Sincalide

近日，在Nature communications期刊上公布了一篇名为“Linker-free PROTACs efficiently induce the degradation of oncoproteins”的文章。文章标题该文章主要描述了关于新型的无连接子（linker-free）的蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）的研究，这些无连接子的PROTACs能够有效地诱导癌蛋白的降解，并在非小细胞肺癌（NSCLC）和慢性髓性白血病（CML）模型中展现出良好的抗肿瘤效果。文章详细描述了这种新型PROTACs的设计、生物活性评估、作用机制以及在体内外的抗肿瘤效果。研究方法与结果首先，研究人员设计了多种无连接子的PROTACs，如Pro-BA、Gly-BA和Arg-BA，这些分子通过直接将特定的氨基酸（如Pro、Gly、Arg）与目标蛋白配体（如ALK抑制剂Brigatinib的类似物BA）相连，无需连接子。随后，研究人员通过免疫印迹实验（Western blot）和细胞活性实验（CCK-8 assay）对这些无连接子的PROTAC进行了生物活性评估。结果显示，Pro-BA、Gly-BA和Arg-BA均对EML4-ALK蛋白有降解作用。在NSCLC细胞系H3122中，无连接子PROTACs（如Pro-BA和Gly-BA）在降解EML4-ALK蛋白方面比传统含连接子的PROTACs更有效，且Pro-BA的降解能力最强[Gly-BA的DC50为142 nM，Dmax为76%，IC50为69 nM; Pro-BA的DC50为74 nM，Dmax为82%，IC50为34 nM]。接下来，研究人员通过一系列实验，包括使用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂CQ的处理，以及CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GID4基因，进一步研究了其作用机制。结果表明，Pro-BA通过泛素-蛋白酶体系统诱导EML4-ALK降解，并且GID4在这一过程中起关键作用：GID4的敲除抑制了Pro-BA对EML4-ALK的降解。随后，研究人员在H3122异种移植瘤小鼠模型中评估了Pro-BA和Pro-PEG3-BA的抗肿瘤效果。结果显示，Pro-BA在减少肿瘤大小和抑制肿瘤生长方面比Pro-PEG3-BA更有效。此外，Pro-BA还能通过口服给药有效抑制肿瘤生长，且在小鼠中表现出良好的耐受性和口服生物利用度（Pro-BA在小鼠模型中的口服生物利用度为35%）。研究人员进一步探索了这种无连接子策略是否可以应用于其他目标蛋白，如BCR-ABL融合蛋白，这是慢性髓性白血病（CML）的主要驱动因素。他们设计了Pro-DA和Gly-DA两种无连接子的BCR-ABL降解剂，并在K562细胞系中评估了它们的降解效率和细胞生长抑制效果。结果显示，这种无连接子策略是可以扩展到其他目标蛋白的（如BCR-ABL），Pro-DA和Gly-DA在K562细胞系中显示出了高效的降解能力和细胞生长抑制效果，DC50分别为8 nM和6 nM，IC50分别为0.9 nM和0.6 nM。关键结论无连接子PROTACs的高效性：在该研究中，无连接子PROTACs（如Pro-BA和Gly-BA）在降解EML4-ALK蛋白方面比传统含连接子的PROTACs更有效。作用机制：Pro-BA通过泛素-蛋白酶体系统诱导EML4-ALK降解，并且GID4在这一过程中起关键作用。体内外抗肿瘤效果：Pro-BA在H3122异种移植瘤小鼠模型中展现出良好的抗肿瘤效果，且通过口服给药也能有效抑制肿瘤生长，具有良好的耐受性和口服生物利用度。策略的普适性：该无连接子策略可以扩展到其他目标蛋白，如BCR-ABL。研究意义该研究不仅提供了一种新型的无连接子PROTACs设计策略，还通过体内外实验验证了其高效性和普适性。这种策略有望在多种疾病治疗中发挥重要作用，尤其是在提高药物的生物利用度和降低分子量方面具有显著优势。未来的研究可以进一步优化这种无连接子PROTACs的设计，探索其在更多疾病模型中的应用潜力。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

