Grazoprevir Hydrate

供稿：白乔 编辑：弓长 最新一期的JMC期刊，以A Decade of FDA-Approved Drugs (2010–2019): Trends and Future Directions为题，发表综述性文章，详细分析、总结了过去10年FDA批准新药的情况，并对未来进行了展望。 2010年至2019年间，美国FDA共批准了378种新药和27种生物仿制药，其中肿瘤领域占25%，感染领域占15%和中枢神经系统领域占11%。监管激励颇有成效。伴随孤儿药物适应症的增加，药物的临床开发时间正在延长。小分子仍然主要遵循5R法则，但随着反义寡核苷酸（ASO）、siRNAs和ADC药物的批准，新模式的创新药正在迅速进展。背 景 在过去的十年里，由于专利到期、研发成本增加以及获批数量不断减少的预测给制药行业带来了巨大挑战。2009年的一份报告估计，2010年至2014年间，超过2090亿美元的年销售额将因专利到期而面临风险，如阿托伐他汀（2006年销售峰值为130亿美元）在2011年失去了独占权，氯吡格雷（峰值年销售额为71亿美元）和孟鲁司特（2012年峰值年销售额为55亿美元）都在2012年都失去了排他性。2009年《生物制品价格竞争与创新法案》（BPCIA）的出台鼓励了生物制品的仿制药竞争，如销量第一的处方药阿达木单抗（2018年峰值年销售额为199亿美元）面临不少于四个生物仿制药的竞争（在过去的4年里均获得批准）。 除了畅销药的市场份额因仿制药竞争而丧失外，由于上市的创新新药数量不断减少，人们还担心原创新药（first in class，FIC）已停滞不前，新批药物将无法弥补因专利过期而造成的损失。例如，2007年只有19个新分子实体(new molecular entities，NMEs)获得批准，这是自1983年以来的最低数字；并且FIC只有29%，在2009年进一步下降到17%。上世纪90年代和21世纪初占主导地位的“畅销药”狂热和“Mee-to”药物概念似乎不再是维持该行业的可行模式。 综上所述，这些因素使得制药行业必须进行自我改造，以阻止预期的新药数量下降，并将创新药推向市场。比医药行业健康更重要的是，患者尚未满足的医疗需求迫切需要发明创新药物。 2010-2019年批准的药物数量 从2010年到2019年，共有289个新分子实体（NME）、89个生物许可证申请（BLA）和27个生物仿制药获得批准（图1）。在过去十年中，每年NME和BLA批准的中位数为40个，2010年最低为21个，2018年最高为59个。 相比之下，在2000年至2009年的十年中，每年批准25种新药，2004年最高36种，2007年最低18种。BLA批准的比例在过去十年中没有变化（图1），平均占所有新药批准的23%（不包括生物仿制药）。2013年批准的BLA比例最低，为8%，而2015年为32%。自2015年FDA首次批准以来，生物仿制药的批准数量稳步增长。 图1 2010年至2019年批准的NME和BLA数量 2010年至2019年批准的新分子实体（NME）、生物许可证申请（BLA）和生物仿制药的数量 批准时间 本文比较了2010年至2019年268种新药从提交IND（investigational new drug）申请到最终NDA（new drug application）批准的时间（图2）。 图2 从IND申请到药品批准的时间 从IND申请到NDA批准的平均时间为8.7年（±3.8），中位数为8.1年（范围2.2-23.2）。EGFR抑制剂osimertinib从IND申请到NDA批准的为2.2年，创造了最短批准时间记录；deflazacort 为2.3年。相反，伊巴利珠单抗和flibanserin从IND申请到NDA批准分别花了16年和18年。 过去，从IND申请到NDA批准的时间表的研究见表1。1987年至1989年间，IND到NDA批准的中位总时间为7.7年，中位开发时间为4.2年，监管时间为2.5年。1990年至1992年期间，这一时间保持相对稳定（IND至NDA批准的总时间中位为7.8年，临床开发中位为4.9年，监管审查中位为2.0年）。1992年至2002年期间，从IND申请到NDA批准的中位时间减少到6.4年，临床试验的中位时间为5.1年，监管审查的中位时间为1.2年。 监管批准的显著加快归功于1992年《处方药使用者费用法》（PDUFA），该法将使用者费用作为一种机制来资助监管审查并减少审查时间。今天，许多快速审查认定有助于减少监管审查时间，包括快速通道（1988年开始）、优先审查和加速批准（1992年）和突破性疗法（2012年）（图4）等。 图4 药物加速审批通道 因此，从2012年到2016年，非快速审查药物从IND到NDA的中位时间为8.0年，突破性治疗药物获批速度最快，中位数为4.8年。根据FDA的最新数据，自20世纪90年代中期以来，批准时间一直保持一致，2016年优先审查的中位数为8个月，而标准审查申请为10个月。 尽管批准时间在很大程度上是由于加速审查而加快，但近年来临床试验周期（特别是II期和III期试验）却增加了。Martin等人推测，开发时间的增加可能是由于试验设计的复杂性增加。 快速审查状态 为了加速治疗危及生命或严重疾病的药物进入市场，FDA制定了四个加速审查通道：优先审查、快速通道、突破性疗法和加速批准（图4）。这些通道并不是相互排斥的，意味着一种药物可以在其中一个以上的通道中进入快速审评状态。 图5 2010-2019年FDA批准药物的快速审查类别 每个条形图表示每个类别相对于给定年份批准的所有药物的百分比。一种药物可以分为多个类别。 图5显示了2010年至2019年FDA批准药物的快速审评状况。例如，在2019年批准的48种药物中，17种是快速通道（35%），13种是突破性疗法（27%），28种是优先审查（58%），9种是加速批准（19%）。 在快速审评类别中，优先审评名称占大多数，自2014年以来，每年有一半以上的药品批准属于这一类别（图5）。在过去的十年中（2010年除外），FDA批准的具有快速通道名称的药物的百分比保持相对稳定，平均为35%。自2012年引入突破性类别以来，越来越多的药物被授予这一称号，目前占批准药物的25%。 最严格的通道是加速批准，平均只有13%的新药获得加速批准。加速批准认定授予药物的早期批准，并要求进行进一步的临床研究以确认疗效，因此被谨慎使用。例如，2019年只有9种化合物获得加速批准，其中7种为肿瘤适应症；2018年加速批准的3/4的药物也是用于肿瘤。 同一个药物可能进入多个加速审批通道，例如larotrectinib同时获得突破性和优先性评价，duvelisib获得快速通道和优先性评价，lorlatinib获得突破性和优先性评价，migalastat获得快速通道和优先性评价。 治疗领域 对2010年至2019年批准的289个NME和89个BLA的治疗区域进行了分析，发现：FDA批准新药的前五大治疗领域（NME和BLA）是肿瘤学（25%）、感染（14%）、中枢神经系统（CNS）疾病（12%）、代谢紊乱（7%）和心血管疾病（6%）（图7a）。大约4%的新批准用于血液学、呼吸学、成像/诊断学、胃肠道和免疫学等综合领域（图7a）。 图7 2010-2019年各治疗领域批准的药物 （a） 基于378个批准的NME和BLAs 2010-2019年按疾病区域划分的批准百分比 ；（b） 治疗区批准分为2010-2014年（橙色，158）和2015-2019年（绿色，220） 分析2010-2014年和2015-2019年的治疗领域（图7b）发现：血液学的批准在过去十年中有所增加；2010-2014年只有3种药物获得批准（1.9%），而2015-2019年间有14种药物获得批准（6.3%）。 另一方面，一些疾病领域的新药批准比例出现了小到中度下降，包括代谢紊乱（2015年至2019年为5.4%，2010年至2014年为10%）、呼吸系统疾病（2015年至2019年为3.1%，2010年至2014年为6.3%）和成像/对比剂（2015年至2019年为3.1%，2010年至2014年为6.3%）。 值得注意的是，2018年未批准心血管或糖尿病药物，2019年仅批准一种某一特定疾病领域的药物。审批速度放缓可能表明，目前的护理标准足以覆盖大多数患者。此外，如果许多标准的治疗方法是非专利的或很快将是非专利的，那么一种新药需要有明确的患者利益，以证明新疗法的收益高于非专利疗法。 在典型的研发策略中，病人需求、差异化和经济可行性都是需要考虑的因素。由于新药批准是一个滞后的投资指标，鉴于从临床前开发到批准的平均时间很长，市场上的任何新药都反映了过去几十年的研究投资。 肿 瘤 在过去十年中，癌症治疗的一个重大突破是免疫肿瘤学（I-O）药物的引入，这一领域的一个重大进展是发现T细胞可以通过所谓的“免疫检查点”开启或关闭。这一途径的主要调节因子被鉴定为CTLA-4。伊普利单抗，一种CTLA-4抗体，在2011年被批准用于转移性乳腺癌，标志着免疫肿瘤药物的首次批准。2014年，PD-1阻断剂彭布罗利珠单抗是首个批准的二代免疫肿瘤药物。 过去十年中，批准的另一类重要的新型癌症治疗药物是PARP抑制剂（图8），BRCA的突变使肿瘤细胞对PARP抑制剂敏感。第一个PARP抑制剂olaparib于2014年获批，用于BRCA突变的晚期卵巢癌；之后批准的其他PARP抑制剂有rucaparib 14（2016）、niraparib 15（2017）和talazoparib 16（2018）。 在2010-2019年批准的103种肿瘤药物中，首批适应症最多的是白血病（表2，17%），其次是乳腺癌（12%）和非小细胞肺癌（9%）。在18项白血病批准中，50%为FIC药物，包括：IDH1抑制剂ivosidenib（2018）、IDH2抑制剂enasidenib（2017）、KIT/FLT3）抑制剂midostaurin（2017）以及BCL-2抑制剂venetoclax（2017）。其他被批准用于白血病的新型激酶抑制剂包括PI3Kδ抑制剂idelalisib（2014）、BTK抑制剂ibrutinib（2013）和Bcr-Abl抑制剂ponatinib（2012）。此外，两个BLA批准被认为是FIC：CD22-ADC药物inotuzumab（2017）和CD19/CD3双特异性抗体blinatumomab（2014）（表2）。 在过去的十年中，FDA批准越来越多的肿瘤药物伴随诊断。自1998年批准第一个曲妥珠单抗伴随诊断以来，共计批准44个伴随诊断。在2010年至2019年的38项FIC肿瘤药物中，FDA批准12项伴随诊断。 新型抗病毒药物 2010-2019十年，见证了多种新机制药物用于对抗病毒感染。2018年，CD4抗体ibalizumab-uiyk获得批准，这是十多年来首个针对HIV的单克隆抗体和新的治疗机制。此外，一种治疗巨细胞病毒（CMV）的新药letermovir 于2017年获得批准（图11），是一种抑制DNA末端酶复合物的非核苷CMV抑制剂，其独特的作用机制带来较少的不良反应。 过去十年中，抗病毒药物带来最大影响的是丙型肝炎病毒（HCV）治疗。2011年，boceprevir 被批准为第一个NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂，与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合使用。