Grazoprevir Hydrate

用于精准医学的下一代可编程细胞疗法 工程化的细胞疗法正通过实现对疾病特异性信号进行实时、情境响应的干预，从而变革精准医学。受CAR-T细胞在肿瘤学领域成功的启发，研究人员正在利用多种免疫细胞和干细胞开发下一代平台，以应对更广泛的疾病。这些活体疗法利用合成基因回路，在响应内源性信号或外部递送的分子及物理触发因素时，诱导靶向细胞毒性、调节效应蛋白的分泌，或协调这两种功能。离体工程化自体细胞仍是当前的标准，但在可扩展性、成本和可及性方面的挑战正推动着对同种异体产品和体内重编程的研究。靶向递送技术的进展——使用病毒载体、装载mRNA的纳米颗粒和病毒样颗粒——正在扩展用于直接在体内编程细胞的工具包。本综述讨论了用治疗功能工程化人类细胞的新兴策略，重点介绍了模块化控制系统、递送创新以及摆在面前的转化障碍。 引言 活体疗法正通过将细胞用作可编程实体来重塑现代医学，这些实体能够持续监视其周围环境，并响应特定信号执行治疗程序以缓解疾病。与传统小分子药物或生物制剂不同(后者通常不考虑患者生理或疾病状态变化而以预先确定的剂量给药)，工程化细胞能够适应并实时响应，提供更精准和持续的治疗效果。 经工程化改造以表达嵌合抗原受体的T细胞在靶向B细胞恶性肿瘤方面获得临床批准是一个里程碑，确立了基因增强免疫细胞的治疗潜力。尽管取得了成功，CAR-T细胞疗法的广泛应用仍然受限于其对自体细胞来源的依赖、复杂的患者特异性制造过程以及治疗相关的毒性。 为了扩大活体药物的治疗范围，其他工程化免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞，也正在临床前和临床环境中进行探索。这些平台可能提供一些优势，例如改善的安全性、降低的移植物抗宿主病风险以及在实体组织环境中的内在活性。其应用也正在扩展到肿瘤学以外，针对自身免疫性疾病、纤维化疾病、代谢性疾病和衰老相关疾病的工程化细胞疗法正在开发中。此外，其他细胞来源，包括多能干细胞和成体干细胞，也正被探索作为治疗性重编程的平台，从而能够生成具有定制功能的各种细胞类型。 同时，合成生物学的进展通过整合能够实现布尔逻辑函数以增强特异性、疗效和安全性，同时最小化脱靶效应的复杂基因回路，进一步精炼了工程化细胞疗法。将治疗回路工程化到细胞中的策略主要依赖于离体方法，使用病毒载体转导患者来源的细胞。然而，与自体细胞疗法相关的复杂性和高成本正推动着开发同种异体细胞疗法——即源自健康供体的即用型产品。并行地，体内重编程作为一种规避离体操作挑战的策略正受到越来越多的关注。临床前研究已证明了使用递送平台(如病毒载体、装载mRNA的聚合物或脂质基纳米载体以及基因编码的病毒样颗粒)进行体内重编程的可行性，尽管在靶向特异性、递送效率和免疫原性方面仍存在挑战。 本综述探讨了将治疗功能编程到活细胞中的新兴策略，讨论了离体和体内方法的调控模式、功能输出和递送技术。我们重点关注那些设计用于调节治疗性蛋白分泌、针对表达抗原的靶细胞启动细胞毒性反应或协调这两种输出的工程化细胞。我们不涉及经典的基因治疗方法，即通过离体或体内递送组成型、普遍性或组织特异性转基因表达，这些内容已在其他地方有过综述。最后，我们强调了与制造、递送和临床部署相关的转化挑战。这些进展共同为开发更具适应性、可及性和有效性的活体药物铺平了道路。 用治疗程序工程化细胞 工程化细胞疗法主要有两种类型。第一种涉及工程化各种免疫细胞以表达合成识别模块。CAR构建体将抗体衍生的胞外结构域与参与宿主细胞内源性激活途径的细胞内信号基序和共刺激结构域偶联；CAR工程化细胞通过其表面抗原表达识别靶标致病或功能失调细胞，并通过引发强大的细胞毒性、吞噬或免疫调节反应来消除它们。第二种类型涉及将可编程感应回路工程化到不同的效应细胞中，使它们能够检测疾病相关信号并以受控方式释放治疗性蛋白质，为纠正慢性疾病提供了新策略。 图1 | 用治疗程序工程化细胞 a, CAR-T细胞的作用机制： 过程：CAR(嵌合抗原受体)在T细胞表面识别靶细胞(如癌细胞)上的抗原 → T细胞被激活 → 释放含有穿孔素和颗粒酶的颗粒；同时激活死亡受体通路(如Fas/FasL)。 结果：导致靶细胞凋亡；活化的T细胞还分泌IFN-γ和TNF，招募NK细胞等免疫细胞协同作战。 b, CAR-NK细胞的作用机制： 特点：NK细胞本身就通过激活受体识别异常细胞。经过CAR工程化后，特异性增强。 功能：释放穿孔素/颗粒酶；通过FasL和TRAIL通路诱导凋亡；通过CD16介导ADCC(抗体依赖的细胞毒性)；分泌趋化因子招募T细胞和树突状细胞。 c, CAR-巨噬细胞的作用机制： 功能：CAR与肿瘤相关抗原结合 → 诱导吞噬作用；分泌促炎细胞因子；释放MMPs(基质金属蛋白酶)重塑ECM(细胞外基质)和TME(肿瘤微环境)；激活T细胞并招募其他免疫细胞。 d, 刺激响应性效应物分泌： 机制：合成基因回路使细胞能够感知内源性(可溶性或膜结合型)疾病生物标志物的升高，从而激活治疗程序，动态调节失调信号。 工程化CAR细胞以消除靶细胞 用于靶向杀伤的CAR-T细胞。用CAR修饰的T细胞是临床最先进的工程化细胞疗法形式。抗原结合后，CAR-T细胞通过两种途径杀死靶细胞：颗粒胞吐作用，涉及免疫突触形成、穿孔素介导的孔形成和颗粒酶诱导的caspase-3依赖性凋亡；以及死亡受体信号传导，即CAR-T细胞上的FasL与靶细胞上的Fas结合以触发凋亡。活化的CAR-T细胞还会释放IFNγ和TNF等细胞因子，有助于招募和激活其他免疫细胞，包括NK细胞。