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大家好，今天给大家分享一篇发表在Science Translational Medicine上的文章，题目为：Small-molecule inhibition of YTHDC1 as a strategy  against acute myeloid leukemia in mouse models本文通讯作者为四川大学的杨胜勇教授、浙江大学医学院的裴善赡研究员和四川大学的李琳丽教授，他们的研究方向聚焦于RNA表观遗传修饰在肿瘤发生中的作用及其靶向药物开发。     在RNA表观遗传学领域，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物信使RNA中最丰富的转录后修饰，通过“写入器”、“擦除器”和“阅读器”蛋白动态调控mRNA代谢与功能，在多种生理和病理过程中发挥关键作用。其中，m6A阅读器蛋白YTHDC1在RNA剪接、多聚腺苷酸化和核输出等核内过程中扮演重要角色，其异常表达与急性髓系白血病（AML）的发生发展密切相关。YTHDC1在AML细胞中过表达，对白血病细胞增殖、生存及白血病干细胞（LSC）的自我更新至关重要，被视为治疗AML的潜在靶点。然而，迄今为止尚未报道具有体内活性的高效YTHDC1抑制剂，其治疗潜力仍属未知。     为此，研究团队通过基于荧光偏振的高通量筛选，从约2.5万个化合物中发现了先导化合物Hit-1，并经过结构导向的逐步优化，最终获得了首个具有纳摩活性（IC50 = 7.4 nM）的高选择性YTHDC1小分子抑制剂YL-5092。通过X射线晶体学解析了YL-5092与YTHDC1 YTH结构域的复合物结构（分辨率1.65 Å），揭示了其通过氢键、疏水相互作用和π-π堆积等与关键残基结合，占据m6A结合口袋并诱导局部构象变化，从而竞争性抑制YTHDC1与m6A-RNA的结合。选择性实验表明，YL-5092对其他YTH家族蛋白（YTHDC2、YTHDF1-3）、IGF2BP1-3、HNRNPA2B1以及416种激酶均无显著抑制活性，表现出优异的选择性。     在细胞层面，YL-5092在AML细胞中能选择性结合并稳定YTHDC1蛋白，阻碍其与m6A底物的结合，并显著抑制YTHDC1介导的液-液相分离（LLPS）及核凝聚体形成。进一步机制研究表明，YL-5092处理导致YTHDC1下游关键靶基因（如MYC、FOXM1、GINS1、MCM2/4/5）的mRNA稳定性下降、表达降低，进而通过转录组与表观转录组整合分析，系统揭示了YL-5092通过干扰YTHDC1依赖的m6A修饰转录本稳定性，调控细胞周期、凋亡和分化相关通路。     在体外抗白血病活性评价中，YL-5092对多种AML细胞系及原代AML样本均表现出强效生长抑制活性（IC50范围0.28–2.87 μM），并能诱导细胞周期阻滞、促进凋亡和髓系分化。值得注意的是，YL-5092能显著抑制AML白血病干细胞/祖细胞（LSPCs）的集落形成能力，而对正常脐带血来源的造血干细胞/祖细胞（HSPCs）影响甚微，展现出良好的治疗窗口。     在体内研究中，YL-5092具有良好的药代动力学特征和安全性，在细胞系来源和患者来源的AML异种移植模型中均能显著抑制白血病进展、降低肿瘤负荷、延长小鼠生存期，并能有效损伤白血病干细胞功能。此外，YL-5092与临床标准疗法Venetoclax/Azacitidine（Ven/Aza）联用表现出强效协同抗白血病效应，并能克服Ven/Aza耐药相关通路，为AML联合治疗提供了新策略。     本研究首次报道了具有体内高效抗白血病活性的YTHDC1选择性抑制剂YL-5092，通过多维度机制研究系统阐明了其通过干扰YTHDC1功能、破坏m6A依赖的转录本稳定性进而抑制AML的分子基础。