2013年，第一个NS5B聚合酶抑制剂sofosbuvir获得批准，接着是NS5A抑制剂如达克拉他韦。莱迪帕韦（也是一种NS5A抑制剂）和索福布韦29的联合治疗12周和24周的患者中，HCV的缓解率分别为94%和99%。另一种NS5A抑制剂velpatasvir于2016年获得批准，其他许多新的HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂包括simeprevir、paritaprevir、grazoprevir、glecaprevir和voxilaprevir（图12）。 新型抗菌、抗寄生虫药 抗菌药物的批准也在增加。由于超级细菌和抗药性细菌的新兴危机，以及许多大型制药公司的大规模撤资，GAIN法案（“立即产生抗菌激励”）于2011年通过，为新抗生素提供了5年的市场排他性和快速通道批准。治疗威胁生命的感染的潜在药物可获得合格传染病产品（qualified infectious disease products，QIDP）称号，并允许利用GAIN法案激励。 自2014年以来，共有15种新抗菌药物获得QIDP认证（表3）。尽管GAIN法案鼓励开发新的抗生素，但新的抗菌疗法仍然难以捉摸，绝大多数批准来自传统疗法，如四环素类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类。 β-内酰胺酶抑制剂出现了一些创新性的发展，如瓦博巴坦（2017）是第一种与美罗培南联合使用的oxobooleβ-内酰胺酶抑制剂（图13）。另一类新的β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦（一种非β-内酰胺），2015年与头孢他啶联合使用获得批准。 一些治疗被忽视的热带疾病的药物也获得批准，例如用于治疗耐多药结核病（TB）的pretomanid（2019年），用于河盲症的moxidectin（2018年），用于治疗疟疾的tafenoquine（2018年）等。 慈善和慈善基金会推动并促成了许多热带病药物的开发，例如pretomanid 是由全球结核病药物开发联盟（TB联盟）开发的，而tafenoquine 是由疟疾风险投资公司和葛兰素史克公司（GSK）合作开发的。这些类型的基金会和合作对于解决被忽视的热带疾病至关重要，因为这些疾病缺乏重大的经济利益来激励投资进行新药研究、开发和商业化。 中枢神经系统药物 本世纪初，神经科学药物开发出现了重大变化，几家主要制药公司包括阿斯利康、葛兰素史克、诺华和辉瑞在内进行了大规模撤资。这种急剧撤资的部分原因是开发精神病药物的风险越来越大，生物标志物并不容易获得。但令人惊讶的是，在研发大量退出的背景下，在整个十年中，批准的中枢神经系统药物数量保持稳定，占总批准量的10%。 其中，依达拉奉是20年来批准的第一种新的肌萎缩侧索硬化症（ALS）治疗方法（图14）。nusinersen，是第一个被认可的治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的方法。 SMA是一组以运动神经元丧失为特征的罕见神经肌肉疾病。SMA是几种疾病亚型的总称，由发病年龄和疾病严重程度来定义。SMA是由运动神经元存活基因1（SMN1）基因突变引起的，该基因是两个编码运动神经元存活蛋白（SMN）的基因之一。SMN蛋白的缺失是神经退行性变表型的驱动因素。第二个基因SMN2与SMN1的序列几乎相同，但含有单核苷酸替换，导致外显子7被排除，从而导致截短蛋白的表达。 Nusinersen是一种反义寡核苷酸（ASO），可调节SMN2前体mRNA的剪接，促进外显子7在SMN2中的包含，从而增加SMN2的表达功能性SMN的生产。 偏头痛药物也获得批准，2018年批准了三种新的降钙素基因相关肽（CGRP）拮抗剂（fremanezumab、erenumab和galcanezumab），均为单克隆抗体。这些药物标志着20多年来首个偏头痛的新疗法。它们提供了偏头痛的预防控制，与现有口服非专利药物的具有重要区别。 2010年至2019年间批准的其他FIC CNS药物如图14所示。洛非西定是用于阿片类药物戒断的α2-肾上腺素能激动剂（2018年），异丙肾上腺素是用于帕金森病的腺苷受体拮抗剂（2019年），帕拉帕内尔是作为抗癫痫药物的AMPA受体拮抗剂（2012年），布列沙诺酮是GABAA受体调节剂（2019年），suvorexant是用于睡眠障碍的促食欲素-1拮抗剂（2014年），用于多发性硬化症的富马酸二甲酯（2013年），用于多发性硬化症的鞘氨醇受体调节剂fingolimod（2010年），以及用于发作性睡病的催眠药56（2019年）。 孤儿药 1983年的《孤儿药物法》规定了7年的市场独占期以及税收抵免和补助金，以支持针对孤儿疾病的药物临床试验。根据2010年至2019年289个NME和89个BLA的数据，在过去十年中，根据《孤儿药物法》批准的NME数量有所增加，2010年超过40%（图15），10年平均为37%。按孤儿药批准的BLA为所有批准的48%。 图15 每年批准的孤儿药物占比 2018年按孤儿药批准的migalastat （图6），用于治疗成人法布里病，由α-半乳糖苷酶缺乏引起的危及生命的溶酶体贮存障碍导致球三糖神经酰胺（GL-3）的毒性积聚，患病率为40万分之一到60万分之一。 burosumab也于2018年按孤儿药被批准，用于治疗患有X连锁低磷血症（XLH）的成人和1岁及以上儿童，XLH是一种抗维生素D的佝偻病，患病率为1:20 000。 ravulizumab按孤儿药批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿症（PNH），这是一种非常罕见的疾病，是由补体系统对缺陷红细胞的免疫反应引起的，导致溶血，可能危及生命的血块和骨髓问，患病率低至百万分之0.5-1.5。原创新药批准（FIC） Paul等人认为，2009年只有17%的批准药物被认为是FIC，低于2008年的29%，这表明整个制药和生物技术行业的创新和生产力都在下降。这里我们分析了2010-2019年FDA批准的药物，并根据批准年份确定了FIC的百分比（图16）。我们发现，在过去十年中，平均37%的新药是FIC，2013年最低32%，2012年最高49%。这表明创新（以FIC批准衡量）在整个十年中并没有停滞不前。 图16 每年批准的FIC药物数量和占比 新分子实体（NMEs）的给药途径及联合治疗 2010年至2019年，口服给药仍然是所有非处方药的主要给药途径（201种）。尽管与其他给药途径相比，口服药物的比例逐年变化，但在过去十年中，其他给药途径没有明显的增加或减少趋势（图17a）。在过去十年中，平均66%的新批准药物为口服给药，15%为静脉给药，其他给药途径包括吸入、肌肉注射、耳内给药和局部给药等。只有一种鞘内药物获得批准，即SMA药物nusinersen。 图17（a） 2010年至2019年FDA批准的给药途径，（b）2010年至2019年FDA批准的单药或固定剂量组合 从2010年到2019年，只有10%的NME被批准为固定剂量组合（图17b），感染药物占比最多。除HCV外，2012年还批准了4种治疗HIV的药物组合。在这一类的24种药物中，有13种用于病毒或细菌感染（表4），这在很大程度上是由于传染病需要药物在多种机制上发挥作用，以对抗耐药性。 有趣的是，在过去的十年中，只有两种固定剂量的肿瘤药物被批准。HER2抗体曲妥珠单抗和透明质酸酶oysk的固定剂量组合在2019年被批准用于乳腺癌。2015年，三氟尿苷和替吡拉西尔（2015）的组合被批准用于结直肠癌。 黑框警告 许多FDA批准的药物会收到黑框警告，这是一个直接在标签上的声明，表明严重或危及生命的副作用。黑框警告于1979年实施，可以在药品批准时或在上市后期间附上。它们可以是针对某一药品的，也可以附在整个类别的药品上。 我们分析了2010年至2019年所有389个NME和BLA，以确定最初批准的带有黑框警告的NME和BLA（图21）。在新分子实体（NMEs）中，21%的批准带有黑框警告，而几乎一半（42%）的BLA批准带有黑框警告。 带有黑框警告批准的BLA数量之多可能是由许多因素造成的。BLA更多的被批准用于孤儿适应症。鉴于孤儿疾病缺乏治疗选择，与不治疗的替代方案相比，将监测到的风险带入诊所的意愿更高。此外，由于疾病适应症本身、生物制剂的作用机制或给药途径，使用生物制剂治疗的患者发生机会性感染的风险增加。 对2010年至2019年批准药物的治疗领域进行的检查显示，31/103（30%）的肿瘤药物、8/56（14%）的感染药物、13/45（28%）的中枢神经系统药物、7/28（25%）的代谢疾病药物和11/22（50%）的心血管药物批准了黑框警告。 新化学实体药物的特点 Ro5是一套成药规律，描述了绝大多数已知口服药物的特点，规则如下：（1）分子中的氢键供体（HBD）不超过5个；（2）分子中的氢键受体（HBA）不超过10个；（3）分子量（MW）小于500；（4）cLogP<5。 在Lipinksi等人2001年发表的描述5法则的原始论文中，90%的已知口服药物符合规则。我们检查了从2010年到2019年批准的药物，看看它们是否符合这些规则。2010-2019，总共有192种经批准的药物和口服药物组合有望被口服吸收。由于这些已获批准的药物中有几种是与先前已获批准的药物联合使用的药物，因此将这些联合用药伙伴纳入分析，共有204种小分子口服药物用于评估。 我们发现分析中只有17%（35/204）的药物违反了1项以上的规律，而83%（169/204）的药物违反了1项或0项。（图22a）。此外，在2010年至2019年的十年间，违规超过1次的经批准口服药物数量并未随时间发生显著变化（图22b）。在这些违规行为中，大多数（62/73）是由于MW，其次是clogP（18/73），然后是氢键受体（13/73）违规。 新类型药物 反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，AOS）和小干扰RNA（siRNA）都是靶向RNA的核苷酸治疗方法，旨在调节基因表达。ASOs是单链修饰的脱氧核糖核酸，与互补RNA序列结合。这可能导致翻译的空间位阻、RNA酶H降解DNA-RNA复合物或剪接的调节。相反，siRNA由双链RNA分子组成，这些分子在细胞内散开。单链RNA同样结合互补的RNA靶序列并导致mRNA降解，从而导致表达沉默。 从2010年到2019年，共批准了6个ASO和2个siRNA（表5）。相比之下，在2009年之前，只有2种ASO被批准，没有siRNA治疗药物被批准。其中包括一种治疗DMDM的ASO药物eteplirsen（2016），以及用于治疗SMA的ASO nusinersen。nusinersen是2010-2019中唯一批准鞘内给药途径的ASO。另一种ASO，inotersen（2018），被批准用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变多发性神经病（hATTR）。 2018年，FDA批准的第一个siRNA药物patisiran用于hATTR的多发性神经病。适配子是单链寡核苷酸，可特异性结合多肽或小分子等靶分子。第一个批准的适配子pegaptanib于2004年批准用于湿性肝移植黄斑变性，但很快失去了市场份额，因为单克隆抗体贝伐单抗和雷尼珠单抗（2006年）具有更优越的疗效。迄今为止，FDA没有批准其他适配子。 