靶向B细胞限制性抗原CD19和BCMA的已批准CAR-T细胞疗法对血液系统恶性肿瘤显示出高效性，通常能带来持久的缓解。然而，这些益处常常伴随着显著的毒性，包括细胞因子释放综合征(涉及过度免疫激活导致全身性细胞因子水平升高)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(一种通常与细胞因子释放综合征相关的神经毒性并发症)。管理这些毒性仍然是一个关键的转化挑战，并推动了可控或自我调节的细胞治疗系统的发展。 CD19和BCMA靶向产品的临床成功催化了将CAR-T细胞疗法扩展到血液系统癌症以外的努力。正在进行的研究正在评估靶向肿瘤相关抗原如EGFR、HER2和间皮素的CAR-T细胞在胶质瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌中的应用。然而，在实体瘤中的疗效仍然有限，主要归因于肿瘤抗原异质性、T细胞持久性差以及由致密的细胞外基质屏障和免疫抑制性肿瘤微环境(通常富含调节性T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和抑制性细胞因子)引起的肿瘤浸润受限。为了增强持久性和抗肿瘤活性，CAR-T细胞被进一步改造，以在具有肿瘤限制性活性的启动子控制下过表达转录因子和多种细胞因子，以最小化全身毒性。这种“细胞因子装甲”的CAR-T细胞现在在血液和实体恶性肿瘤的临床研究中显示出有希望的结果。 CD19 CAR-T细胞也已在自身免疫性疾病中进行了研究，在消耗B细胞和恢复系统性红斑狼疮、特发性炎症性肌病和系统性硬化症中的免疫耐受方面显示出积极的临床反应，具有良好的安全性和诱导长期缓解。更特异的方法采用嵌合自身抗体受体，其包含特定自身抗原的片段，以实现对自身反应性B细胞的选择性靶向。例如，患有重症肌无力的个体由于针对肌肉特异性酪氨酸激酶的自身抗体而导致危及生命的肌肉无力，这种自身抗体破坏神经肌肉接头信号传导。在重症肌无力的临床前小鼠模型中，MuSK-CAAR T细胞降低了致病性免疫球蛋白水平，同时保留了健康B细胞和整体抗体产生。 CAR-T细胞也代表了解决传染病、病理性纤维化和细胞衰老的有前景的方法。在HIV的背景下，用源自靶向病毒包膜CD4结合位点的广泛中和抗体的CAR工程化的T细胞可以选择性识别和消除受感染的细胞。在最近的一项临床研究中，共表达滤泡归巢受体CXCR5的同种异体Env特异性CAR-T细胞耐受性良好，并且与大多数接受治疗的个体血浆病毒血症和细胞相关HIV-1 RNA的减少相关。在纤维化疾病中，靶向成纤维细胞活化蛋白的CAR-T细胞在心脏和肝纤维化小鼠模型中减少了活化的成纤维细胞并改善了器官功能。细胞衰老以持续性DNA损伤和促炎分泌表型为特征，促使慢性炎症和年龄相关疾病。在衰老的小鼠和非人灵长类动物模型中，经工程化改造以识别衰老相关标志物(如uPAR或NKG2D配体)的CAR-T细胞有效清除了衰老细胞，并在无明显毒性的情况下恢复了组织功能。 作为即用型细胞毒性效应细胞的CAR-NK细胞。NK细胞使用激活和抑制受体的平衡来识别异常或应激细胞。激活受体检测健康细胞上基本不存在的特定细胞表面标志物，并启动一系列导致钙内流、脱颗粒以及穿孔素和颗粒酶释放的事件。相比之下，抑制受体结合人白细胞抗原并抑制NK细胞活化。与供体T细胞(当其T细胞受体遇到患者健康组织上的错配HLA时可能引发强烈的同种异体反应)不同，NK细胞主要感知HLA的丢失或改变，这是恶性转化或感染的指标。这一特性使NK细胞在个体间本质上更具兼容性，导致低同种异体反应性和最小的移植物抗宿主病风险。因此，CAR工程化的NK细胞适合用作即用型疗法，可以提前制造并在无需患者特异性匹配的情况下给药。这些细胞将直接的、靶向的细胞毒性与其天然的肿瘤监视功能相结合，并分泌趋化因子以招募T细胞和其他免疫细胞，从而实现对靶细胞的协调消除。 NK细胞可以从外周血(约占淋巴细胞的5-15%)或脐带血(可包含高达30%的NK细胞)中分离。同种异体CAR-NK细胞的临床研究，包括源自脐带血的抗CD19 CAR-NK细胞，已证明了安全性和抗肿瘤活性。即使供体和受体具有不同的HLA谱，也几乎没有发生高级别细胞因子释放综合征，也没有发生移植物抗宿主病。这凸显了它们本质上低的同种异体反应性，并与CAR-T细胞疗法中通常观察到的较高毒性率形成对比。为了增强CAR-NK细胞的持久性和扩增能力，它们被设计为共表达NK细胞促进性细胞因子，如IL-15。抗CD19 CAR-NK细胞也正在临床研究中探索用于自身免疫性疾病。 尽管NK细胞的基因修饰效率一直低于T细胞，但转导方法和培养系统的进展正在逐步改善工程化结果。诱导多能干细胞或CD34+造血干细胞提供了可扩展的NK细胞来源，这些细胞更易于进行基因修饰。尽管如此，CAR-NK细胞在实体瘤中面临与CAR-T细胞类似的挑战，包括抗原逃逸和肿瘤浸润能力差。 用于肿瘤重塑和清除的CAR-巨噬细胞。巨噬细胞因其天然的浸润能力、吞噬功能和免疫调节作用，成为实体瘤治疗的有希望的候选者。当配备CAR时，巨噬细胞被重新定向以识别和吞噬肿瘤细胞，同时增强抗原呈递和局部免疫激活。根据CAR构建体中包含的胞质信号传导结构域，CAR-巨噬细胞可能分泌免疫调节细胞因子和趋化因子，以及重塑细胞外基质的基质金属蛋白酶，从而促进免疫浸润和肿瘤清除。临床前研究表明，单次输注CAR-巨噬细胞可通过多种机制重塑肿瘤微环境，包括分泌炎性细胞因子和增强向T细胞呈递抗原，从而在实体瘤异种移植模型中减少肿瘤负荷并延长生存期。