沈阳药科大学程卯生教授近日，沈阳药科大学程卯生教授、赵冬梅教授和王健教授团队在国际权威药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“针对肺癌转移治疗的PAK4选择性降解剂的设计、合成与生物学评估”的研究论文。该研究聚焦于设计、合成和生物评估针对PAK4蛋白的特异性降解剂，旨在为肺癌转移的治疗提供新的策略。一分钟速览研究背景PAK4（p21-activated kinase 4）是II组PAK家族中最为关键的成员之一，在多种癌症细胞信号通路中扮演着重要角色，与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。尽管已有PAK4抑制剂进入临床研究，但其详细的结合机制尚不明确。此外，传统的PAK4抑制剂主要通过抑制其激酶活性来发挥作用，但存在一定的局限性，如对非激酶功能的抑制不足以及药物抗性问题。因此，开发一种能够特异性降解PAK4蛋白的新型药物，对于肺癌等癌症的治疗具有重要意义。重点内容设计策略：研究团队基于PAK4的晶体结构，设计了一种名为CPS-021的PAK4选择性降解剂。该降解剂通过将PAK4抑制剂CPL-042与CRBN（Cereblon）E3泛素连接酶配体pomalidomide通过连接子连接而成，能够特异性地诱导PAK4蛋白的降解。生物活性评估：实验结果表明，CPS-021在体外对多种肺癌细胞系（如A549、MDA-MB-231等）具有显著的PAK4降解能力，其半数降解浓度（DC50）低至50 nM。此外，CPS-021还能显著抑制这些细胞的迁移和侵袭能力，且具有良好的选择性，对PAK5和I组PAKs的抑制作用较弱。作用机制：分子对接和分子动力学模拟结果揭示了CPS-021与PAK4和CRBN蛋白的相互作用模式。CPS-021能够与PAK4的激酶结构域形成稳定的结合，并通过CRBN介导的泛素化过程，将PAK4标记为降解目标，最终通过蛋白酶体系统实现PAK4的降解。体内实验：在A549-luc肺癌转移裸鼠模型中，CPS-021能有效抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，且在体内表现出良好的药代动力学特性，具有较长的半衰期和较高的生物利用度。研究总结本研究成功设计和合成了一种新型的PAK4选择性降解剂CPS-021，该降解剂通过特异性诱导PAK4蛋白的降解，展现出显著的抗迁移和抗侵袭活性。CPS-021不仅在体外对多种肺癌细胞系具有高效的PAK4降解能力，而且在体内模型中也表现出良好的抗转移效果和药代动力学特性。此外，研究还揭示了CPS-021的作用机制，为其进一步的临床开发提供了坚实的理论基础。CPS-021作为一种新型的PAK4降解剂，有望成为治疗肺癌转移的有效工具化合物，为相关癌症的治疗提供新的策略和手段。图片来源：ACS详细阅读01Background研究背景p21激活激酶（PAKs）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为Rho家族GTP酶的下游信号效应因子，在细胞骨架组织、黏着斑形成、细胞运动、细胞侵袭和形态变化等基本细胞过程中发挥关键作用。PAKs根据结构同源性和生化特征被分为两组：PAK1−3（I组）和PAK4−6（II组）。PAK4是II组PAKs中研究最为透彻的成员，其在多种癌症细胞系中均出现mRNA和蛋白水平的上调，与前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等细胞的转化、增殖、迁移和侵袭密切相关。PAK4通过PI3K/Akt和MEK/ERK依赖途径促进细胞生长，并通过HGF/LIMK1/cofilin和MEK-1/ERK1/ERK2/MMP2途径增强肿瘤转移。此外，PAK4在多种肿瘤的药物抗性中也扮演关键角色。早期研究显示，PAK4在获得顺铂耐药性的胃癌细胞中表达上调，沉默PAK4可恢复这些耐药细胞对顺铂的敏感性。近期研究还发现，PAK4通过改变Wnt/β-catenin信号通路，增强肿瘤内T细胞浸润，使肿瘤对PD-1/PD-L1阻断疗法更敏感。此外，PAK4通过Myocyte增强因子2D/Zinc Finger E-Box结合同源框1（MEF2D/ZEB1）和Zinc finger蛋白SNAI2（SLUG）重编程内皮细胞（EC）转录组，降低T细胞粘附至内皮细胞，减少T细胞浸润，从而增强针对胶质母细胞瘤的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）的疗效。过去二十年间，虽已开发出多种PAK4抑制剂，但目前仅有PF-3758309进入I期临床试验，后因药代动力学数据不佳而终止。GNE-2861是首个I/II型PAK4选择性抑制剂，其选择性优于前体PF-3758309。本团队专注于发现和优化新型PAK4选择性抑制剂十余年。