Antibody Drug Conjugates (ADC)药物 2019年，FDA批准了3种ADC药物：曲妥珠单抗-德鲁替康、恩福妥单抗-维多汀和波拉图珠单抗-维多汀，都是肿瘤适应症。德鲁替康是一种拓扑异构酶抑制剂，用于治疗先前治疗的HER2阳性乳腺癌。韦多汀是靶向单甲基金盏花素E的微管和靶向连接蛋白4抗体的结合物，批准用于治疗转移性尿路上皮癌。单甲基金盏花素E66本身具有剧毒性（图23），与抗体结合可减轻这种毒性，因为毒性有效载荷直接作用于肿瘤细胞。 药物销售额 根据总销售额，对2017年和2018年548种最畅销药物进行了分析，生物制剂的销售额比非生物制剂的要高。生物制剂的年平均销售额为18.4亿美元，而NME的年平均销售额为8.5亿美元。生物制品的销售额主要是由10种产品推动的，这些产品总共创造了770亿美元的销售额，几乎占生物制品销售总额的一半。在这10种产品中，只有3种是2010-2019年批准的产品（aflibercept、nivolumab、ustekinumab）。最近对2019年销量的预测显示，两种抗PD-1单克隆抗体药物pembrolizumab（2014年获批）和nivolimumab（2014年获批）的销售额将进入前十。 图24（a） BLA和NME的数量（2010-2019）；（b） 按BLA和NME分类的销售额 2018年，超过1700亿美元的销售额来自于2010年至2019年间批准的药品（图25）。平均而言，30%的销售额来自孤儿药。 2013年和2014年是最具代表性的年份，这些年份批准的孤儿药在2018年的销售额中占50%以上（例如2013年批准伊布替尼用于肿瘤治疗，2018年销售额为62亿美元，2014年批准nivolumab用于肿瘤治疗，2018年销售额为75亿美元，2014年批准pembrolizumab用于肿瘤治疗，2018年销售额为71亿美元）。2018年最畅销的药物列于表6。 未来展望 在过去的十年中，批准的FIC及新作用模式药物数量都有所增加。下一个十年开始之际，仍然存在许多机遇。 中枢神经系统 神经退行性疾病是该领域最重要的挑战之一。世界卫生组织（WHO）预测，到2040年，神经退行性疾病将超过癌症，成为仅次于心血管疾病的第二大死亡原因。 尽管投入了大量资金，但神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症、额颞部痴呆症和阿尔茨海默病）的治疗选择仍然很少。虽然2种ALS治疗药物获批，但对死亡率和疾病进展的影响都不大。直到今天，阿尔茨海默病仍然是中枢神经系统药物研究的白鲸，有超过190种研究新药在临床试验中失败。 虽然大型制药公司已经从神经科学领域进行了大量的撤资，但在过去十年中，中枢神经系统药物的批准比例保持不变。这种看似悖论的部分原因可能是，投资从大型制药公司转移到CNS初创公司。 由于对神经系统疾病分子机制的理解不断提高和高度未满足的医疗需求，过去5年该领域的风险投资增加了40%。最近的一份报告表明，中枢神经系统药物的开发时间比非中枢神经系统药物长20%，批准时间比非中枢神经系统药物长38%。 另一个未得到满足的重要需求是阿片类药物成瘾的发病率不断上升，1999年至2018年，阿片类药物成瘾在美国已达到流行状态，因阿片类药物过量导致超过45万人死亡。最近，第一个用于阿片类药物戒断症状的非阿片类药物，α2a拮抗剂洛非西定被批准上市（2018）。 感染 在过去十年中，有15种新的抗菌药物被批准为QIDP，这一安排旨在帮助新的抗菌药物进入市场。这种监管激励措施似乎提高了新抗菌药物上市的数量。 但大多数批准细菌感染药物都与已知药物相似。细菌耐药的威胁越来越大，世卫组织将开发针对碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科的药物列为最高优先事项。 截至2019年底，全世界有53种抗菌药物正在进行临床评估。热带传染病影响着全世界10亿多人，继续给发展中国家造成重大负担。疟疾药物合资公司（MMV）在开发疟疾药物管道方面取得了重大进展，该合资公司还支持了2018年批准的塔非诺喹的开发。 二十一世纪见证了一些威胁发展中国家和发达国家的病毒性流行病的大流行，包括2002年的SARS疫情、2015-2016年的寨卡病毒疫情、2013-2016年的西非埃博拉病毒疫情和2016年的黄热病疫情，还有最近还在持续的由SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行，已在全球感染4600万人，迄今为止已夺走近120万人的生命。 FDA已经建立了一个紧急计划来加速潜在的COVID-19治疗，即冠状病毒治疗加速计划（CTAP）。治疗方法包括恢复期血浆，几类抗病毒药物，包括RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和病毒进入抑制剂，中和抗体，目前有五种治疗方法被批准用于紧急使用（EUA）等。 心血管疾病与代谢综合征 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎是临床试验的一个活跃领域，具有多种不同的治疗作用机制。由于NAFLD的治疗没有经批准的介入疗法，因此该病的临床需求严重得不到满足。最近正在研究的药物包括法尼类X受体激动剂阿苯胆酸、PPARα/δ双激动剂依拉贝诺、CCR 2/5型双拮抗剂塞尼昔洛克和ASK1抑制剂塞隆塞替布等。 阿苯胆酸在III期中期分析中改善纤维化，但elafibranor和selonsertib均未达到其NASH解决和纤维化的主要终点。Cenicriroc的III期临床数据预计要到2020年末才能获得。 迄今为止，心血管疾病仍然是全世界的头号死因，每年夺走近1800万人的生命。心血管疾病的一个主要驱动因素是代谢综合征，这是一组经常同时发生的疾病：肥胖、高血糖、血脂异常和高血压。最近，2个三期临床试验完成了对低密度脂蛋白（LDL）胆固醇升高患者的研究。 肿瘤.免疫肿瘤学（Immuno-oncology，I-O） 肿瘤的免疫治疗已经改变了癌症患者的治疗选择，是肿瘤药物发现和开发的最重要的最新进展之一。自第一个I-O药物pembrolizumab上市以来，服用这些药物的患者人数从2014年的2500人增加到2018年的200多万人。 尤其是PD-1和PD-1L靶向I-O药物正在成为美国治疗实体瘤的一线疗法，如转移性NSCLC、转移性黑色素瘤和转移性肾细胞癌。 CD19在多种B细胞恶性肿瘤中表达，但针对CD19的传统单特异性CD19抗体的疗效有限。第一个CD19靶向抗体blinatumomab于2014年获得批准，2种靶向CD19的新药于2020年获得批准（他法昔单抗cxix和brexucabtagene autoleucel）。 Brexucabtagene autoleucel是第三个被批准的嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，通过重组患者T细胞来靶向表达CD19的肿瘤细胞。 继PD-1和CTLA-4之后，第三种抑制性受体LAG3作为I-O治疗方法的靶点受到关注。LAG3同样抑制T细胞活化和细胞因子释放。LAG3可提供对PD-1的协同作用，因此正在与抗PD1治疗相结合进行研究。三种旨在抑制抑制信号传导的LAG3靶向抗体目前正在临床试验中进行评估（BMS-986016、LAG525和MK-4280）。 肿瘤.新的生物标志物 抗-PD-1和-PD-L1疗法已被证明对多种实体肿瘤和血液肿瘤有效。然而，不同恶性肿瘤和临床试验的客观缓解率不同。此外，7%到34%的患者经历了高级别的免疫相关不良事件。目前，没有有效的生物标志物可用于选择对治疗最敏感的患者。 在肿瘤治疗领域的一个令人鼓舞的发展中，使用生物标志物来选择合适的患者群体在整个十年中稳步增加，截至2018年，40%的肿瘤临床试验使用生物标志物。识别生物标志物以预测PD-1/PD-L1治疗的反应性并降低不良事件的风险是一个重要领域，正在考虑的生物标志物包括肿瘤突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞、错配修复缺陷和肠道微生物组分等。 肿瘤.靶向DNA损伤修复途径的研究 靶向DNA修复机制是一种安全有效的方法，这一发现为癌症患者提供了新的治疗方法。自2014年批准首个PARP抑制剂olaparib 以来，又有3种PARP抑制剂进入市场。 此外，其他DNA损伤修复蛋白作为多种肿瘤的治疗靶点也在研究中。第一个ATR抑制剂M6620/berzosertib联合吉西他滨用于铂耐药卵巢癌患者的II期试验中显示出疗效。几种DNA-PK抑制剂已作为单一或组合也已进入临床治疗。ATM抑制剂也已进入临床试验，以评估单药治疗或与奥拉帕利和化疗联合使用的安全性。 创新新模式 新的治疗方式为以前认为的不可成药靶点和信号通路提供了无数的成药机会。在过去的十年中，RNA靶向疗法的批准数量急剧增加，更多的药物处于临床试验的晚期阶段。ADC利用识别癌细胞抗原的抗体将细胞毒性药物靶向癌细胞，使抗癌药物数量的快速增长。 自从第一个双特异性抗体blinatumomab（2014年，CD9/CD13, 急性淋巴细胞白血病）获批以来，双特异性抗体在所占的份额越来越大，2018年上升至抗体药物的25%，2019年有57种双特异性抗体在临床试验中。 利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）靶向降解蛋白质来降低疾病相关蛋白质的水平正成为一个新的药物研发领域。自2014年以来，蛋白质降解剂领域投资超过35亿美元，其中蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）在蛋白质降解剂的开发中占很大份额。2019年，ARV-110成为第一个进入临床的PROTAC，其是一种口服有效的雄激素受体降解剂，用于治疗转移性去势抵抗前列腺癌。I期临床数据表明，该药物具有可接受的安全性和药效。 基因编辑是另一个经历爆炸性增长的领域。2012年，发现CRISPR-Cas9可以用作高效基因编辑的工具，大大加速了这种增长。一些CRISPR疗法已经启动，大多数集中于T细胞或造血干细胞的体外编辑。然而，在2019年，第一个人体CRISPR研究启动，用于CEP290基因突变的眼部疾病Leber先天性黑蒙10（LCA）。 全文总结 2010年至2019年，NME和BLA批准的中位数相比前十年增加了60%。最近制药行业的产出可能与监管激励措施有关，如突破性治疗、快速通道指定和孤儿药物和增益法案等。此外，美国国立卫生研究院在基础神经科学研究方面增加的投资最近与中枢神经系统创业投资的增加有关。 新治疗模式的出现进一步促进了治疗领域和方法的进步，而传统的药物靶向治疗方法并没有受到影响。2010年至2019年，FIC批准数量占所有药品批准量的37%，高于2009年的17%。 在I-O等新机制上的重大突破改变了患者的预后，并导致了新的更有效的临床试验设计。随着该行业进入新的机制和新的患者群体，临床试验设计可能会更加复杂，导致更长和更昂贵的开发时间成本。使用伴随诊断来预测正确的患者群体对于减少昂贵或长期临床试验的消耗将变得越来越重要。 最后，新的药物和诊断必须是患者负担得起的，可以获得的，与现有药物差异化的产品。过去十年的成功给整个行业带来了希望，药物研发企业和机构将迎接新的挑战，继续为患者提供亟需的新药。 参考文献：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c01516

