品的制备。未来的下游开发工作应着重于可放大的制剂和灌装解决方案，以便将大量CAR-T细胞高效、大规模地包装到最终产品袋中，使其适于冷冻、储存和运输至治疗中心。 结论 这项工作展示了在无血清培养基中，利用多升一次性搅拌罐反应器（STR）进行灌流，实现CAR-T细胞的可放大扩增至高密度，每批次可产生超过110个功能剂量。逆流离心被证明是一种可放大的下游操作，能够简化和自动化CAR-T产品的收集、浓缩和洗涤，将其整合为一个多升规模的单元操作，且不会对产品质量产生不利影响。电容传感技术已被验证可用于实时监测2升STR中CAR-T细胞的浓度，为未来改进灌流工艺控制提供了可能。Ambr® 250被证实是一种具有代表性的规模缩小模型（SDM），能够显著支持同种异体CAR-T工艺的开发并降低规模化生产的风险。总而言之，所提出的工作流程提供了一个稳健且可放大的生产平台，以满足未来对同种异体疗法的需求，并有助于推动CAR-T生产向成熟的大规模商业生物制品生产标准迈进。 原文：P.Springuel, P.S.Couto, D.H.Stibbs, et al., Scalable CAR-T production in a 2-litre perfusion stirred-tank bioreactor with automated harvesting and scale-down model characterization. Front. Bioeng. Biotechnol.,2026.