类似地，工程化的抗HER2 CAR-巨噬细胞在同基因小鼠肿瘤模型中改善了生存期和免疫细胞浸润，同时诱导了抗原扩散。此外，与第一代T细胞衍生的基于CD3ζ构建体相比，包含TLR4信号模块的CAR-巨噬细胞通过在抗原结合后以NF-κB依赖性方式诱导强大的促炎表型并抑制抗炎程序，显示出优越的抗肿瘤活性。当输注给HER2阳性乳腺和胃食管肿瘤患者时，用编码抗HER2 CAR的嵌合腺病毒载体转导的自体巨噬细胞显示出良好的安全性和耐受性。 尽管具有治疗潜力，但巨噬细胞在离体扩增和转导方面比T细胞或NK细胞更困难。基因修饰的多能干细胞的分化提供了一种替代方案。在一项研究中，靶向神经外胚层肿瘤相关抗原GD2的CAR被插入到iPSC的AAVS1安全港位点，然后分化为巨噬细胞，在神经母细胞瘤小鼠模型中产生了有效的抗肿瘤效果。同样，表达靶向胰腺癌中高表达TAA的CAR和膜结合IL-15的人多能干细胞工程化后，产生的巨噬细胞在胰腺癌小鼠模型中抑制了肿瘤生长并延长了生存期。 然而，CAR-巨噬细胞的治疗性能可能因特定的肿瘤环境而异。巨噬细胞是高度可塑的细胞，其行为受局部信号的影响，这些信号在不同肿瘤类型和疾病阶段有所不同，这仍然是CAR-巨噬细胞疗法转化到临床的一个重要考虑因素。 工程化替代免疫细胞平台。具有先天抗肿瘤特性的替代免疫效应细胞，如γδ T细胞和恒定型自然杀伤T细胞，也正在被探索作为CAR表达的治疗平台。γδ T细胞比常规T细胞更难离体扩增，且频率低得多，但它们识别靶标基本不依赖于主要组织相容性复合体I类分子呈递，使其适用于MHC缺陷型肿瘤和同种异体应用。在复发性或难治性非霍奇金淋巴瘤患者中使用同种异体抗CD20 CAR-γδ T细胞的早期临床研究显示出有希望的活性，尽管持久性仍然有限。在临床前研究中，细胞因子共表达提高了持久性，但仍不及CAR-T细胞的持久性。iNKT细胞在外周血淋巴细胞中的比例更低，但分离和离体扩增的方案正在改进。它们表达一种恒定的T细胞受体，识别由靶细胞上表达的MHC样分子CD1d呈递的糖脂，并且一些细胞表达NK受体，可引发强大的细胞毒性和快速的细胞因子分泌。在临床前模型中，CAR-iNKT细胞通过消除免疫抑制性CD1d+巨噬细胞、通过树突状细胞激活促进表位扩散以及随后的内源性T细胞反应，从而优于CAR-T细胞。临床上，表达GD2特异性CAR和IL-15的自体iNKT细胞在输注后于复发或耐药神经母细胞瘤儿童的外周血中扩增，迁移至转移部位并诱导肿瘤消退。树突状细胞作为专业的抗原呈递细胞，也正在被改造用于免疫治疗，例如，通过过表达细胞因子以增强内源性T细胞启动和抗肿瘤免疫。从造血干细胞和祖细胞分化而来的树突状细胞祖细胞，经工程化改造以分泌免疫刺激性细胞因子，在小鼠模型中减少了肿瘤生长，这与NK细胞和T细胞浸润及活化相关。这些细胞因子武装的树突状细胞祖细胞还能与CAR-T细胞协同作用，在胶质瘤小鼠模型中根除已建立的肿瘤，而每种单一疗法仅获得有限的反应。 图2 | 在DNA、RNA和蛋白质水平上诱导控制目标蛋白功能 a, 转录水平控制：输入信号激活转录调节因子，使其结合DNA，从而诱导下游目的基因的表达。 b, 翻译水平控制：位于 5‘ 或 3’ UTR(非翻译区)的调节性RNA元件在信号结合后调节目的蛋白的翻译。 例子：输入信号抑制 3’UTR 中的自切割核酶，稳定mRNA，从而允许翻译进行。 c, 翻译后水平控制：通过信号调节的降解结构域或可抑制的蛋白酶来调控已有蛋白质的稳定性或活性。 总之，工程化T细胞因其增殖能力和记忆亚群，仍然是对抗靶细胞的有效细胞毒性效应细胞，但它们与细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征的风险增加相关。NK细胞提供快速的细胞毒性反应，毒性风险较低，但寿命较短，且存在可能限制疗效的抑制性受体。巨噬细胞兼具吞噬和免疫调节功能，使其成为重编程以对抗免疫抑制性肿瘤微环境的有希望的候选者。利用iPSC作为工程化免疫细胞的可再生来源，并结合多种免疫细胞类型，可能提供协同策略，以提高疗效并克服不同适应症中的耐药性。此外，即用型多特异性抗体正在开发中，以共同参与激活免疫受体和肿瘤相关抗原，将内源性T细胞或NK细胞的细胞毒性重新定向到癌细胞，具有CAR样的特异性，而无需离体细胞工程化。 用于控制效应物分泌的合成回路 工程化细胞可以通过整合将疾病特异性输入与受控效应物输出偶联的合成基因回路，作为自主的治疗工厂。这些回路使得效应蛋白能够响应内源性分子信号进行反馈调节分泌，允许细胞以情境特异性的方式感知和对抗病理信号。 回路设计和刺激响应性。尽管CAR-T细胞的大多数临床应用都集中在细胞毒性CD8+ T细胞上，但类似的策略可以被调整以利用替代性免疫细胞类型在其他疾病中获得治疗效果。例如，最近的研究已经工程化了人CD4+ T细胞，使其带有合成Notch受体，在感知靶向抗原时触发局部免疫调节。在一个例子中，synNotch受体被设计用于感知表达抗原的细胞毒性T细胞并触发免疫抑制蛋白的产生。另一种设计靶向脑细胞外基质成分。在这种设计中，植入的工程化T细胞在自身免疫、移植和神经炎症的鼠模型中诱导抗炎细胞因子的表达，保护靶组织而不引起全身性免疫抑制。其他工作使用CRISPR-Cas9介导的基因组工程将抗炎基因插入到含有趋化因子MCP-1基因及其启动子的基因组位点，该启动子可被炎性细胞因子激活。