📑 文章目录 Basic Information英文标题：Next-generation programmable cell therapies for precision medicine中文标题：用于精准医疗的新一代可编程细胞疗法发表日期：11 March 2026文章类型：Review Article所属期刊：Nature Reviews Genetics文章作者：Ana Palma Teixeira | Martin Fussenegger文章链接：https://www.nature.com/articles/s41576-026-00945-3AbstractPara_01工程化细胞疗法通过实现基于疾病特异性信号的实时、情境响应性干预，正在改变精准医学的格局。受CAR-T细胞在肿瘤学领域成功应用的启发，新一代治疗平台正利用多种免疫细胞和干细胞被开发出来，以应对更广泛的疾病类型。这些活体疗法利用合成基因回路来诱导靶向性细胞毒性，调节效应蛋白的分泌，或根据内源性信号及外源性分子与物理刺激协调这两种功能。目前自体细胞的体外工程化仍是主流，但在可扩展性、成本和可及性方面的挑战正推动人们致力于开发同种异体产品和体内重编程技术。靶向递送技术的进步——包括病毒载体、负载mRNA的纳米颗粒和类病毒颗粒——正在拓展对体内细胞进行直接编程的工具箱。本综述讨论了赋予人类细胞治疗功能的新兴工程策略，重点介绍了模块化控制系统、递送技术创新以及未来面临的转化难题。IntroductionPara_01活体疗法正在通过利用细胞作为可编程实体来重塑现代医学，这些细胞能够持续监控其周围环境，并在接收到特定信号时执行治疗程序以缓解疾病。与传统的化学小分子药物或生物制剂不同，后者通常以预先设定的剂量给药，而不考虑患者的生理状态或疾病状态的差异，而工程化细胞能够实时适应并作出响应，从而提供更精确且持久的治疗效果。Para_02利用嵌合抗原受体（CAR）对T细胞进行基因工程改造以靶向B细胞恶性肿瘤的临床批准是一个里程碑，确立了基因增强免疫细胞的治疗潜力。尽管CAR-T细胞疗法已取得成功，但其广泛应用仍受到自体细胞来源依赖、复杂的患者特异性制造流程以及治疗相关毒性的限制。Para_03为了扩大活体药物的治疗范围，其他工程化免疫细胞（如巨噬细胞和自然杀伤细胞）正在临床前和临床研究中被探索。这些平台可能具有多种优势，例如更佳的安全性、降低移植物抗宿主病的风险，以及在实体组织环境中固有的活性。应用领域也正扩展到肿瘤学以外，工程化细胞疗法正在被开发用于治疗自身免疫性疾病、纤维化疾病、代谢性疾病以及与衰老相关的疾病。此外，其他细胞来源（包括多能干细胞和成体干细胞）也正在被探索作为治疗性重编程的平台，从而能够生成具有定制功能的多种细胞类型。Para_04与此同时，合成生物学的进步正在通过引入复杂的基因回路来进一步优化工程化细胞疗法，这些基因回路能够实现类似布尔逻辑的功能，从而提高特异性、有效性和安全性，同时最大限度地减少脱靶效应。将治疗性基因回路工程化导入细胞的策略主要依赖于体外方法，即利用病毒载体对患者来源的细胞进行转导。然而，自体细胞疗法所涉及的复杂性和高昂成本正推动人们致力于开发同种异体细胞疗法——即来源于健康供体的‘即用型’产品。与此同时，体内重编程作为一种规避体外操作挑战的策略正逐渐受到关注。临床前研究已证明，利用病毒载体、装载mRNA的聚合物或脂质纳米载体以及基因编码的病毒样颗粒等递送平台实现体内重编程是可行的，尽管在靶向特异性、递送效率和免疫原性方面仍存在挑战。Para_05在本综述中，我们探讨了将治疗功能编程到活细胞中的新兴策略，讨论了体外和体内方法的调控模式、功能输出以及递送技术。我们重点关注被设计用于调控治疗性蛋白质分泌、针对表达抗原的靶细胞引发细胞毒性反应或协调这两种输出的工程化细胞。我们不涉及已在其他地方综述过的经典基因治疗方法，这些方法涉及在体外或体内递送组成型、普遍性或组织特异性的转基因表达。最后，我们强调了与制造、递送和临床应用相关的转化挑战。总体而言，这些进展正在为实现更适应性强、更易获取且更有效的活体药物铺平道路。Engineering cells with therapeutic programsPara_01工程细胞疗法主要有两种类型。第一种类型涉及改造各种免疫细胞，使其表达合成识别模块（即CAR）。CAR结构将抗体来源的胞外域与胞内信号基序和共刺激域相结合，从而激活宿主细胞的内源性激活通路；CAR工程化细胞通过识别靶标致病或功能异常细胞表面抗原的表达，并引发强烈的细胞毒性、吞噬或免疫调节反应来清除这些细胞。第二种类型是将可编程的感应电路导入不同的效应细胞中，使其能够检测与疾病相关的信号，并以受控方式释放治疗性蛋白质，为纠正慢性疾病提供了新的策略。Engineering CAR cells to eliminate target cells 改造CAR细胞以消除靶细胞CAR-T cells for targeted killing 用于靶向杀伤的CAR-T细胞Para_01经过CAR修饰的T细胞是目前临床上最先进的工程化细胞治疗形式。当识别并结合抗原后，CAR-T细胞通过两种途径杀伤靶细胞：一是颗粒外排途径，涉及免疫突触形成、穿孔素介导的孔道形成以及颗粒酶诱导的caspase-3依赖性凋亡；二是死亡受体信号通路，即CAR-T细胞表面的FasL与靶细胞上的Fas结合，触发细胞凋亡。活化的CAR-T细胞还会释放干扰素γ和肿瘤坏死因子等细胞因子，有助于招募并激活其他免疫细胞，包括自然杀伤细胞（图1a）。已获批的靶向B细胞特异性抗原CD19和BCMA（B细胞成熟抗原）的CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中表现出高效性，常可实现持久缓解。然而，这些疗效通常伴随显著的毒性反应，包括细胞因子释放综合征，其特征为免疫系统过度激活，导致全身性细胞因子水平显著升高，以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征，这是一种常与细胞因子释放综合征相关的神经毒性并发症。如何管理这些毒性反应仍是当前转化医学面临的关键挑战，并推动了可控或自调节型细胞治疗系统的研发（参见‘利用合成生物学增强细胞治疗’部分）。 Fig. 1: Engineering cells with therapeutic programs. - 图片说明 ◉ CAR-T细胞发挥作用。嵌合抗原受体（CAR）与邻近细胞上的靶抗原结合，激活T细胞，触发含穿孔素和颗粒酶的颗粒释放，并激活Fas/Fas配体（FasL）等死亡受体通路，导致靶细胞发生凋亡和坏死。◉ 活化的CAR-T细胞还分泌干扰素-γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子（TNF），这些因子可增强自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性。◉ CAR-NK细胞发挥作用。NK细胞通过活化受体识别功能异常的细胞，并通过释放穿孔素和颗粒酶B诱导细胞裂解。◉ 它们通过分泌细胞因子TNF和IFNγ诱导凋亡，这些细胞因子激活FasL和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）通路，并通过CD16介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。◉ NK细胞还能够分泌趋化因子，招募T细胞、树突状细胞和其他免疫细胞共同参与对靶细胞的协同杀伤作用。◉ CAR-NK细胞经过基因工程改造，可识别靶细胞上的特异性抗原，从而增强这些细胞毒机制。◉ CAR-巨噬细胞发挥作用。CAR与肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原（TAA）结合后，诱导吞噬作用、促炎性细胞因子的分泌、基质金属蛋白酶（MMPs）的释放，这些酶可重塑细胞外基质（ECM）和肿瘤微环境（TME），并激活T细胞以及招募其他免疫细胞。◉ 刺激响应型效应分子分泌。合成基因回路使细胞能够感应升高的内源性疾病生物标志物（无论是可溶性还是膜结合型），并启动治疗程序，实现对失调信号的动态调控。◉ MHC代表主要组织相容性复合体；TCR代表T细胞受体。Para_02CD19和BCMA靶向产品的临床成功推动了将CAR-T细胞疗法扩展到血液系统恶性肿瘤之外的努力。目前正在进行的试验正在评估靶向EGFR、HER2和间皮素等肿瘤相关抗原的CAR-T细胞在胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌中的应用。然而，CAR-T细胞在实体瘤中的疗效仍然有限，这主要归因于肿瘤抗原异质性、T细胞持续性差以及致密的细胞外基质屏障和免疫抑制性肿瘤微环境导致的T细胞浸润受限，后者通常富含调节性T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和抑制性细胞因子。为了增强CAR-T细胞的持续性和抗肿瘤活性，已对其进行进一步改造，使其在具有肿瘤限制性活性的启动子驱动下过表达转录因子（如FOX1、BAFT和IRF4）以及多种细胞因子（如白细胞介素IL-2、IL-12、IL-15和IL-18），以最大限度地减少全身毒性。这类“细胞因子武装”的CAR-T细胞目前在血液系统恶性肿瘤和实体瘤的临床试验中均显示出令人鼓舞的治疗效果。Para_03CD19 CAR-T细胞也已用于自身免疫性疾病的临床试验，在系统性红斑狼疮、特发性炎症性肌炎和系统性硬化症中显示出积极的临床反应，能够有效耗竭B细胞并恢复免疫耐受，且安全性良好，可诱导长期缓解。更特异性的方法采用了嵌合自身抗体受体（CAAR），该受体包含特定自身抗原的片段，从而实现对自身反应性B细胞的选择性靶向。例如，重症肌无力患者因存在针对肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）的自身抗体，导致神经肌肉接头信号传导障碍，从而出现危及生命的肌无力症状。在重症肌无力的临床前小鼠模型中，MuSK–CAART细胞在保留健康B细胞和整体抗体产生的同时，降低了致病性免疫球蛋白γ水平。Para_04CAR-T细胞也代表了一种有前景的方法，可用于应对传染病、病理性纤维化和细胞衰老。在HIV的背景下，通过源自靶向病毒包膜CD4结合位点的广谱中和抗体的CAR改造的T细胞，能够选择性地识别并清除被感染的细胞。在一项近期的临床研究中，共表达滤泡归巢受体CXCR5的异基因Env特异性CAR-T细胞耐受性良好，并且在接受治疗的大多数个体中，与血浆病毒血症以及细胞相关HIV-1 RNA的减少相关。在纤维化疾病中，靶向成纤维细胞激活蛋白的CAR-T细胞在小鼠的心脏和肝脏纤维化模型中减少了活化的成纤维细胞，并改善了器官功能。细胞衰老以持续的DNA损伤和促炎性分泌表型为特征，是慢性炎症和衰老相关疾病的重要因素。在小鼠和非人灵长类动物的衰老模型中，经改造以识别与衰老相关的标志物（如uPAR或NKG2D配体）的CAR-T细胞能够高效清除衰老细胞，并在无明显毒性的情况下恢复组织功能。CAR-NK cells as ready-to-use cytotoxic effectors CAR-NK细胞作为即用型细胞毒性效应因子Para_01NK细胞通过激活和抑制性受体的平衡来识别异常或应激细胞。