CZH-226和CPL-055作为强效且高选择性的PAK4抑制剂，其选择性高于PAK1。KPT9274是Karyopharm公司报告的一种新型PAK4/NAMPT双重调节剂，已进入I期临床试验，但其与PAK4蛋白的结合模式尚未公布，这使得基于分子模拟方法合理设计KPT9274衍生物变得困难。PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）分子是一类设计用于细胞内降解特定目标蛋白的小分子。它通过招募E3泛素连接酶酶至目标蛋白，触发蛋白的泛素化修饰，最终由细胞的蛋白酶体系统降解目标蛋白。鉴于PAK4在多种癌症中的关键作用，以及目前缺乏对PAK4非激酶功能的强效抑制剂，本研究旨在设计、合成并生物评估基于PROTAC的PAK4选择性降解剂，以期发现具有纳摩尔级活性的强效PAK4降解分子。实验结果显示，本团队开发的CPS-021能有效诱导PAK4的特异性降解，并在体内外展现出显著的抗迁移和抗侵袭活性，且为首个化学合成的PAK4蛋白降解剂。与之前报道的竞争性PAK4抑制剂相比，CPS-021不仅能抑制PAK4的激酶功能，还能抑制其非激酶功能，并对PAK5和I组PAKs展现出强选择性。图片来源：ACS02Drug Design药物设计①PAK4 PROTAC降解剂的设计策略在设计PAK4 PROTAC降解剂的过程中，研究团队首先分析了CPL-055与PAK4的共晶结构（PDB ID: 7CP4），详细考察了配体与PAK4之间的关键相互作用。研究发现，CPL-055中的氨基吡啶基团与PAK4的Leu398和Glu396形成了双齿氢键，而烷炔醇基团则与Glu366和Phe459形成了两个氢键。为了保持CPL-055的结合模式并增强PROTAC降解剂的选择性，研究团队保留了CPL-055占据PAK4疏水结合口袋的部分结构，并去除了CPL-055哌嗪部分的甲基，以避免因PROTAC修饰而产生的意外空间位阻，从而得到了CPL-042。此外，通过3D-RISM计算结果表明，CPL-042的哌嗪基团比CPL-055更接近溶剂可及区域，这意味着CPL-042作为连接子与PAK4结合时具有更好的稳定性。基于以上假设，后续的PROTAC降解剂设计中，研究团队以哌嗪作为连接位点，并通过连接子结构将CPL-042与Cereblon（CRBN）E3泛素连接酶配体（本研究中为泊马度胺）连接起来。基于这一设计思路，研究团队合成了一系列具有不同连接子长度和组成的PROTAC降解剂。图片来源：ACS②PAK4靶向PROTAC降解剂活性筛选在PAK4靶向PROTAC降解剂的活性筛选部分，研究团队以非小细胞肺癌A549细胞系、乳腺癌MDA-MB-231细胞系以及非小细胞肺癌H1299细胞系作为主要研究工具，这些细胞系均表现出较强的迁移和侵袭能力，并且在PAK4相关研究中被广泛使用。研究假设CRBN E3连接酶能够成功用于PAK4的靶向降解，并基于此设计了一系列潜在的PROTAC分子。考虑到连接子长度在PROTAC降解剂效力中起着关键作用，研究团队系统地合成了具有不同长度连接子（从6到18个原子）的PROTAC分子，以确定最佳的连接子长度，同时固定泊马度胺的取代位置在3位。通过Western blotting实验，初步评估了这些化合物在A549细胞系中0.2和2 μM浓度下的降解效果。研究数据表明，具有不同连接子长度的PROTAC分子在A549细胞中展现出不同的PAK4降解效果。具体而言，连接子长度小于12个原子的化合物PS1-PS7在0.2 μM和2 μM的测试浓度下均未显示出显著的PAK4降解效果。而连接子长度在13到16个原子之间的化合物PS8、PS20、PS21以及PS35表现出较好的PAK4降解活性，尤其是PS21（CPS-021），在A549和MDA-MB-231细胞系中，2 μM浓度下PAK4蛋白降解率分别达到81%和93%。图片来源：ACS03In vitro In Vivo体内外评价①CPS-021诱导PAK4降解的动力学研究在研究CPS-021诱导PAK4降解的动力学过程中，实验结果表明CPS-021在A549和MDA-MB-231细胞系中展现出显著的PAK4降解能力。在A549细胞系中，CPS-021在12小时内实现了最大72%的PAK4降解率，其半数降解浓度（DC50）略高于500 nM。对于MDA-MB-231细胞系，CPS-021在12小时内降解了88%的PAK4蛋白，其DC50值为50 nM。此外，MDA-MB-231细胞系对CPS-021更为敏感，处理8小时后，该细胞系中82%的PAK4蛋白被降解，而24小时后这一比例上升至93%。