这使得间充质干细胞能够响应由IL-1和TNF细胞因子驱动的局部炎症，表达这些抗炎蛋白。由此产生的反馈控制回路在炎性关节炎小鼠模型中赋予了持续的治疗益处，且分泌的蛋白质全身暴露最小。类似的反馈控制回路也已被开发用于治疗苯丙酮尿症、痛风性关节炎、代谢综合征、肝损伤、高胆固醇血症、银屑病和其他炎症性疾病。在这些系统中，人细胞系被改造为具有转录调控的基因回路，利用合成或内源性膜受体或转录因子作为疾病相关生物标志物的生物传感器。一旦检测到信号，回路就会触发治疗性蛋白质的产生。将工程化细胞封装在海藻酸盐微球中并植入小鼠模型，使其能够自主恢复生理稳态并纠正疾病表型。将这一概念扩展到疾病相关信号之外，最近的一项研究开发了昼夜节律激素响应开关，感知振荡的褪黑素或促甲状腺激素水平，以实现每日一次的转基因激活。当封装并植入2型糖尿病小鼠体内时，褪黑素响应回路驱动转基因GLP-1在夜间分泌，以调节葡萄糖稳态并刺激胰岛素分泌，突显了利用内源性昼夜节律信号进行时间程序化治疗递送的潜力。 细胞类型选择与考量。这些系统临床转化的一个关键因素是细胞平台的选择。理想的宿主应支持稳定的基因组工程，并具有低免疫原性、无致瘤潜力以及在体内所需治疗时间范围内生存和发挥功能的能力。在自身免疫性疾病中，短暂的分泌可能足以重置免疫稳态或解决炎症。然而，慢性疾病，如1型糖尿病，可能需要工程化细胞的长期持久性或重复输注。间充质干细胞在临床研究中已被广泛研究，主要归因于其天然的免疫调节和再生特性。除了这些天然功能外，MSCs还被基因工程化改造，以在植入后产生治疗性蛋白质，在临床前研究中显示出前景。例如，经全身输注的、用慢病毒载体工程化以响应肿瘤微环境特征性机械刺激分泌抗肿瘤酶的MSCs，能够选择性地靶向并杀死小鼠体内的转移细胞，同时保留健康组织，说明了MSCs作为刺激响应性治疗递送平台的潜力。然而，体内存活率和组织滞留率低继续限制着其治疗效果。包括封装和预激活在内的多种策略正在研究中，以增强MSC的活力和持久性。 记忆T细胞提供了另一种引人注目的平台，因为它们具有长寿和全身循环的能力。最近的一项研究证明了记忆T细胞经工程化改造以分泌α-L-艾杜糖苷酶的治疗潜力，该酶是1型粘多糖贮积症患者缺乏的酶。通过CRISPR-Cas9介导的IDUA整合到AAVS1位点，并将这些细胞过继转移到小鼠体内，导致了IDUA的长期分泌，在包括大脑在内的多个器官中实现了长达22周的糖胺聚糖积累的代谢校正。B细胞及其终末分化的浆细胞代表了其他有前途的平台。与记忆T细胞类似，它们可以从外周血中分离出来，并在分化前进行工程化改造。浆细胞寿命长，能够归巢到相关组织，并拥有卓越的分泌能力，因此可能能够使用更低的细胞剂量来达到治疗性蛋白质水平。概念验证的动物研究已证明B细胞或浆细胞能够在蛋白质缺乏症、病毒感染和癌症的背景下递送生物制剂。B细胞工程化技术的进步实现了基于抗体和非抗体的蛋白质分泌，可以整合到免疫球蛋白基因座或CCR5等安全港位点。然而，B细胞工程化仍然不如T细胞工程化高效，并且这两个平台至今主要依赖于转基因的组成型表达。刺激响应性基因回路尚未在这些系统中得到充分展示。 利用合成生物学增强细胞疗法 合成生物学通过实现对细胞行为的可编程控制，正在推动细胞疗法的发展。增强工程化细胞疗法安全性、特异性和疗效的策略包括整合合成基因回路、逻辑门、自杀开关和外部可调控系统。 图3 | 利用合成生物学增强细胞疗法 A, 通用CAR：依赖衔接分子桥接CAR表达细胞和靶抗原。通过更换衔接分子，同一工程化细胞可以重定向至不同的抗原。 B, 条件性CAR(外部控制)：Ba (SNIP CAR)：通过小分子抑制剂(如grazoprevir)抑制膜锚定的病毒蛋白酶，防止其切割CAR分子，使CAR保持完整功能。 Bb (降解结构域)：小分子(如trimethoprim)稳定融合在CAR上的降解结构域，从而稳定CAR并激活T细胞；无小分子时，CAR被快速降解。 C, 逻辑门控CAR(空间/逻辑控制)：Ca (HypoxiCAR)：“如果缺氧” → “则表达CAR”。结合了缺氧诱导型启动子和氧依赖性降解结构域，使CAR只在肿瘤缺氧环境中稳定表达。 Cb (AND门-LINK CAR)：“同时识别TAA1和TAA2” → “才激活”。两个受体分别结合抗原，组装LAT和SLP-76支架，共同激活PLCγ1信号。 Cc (synNotch-CAR)：“如果识别TAA1” → “则表达靶向TAA2的CAR”。实现顺序性的“如果-则”逻辑控制。 多层次合成控制系统 一个广泛且不断扩大的、在DNA、RNA和蛋白质水平上运作的模块化且特性明确的分子部件工具箱，支持高级控制系统的组装。在转录水平上，可以构建受细胞外控制的合成转录网络，主要基于三种策略。首先，依赖于异源转录因子，其与同源DNA序列的结合受特定输入信号的调节。其次，利用天然或合成受体，它们在检测到输入信号后启动内源性或正交信号级联反应，最终导致转录激活。第三，通过使用分裂转录因子，它们在检测到输入信号后重构活性，以驱动内源基因或转基因的表达。诱导型CRISPR激活和干扰系统通常遵循这种分裂设计，其中失活的Cas蛋白和反式激活因子或反式抑制因子以输入依赖的方式共定位在靶位点。最近的大规模筛选工作通过鉴定与CRISPR-Cas系统、锌指结构域和其他DNA结合结构域或蛋白兼容的有效的人类来源的激活子和抑制子，进一步扩展了调控设计空间。 诱导型翻译开关可能依赖于RNA结合蛋白(其与位于目标基因非翻译区的特定RNA结构的结合可由输入信号调节以抑制翻译)，或依赖于信号响应性RNA结构，如核酶和可变剪接装置。