激活性受体（如NKG2D和NKp30）可识别在健康细胞中基本不存在的特定细胞表面标志物，并启动一系列事件，导致钙离子内流、脱颗粒以及穿孔素和颗粒酶的释放。相比之下，抑制性受体（如NKG2A）则与人类白细胞抗原（HLA）结合，通过抑制细胞内信号传导来减弱NK细胞的活化。与供体T细胞不同，当T细胞受体识别到患者健康组织上不匹配的HLA时会引发强烈的同种异体反应，而NK细胞主要感知HLA的缺失或改变，这是恶性转化或感染的标志。这一特性使得NK细胞在个体之间本质上具有更高的相容性，因而同种异体反应性低，移植物抗宿主病的风险也极小。因此，经过CAR改造的NK细胞适用于作为现成可用的疗法，可预先生产，并在无需进行患者特异性配型的情况下使用。这些细胞将直接的靶向杀伤能力与其天然的肿瘤监视功能相结合，并分泌趋化因子以招募T细胞和其他免疫细胞。这实现了对靶细胞的协同清除（图1b）。Para_02NK细胞可以从外周血中分离获得，它们在外周血淋巴细胞中约占5–15%，也可从脐带血中分离，脐带血中NK细胞含量可高达30%。包括来自脐带血的抗CD19 CAR-NK细胞在内的同种异体CAR-NK细胞的临床研究已证明其具有安全性和抗肿瘤活性。即使供体与受体的HLA谱不同，也极少出现高级别的细胞因子释放综合征，且未发生移植物抗宿主病。这表明NK细胞本身具有较低的同种反应性，并与CAR-T细胞治疗中常观察到的较高毒性形成对比。为了增强CAR-NK细胞的持续存在和扩增能力，已通过基因工程使其共表达促进NK细胞活性的细胞因子，例如IL-15。抗CD19 CAR-NK细胞目前也在临床试验中被探索用于治疗自身免疫性疾病。Para_03尽管自然杀伤细胞（NK细胞）的基因修饰效率低于T细胞，但转导方法和培养系统的进步正在逐步改善工程化效果。诱导多能干细胞（iPSCs）或CD34+造血干细胞提供了可扩展的NK细胞来源，更易于进行基因修饰。然而，CAR-NK细胞在实体瘤中仍面临与CAR-T细胞类似的挑战，包括抗原逃逸和肿瘤浸润能力差。CAR-macrophages for tumour remodelling and clearance 用于肿瘤重塑和清除的CAR-巨噬细胞Para_01巨噬细胞因其天然的浸润能力、吞噬功能以及免疫调节作用，成为实体瘤治疗的有前景候选者。当装备了CAR后，巨噬细胞被重新定向以识别并吞噬肿瘤细胞，同时增强抗原呈递和局部免疫激活（图1c）。根据CAR结构中所包含的胞内信号域，CAR-巨噬细胞可能分泌免疫调节性细胞因子和趋化因子，以及重塑细胞外基质的基质金属蛋白酶，从而促进免疫细胞浸润和肿瘤清除。临床前研究表明，单次输注CAR-巨噬细胞可通过多种机制重塑肿瘤微环境，包括分泌炎症性细胞因子以及增强向T细胞呈递抗原，从而减少实体瘤异种移植模型中的肿瘤负荷并延长生存期。类似地，在同源小鼠肿瘤模型中，经基因工程改造的抗HER2 CAR-巨噬细胞改善了生存率和免疫细胞浸润，并诱导了抗原扩散。此外，整合基于TLR4信号模块的CAR-巨噬细胞在与抗原结合后，能够以NF-κB依赖的方式诱导强烈的促炎表型并抑制抗炎程序，其抗肿瘤活性优于第一代基于T细胞来源CD3ζ的结构。使用编码抗HER2 CAR的嵌合腺病毒载体转导的自体巨噬细胞，在输注至HER2阳性乳腺癌和胃食管肿瘤患者时表现出良好的安全性和耐受性。Para_02尽管巨噬细胞具有治疗潜力，但与T细胞或自然杀伤细胞相比，它们在体外扩增和转导方面更为困难。通过基因修饰的多能干细胞进行分化提供了一种替代方案。在一项研究中，将靶向神经外胚层肿瘤相关抗原GD2的嵌合抗原受体插入诱导性多能干细胞的AAVS1安全位点，随后这些细胞被分化为巨噬细胞，在神经母细胞瘤小鼠模型中表现出强大的抗肿瘤效果。同样，经过工程化改造的人类多能干细胞表达靶向在胰腺癌中高表达的肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体，并共表达膜结合型IL-15，其分化的巨噬细胞在胰腺癌小鼠模型中抑制了肿瘤生长并延长了生存期。Para_03然而，CAR-巨噬细胞的治疗效果可能因特定肿瘤微环境的不同而有所差异。巨噬细胞是具有高度可塑性的细胞，其行为受局部信号调控，而这些信号在不同肿瘤类型和疾病阶段中各不相同，这仍是将CAR-巨噬细胞疗法转化为临床应用时需要重点考虑的问题。Engineering alternative immune cell platforms 工程化替代免疫细胞平台Para_01具有先天抗肿瘤特性的替代性免疫效应细胞，例如γδ T细胞和不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，也正在被探索作为CAR表达的治疗平台。γδ T细胞比常规T细胞更难在体外扩增，且在外周血中的频率低得多（占所有T细胞的不到10%），但它们识别靶标的机制在很大程度上不依赖于主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的呈递，因此适用于MHC缺陷型肿瘤以及异基因应用。早期临床研究显示，在复发或难治性非霍奇金淋巴瘤患者中使用异基因抗CD20 CAR γδ T细胞具有令人鼓舞的活性，尽管其体内存续时间仍然有限。在临床前研究中，共表达细胞因子可改善其存续能力，但仍不及CAR-T细胞的持久性。iNKT细胞在外周血中更为稀少（占淋巴细胞的0.1%），但目前已有不断改进的方法可用于其分离和体外扩增。它们表达一种不变的T细胞受体，能够识别由靶细胞表面MHC样分子CD1d呈递的糖脂抗原，部分iNKT细胞还表达自然杀伤细胞受体，可引发强烈的细胞毒性及快速分泌细胞因子。在临床前模型中，CAR-iNKT细胞的表现优于CAR-T细胞，能够清除具有免疫抑制作用的CD1d+巨噬细胞，并通过激活树突状细胞促进表位扩散，从而诱导内源性T细胞应答。在临床方面，自体表达GD2特异性CAR和IL15的iNKT细胞在输注后于复发或耐药神经母细胞瘤患儿的外周血中得以扩增，迁移至转移部位并诱导肿瘤消退。树突状细胞作为专业的抗原呈递细胞，也正在被用于免疫治疗的工程化改造，例如通过过表达细胞因子来增强内源性T细胞的启动和抗肿瘤免疫反应。由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化而来的树突状细胞前体经基因工程改造后可分泌免疫刺激性细胞因子，在小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长，这与自然杀伤细胞和T细胞的浸润及活化相关。这些携带细胞因子的工程化树突状细胞前体还可与CAR-T细胞协同作用，在胶质瘤小鼠模型中根除已建立的肿瘤，而单独使用任一单药疗法仅产生有限的疗效。Para_02总之，工程化T细胞由于其增殖能力和记忆细胞亚群，仍能作为对抗靶细胞的强效细胞毒性效应物，但其与细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征的风险增加有关。自然杀伤细胞（NK细胞）能够提供快速的细胞毒性反应，且毒性风险较低，但其寿命较短，并存在可能限制疗效的抑制性受体。巨噬细胞兼具吞噬功能和免疫调节功能，使其成为重编程以对抗免疫抑制性肿瘤微环境的有前景候选者。利用诱导多能干细胞（iPSCs）作为工程化免疫细胞的可再生来源，并结合多种免疫细胞类型，可能提供协同策略，以提高疗效并克服不同适应症中的耐药性。此外，现成的多特异性抗体正在被开发，用于共同激活免疫受体和肿瘤相关抗原，将内源性T细胞或NK细胞的细胞毒性重定向至癌细胞，实现类似CAR的特异性，而无需体外细胞工程。Synthetic circuits for controlled effector secretion 用于控制效应物分泌的合成电路Para_01通过整合将疾病特异性输入与受控效应输出相耦合的合成基因回路，工程化细胞可以作为自主的治疗工厂发挥作用。这些回路能够响应内源性分子信号，实现效应蛋白的反馈调控分泌，使细胞能够以特定环境依赖的方式感知并抵消病理信号（图1d）。Circuit design and stimulus responsiveness 电路设计与刺激响应性Para_01尽管CAR-T细胞的大多数临床应用集中于细胞毒性CD8⁺ T细胞，但类似策略也可用于利用其他类型的免疫细胞以治疗其他疾病。例如，最近的研究通过合成Notch受体（synNotch）对人CD4+ T细胞进行工程化改造，使其在感知特定抗原后触发局部免疫调节。在一个例子中，synNotch受体被设计用于感应表达抗原的细胞毒性T细胞，并触发免疫抑制蛋白的产生。另一种设计则靶向脑部细胞外基质成分，植入的工程化T细胞可诱导抗炎细胞因子的表达，在自身免疫、移植和神经炎症的小鼠模型中保护靶组织，且不会引起全身性免疫抑制。其他研究利用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术，将抗炎基因（如IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）和可溶性肿瘤坏死因子受体）插入趋化因子MCP-1基因（CCL2）及其启动子所在的基因组位点，该启动子可被炎症细胞因子激活。这使得间充质干细胞能够在IL-1和TNF细胞因子驱动的局部炎症反应中表达这些抗炎蛋白。由此构建的反馈控制回路在炎症性关节炎小鼠模型中提供了持续的治疗益处，同时分泌蛋白的全身暴露程度极低。类似的反馈控制回路也已开发用于苯丙酮尿症、痛风性关节炎、代谢综合征、肝损伤、高胆固醇血症、银屑病及其他炎症性疾病的治疗。在这些系统中，人类细胞系被工程化改造为转录调控的基因回路，利用合成或内源性的膜受体或转录因子作为与疾病相关生物标志物的生物传感器。一旦检测到相应信号，这些回路便会触发治疗性蛋白的生成。将这些细胞封装于海藻酸盐微珠中并植入小鼠模型后，工程化细胞能够自主恢复生理稳态并纠正疾病表型。将这一概念扩展至疾病相关信号之外，最近一项研究开发了昼夜节律激素响应开关，可感知振荡的褪黑素或促甲状腺激素水平，从而实现每日一次的转基因激活。当这类响应褪黑素的回路被封装并植入2型糖尿病小鼠体内时，可驱动转基因GLP-1（又称GCG）在夜间分泌，以调节葡萄糖稳态并刺激胰岛素分泌，突显了利用内源性昼夜节律信号实现时间编程治疗递送的潜力。Cell-type choice and considerations 细胞类型选择及考虑因素Para_01这些系统临床转化的一个关键因素是细胞平台（也称为细胞底盘）的选择。理想的宿主应支持稳定的基因组编辑，具有低免疫原性、无致瘤潜力，并能在所需的治疗时间范围内在体内存活并发挥功能。在自身免疫性疾病中，短暂的分泌可能足以重置免疫稳态或消除炎症。然而，对于1型糖尿病等慢性疾病，可能需要工程化细胞的长期存留或重复输注。间充质干细胞/基质细胞（MSCs，来源于脂肪组织、脐带血或骨髓）由于其固有的免疫调节和再生特性，已在临床试验中得到广泛研究。除了这些天然功能外，MSCs还被基因工程改造为在植入后产生治疗性蛋白质，在临床前研究中显示出良好前景。例如，在小鼠模型中，通过慢病毒载体改造的MSCs可响应肿瘤微环境特有的机械刺激而分泌抗肿瘤酶，能够选择性地靶向并杀伤转移性细胞，同时保护健康组织，这展示了MSCs作为刺激响应型治疗递送平台的潜力。然而，MSCs在体内的存活率低和组织滞留能力差仍限制了其治疗效果。目前正研究多种策略，包括包封和预处理，以提高MSC的存活率和持久性。Para_02记忆T细胞是另一种极具吸引力的底盘细胞，因其具有长期存活和全身循环的能力。