该工作不仅为靶向RNA修饰的抗肿瘤药物开发提供了新的化学实体和概念验证，也为克服AML异质性与耐药性、实现精准治疗开辟了新的方向。未来，YL-5092及其衍生物的进一步临床转化研究，有望为AML及其他YTHDC1依赖的恶性肿瘤患者带来新的治疗希望。 该项工作主要完成人为：张海林、李越山、赵印、王发禄、林桂凤等，原文链接： https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/scitranslmed.adu3137

文章链接DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1632； 本研究由上海交通大学卢莹教授与大连医科大学附属第二医院血液科共同完成。 一句话说出结论：奥希替尼通过与白血病干/祖细胞表面的CD34蛋白发生共价结合，抑制了Src家族激酶（SFK）及下游STAT3信号通路的活化，从而选择性地诱导CD34高表达的髓系白血病细胞凋亡，为治疗这类难治性白血病提供了新的治疗策略和生物标志物。 作为生命科学领域的专家，我将为您深入剖析这篇发表在《Cancer Research》上的重磅文献。 1. 科学问题如何提出，有什么意义？ 科学问题的提出： 该研究的科学问题源于一系列临床观察和基础研究中的矛盾与未解之谜： 历史观察与临床失败： 早在2007-2008年，就有个案报道第一代EGFR抑制剂（如厄洛替尼）在治疗肺癌的同时，意外地使合并的急性髓系白血病（AML）患者达到完全缓解。体外研究也证实了其对AML细胞的促分化作用。然而，后续的多项临床试验结果却大多是阴性的，效果不佳。 作用机制的悖论： AML细胞本身几乎不表达EGFR，这意味着EGFR抑制剂的抗白血病作用是一种“脱靶效应”（off-target effect）。虽然有研究提示可能与SYK、JAK1等激酶有关，但其精确的脱靶靶点和作用机制仍不明确。 临床转化的关键缺失： 临床试验失败的核心原因在于，研究者们不清楚到底哪一个亚型的AML患者可能从EGFR抑制剂治疗中获益，即缺乏一个有效的生物标志物（biomarker）来筛选优势人群。 新药的未知潜力： 奥希替尼（Osimertinib）是第三代、不可逆的共价EGFR抑制剂，其作用模式与前代可逆抑制剂不同。它是否对AML有效，以及其潜在的脱靶机制是什么，完全是未知的。 研究意义： 解决临床难题： AML是一种致死率高、易复发的恶性血液肿瘤，尤其是化疗耐药和复发的患者，治疗选择极为有限。其复发的根源在于化疗无法清除的白血病干/祖细胞（LSC），而这些细胞通常高表达CD34。如果能找到一种有效清除CD34+ LSC的药物，将对改善AML患者预后、降低复发率具有革命性的意义。 药物重定位（Drug Repurposing）： 奥希替尼是治疗EGFR突变非小细胞肺癌的重磅药物。发现其在白血病中的新用途，是一种典型的“老药新用”，可以大大缩短新药研发周期和成本，快速为白血病患者提供新的治疗选择。 揭示新生物学机制： 本研究旨在阐明奥希替尼在AML中的EGFR非依赖性作用机制。这不仅能解释长久以来关于EGFR抑制剂抗白血病效应的谜团，更重要的是，可能发现新的药物靶点（如本文中的CD34）和信号通路，加深对白血病干细胞生存机制的理解。 2. 逻辑上如何证明科学问题，研究内容是什么？ 研究者采用了一个“从现象到机制，再到临床验证”的严谨逻辑链来证明其核心科学问题。 研究内容与逻辑步骤： 现象观察：奥希替尼选择性杀伤CD34+白血病细胞。 首先验证奥希替尼对来自AML和CML（慢性髓系白血病）患者的原代CD34+细胞具有强效的、剂量依赖性的凋亡诱导作用。 通过对比，证明第一代抑制剂厄洛替尼和另一种共价抑制剂伊布替尼效果远不如奥希替尼，暗示了其独特的作用机制。 关键对比实验：发现奥希替尼对CD34-的白血病细胞几乎没有杀伤效果。