在蛋白质水平上，翻译后开关可以使用诱导型降解结构域或可抑制的蛋白酶来实现快速控制，这些蛋白酶调节蛋白质的稳定性或活性。 CAR的精准调控 时间性CAR调控。基于这些合成控制系统，已经开发了几种平台来以精确和可调的方式调控CAR活性。外部调控的CAR系统提供了对效应器功能的时序性和可逆性控制。例如，通用CAR平台使用衔接分子连接通用CAR支架和不同的抗原，允许灵活地重定向T细胞特异性。使用翻译后控制机制的條件性策略，包括基于可抑制病毒蛋白酶的切割系统、小分子诱导的受体降解以及由化学二聚化剂控制的分裂CAR，使得能够通过药物剂量实现对CAR活性的滴定调节。这些策略在临床前研究中增强了CAR-T细胞的疗效、特异性和持久性，激发了对其在临床环境中转化潜力的探索。 空间特异性和逻辑门控CAR。除了时间控制外，空间特异性是一个关键挑战，因此已经开发了诱导型逻辑门控CAR系统，其中效应器功能仅在肿瘤微环境内被激活。例如，HypoxiCAR T细胞实现了如果-则逻辑，即如果存在缺氧，则通过结合缺氧敏感型启动子和氧依赖性降解结构域，实现CAR的表达和稳定。这种设计将细胞毒性限制在肿瘤区域，同时限制了在常氧环境中的脱肿瘤毒性。通过将其他形式的布尔逻辑整合到合成受体设计中，可以进一步提高特异性。与门CAR允许工程化细胞仅在存在多种TAA时作出响应。在LINK-CAR系统中，T细胞表达识别两种TAA的两种不同受体。两种受体的结合对于组装LAT和SLP-76信号支架是必需的，这些支架传播T细胞活化所需的下游信号。另一种广泛使用的策略涉及synNotch受体，它感应一种启动抗原并诱导针对第二种杀伤抗原的CAR的转录。这种两步激活降低了攻击仅表达一种抗原的健康组织的风险。这一概念被扩展到开发可溶性配体感应synNotch平台，该平台响应免疫抑制信号(如TGFβ或VEGF)激活CAR表达。与组成型活性CAR-T细胞相比，这些如果-则逻辑门控CAR-T细胞在肺腺癌和黑色素瘤异种移植模型中显示出增强的肿瘤抑制作用和减少的脱靶效应。多抗原识别系统已在临床前模型中证明具有改进的安全性和持久性。 用于癌症以外疾病的合成回路 在肿瘤学之外，受外部施用的小分子或物理信号调控的治疗性基因回路正在糖尿病、慢性疼痛和肌肉萎缩等疾病的临床前模型中进行测试。诸如光、超声波、电磁场和电信号之类的物理信号允许精确的时空调节，而无需全身性药物暴露。然而，它们的使用可能需要复杂的外部硬件，并可能受到组织穿透深度的限制。理想的分子诱导剂应是安全的、口服生物可利用的、能够到达靶部位，并且应保持与内源性哺乳动物途径正交。最近的例子包括使用植物来源的转录调节因子NPR1和NPR4调控的阿司匹林调节合成回路，它们的结合依赖于水杨酸(阿司匹林的一种代谢产物)。其他回路已被开发出来，以响应膳食分子，如木糖、葡糖酸、阿魏酸、咖啡因和薄荷醇，扩大了临床可行输入的范围。然而，其中一些系统的潜在局限性在于它们依赖于非人源组分，可能引发免疫反应。初步研究发现在体内递送至肝细胞后没有显著的细胞因子诱导，但仍需进行长期安全性评估。此外，许多设计优先考虑最大倍数激活，而忽视了在缺乏目标输入的情况下不希望有的基础回路活性，这对于安全的体内部署至关重要。诸如相干前馈环或相互抑制开关之类的网络基序可以显著降低基础活性，同时不影响最大输出，从而改善功能性能。 综上所述，合成生物学框架正在使得能够设计智能、响应性和可调的细胞疗法成为可能，这些疗法能够在多种疾病中进行精确干预。这些工具的不断完善将释放活体药物的全部潜力。 自体细胞的离体工程化 自体细胞的来源。目前所有已批准的工程化细胞疗法都依赖于离体修饰从患者外周血分离的T细胞，这些细胞经逆转录病毒载体基因工程化改造、扩增，然后重新输注。这种个性化方法最大限度地降低了植入细胞的免疫排斥风险，但受到后勤和制造挑战的限制，包括需要个性化处理和质控。其他自体来源包括从外周血或骨髓分离的HSPCs、来自骨髓或脂肪组织的MSCs，以及通过使用山中因子对患者体细胞进行重编程产生的iPSCs。干细胞可以用合成构建体进行基因修饰，然后在移植前分化成所需的治疗性细胞类型。然而，仍然存在几个挑战，包括确保基因组稳定性，以及开发用于分化和功能成熟的稳健、可扩展的方案。正在通过临床前和临床开发推进的自体方法依赖于多种病毒和非病毒递送策略来引入合成构建体或编辑内源基因，每种策略都提供独特的优势和权衡。 病毒递送。病毒载体仍然是将基因转移到原代人细胞中最有效的方法。假型化水疱性口炎病毒糖蛋白的慢病毒载体广泛用于稳定基因整合和长期转基因表达。T细胞可以有效地被这些载体转导，但性能因细胞类型而异，在NK细胞和巨噬细胞中观察到的转导效率低得多。NK细胞对病毒感染特别抵抗。已经探索了各种策略来提高慢病毒转导效率，例如抑制抗病毒受体信号传导、利用病毒对快速分裂细胞的趋向性，或使用替代包膜蛋白。尽管如此，逆转录病毒或慢病毒载体的一个持续担忧是插入突变的可能性，因为整合到宿主基因组中可能破坏必需基因或调节元件。 相比之下，腺病毒和腺相关病毒载体以附加体形式递送转基因，从而避免了基因组整合并降低了相关的插入突变风险。尽管以这种方式递送的转基因的表达通常是瞬时的，但在短期免疫调节或效应物的暂时递送足以重置病理过程的治疗情境中，例如在自身免疫性疾病和纤维化疾病中，这可能就足够了。腺病毒平台已用于临床前和早期临床研究。大多数免疫细胞缺乏广泛使用的腺病毒血清型Ad5的受体，但例如，巨噬细胞表达Ad35的主要受体CD46。