最近一项研究展示了经过基因工程改造以分泌α-L-艾杜糖苷酶（IDUA）的记忆T细胞的治疗潜力，这种酶在I型黏多糖贮积症患者中存在缺陷。通过CRISPR–Cas9技术将IDUA整合到AAVS1位点，并将这些细胞过继性转移至小鼠体内，实现了长达22周的IDUA长期分泌，从而在包括大脑在内的多个器官中纠正了糖胺聚糖的异常积累。B细胞及其终末分化的浆细胞是另一类有前景的底盘细胞。与记忆T细胞类似，它们可从外周血中分离，并在分化前进行基因改造。浆细胞寿命长，能够归巢至相关组织，并具备极强的分泌能力，因此可能只需较低的细胞剂量即可达到治疗所需的蛋白水平。概念验证的动物研究表明，B细胞或浆细胞可在蛋白质缺乏性疾病、病毒感染和癌症等背景下递送生物制剂。B细胞工程的进展已实现基于抗体和非抗体类蛋白的分泌，其基因整合可靶向免疫球蛋白位点或CCR5等安全港位点。然而，B细胞的基因工程效率仍低于T细胞，且目前这两种平台主要依赖于转基因的组成型表达。在这两类系统中，响应刺激的基因调控回路尚未得到充分验证。Enhancing cell therapies with synthetic biologyPara_01合成生物学通过实现对细胞行为的可编程控制，推动了细胞治疗的发展。提高工程化细胞治疗安全性、特异性和有效性的策略包括整合合成基因回路、逻辑门、杀伤开关以及可 externally 调控的控制系统。Synthetic control systems at multiple levels 多层次的合成控制系统Para_01在DNA、RNA和蛋白质水平上，一系列模块化且特性明确的分子元件构成了日益庞大的工具箱（图2），支持构建先进的控制系统。在转录水平上，可以基于三种主要策略构建由胞外信号控制的合成转录网络。第一种策略是利用异源转录因子，其与相应DNA序列的结合受到特定输入信号的调控。第二种策略是利用天然或合成受体，在检测到输入信号时启动内源性或正交的信号级联反应，最终实现转录激活（图2a）。第三种策略是使用分裂型转录因子，在检测到输入信号时恢复活性，从而驱动内源基因或转基因的表达。可诱导的CRISPR激活和干扰系统通常采用这种分裂设计，使失活的Cas蛋白与转录激活因子或转录抑制因子在依赖输入信号的情况下共同定位于靶位点。最近的大规模筛选工作进一步拓展了调控设计的空间，鉴定出多种高效的人源激活因子和抑制因子，这些因子可与CRISPR–Cas系统、锌指结构域及其他DNA结合结构域或蛋白兼容。 Fig. 2: Inducible control of target protein function at the DNA, RNA and protein levels. - 图片说明 ◉ 转录调控：输入信号最终激活一种转录调节因子，使其具备DNA结合活性，从而诱导下游目的基因（GOI）的表达。◉ 翻译调控：位于5′或3′非翻译区（UTRs）的调控性RNA元件在信号分子结合后调节目的蛋白（POI）的翻译。◉ 例如，输入信号可以抑制3′ UTR中的适体酶（aptazyme），防止其自我切割，并通过保持多聚腺苷酸化信号（An）与mRNA的连接来稳定mRNA，促进其翻译。◉ 翻译后调控：通过蛋白酶切割位点将不稳定结构域（降解子，degrons）融合到目的蛋白（POI）上，由信号响应型蛋白酶识别该位点，从而调控蛋白稳定性。◉ 在无信号（即无蛋白酶抑制剂）时，蛋白酶处于活性状态，将降解子切除，从而使目的蛋白稳定；◉ 当信号存在时，蛋白酶被抑制，降解子保持附着，导致目的蛋白被标记并靶向降解。◉ AD代表激活结构域；DBD代表DNA结合结构域；Pmin代表最小启动子；TF代表转录因子。Para_02可诱导的翻译开关可能依赖于RNA结合蛋白，这些蛋白与目的基因非翻译区中特定RNA结构的结合可通过输入信号进行调控，从而抑制翻译。或者依赖于信号响应型RNA结构，例如核酶和可变剪接装置（图2b）。在蛋白质水平上，翻译后开关可以通过可诱导的降解结构域或可抑制的蛋白酶实现快速控制，这些元件可调节蛋白质的稳定性或活性（图2c）。Precision regulation of CARs CARs的精确调控Temporal CAR regulation 时间CAR调控Para_01基于这些合成控制系统，已开发出多个平台以精确且可调节的方式调控CAR活性。外部可调控的CAR系统可对效应功能实现时间上可控且可逆的调节。例如，通用型CAR平台使用连接通用CAR骨架与多种抗原的衔接分子，从而灵活地重定向T细胞特异性（图3a）。采用翻译后调控机制的条件性策略（图3b），包括基于可抑制病毒蛋白酶的切割系统、小分子诱导的受体降解以及由化学二聚剂控制的分体式CAR，可通过药物剂量调节CAR活性（图3b）。这些策略在临床前研究中表现出增强的CAR-T细胞疗效、特异性和持久性，推动了其在临床应用中转化潜力的探索。 Fig. 3: Enhancing cell therapies with synthetic biology. - 图片说明 ◉ A,B，对外源性嵌合抗原受体（CAR）工程化细胞的控制。◉ A，通用型CAR依赖衔接分子将表达CAR的细胞与其靶向抗原（TAA1和TAA2）连接，从而实现条件性激活。◉ 通过更换不同的衔接分子，同一群工程化细胞可被重定向至不同抗原。◉ B，条件型CAR被设计为仅在特定环境信号存在时才发挥功能。◉ Ba，在SNIP（通过可抑制蛋白酶实现信号中和）CAR中，小分子抑制剂（例如grazoprevir）可抑制锚定在膜上的丙型肝炎病毒蛋白酶，从而阻止携带蛋白酶识别位点的CAR分子被切割。◉ CAR分子保持完整且功能正常，因此抗原结合可触发细胞活化。◉ 在缺乏蛋白酶抑制剂的情况下，SNIP CAR会被蛋白酶切割而失活。◉ Bb，CAR活性也可通过可诱导降解结构域进行调控，例如二氢叶酸还原酶降解结构域（DHFRDD）。◉ 当该结构域与CAR胞内区融合时，小分子三甲氧苄啶可作为结构域稳定剂，稳定DHFRDD，从而允许T细胞活化。◉ 在缺乏小分子稳定剂的情况下，DHFRDD会促进CAR快速降解，从而阻止T细胞活化。◉ C，响应多种环境信号的逻辑门控CAR设计。◉ Ca，HypoxiCAR：靶向肿瘤相关抗原（TAA）的CAR由含有低氧反应元件（HREs）的低氧诱导型启动子驱动表达，并与HIF1α的氧依赖性降解结构域（ODD）融合。◉ 这一双重系统通过HIF1α的激活在低氧条件下促进CAR的表达与稳定性，而在常氧条件下则通过ODD介导的泛素化（Ub）促进其降解。◉ Cb，AND门控CAR需要同时识别多个抗原才能激活。◉ 在LINK–CAR系统中，两个独立的受体必须分别结合各自的抗原（TAA1和TAA2），才能触发LAT和SLP-76支架蛋白的组装，二者均是通过磷脂酶C-γ1（PLCγ1）传递信号并激活T细胞所必需的。◉ Cc，在synNotch–CAR系统中，synNotch受体识别抗原1（TAA1）后释放出人工合成的转录因子，从而诱导表达一种靶向抗原2（TAA2）的传统CAR，实现顺序性的AND逻辑（如果—则）控制。◉ TF代表转录因子。Spatial specificity and logic-gated CARs 空间特异性和逻辑门控的CARPara_01除了时间控制外，空间特异性也是一个关键挑战，因此已开发出可诱导的逻辑门控CAR系统，其中效应功能仅在肿瘤微环境中被激活。例如，HypoxiCAR T细胞采用一种‘如果—则’逻辑，即如果存在缺氧环境，则通过缺氧敏感启动子和氧依赖性降解结构域的组合实现CAR的表达与稳定。该设计将细胞毒性限制在肿瘤区域，同时在常氧环境中减少对非肿瘤组织的毒性（图3Ca）。通过将其他形式的布尔逻辑引入合成受体设计，可以获得更高的特异性。AND门控CAR使得工程化细胞仅在多种肿瘤相关抗原（TAAs）同时存在时才产生响应。在LINK–CAR系统中，T细胞表达两种不同的受体以识别两种TAAs。只有当这两个受体均被结合时，才能组装LAT和SLP-76信号支架，从而传递T细胞活化所必需的下游信号（图3Cb）。另一种广泛使用的策略是使用synNotch受体，它能感应一种启动抗原并诱导针对第二种杀伤抗原的CAR的转录。这种两步激活机制降低了攻击仅表达其中一种抗原的健康组织的风险。该概念已被进一步拓展，开发出一种可感应可溶性配体的synNotch平台，能够响应免疫抑制信号如转化生长因子-β（TGFβ）或血管内皮生长因子（VEGF）而激活CAR表达（图3Cc）。相较于持续活化的CAR-T细胞，这些具有‘如果—则’逻辑门控的CAR-T细胞在肺腺癌和黑色素瘤异种移植模型中表现出更强的肿瘤抑制效果和更少的脱靶效应。多抗原识别系统在临床前模型中已显示出更优的安全性和持久性。Synthetic circuits for diseases other than cancer 用于癌症以外疾病的合成电路Para_01除了肿瘤学领域之外，由外部施用的小分子或物理信号调控的治疗性基因回路正在糖尿病、慢性疼痛和肌肉萎缩等疾病的临床前模型中进行测试。光、超声波、电磁场和电信号等物理信号能够实现精确的时空调控，且无需产生全身性的药物暴露。然而，这些物理信号的使用可能需要复杂的外部硬件，并且可能受到组织穿透深度的限制。理想的分子诱导剂应具备安全性、口服生物利用度高、能够到达靶部位，并且与内源性哺乳动物通路保持正交性。最近的例子包括利用植物来源的转录调节因子NPR1和NPR4构建的阿司匹林调控合成回路，这两种蛋白的结合依赖于阿司匹林的代谢物水杨酸。其他基因回路已被开发用于响应饮食中的分子，如木糖、葡萄糖酸、阿魏酸、咖啡因和薄荷醇，从而扩大了临床上可行的输入信号范围。然而，这些系统中某些潜在的局限性在于其依赖非人类来源的组分，可能会引发免疫反应。初步研究发现，在体内递送至肝细胞后未引起明显的细胞因子释放，但仍需进一步评估长期安全性。此外，许多设计过于注重最大激活倍数，而忽视了在缺乏目标输入时可能出现的非预期基础活性（即泄漏），而这对于体内安全应用至关重要。诸如一致型前馈环路或相互抑制开关等网络模体可以显著降低基础活性，同时不损害最大输出，从而提升功能表现。Para_02综上所述，合成生物学框架正在推动能够精确干预多种疾病的各种智能、响应性强且可调节的细胞疗法的设计。这些工具的持续优化将释放活体药物的全部潜力。Ex vivo engineering of autologous cellsSources of autologous cells 自体细胞的来源Para_01目前所有获批的工程化细胞疗法都依赖于对患者外周血中分离出的T细胞进行体外修饰，这些T细胞通过逆转录病毒载体进行基因工程改造，扩增后重新回输给患者（图4A）。这种个体化方法可最大限度地降低植入细胞发生免疫排斥的风险，但受限于物流和生产方面的挑战，包括需要对每个个体进行单独处理和质量控制。其他自体来源包括从外周血或骨髓中分离的造血干细胞（HSPCs）、从骨髓或脂肪组织中获取的间充质干细胞（MSCs），以及通过Yamanaka因子（OCT4、SOX2、KKF4和MYC）重编程患者体细胞生成的诱导多能干细胞（iPSCs）（图4B）。干细胞可用合成构建物进行基因修饰，然后在移植前分化为所需的治疗性细胞类型。然而，仍存在若干挑战，包括确保基因组稳定性，以及开发可靠且可扩展的分化和功能成熟方案。目前处于临床前和临床开发阶段的自体策略依赖多种病毒性和非病毒性递送方法来导入合成构建物或编辑内源基因（图4C），每种方法都有其独特的优势与权衡。 Fig. 4: Autologous, ex vivo engineered cell therapies. - 图片说明 ◉ A，外周血来源的细胞疗法。