在含有CD34+和CD34-细胞的混合样本中，奥希替尼优先清除了CD34+群体。这是整个研究的逻辑起点。 机制探索（一）：寻找直接靶点——CD34。 排除EGFR： 首先确认AML细胞不表达EGFR，排除了其经典靶点。 提出假设： 基于奥希替尼对CD34+细胞的选择性杀伤，大胆假设CD34本身可能就是药物的直接靶点。 直接结合验证： 设计并合成了带生物素（Biotin）标签的奥希替尼探针（biotin-osimertinib）。 通过Pull-down实验，证明该探针可以直接“钓”到纯化的重组CD34蛋白以及细胞裂解液中的内源性CD34蛋白，且这种结合可以被过量的、无标签的奥希替尼竞争掉，证明了结合的特异性。 确定共价结合位点： 利用质谱（MS）技术，分析与奥希替尼孵育后的CD34蛋白，精确鉴定出药物通过迈克尔加成反应，共价结合在了CD34胞外域的半胱氨酸199位（C199）和177位（C177）。 功能性验证： 利用CRISPR-Cas9技术敲除细胞中的CD34，发现细胞对奥希替尼的敏感性显著降低。再将野生型CD34（CD34-WT）或C199/C177突变型CD34（CD34-mut）回补到敲除细胞中，发现只有回补WT-CD34的细胞才恢复了对药物的敏感性。这在遗传学上完美证明了奥希替尼是通过结合CD34的C199/C177位点来发挥作用的。 机制探索（二）：连接“胞外结合”与“胞内凋亡”的信号通路。 寻找信号变化： 药物结合在胞外，如何引起胞内凋亡？研究者利用磷酸化蛋白质组学技术，分析用药前后细胞内酪氨酸磷酸化水平的变化。 发现关键信号分子： 发现奥希替尼处理后，CD34蛋白胞内域的酪氨酸329位（Y329）磷酸化水平显著下降，同时Src家族激酶（SFK，包括Src, Lyn等）的活性被抑制。 建立连接： 通过免疫共沉淀（Co-IP）实验，证明CD34与Src激酶存在物理相互作用。 奥希替尼处理会破坏CD34与Src的结合，且这种破坏依赖于CD34的C199位点。 体外激酶实验证明，Src和Lyn可以直接磷酸化CD34的Y329位点。 确定下游通路： 发现SFK的下游关键效应分子STAT3的磷酸化水平也随之被抑制。使用SFK抑制剂或STAT3抑制剂与奥希替尼联用，表现出协同杀伤效果。 完整通路描绘： 奥希替尼结合CD34胞外域 -> 改变CD34构象 -> 破坏其与胞内Src激酶的结合 -> 导致CD34-Y329磷酸化水平下降，同时SFK/STAT3信号通路被抑制 -> 细胞凋亡。 临床意义和转化验证。 生物标志物确立： 分析TCGA等大型临床数据库，发现CD34高表达是AML不良预后的独立风险因素，并且与特定的基因突变模式（如CEBPA突变）相关。这为筛选优势人群提供了理论依据。 临床前模型验证： 在AML患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中，证明奥希替尼能有效清除CD34high的白血病细胞，延长小鼠生存期，且对正常的CD34+造血干细胞毒性较小，展示了良好的治疗窗口。 初步临床观察： 对两名常规治疗失败的CD34高表达AML患者进行同情用药，观察到奥希替尼治疗后，患者的外周血白细胞和原始细胞比例迅速下降，证实了其在真实世界中的抗白血病活性。 3. 关键的实验技术有哪些？ 细胞生物学技术： 流式细胞术（FACS）： 用于分选CD34+和CD34-细胞，以及检测细胞凋亡（Annexin V/PI染色）、细胞表面标志物等。 集落形成实验（Colony formation assays）： 评估药物对干/祖细胞增殖和分化潜能的影响。 蛋白质组学与质谱技术（MS）： 这是本研究的核心技术，用于机制发现。 定量磷酸化酪氨酸蛋白质组学： 无偏向性地筛选药物处理后发生磷酸化水平变化的蛋白和位点，是发现信号通路变化的关键。 