因此，通过用Ad35的纤维基因替换Ad5纤维基因工程化改造的嵌合腺病毒载体，已证明在人巨噬细胞中增强了抗HER2 CAR的表达。 非病毒递送。非病毒策略依赖于物理或化学方法将DNA、mRNA或蛋白质货物引入细胞。非病毒递送主要应用于靶向基因组编辑以实现位点特异性敲入或敲除，或通过转座酶系统实现合成构建体的随机整合。电穿孔仍然是共递送DNA、mRNA和蛋白质进入靶细胞的主要方法，尽管它具有细胞毒性。转座酶系统，特别是Sleeping Beauty和piggyBac系统，已成为病毒递送的替代方案。这些系统由包含侧翼为反向末端重复序列的目的基因的供体载体和编码转座酶的质粒组成，该转座酶介导货物半随机整合到基因组中。转座子支持稳定整合，并且可以容纳比大多数病毒载体更大的转基因盒。通过电穿孔递送编码Sleeping Beauty转座酶的mRNA以及编码转座子的微环DNA载体，已经实现了高效率的递送。因为这些载体缺乏细菌骨架序列，它们在原代人T细胞和造血干细胞中表现出降低的毒性和增强的整合效率。 对于使用CRISPR-Cas9技术的靶向转基因插入，通常通过电穿孔将重组Cas9与单向导RNA形成的核糖核蛋白复合物与DNA供体模板一起递送到细胞中，以实现同源定向修复。也可以使用AAV载体提供供体模板。一项里程碑式的临床应用涉及对镰状细胞病和β-地中海贫血患者来源的HSPCs进行离体编辑，这两种疾病均由β-珠蛋白基因突变引起。将Cas9 RNP电穿孔到HSPCs中以破坏BCL11A增强子或纠正HBB基因突变。然后将编辑过的细胞重新输注，导致稳健的植入和临床益处，从而促成了首个基于CRISPR的疗法获得监管批准。 总的来说，与体内策略相比，离体修饰允许对基因工程过程和最终细胞产物的质量进行更大的控制，并且对递送载体的特异性或全身耐受性的要求较低。优先考虑高转导或转染效率，以缩短扩增工作流程的持续时间和复杂性，同时最大限度地提高产品一致性。 工程化同种异体疗法以扩大可及性 自体细胞广泛应用仍然存在重要障碍，包括起始材料的变异性、制造失败的风险、基因工程后产品一致性和纯度的缺乏，以及对患有侵袭性疾病的个体来说可能无法接受的生產延遲。同种异体细胞疗法有助于克服自体疗法的一些问题。这些“即用型”治疗可以提前准备好，并根据个体患者的情况酌情选择。然而，它们也伴随着重要的风险，例如移植物抗宿主病和宿主抗移植物排斥反应。 天然或工程化的低免疫原性原代细胞。具有本质上低同种异体反应性的免疫细胞类型，如前面讨论的NK细胞、巨噬细胞、γδ T细胞和iNKT细胞，已被探索作为同种异体治疗平台。它们逃避识别错配宿主组织的能力降低了移植物抗宿主病的风险。然而，这些细胞类型在外周血中通常稀少，需要广泛的离体扩增，这可能影响最终疗法的一致性和质量。或者，已经开发了免疫工程策略，以使得在同种异体环境中能够使用更丰富的原代细胞。一种策略涉及共表达一种细胞表面受体，该受体选择性识别在活化的淋巴细胞上瞬时上调的4-1BB。通过靶向这种活化标志物，表达该受体的同种异体T细胞可以通过选择性消除同种异体反应性淋巴细胞同时保留静息状态的细胞来抵抗细胞排斥，从而在小鼠研究中提高了持久性。来自健康供体的外周血和脐带血来源的T细胞也已在临床同种异体CAR-T细胞疗法中使用。为了最大限度地降低移植物抗宿主病的风险，这些细胞通常经过基因编辑以破坏T细胞受体α恒定区基因座。额外的基因修饰可以降低免疫原性并增强在宿主中的持久性，包括敲除选定的HLA I类分子或通过β2-微球蛋白缺失完全消除它们，以及敲除转录因子II类反式激活因子以防止HLA II类表达。体内持久性可以通过过表达免疫检查点抑制剂(如CD47和PDL1)或敲除限制T细胞活化和持久性的抑制性受体PD-1来进一步增强。这种方法也已应用于恒河猴的原代胰岛。通过CRISPR-Cas9介导的HLA I类和II类分子敲除以及通过慢病毒转导过表达CD47，它们被赋予了低免疫原性。当移植到糖尿病猴体内时，这些工程化的胰岛能够在没有任何免疫抑制的情况下控制血糖水平并恢复胰岛素产生超过六个月。这些结果提供了概念验证，即工程化的低免疫原性原代细胞可以在同种异体受者中持续存在并发挥功能，支持它们在糖尿病患者中实现长期血糖控制的潜力。 同种异体干细胞来源的治疗细胞。干细胞来源为同种异体疗法提供了一个可再生和标准化的效应细胞来源。iPSCs或成体组织驻留干细胞可以在体外扩增并分化为各种治疗性效应细胞。这些即用型产品提供了按需可用性，使更多患者能够获得治疗并减少治疗延迟。在肿瘤学中，从骨髓或脐带血中分离的HSPCs可以用CAR和其他效应蛋白进行工程化改造，然后分化为NK细胞、巨噬细胞或其他免疫效应细胞。然而，由于HSPCs丰度低且所需分化方案冗长，这些过程耗时。iPSCs提供了一个更灵活和可扩展的平台。基因修饰可以在多能阶段引入，允许大规模生产功能统一的细胞产品。临床前和临床研究已经验证了iPSC来源的免疫疗法的安全性和可行性。使用iPSC来源的同种异体CAR-NK产品(经工程化改造表达抗CD19 CAR、高亲和力非可裂解CD16受体以减轻抗原逃逸，以及IL-15受体融合物以增强持久性)的1期临床结果显示，在一部分患者中具有良好的耐受性和仅轻微的毒性。 为了最大限度地减少排斥，已经采用先进的基因编辑方法通过敲除HLA分子和其他免疫识别因子来生成低免疫原性的iPSC系。正在进行的研究专注于确保转基因的稳定表达，以及优化分化方案以实现所得效应细胞的完全和功能性成熟。增强治疗细胞产量和功能性的一种策略是使用与预期效应细胞相同谱系产生的iPSC。