从患者的外周血中分离出T细胞、自然杀伤（NK）细胞或其他免疫亚群，通过病毒或非病毒递送系统在体外进行基因修饰，扩增后重新回输给患者，以发挥细胞毒性或免疫调节作用。◉ B，干细胞来源的疗法。自体干细胞从外周血、骨髓或脂肪组织中分离获得，或由患者来源的成纤维细胞或外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），在体外通过治疗性构建体进行基因工程改造，并在移植前分化为谱系特异性的细胞类型。◉ C，用于编程自体细胞的体外基因递送平台和合成回路的概述，包括以附加体形式发挥作用、通过随机或位点特异性机制整合到基因组中，或使用短暂递送的基于CRISPR的系统引入永久性编辑的系统。◉ Ca，将CAR和SynNotch–CAR构建体通过逆转录病毒或慢病毒载体递送到T细胞及其他淋巴细胞，支持稳定的基因组整合和长期表达。◉ Cb，改造后的嵌合腺病毒载体可高效以附加体形式将CAR递送至巨噬细胞，实现短暂表达。◉ Cc，基于电穿孔技术将转座酶DNA或RNA与转座子载体共同递送，从而实现稳定且半随机的基因组整合。◉ Cd，通过电穿孔将核糖核蛋白复合物与供体DNA模板共同递送，介导CRISPR–Cas9靶向基因组编辑，可在短暂接触编辑器后实现精确且永久的基因修饰。◉ CAR，嵌合抗原受体；FAP，成纤维细胞活化蛋白；HSPC，造血干细胞和祖细胞；ITR，反向末端重复序列；LTR，长末端重复序列；MSC，间充质干细胞/基质细胞；sgRNA，单导向RNA；TM，跨膜区；TR，末端重复序列；uPAR，尿激酶型纤溶酶原激活物受体。Viral delivery 病毒递送Para_01病毒载体仍然是将基因转入原代人细胞中最有效的方法。使用水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）包膜蛋白假型化的慢病毒载体被广泛用于实现稳定的基因整合和长期的转基因表达。这些载体能够高效转导T细胞，但在不同细胞类型中的表现存在差异，在自然杀伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞中观察到的转导效率要低得多。自然杀伤细胞对病毒感染尤其具有抗性。已有多种策略被探索以提高慢病毒的转导效率，例如抑制抗病毒受体信号传导、利用病毒对快速分裂细胞的趋向性，或使用其他类型的包膜蛋白。然而，逆转录病毒或慢病毒载体的一个持续存在的担忧是插入突变的可能性，因为其整合到宿主基因组中可能会破坏重要基因或调控元件。Para_02相比之下，腺病毒和腺相关病毒（AAV）载体以附加体形式递送转基因，从而避免基因组整合，降低插入突变的风险。尽管这种方式递送的转基因表达通常是短暂的，但在需要短期免疫调节或暂时递送效应分子即可重置病理过程的治疗情境下，这种表达可能已足够，例如在自身免疫性疾病和纤维化疾病中。腺病毒平台已被用于临床前和早期临床研究。大多数免疫细胞缺乏广泛使用的腺病毒血清型Ad5的受体，但例如巨噬细胞表达CD46，这是Ad35的主要受体。因此，通过将Ad5的纤毛基因替换为Ad35的纤毛基因而构建的嵌合腺病毒载体，在人巨噬细胞中显示出增强的抗HER2 CAR表达。Non-viral delivery 非病毒递送Para_01非病毒策略依赖物理或化学方法将DNA、mRNA或蛋白质货物导入细胞。非病毒递送主要应用于靶向基因组编辑，以实现位点特异性的基因敲入或敲除，或通过转座酶系统随机整合合成构建体。尽管存在细胞毒性，电穿孔仍是将DNA、mRNA和蛋白质共递送到靶细胞的主要方法。转座酶系统，特别是Sleeping Beauty和piggyBac系统，已逐渐成为病毒载体的替代方案。这些系统包括一个供体载体，其含有由反向末端重复序列包围的目的基因，以及一个编码转座酶的质粒，该酶介导货物在基因组中的半随机整合。转座子支持稳定的整合，并且能够容纳比大多数病毒载体更大的转基因盒。通过电穿孔递送编码Sleeping Beauty转座酶的mRNA以及编码转座子的微环DNA载体，已实现了高效的递送。由于这些载体缺乏细菌骨架序列，它们在原代人T细胞和造血干细胞中表现出更低的毒性和更高的整合效率。Para_02利用CRISPR-Cas9技术进行靶向转基因插入时，通常通过电穿孔将重组Cas9与单导RNA（sgRNA）形成的核糖核蛋白（RNP）复合物连同DNA供体模板一起递送至细胞，以实现同源定向修复。AAV载体也可用于提供供体模板。一项具有里程碑意义的临床应用涉及对患有镰状细胞病和β-地中海贫血患者的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行体外基因编辑，这两种疾病均由β-珠蛋白基因（HBB）突变引起。将Cas9 RNP通过电穿孔导入HSPCs，以破坏BCL11A增强子或纠正HBB基因突变。编辑后的细胞被重新回输，实现了有效的植入和临床获益，从而促成了首个基于CRISPR疗法的监管批准。Para_03总体而言，与体内策略相比，体外修饰能够对基因工程过程及最终细胞产品的质量实现更严格的控制，同时对递送载体的特异性或全身耐受性的要求也更低。优先追求高转导或转染效率，以缩短并简化扩增操作流程，同时最大程度地提高产品的一致性。Engineering allogeneic therapies for broad accessPara_01自体细胞的广泛应用仍存在重要障碍，包括起始材料的变异性、制造失败的风险、基因工程后产品缺乏一致性和纯度，以及对于患有侵袭性疾病的个体而言可能无法接受的生产延迟。异体细胞治疗有助于克服自体治疗的一些问题。这些“即用型”治疗方法可以提前准备就绪，并根据患者个体情况选择使用（图5）。然而，它们也伴随着重要风险，例如移植物抗宿主病和宿主对移植物的排斥反应。 Fig. 5: Designing off-the-shelf allogeneic engineered cell therapies. - 图片说明 ◉ a，天然低免疫原性细胞。从健康供体的外周血或脐带血中分离出的自然杀伤（NK）细胞、γδ T细胞以及不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）具有天然较低的异体反应性，已被探索用于CAR工程化细胞治疗。◉ b，工程化低免疫原性细胞。从脐带血或骨髓中分离的造血干细胞和祖细胞（HSPCs），或由成人体细胞衍生的诱导多能干细胞（iPSCs），可通过基因改造以逃避免疫系统的识别：例如，利用CRISPR-Cas技术敲除人类白细胞抗原（HLA）I类/II类分子以避免T细胞介导的排斥反应，并过表达HLA-E、HLA-G或CD47以抑制NK细胞或巨噬细胞的反应。◉ c，制造工艺：在完成基因修饰并引入治疗功能后，细胞被扩增，随后将工程化的HSPCs和iPSCs分化为所需的细胞谱系，并进行冷冻保存，以实现即用型产品供应。Naturally or engineered hypoimmune primary cells 天然或工程化的低免疫原性原代细胞Para_01天然异体反应性较低的免疫细胞类型，例如上述讨论的自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞、γδ T细胞和iNKT细胞，已被探索作为同种异体治疗平台（图5a）。这些细胞能够逃避对宿主不匹配组织的识别，从而降低移植物抗宿主病的风险。然而，这些细胞类型在外周血中通常较为稀少，需要进行广泛的体外扩增，这可能会影响最终疗法的一致性和质量。作为替代方案，已开发出免疫工程策略，以使更丰富的原代细胞能够在同种异体环境下使用。其中一种策略涉及共表达一种可特异性识别4-1BB的细胞表面受体，该受体在活化的淋巴细胞上短暂上调。通过靶向这一活化标志物，表达该受体的同种异体T细胞可以选择性地清除异体反应性淋巴细胞，同时保留静息状态的淋巴细胞，从而在小鼠研究中实现更好的存留效果。来自健康供体的外周血和脐带血来源的T细胞也已用于临床同种异体CAR-T细胞治疗（图5b）。为了最大限度地降低移植物抗宿主病的风险，这些细胞通常经过基因编辑以破坏T细胞受体α恒定区（TRAC）位点。额外的遗传修饰可以降低免疫原性并增强细胞在宿主体内的持久性，包括敲除选定的HLA I类分子或通过删除β2-微球蛋白（B2M）完全消除HLA I类分子，以及敲除II类反式激活因子（CIITA）转录因子以防止HLA II类分子的表达。通过过表达免疫检查点抑制分子如CD47和PDL1，或敲除抑制性受体PD-1（该受体限制T细胞的活化和持久性），可进一步增强体内耐久性。该方法也已应用于来自恒河猴的原代胰岛细胞。这些胰岛细胞通过CRISPR–Cas9介导的HLA I类和II类分子耗竭，并通过慢病毒转导实现CD47的过表达，从而被改造为低免疫原性细胞。当移植到糖尿病猴体内时，这些经工程改造的胰岛细胞能够在无需任何免疫抑制的情况下，控制血糖水平并恢复胰岛素生成，持续超过六个月。这些结果证明了工程化低免疫原性原代细胞可在同种异体受体中长期存活并发挥功能，支持其在糖尿病患者中实现长期血糖控制的潜力。Allogeneic stem-cell-derived therapeutic cells 异体干细胞来源的治疗细胞Para_01干细胞来源的平台为同种异体治疗提供了可再生且标准化的效应细胞来源。诱导多能干细胞或成体组织驻留干细胞可在体外扩增，并分化为多种治疗性效应细胞。这些现成的产品能够按需供应，有助于扩大患者对治疗的可及性，并减少治疗延误。在肿瘤学领域，从骨髓或脐带血中分离出的造血干细胞可以被改造以表达嵌合抗原受体和其他效应蛋白，随后分化为自然杀伤细胞、巨噬细胞或其他免疫效应细胞。然而，由于造血干细胞丰度较低且所需分化流程耗时较长，这些过程往往较为费时。诱导多能干细胞则提供了一个更灵活且可扩展的平台。基因修饰可以在多能阶段引入，从而实现功能一致的细胞产品的规模化生产。临床前和临床研究已证实了诱导多能干细胞来源免疫疗法的安全性和可行性。一项使用诱导多能干细胞来源的同种异体CAR-NK产品的1期临床试验结果显示，该产品经过基因工程改造，可表达抗CD19嵌合抗原受体、用于减轻抗原逃逸的高亲和力不可切割CD16受体以及增强存续能力的IL-15受体融合蛋白，在部分患者中表现出良好的耐受性，仅出现轻微毒性。Para_02为了最大限度地减少排斥反应，已采用先进的基因编辑技术，通过敲除HLA分子及其他免疫识别因子来生成低免疫原性的iPSC系。目前的研究重点在于确保转基因的稳定表达，以及优化分化方案，以实现效应细胞的完全且功能成熟的分化。提高治疗性细胞产量和功能的一种策略是使用与预期效应细胞相同谱系来源的iPSC。这些谱系预设的iPSC保留了表观遗传记忆，从而能够更高效地分化为所需表型。为确保临床安全性，在给药前必须清除残留的未分化细胞，通常通过筛选谱系特异性标志物并排除多能性标志物来实现。为进一步增强安全性，可引入自杀开关，以便在给药后清除异常细胞。Para_03异体疗法与工业化规模生产具有独特兼容性（图5c）。它们可以大规模扩增，经过严格的质量控制，并冷冻保存为均一的治疗批次。这使得临床可以立即使用，避免了自体产品固有的延迟，同时扩大了患者的可及性。In vivo programming of therapeutic cellsPara_01体内重编程涉及将基因构建体直接递送至患者体内，以在体内生成治疗性细胞群体。与体外方法相比，该策略避免了细胞分离、扩增和再输注的需求，为治疗提供了更简化的途径。