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）： 用于鉴定Pull-down或IP实验的蛋白，以及鉴定奥希替尼在CD34上的精确共价结合位点。 免疫沉淀-质谱（IP-MS）： 用于鉴定与CD34相互作用的蛋白（发现了Src）。 平行反应监测质谱（PRM-MS）： 一种靶向质谱技术，用于精确定量特定肽段（如CD34-Y329磷酸化肽段）的丰度变化，作为Western Blot的有力补充和验证。 化学与生物化学技术： 化学探针合成： 合成生物素标记的奥希替尼探针，是进行靶点垂钓（Pull-down）的前提。 Pull-down实验： 利用“探针-靶蛋白”的亲和作用，验证药物与CD34的直接结合。 免疫共沉淀（Co-IP）： 验证内源性蛋白之间的相互作用（CD34与Src）。 体外激酶实验（In vitro kinase assay）： 在试管中验证Src/Lyn激酶能否直接磷酸化CD34的特定肽段。 分子生物学与遗传学技术： CRISPR-Cas9基因编辑技术： 用于敲除（Knockout）CD34基因，并通过质粒回补野生型或突变型CD34，是功能验证的“金标准”，有力证明了CD34及其特定位点在药效中的关键作用。 动物模型与临床研究： 患者来源的异种移植（PDX）模型： 将患者的白血病细胞植入免疫缺陷小鼠体内，构建能更好模拟人体肿瘤特征的动物模型，用于评估药物的体内疗效和安全性。 生物信息学分析： 对TCGA、BeatAML等公共数据库进行生存分析和基因表达谱分析，挖掘CD34的临床预后价值。 4. 从文章逻辑性中找到逻辑链接的关键点，并阐明关键点的重要意义。 关键点一：奥希替尼对CD34+细胞的“选择性杀伤”现象。 意义： 这是整个研究的**“逻辑起点”和“驱动力”**。如果奥希替尼对所有白血病细胞都有效，或者对CD34+和CD34-细胞没有差异，研究者就不会将目光锁定在CD34上。正是这种高度的选择性，才催生了“CD34本身可能是靶点”这一极具创新性的假设。它将一个经典的细胞表面标志物，推向了药物直接靶点的前台。 关键点二：证明奥希替尼与CD34的“直接共价结合”。 意义： 这是研究的**“机制核心”**。通过化学探针Pull-down和质谱鉴定结合位点，将药物和CD34直接“绑定”在一起。这一发现颠覆了传统认知，即CD34不仅仅是一个被动标记，而是一个可以被小分子药物直接作用并改变其功能的蛋白。它为“脱靶效应”找到了一个确凿的“靶”，是整个故事中最坚实的证据。 关键点三：揭示“CD34-Src相互作用被药物破坏”的信号转导机制。 意义： 这是连接“胞外事件”与“胞内效应”的**“跨膜信号桥梁”**。它完美地解释了药物结合在细胞膜外的CD34上，为何能引起细胞内部的凋亡信号。通过证明药物结合破坏了CD34与Src激酶的“联盟”，从而关闭了下游的SFK-STAT3促生存通路，使得整个生物学故事链条完整且自洽。 关键点四：将“CD34高表达”确立为疗效预测的“生物标志物”。 意义： 这是从基础研究迈向临床应用的**“转化桥梁”**。通过对临床大数据的分析和PDX模型的验证，研究不仅找到了新靶点，还回答了最初的临床问题：“哪类病人会获益？”。答案就是CD34高表达的患者。这使得奥希替尼治疗白血病从一个模糊的概念，变成了一个具有明确指导原则的精准治疗策略，极大地提升了研究的临床转化价值。 5. 逻辑总结 （1）用简单的逻辑线路总结科学问题： AML化疗易复发（因LSC存在） -> 第一代EGFRi临床试验失败（因靶点和优势人群不明） -> 第三代共价EGFRi（奥希替尼）是否有效？ -> 其作用的精确脱靶靶点和信号通路是什么？ -> 如何利用该机制指导临床用药？ （2）用简单逻辑线路总结实验技术流程: 流式分选CD34+细胞验证药效 -> 化学探针Pull-down发现直接靶点CD34 -> 质谱鉴定共价结合位点C199/C177 -> CRISPR基因编辑验证靶点功能 -> 磷酸化组学筛选信号通路（SFK/STAT3） -> Co-IP和激酶实验验证信号连接 -> PDX模型和临床病例验证体内疗效和临床相关性。 （3）有逻辑性的讲述解决科学问题的经过及背后科学原理： 本研究始于一个长久悬而未决的医学谜题：为什么靶向EGFR的药物会对不表达EGFR的白血病产生作用，但临床应用却屡屡失败？研究团队敏锐地将目光投向了新一代的共价抑制剂奥希替尼，并观察到了一个关键现象：它能高效且选择性地杀死作为白血病复发根源的CD34+白血病干/祖细胞，而对CD34-细胞无效。 这一现象背后的科学原理是什么？他们大胆假设，CD34本身就是奥希替尼的“脱靶”靶点。为了验证这一点，他们采用化学和蛋白质组学手段，首先通过“分子鱼钩”（生物素标记的奥希替尼）成功“钓”到了CD34蛋白，证实了二者的直接结合。接着，利用高精度质谱，他们进一步揭示了结合的本质：奥希替尼像一把带锁的钥匙，通过其活性基团与CD34蛋白胞外域的C199和C177两个半胱氨酸残基形成了不可逆的共价键。最终，通过CRISPR基因编辑这一遗传学“铁证”，他们证明了正是这个结合事件，介导了奥希替尼的杀伤作用。 然而，药物结合在细胞外部，如何触发细胞内部的“自毁程序”？这背后必然有信号的传递。研究团队再次运用蛋白质组学，发现药物结合后，CD34与胞内的Src激酶“分道扬镳”，导致Src激酶及其下游的STAT3促生存信号通路被“关闭”。这揭示了一个精巧的信号转导机制：奥希替尼的外部结合引起CD34构象变化，破坏了其作为“支架”蛋白维持内部促生存信号的能力，最终导致癌细胞凋亡。 最后，研究回归临床。他们发现，CD34高表达本身就是AML患者预后不良的标志。这恰好与他们的发现形成完美闭环：CD34高表达的肿瘤更“毒”，但也恰恰是这类肿瘤，对靶向CD34的奥希替尼最敏感。通过在小鼠模型和两名患者身上的成功应用，他们最终将这一系列基础发现转化为了一个有巨大潜力的、针对特定患者群体的精准治疗新策略。 6. 基于这篇文章能进一步衍生的课题有哪些 药物优化与开发： 能否设计一种新型的、只靶向CD34而不影响EGFR的共价抑制剂？这将能避免在白血病患者中使用时可能出现的EGFR相关副作用（如皮疹、腹泻），实现更精准、更安全的治疗。 探索其他已知的共价激酶抑制剂库，看是否还有其他药物也具备与CD34结合的能力。 深入机制研究： 利用冷冻电镜（Cryo-EM）等结构生物学技术，解析奥希替尼与CD34结合前后的三维结构，从原子层面揭示药物结合如何引起构象变化，并破坏与Src的相互作用。 CD34的Y329位点磷酸化除了与Src/STAT3通路有关，是否还调控其他信号通路或细胞功能？其在正常造血干细胞中的作用是什么？ 奥希替尼对CD34+的正常造血干细胞毒性较低的深层原因是什么？是因为表达量差异，还是正常细胞内有更强的代偿或保护机制？ 临床转化研究： 发起正式临床试验： 基于本文强大的临床前数据和初步人体数据，应设计并开展一项针对复发/难治性、CD34高表达AML/CML患者的I/II期临床试验，以系统评估奥希替尼的疗效和安全性。 联合用药策略： 探索奥希替尼与其他AML标准疗法（如化疗药物、Venetoclax等）或CML疗法（如伊马替尼等TKI）的联合应用，看是否能产生协同增效，甚至根除白血病干细胞，实现“停药”可能。 拓展应用领域： CD34不仅表达在造血干细胞上，还表达在血管内皮祖细胞、某些肿瘤的干细胞上。奥希替尼是否对其他CD34阳性的实体瘤（如某些肉瘤）具有治疗潜力？ 反向思考，奥希替尼对正常CD34+细胞的暂时性抑制作用，是否可以被用于造血干细胞动员，作为一种新型的动员剂辅助干细胞移植？这是一个极具想象力的方向。 探究在自身免疫性疾病等领域，CD34+细胞是否也扮演重要角色，奥希替尼是否能成为一种新的免疫调节剂。