这些谱系定型的iPSC保留表观遗传记忆，能够更有效地分化为所需表型。为了确保临床安全性，残余的未分化细胞必须在给药前被清除，通常通过分选谱系特异性标志物和排除多能性标志物来实现。为了增加一层安全性，可以加入自杀开关以在给药后消除异常细胞。 同种异体疗法与工业规模制造具有独特的兼容性。它们可以批量扩增、严格质量控制，并作为统一的治疗小瓶冷冻保存。这使得能够立即临床使用，而没有自体产品固有的延迟，并扩大了患者的可及性。 体内编程治疗性细胞 体内重编程涉及将遗传构建体直接递送给患者，以在体内生成治疗性细胞群体。与离体方法相比，这种策略绕过了细胞分离、扩增和再输注的需要，提供了一条简化的治疗途径。通过实现原位细胞工程化，它有潜力靶向多种细胞类型、组织和器官，克服物理分离和离体工程化的限制。此外，体内重编程为即用型治疗解决方案打开了大门，这可以降低制造复杂性、降低成本并缩短治疗准备时间。使用非整合递送方法进一步降低了与插入突变相关的风险，提供了优于永久性基因修饰离体产品的安全优势。然而，体内递送的关键挑战在于协调靶向任何组织的潜力与细胞类型特异性的必要性。有效的递送必须仔细地靶向预期的细胞群体，因为脱靶递送会稀释治疗效果并损害疗效。当前在体内递送基因编辑和基因调控组分的策略包括病毒载体、聚合物或脂质纳米颗粒以及病毒样颗粒，每种策略都有其独特的优势和挑战。 图6 | 体内编程治疗性细胞的递送策略 病毒载体(AAV, 慢病毒,腺病毒)：用于持续或瞬时表达，但需考虑免疫原性和插入风险。 纳米颗粒(LNP/聚合物)：递送mRNA(如CAR mRNA)实现瞬时表达，避免基因组整合。 病毒样颗粒：结合病毒的高效递送和非病毒的安全性，递送RNP复合物进行瞬时基因编辑。 用于持续重编程的病毒递送。AAV因其相对较低的免疫原性、广泛的组织趋向性和附加体持久性，对于在体内递送治疗性构建体特别有吸引力。AAV已广泛应用于基因编辑应用，包括临床研究，以及在动物研究中体内递送CAR分子。为了应对其有限的运载能力，已采用更小的基因组编辑器或双AAV载体策略。局部递送，例如胸腺内给药，已被探索用于实现将基因优先转移到T细胞以治疗自身免疫性疾病和传染病。此外，通过衣壳工程化，AAV载体已经实现了一定程度的趋向性，例如，对T细胞、肌肉细胞和脑细胞。可以将高亲和力配体通过优化的连接子设计整合到衣壳环中，以保持结构完整性并最大化靶向效率。AAV也已被用于递送响应外部刺激的紧凑型基因回路；特别是，避免依赖辅助蛋白的转录后调控开关因其较小的遗传足迹而与AAV兼容。 慢病毒载体虽然主要用于离体工程化，但由于其较大的运载能力，也已被探索用于体内应用，为有效载荷设计提供了更大的灵活性。慢病毒载体已被改造以表达靶向配体，如scFvs或DARPins，通过基因融合到包膜糖蛋白上以增强细胞特异性。此外，VSV-G包膜蛋白的突变版本(其减少了与广泛表达的低密度脂蛋白受体的结合，同时保留了膜融合能力)提高了慢病毒靶向的选择性和效率。这些策略已在非人灵长类动物中实现了对T细胞亚群和NK细胞的选择性体内靶向。尽管如此，关于其整合性质的担忧仍然存在，这增加了插入突变的风险。此外，病毒包膜中宿主来源的膜蛋白的存在可能引发免疫反应，降低载体在循环中的稳定性，并限制了重复给药的可行性。 腺病毒载体已被用于递送效应蛋白可调控表达的系统。一个例子是递送诱导型IL-12表达系统，其中转录激活由蜕皮激素受体控制，并由口服的蜕皮激素类似物veledimex触发。该系统包装在Ad5载体中，并通过肿瘤内注射给胶质母细胞瘤患者，已在多个诱导方案中证明了可行性和耐受性。由于IL-12效力强但具有全身毒性，局部且药物诱导的表达提供了更安全的治疗窗口。 尽管有这些优势，所有基于病毒载体的方法在基因组编辑应用中都有共同的局限性。与瞬时递送方式(如mRNA或蛋白质方法)相比，基因编辑机制的长期表达增加了脱靶效应的风险。 用于瞬时有效载荷的纳米颗粒递送系统。脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒通过递送mRNA，为体内瞬时表达治疗性蛋白(如CARs或基因组编辑器)提供了一种非病毒替代方案。这些平台避免了基因组整合，降低了长期遗传毒性风险。mRNA分子通常通过使用T7 RNA聚合酶进行体外转录产生，并通过非翻译区、密码子使用、合成帽、poly-A尾和核苷酸类似物的序列工程化进行优化，以提高稳定性、降低免疫原性和提高翻译效率。为了延长表达持续时间，正在探索自扩增RNA和环状RNA。 在结构上，LNP类似于脂质体，通常由以下部分组成：可电离的阳离子脂质，与带负电荷的核酸形成复合物并促进内体逃逸；磷脂，用于颗粒结构；胆固醇，用于稳定性和膜融合；以及聚乙二醇化脂质，以延长循环时间。其模块化的配方、可扩展性以及比AAV能够包装更长核酸有效载荷的能力，使其对体内基因编辑特别有吸引力。 将Cas9 mRNA和sgRNA共封装在LNP中，已在小鼠和灵长类动物的肝脏中实现了治疗水平的编辑。尽管如此，实现向肝外组织的高效递送仍然是一个主要障碍，通常需要基于配体的靶向或表面修饰。在一个例子中，使用CD5靶向的LNP将编码靶向成纤维细胞活化蛋白的CAR的mRNA递送给心脏纤维化小鼠模型中的T细胞，导致约20%的脾脏T细胞中产生了瞬时CAR表达、靶向成纤维细胞耗竭和功能性心脏恢复。最近，用抗CD8抗体修饰并携带抗CD19 CAR mRNA的LNP被施用于非人灵长类动物，实现了肿瘤控制以及自身免疫病动物体内瞬时的B细胞耗竭，表明了免疫重置效应。 