通过实现原位细胞工程，它有望靶向多种细胞类型、组织和器官，克服物理分离和体外工程的限制。此外，体内重编程开启了即用型治疗方案的大门，可降低生产复杂性、减少成本并缩短治疗等待时间。采用非整合型递送方法可进一步降低插入突变相关风险，相较于永久性基因修饰的体外产品具有更高的安全性优势。然而，体内递送的关键挑战在于如何协调能够靶向任何组织的潜力与实现细胞类型特异性的必要性之间的矛盾。有效的递送必须精确靶向目标细胞群体，因为脱靶递送可能稀释治疗效果并损害疗效。目前用于体内递送基因编辑和基因调控元件的策略包括病毒载体、聚合物或脂质纳米颗粒以及类病毒颗粒，每种方法都具有各自独特的优势和挑战。 Fig. 6: In vivo programming of therapeutic cells. - 图片说明 ◉ 病毒递送：慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）载体是体内基因转移最常用的病毒系统，其中第三代腺病毒载体具有最大的载荷容量。◉ 这些载体的表达动力学各不相同。慢病毒载体通过基因组整合支持长期表达。◉ AAV载体能够实现持续数月到数年的表观遗传外表达。◉ 腺病毒载体则驱动短暂表达，持续时间为数天至数周。◉ 非病毒递送：脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和类病毒颗粒正在被开发作为非病毒平台，用于将瞬时表达的遗传物质递送到靶细胞群体。◉ dsDNA表示双链DNA；Gag-Pro-Pol表示特异性抗原-蛋白酶-聚合酶；PEG表示聚乙二醇；RNP表示核糖核蛋白；ssRNA表示单链RNA。Viral delivery for sustained reprogramming 用于持续重编程的病毒递送Para_01腺相关病毒（AAV）由于其相对较低的免疫原性、广泛的组织嗜性和游离型持久存在，成为体内递送治疗性构建体的理想选择。AAV已广泛应用于基因编辑技术中，包括临床试验，以及在动物研究中用于递送嵌合抗原受体（CAR）分子。为了应对AAV载荷容量有限（约4.7 kb）的问题，研究人员采用了较小的基因组编辑器，例如古菌来源的Un1Cas12f1，或使用双AAV载体策略。局部递送方式，例如胸腺内注射，已被探索用于实现向T细胞的优先基因转移，以治疗自身免疫性疾病和感染性疾病。此外，通过衣壳工程改造，AAV载体已实现一定程度的靶向嗜性，例如对T细胞、肌肉细胞和脑细胞的特异性趋向。利用优化的连接子设计，可将高亲和力配体（如T细胞上的CD8）整合到衣壳环状结构中，以保持其结构完整性并最大化靶向效率。AAV还被用于递送可响应外部刺激的小型基因回路；特别是那些可在转录后调控、不依赖辅助蛋白的开关系统，因其遗传片段小而与AAV兼容。Para_02慢病毒载体虽然主要用于体外工程，但由于其较大的载荷容量（可达10 kb），在有效载荷设计上具有更高的灵活性，因此也被探索用于体内应用。慢病毒载体已通过改造表达靶向配体，例如单链可变区片段（scFv）或DARPins，并将其与包膜糖蛋白进行基因融合，以增强细胞特异性。此外，对VSV-G包膜蛋白的突变形式进行了研究，这类突变体可减少与广泛表达的低密度脂蛋白受体的结合，同时保持其融合活性，从而提高了慢病毒靶向的特异性和效率。这些策略已在非人灵长类动物中实现了对T细胞亚群和自然杀伤细胞的选择性体内靶向。然而，由于慢病毒载体具有整合能力，仍存在插入突变的风险，令人担忧。此外，病毒包膜中可能含有宿主来源的膜蛋白，这会引发免疫反应，降低载体在血液循环中的稳定性，并限制重复给药的可行性。Para_03腺病毒载体已被用于递送可调控效应蛋白表达的系统。其中一个例子是递送一种可诱导的IL-12表达系统，该系统的转录激活由蜕皮激素受体控制，并通过口服蜕皮激素类似物维德米克斯触发。该系统被包装在AV5载体中，并直接注射到胶质母细胞瘤患者的肿瘤内，在多种诱导方案中均显示出可行性和良好的耐受性。由于IL-12具有强效作用但全身毒性较高，局部且药物可诱导的表达为其提供了更安全的治疗窗口。Para_04尽管病毒载体方法具有优势，但在基因组编辑应用中，所有基于病毒载体的方法都存在局限性。与mRNA或蛋白质等瞬时递送方式相比，基因编辑工具的持续表达会增加脱靶效应的风险。Nanoparticle delivery systems for transient payloads 用于瞬时载荷的纳米粒子递送系统Para_01脂质纳米颗粒（LNPs）和基于聚合物的纳米颗粒通过递送mRNA，为治疗性蛋白质（如CAR或基因组编辑器）的瞬时体内表达提供了非病毒选择。这些平台避免了基因组整合，从而降低了长期的基因毒性风险。mRNA分子通常利用T7 RNA聚合酶通过体外转录产生，并通过非翻译区序列设计、密码子使用、合成帽结构、poly-A尾以及核苷酸类似物等手段进行优化，以提高其稳定性、降低免疫原性并增强翻译效率。为了延长表达持续时间，目前正在探索自扩增RNA和环状RNA。Para_02从结构上看，脂质纳米颗粒（LNPs）类似于脂质体，通常由可电离的阳离子脂质组成，这类脂质能与带负电荷的核酸形成复合物，并促进内涵体逃逸；此外还包括用于维持颗粒结构的磷脂、用于稳定性和膜融合的胆固醇，以及用于延长循环时间的聚乙二醇化脂质。LNPs具有模块化的配方、可扩展性，并且能够比腺相关病毒（AAVs）承载更长的核酸片段，这使其在体内基因编辑中尤为具有吸引力。将Cas9 mRNA与sgRNA共同封装于LNPs中，已在小鼠和非人灵长类动物的肝脏中实现治疗水平的基因编辑。然而，实现向肝外组织的有效递送仍然是一个主要难题，通常需要基于配体的靶向策略或表面修饰。在一个例子中，采用靶向CD5的LNPs将编码靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体（CAR）的mRNA递送至心肌纤维化小鼠模型的T细胞中，导致约20%的脾脏T细胞出现短暂的CAR表达，实现了对成纤维细胞的靶向清除以及心脏功能的恢复。最近，研究人员使用表面修饰抗CD8抗体并携带抗CD19 CAR mRNA的LNPs，在非人灵长类动物中进行给药，实现了肿瘤控制以及在自身免疫动物中短暂的B细胞耗竭，显示出免疫重置效应。Para_03基于聚合物的纳米颗粒在体内生成CAR-T细胞方面也显示出潜力。例如，与CAR mRNA复合并修饰有抗CD8抗体的纳米颗粒能够靶向递送至T细胞，并在淋巴瘤、前列腺癌和乙型肝炎病毒诱发的肝细胞癌的小鼠模型中诱导出治疗反应。其疗效可与体外病毒转导的CAR-T细胞达到的效果相媲美。在另一项研究中，连接了angiopep-2的聚合物纳米颗粒被设计用于穿越血脑屏障，并在小鼠中选择性靶向胶质母细胞瘤细胞，凸显了基于纳米颗粒的递送系统在微创靶向免疫豁免部位方面的潜力。Para_04重要的是，通过纳米粒子介导的mRNA递送实现的瞬时表达，与那些无需或不希望工程化细胞长期存留的治疗场景高度契合。例如，在B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病中，即使没有持续的CAR-T细胞活性，也能实现持久缓解，这使得体内瞬时重编程成为此类适应症的一种极具吸引力的策略。Virus-like particles for transient payloads 用于瞬时载荷的病毒样颗粒Para_01病毒样颗粒（VLPs）提供了一种混合解决方案，结合了病毒递送的高效性与非病毒系统的瞬时、非整合特性。VLPs可以被改造用于递送蛋白质、mRNA或核糖核蛋白复合物（RNPs），而无需携带病毒基因组。例如，通过使用蛋白酶可切割的连接子将货物蛋白与逆转录病毒Gag蛋白融合，已构建出工程化的VLPs，从而实现蛋白酶介导的释放，并通过包膜糖蛋白的假型化控制细胞特异性。这些系统已在小鼠肝脏和视网膜中实现了高效的体内碱基编辑，与腺相关病毒（AAVs）相比，脱靶效应更少。进一步的发展使工程化VLPs能够通过Cas蛋白成分和卷曲螺旋适配器招募RNP复合物，递送原位编辑器复合物，实现瞬时的体内递送，脱靶编辑极少，且无外源基因插入风险。通过定向进化优化衣壳蛋白（使用条形码标记的引导RNA追踪有益突变），将RNP的包装和递送效率提高了多达4倍；其中某些突变破坏了病毒基因组包装的相互作用，提高了对合成RNP货物的选择性。为了克服RNP复合物在细胞核内形成与VLP在细胞膜出芽之间的空间分离问题，研究人员对引导RNA进行了改造，添加了RNA适配体和定位信号，以促进其在细胞核与细胞质之间的穿梭并增强RNA稳定性，从而在Leber先天性黑蒙的小鼠模型中实现了基因突变的纠正和视觉功能的恢复。相较于纳米颗粒，VLPs的一个显著优势在于可通过包膜假型化调节其趋向性。目前正积极开展糖蛋白的工程化研究，以精细调控并限制其对特定免疫细胞亚群的趋向性。Para_02充分发挥体内可编程治疗的全部潜力，需要在递送技术方面取得协调进展，并密切关注转化过程中的限制因素。关键挑战包括载体和有效载荷的可规模化、成本效益高的制造；生物分布和持续性的全面表征；以及对脱靶编辑、基因毒性和免疫原性的评估。对于持久存在或整合到基因组中的疗法，长期安全性监测仍然是监管机构的重点。在早期阶段与监管机构密切合作，有助于确保建立适当的检测方法以发现任何 unintended 效应，并明确所需的长期监测内容。解决上述所有问题，对于将体内重编程安全地转化为临床应用至关重要。ConclusionsPara_01可编程细胞疗法正逐渐成为精准医学的核心支柱，能够针对多种疾病实现动态的、基于特定环境的干预。尽管CAR-T细胞疗法已证明了工程化细胞在临床上的可行性，但下一代方法旨在提高特异性、安全性、持久性和可及性。目前的研究工作集中在整合逻辑门控的决策机制和多层调控系统，使治疗性细胞能够解读复杂的信号，并以可控且适应性的方式作出响应。与此同时，利用可扩展的同种异体干细胞来源，并推进更精确的体外重编程技术，对于扩大可及性、减轻生产负担并提高细胞产品的安全性至关重要。临床中的挫折凸显了严格安全设计的重要性。例如，最近一例因通过PiggyBac介导将CAR整合到同种异体造血干细胞中而引发T细胞淋巴瘤的病例，突显出对更安全载体系统和更严格质量控制措施的迫切需求。随着合成回路日益复杂，在确保性能的同时也必须考虑其可制造性，以保障临床应用的可靠性。展望未来，向体内重编程的转变——即在患者体内直接生成治疗性细胞——为扩大可及性和简化递送方式提供了一条极具前景的路径。朝这一方向迈出的重要一步是，利用脂质纳米颗粒介导的基因编辑工具递送，成功治疗了一名患有罕见代谢疾病的儿童，修复了其肝脏中表达的致病基因。尽管仍需进一步研究以确认长期安全性与编辑准确性，并将递送范围扩展至肝脏以外的组织，但该案例充分展示了体内可编程疗法的潜力，并为治疗类似的单基因遗传病带来了希望。Para_02与此同时，使能技术仍在不断改进。高效的原位编辑器现在在体外修饰的人多能干细胞中已实现超过75%的编辑效率，而CRISPR相关转座酶变体则能够高效、特异性地整合大型遗传元件，且不产生双链断裂，从而降低了意外插入、缺失或染色体重排的风险。在人类细胞中进行的定向进化正在产生性能更优的蛋白质变体，包括对小分子响应更有效的四环素类转录因子。与此同时，一篇预印本论文展示了人工智能（AI）在加速新型生物分子设计以及提升基因组编辑工具（包括下一代CRISPR系统）有效性方面的潜力。最终，合成生物学、基因编辑、人工智能驱动的设计以及精准递送技术的融合，将推动开发出越来越先进、可编程的疗法，以适应多种多样的疾病图景。