这些结果表明CPS-021在两种细胞系中均能快速且有效地诱导PAK4蛋白的降解，且在MDA-MB-231细胞系中表现出了更高的降解效率。图片来源：ACS②CPS-021的抗迁移活性研究在研究CPS-021的抗迁移活性方面，实验结果表明CPS-021对A549、H1299和MDA-MB-231细胞系的迁移和侵袭能力具有显著的抑制作用。通过CCK-8实验评估了CPS-021对细胞增殖的影响，结果显示在10 μM及以下浓度时，CPS-021对A549和H1299细胞的毒性较低，而MDA-MB-231细胞系对PAK4抑制剂和降解剂更为敏感，表现出较低的细胞活性。划痕实验结果表明，在10 μM、5 μM和1 μM的浓度下，CPS-021能有效抑制这三种细胞系的迁移能力。此外，Transwell实验进一步证实了CPS-021对细胞迁移和侵袭能力的抑制作用，且这种抑制作用呈现浓度依赖性。在H1299细胞系中，CPS-021通过抑制PAK4及其下游靶标LIMK1的磷酸化，显著降低了PAK4蛋白的相对表达水平，从而阻断了PAK4-LIMK1信号通路，抑制了细胞的生长。这些发现表明CPS-021通过调节PAK4-LIMK1信号通路发挥其抗迁移和抗侵袭作用，为肺癌等癌症的治疗提供了潜在的药物候选。图片来源：ACS③CPS-021有效抑制TGFβ诱导的上皮-间充质转化（EMT）过程在研究CPS-021对TGFβ诱导的上皮-间充质转化（EMT）过程的影响时，实验采用TGFβ作为诱导剂来触发A549细胞系的EMT过程。结果显示，TGFβ处理后A549细胞发生了显著的形态学变化，细胞从典型的上皮细胞形态转变为更具侵袭性的纺锤形间充质细胞形态。然而，随着CPS-021浓度的增加，这种形态学变化逐渐被逆转，细胞形态重新变得规则，更接近于正常的球形上皮细胞。进一步的免疫荧光分析表明，TGFβ刺激显著增加了N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表达，这两种蛋白是EMT过程中的关键标志物，同时E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达则相应减少。而CPS-021处理则显著抑制了N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，并上调了E-钙黏蛋白的表达，这表明CPS-021能够有效抑制细胞的侵袭潜力，从而阻止EMT过程的进行。这些结果表明CPS-021通过调节细胞黏附分子的表达，有效抑制了TGFβ诱导的EMT过程，为肺癌等癌症的治疗提供了潜在的药物候选。图片来源：ACS④CPS-021处理的A549细胞系的蛋白质组学结果在对CPS-021处理的A549细胞系进行的蛋白质组学研究中，通过R-studio软件对差异蛋白表达数据进行统计分析，共鉴定出201种差异蛋白，其中57种显著上调，144种显著下调。火山图显示，CPS-021处理后，PAK4蛋白被特异性降解，而PAK1、PAK2和PAK5蛋白的表达水平未受影响。蛋白质功能注释分析表明，mTOR信号通路呈现上调趋势，该通路在肿瘤细胞的蛋白质、脂质和碳水化合物代谢中起关键作用，促进肿瘤细胞的生长和增殖，这解释了为何PAK4蛋白降解未能抑制肿瘤细胞的增殖能力。与之相反，NOD样受体信号通路在蛋白质组学结果中呈现下调趋势，这一通路与多种肿瘤细胞的迁移和侵袭能力密切相关，与CPS-021的抗迁移和抗侵袭实验结果相一致。此外，基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析揭示，CPS-021处理的A549细胞中，差异表达蛋白主要涉及病毒防御反应、先天免疫反应、器官移植免疫反应以及自身免疫疾病的发展。在细胞信号传导方面，CPS-021影响了NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、细胞质DNA感应通路、抗原呈递、C型凝集素受体通路和成骨细胞分化通路。这些结果表明，CPS-021不仅可以作为抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的潜在药物，还可能作为肿瘤免疫治疗的辅助疗法，与之前报道的PAK4抑制剂KPT9274在PD-1/PD-L1和CAR-T疗法中的积极作用相呼应。蛋白质聚类分析结果进一步揭示了与PAK4蛋白表达相邻的几种蛋白质，如TAK1和TAB2在TGF-β信号通路中与PAK4相互作用，LAP3通过影响基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/9）、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，促进恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭。综上所述，CPS-021通过降低TAK1的表达来调节EMT过程，而其抑制肿瘤迁移和侵袭的能力则主要源于对LAP3蛋白的调控。图片来源：ACS⑤CPS-021的体内药代动力学（ADME）结果在体内药代动力学（ADME）研究部分，研究团队对CPS-021在ICR小鼠体内的代谢特性进行了评估。实验结果显示，当以1毫克/千克（mpk）的剂量通过静脉注射给药时，CPS-021的半衰期为3.32小时，达到峰值浓度（Cmax）为657.70纳克/毫升。此外，当以2毫克/千克的剂量通过腹腔注射给药时，CPS-021的Cmax为343.11纳克/毫升。这些数据表明CPS-021在体内具有可接受的药代动力学参数，适合进一步的体内实验研究。值得注意的是，CPS-021的生物利用度超过了180%，这可能是由于小鼠腹膜吸收CPS-021进入血液循环的速度较慢，导致药物在体内主要以与血浆蛋白结合的形式存在，从而使得药物-时曲线下面积（AUC）值显著高于静脉注射，最终导致了较高的生物利用度数值。图片来源：ACS⑥CPS-021在肺癌转移模型中的体内效应在评估CPS-021对肺癌转移影响的体内实验中，研究者建立了A549-luc细胞系诱导的裸鼠肺转移模型，以考察CPS-021对肺癌细胞迁移能力的抑制效果。实验结果显示，CPS-021能够显著降低A549-luc细胞在小鼠体内的迁移能力。与未处理的对照组相比，接受CPS-021处理的小鼠肺部荧光强度明显降低，表明肿瘤细胞的肺部定植受到了抑制。此外，实验还观察到A549-luc细胞具有向大脑和骨骼转移的趋势，而CPS-021同样能够有效抑制这些转移过程。这些发现证实了CPS-021在体内对恶性人类肿瘤细胞转移具有显著的抑制作用。图片来源：ACS总结本研究成功设计并合成了基于CRBN的PAK4靶向PROTAC分子CPS-021，旨在通过蛋白降解技术在蛋白层面特异性地降解PAK4并阻断其激酶功能，以探索其药理学机制。研究选用泊马度胺作为E3连接酶配体，并通过3D-RISM溶剂模型计算确定CPL-042作为PAK4连接体，因其展现出更好的PAK4抑制活性和选择性。在分子设计阶段，研究团队对连接子的长度和结构进行了优化，通过一系列合成步骤，成功合成了31个以泊马度胺为E3连接酶配体的PROTAC分子，并对其降解活性进行了评估。实验结果表明，不同连接子长度和结构的PROTAC分子对PAK4的降解效果各异，其中化合物PS8、PS20、PS21和PS35表现出显著的降解活性，尤其是PS21（CPS-021），在A549和MDA-MB-231细胞系中分别实现了81%和93%的PAK4蛋白降解率。分子对接和MD模拟结果进一步揭示了这些化合物与PAK4和CRBN蛋白的结合机制，证实了它们通过形成稳定的三元复合体并依赖泛素-蛋白酶体系统来诱导PAK4降解。此外，研究还设计了PS21M作为阴性对照分子，以验证CPS-021的降解机制。细胞实验结果表明，CPS-21显著抑制了A549、H1299和MDA-MB-231细胞系的迁移和侵袭能力，并通过调节PAK4-LIMK1信号通路发挥其抗迁移作用。蛋白质组学研究进一步揭示了CPS-021对A549细胞内蛋白表达谱的广泛影响，尤其是对NOD样受体途径、Wnt途径、TAK1和TAB2（在TGF-β途径中）以及LAP3的影响。最终，CPS-021的体内药代动力学评估结果表明，该化合物具有可接受的药代动力学特性。14天的毒性学研究表明，小鼠对CPS-021具有良好的耐受性。体内实验结果表明，CPS-021显著降低了A549-luc细胞肺转移模型中的肺部荧光强度，有效抑制了肺癌细胞的迁移，证实了其疗效。综上所述，本研究成功开发的PROTAC分子CPS-021展现出显著的PAK4降解活性，为其后续的临床应用提供了有力支持。参考来源：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c00197 喜欢我们文章的朋友点个“在看”和“赞”吧，不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~免责声明“汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。信息来源：药研视角往期推荐本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。