基于聚合物的纳米颗粒在体内CAR-T细胞生成方面也显示出前景。例如，与CAR mRNA复合并用抗CD8抗体修饰的纳米颗粒，能够实现对T细胞的靶向递送，并在淋巴瘤、前列腺癌和HBV诱导的肝细胞癌小鼠模型中诱导了治疗性反应，其疗效与离体病毒转导的CAR-T细胞相当。在另一项研究中，设计用angiopep-2缀合的聚合物纳米颗粒能够穿越血脑屏障并选择性靶向小鼠的胶质母细胞瘤细胞，突显了基于纳米颗粒的递送系统在微创靶向免疫豁免部位的潜力。 重要的是，纳米颗粒介导的mRNA递送所实现的瞬时表达，与工程化细胞长期持久性不必要或不可取的治疗场景非常吻合。例如，在B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病中，无需持续的CAR-T细胞活性即可实现持久的缓解，使得瞬时体内重编程成为这类适应症的引人注目的策略。 用于瞬时有效载荷的病毒样颗粒。病毒样颗粒提供了一种混合解决方案，结合了病毒递送的高效性与非病毒系统的瞬时、非整合特性。VLP可以被设计来递送蛋白质、mRNA或RNP，而不携带病毒基因组。例如，通过使用蛋白酶可裂解的接头将货物蛋白与逆转录病毒Gag蛋白融合，实现了蛋白酶介导的释放，并通过使用包膜糖蛋白进行假型化来控制细胞特异性，从而构建了工程化的VLP。这些系统已在小鼠肝脏和视网膜中实现了高效的体内碱基编辑，且与AAV相比脱靶效应降低。进一步的发展使得工程化VLP能够通过Cas组分和卷曲螺旋衔接子招募RNP来递送先导编辑器复合物，允许在体内瞬时递送，具有最小的脱靶编辑且无转基因插入风险。通过定向进化优化衣壳蛋白，增强了RNP包装和递送效率，破坏病毒基因组包装相互作用的突变提高了对合成RNP货物的选择性。为了克服RNP复合物在细胞核形成与VLP在细胞膜出芽之间的空间分离，研究人员对向导RNA进行了工程化改造，使其包含RNA适配体和定位信号，以促进核质穿梭并稳定RNA，从而能够在Leber先天性黑蒙小鼠模型中校正基因突变并恢复视觉功能。VLP相对于纳米颗粒的一个显著优势在于其通过包膜假型化可调节的趋向性。糖蛋白的工程化改造正在积极探索中，以精炼和限制对特定免疫细胞亚群的细胞趋向性。 释放体内可编程疗法的全部潜力需要在递送技术方面进行协调进步，并密切关注转化方面的限制。关键挑战包括载体和有效载荷的可扩展、成本效益高的制造；生物分布和持久性的全面表征；以及脱靶编辑、基因毒性和免疫原性的评估。长期安全性监测，特别是对于持久存在或整合到基因组中的疗法，仍然是监管优先事项。在过程早期与监管机构密切合作有助于确保建立适当的测试来检测任何非预期效应，并确定需要哪些长期监测。解决所有这些要点对于将体内重编程安全地转化为临床应用至关重要。 结论 可编程细胞疗法正在成为精准医学的核心支柱，能够在多种疾病中实现动态、情境特异性的干预。尽管CAR-T细胞疗法已证明工程化细胞的临床可行性，但下一代方法旨在提高特异性、安全性、持久性和可及性。正在进行的努力集中于整合逻辑门控决策和分层调控系统，以使治疗性细胞能够解读复杂信号并以受控、自适应的方式作出响应。同时，利用可扩展的同种异体干细胞来源，并推进对离体重编程的更严格控制，对于扩大可及性、减少制造负担和提高细胞产品安全性至关重要。临床挫折强调了严谨安全工程的重要性。例如，最近一例在piggyBac介导的CAR整合到同种异体造血干细胞后发生的T细胞淋巴瘤案例，凸显了对更安全载体系统和更严格质量控制措施的迫切需求。随着合成回路变得越来越复杂，必须将可制造性与性能一并考虑，以确保可靠的临床部署。展望未来，向体内重编程(即在患者体内直接生成治疗细胞)的变革性转变提供了一条扩大可及性和简化递送的有希望的途径。朝着这个方向的一个重要里程碑是成功治疗了一名患有罕见代谢障碍的儿童，该治疗使用LNP介导的基因编辑工具递送来校正肝脏表达的基因。虽然需要进一步的工作来确认长期安全性和编辑保真度，并将递送扩展到肝脏以外的组织，但这个案例例证了体内可编程疗法的前景，并为治疗类似的单基因疾病带来了希望。 与此同时，使能技术持续改进。高效的先导编辑器现在可以在离体修饰的HSPC中实现超过75%的编辑效率，而CRISPR相关转座酶变体能够在无需产生双链断裂的情况下，以高效率实现大基因元件的特异性整合，从而降低了意外插入、缺失或染色体重排的风险。在人类细胞中的定向进化正在产生改进的蛋白质变体，包括四环素样转录因子，它们能响应小分子提供更有效的基因调控。同时，一篇预印本展示了人工智能加速新型生物分子设计和提高基因组编辑工具(包括下一代CRISPR系统)功效的潜力。最终，合成生物学、基因编辑、人工智能驱动的设计和精准递送技术的融合，将使得能够开发出针对不同疾病领域量身定制的、日益完善的可编程疗法。 参考文献：Teixeira AP, Aubel D, Fussenegger M. Next-generation programmable cell therapies for precision medicine. Nat Rev Genet. 2026 Mar 11. doi: 10.1038/s41576-026-00945-3. Epub ahead of print. PMID: 41813914. 本微信公众号内容仅供医疗专业人士参考 不代表对任何药物或者治疗的推荐 由于时间和水平有限，如有错漏敬请谅解，不吝赐教 (以上内容借助KIMI+/DeepSeek翻译整理所成) 加入毕凯今选粉丝群获取更多更新文献资讯~