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CAR T细胞疗法因其在特定血液恶性肿瘤中显著的临床反应率而引起了极大的关注。然而，这些工程化免疫细胞是活体药物，给药后很难控制。这里讨论了可用于控制患者体内CAR T细胞功能的小分子调节开关系统，以及CAR T细胞领域中最重要的障碍，这些障碍可以通过开关系统来克服。 1 背景简介 经过基因工程改造以表达嵌合抗原受体（CAR T细胞）的T细胞代表了一种高效的癌症免疫疗法，特别是对于血液恶性肿瘤的治疗。因此，CD19和B细胞成熟抗原 (BCMA) 特异性CAR T细胞已被FDA批准用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病 （B-ALL）、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。此外，针对其他血液恶性肿瘤（例如慢性淋巴细胞白血病）和实体瘤的CAR T细胞疗法也是广泛研究的领域。 CAR T细胞的一项显著特性是它们能够在患者体内长期持续存在数月或数年。然而，这个重要的优点也有一个缺点。对于任何其他类型的药物（例如小分子、抗体等），如果出现严重毒性，可以停止治疗。相比之下，CAR T细胞是活体药物，不仅能在体内长期存在，还能增殖和分化。因此，一旦给药，控制它们在患者体内的活性就具有挑战性。 为了解决CAR T细胞可控性差的问题，人们开发了多种方法，其中许多方法旨在通过施用小分子药物来调节CAR T细胞的功能。在ON-switch系统中，药物的添加会导致蛋白质-蛋白质相互作用，从而以小分子依赖性方式诱导异二聚化（图1）。相反，对于OFF-switch，两个蛋白质结构域在没有药物的情况下彼此结合，而这种异二聚化在小分子存在的情况下被阻止（图1）。或者，可以添加药物以防止CAR被蛋白酶降解。下面将更详细地讨论打开和关闭开关系统的示例。 图 1. 小分子调节ON和OFF开关的基本原理。在ON-switch系统中，两个蛋白质结构域在添加药物后异二聚或同二聚化，而对于OFF-switch，添加药物会导致蛋白质-蛋白质相互作用的破坏或CAR下调。 2 CAR T应用的小分子调节开关 01 启动型开关（ON） 2015年，Lim和同事提出了一个概念，其中CAR被分成两条多肽链，分别包含抗原结合结构域和CD3ζ信号结构域（图2a）。通过整合响应小分子的二聚化结构域，这些所谓的“分裂CAR（split CARs）”确实能够实现对CAR T细胞活性的药物依赖性控制。然而，在这项重要的里程碑式研究中，作者还指出，所应用的ON-switch（由 rapalog (雷帕霉素类似物）诱导的FKBP12和FRB 结构域的异二聚化）对于临床转化来说不是最佳的，因此需要替代的小分子调节的ON-switch系统是必需的。 图 2. (a) 用于调节CAR 功能的ON开关系统。在splitCAR设计中，抗原结合结构域与CD3ze信号结构域分开。ON-switch的一个蛋白质结构域与每条CAR链融合，导致在添加药物后分裂的CAR完全组装，从而在抗原结合时激活CAR T细胞。在AbCID-CAR和hRBP4 ON-switch-CAR中，ON-switch的一个结构域在CAR链内表达，而第二个结构域是另外包含抗原结合 scFv 的可溶性链的一部分。添加药物会导致可溶性链和膜结合链相互作用，从而在遇到抗原后激活CAR T细胞。在AvidCAR的设计中，两个细胞外低亲和力非基于抗体的单体结合结构域、与细胞内共刺激和信号传导结构域以及条件二聚化结构域融合。只有与小分子药物二聚化后，CAR才能以二价方式与抗原相互作用，从而导致CAR信号传导的亲合力和激活。(b) 已用于CAR T细胞的OFF-switch系统。在STOP-CAR中，抗原结合结构域与CD3ze信号结构域分离，开关的两个结构域在没有药物的情况下相互结合，导致抗原结合后CAR T细胞激活。添加药物会阻断这种相互作用，从而阻断CAR信号传导。SNIP-CAR在共刺激结构域和信号传导结构域之间含有一种融合的蛋白酶，导致在没有药物的情况下连接序列的裂解，最终诱导CAR下调。添加药物可以防止这种裂解并促进CAR表达。在Minocycline-CAR中，CAR包含靶向 EGFR的单域抗体 (sdAb) 和针对肽而设计的sdAb，而肽是包含CD3ze的多肽的一部分。添加药物会阻断这种相互作用，从而阻止包含抗原结合结构域和CD3ze信号传导结构域的功能性CAR复合物的组装。 理想的小分子诱导开关将具有以下特征（图1）：（i）蛋白质成分应该是人类来源的，以降低免疫原性的风险，从而降低对 CAR T 细胞的排斥；（ii）它们应该是表达良好且稳定的蛋白质结构域，以允许灵活和模块化地整合到CAR分子或进入CAR T细胞的其他成分。此外，药物（iii）即使在长期使用中也应该是无毒的，（iv）并具有良好的药代动力学特性，包括合理的半衰期，并且（v）应该是口服的，以便能够连续且简单地长期使用。 为此，几个研究组设计了小分子调节的ON开关（也称为化学诱导二聚化 (CID) 系统），其具有潜在临床应用的有益特性。这里总结了已用于调节CAR活性的ON-switch系统（图2a）。例如，工程抗体片段（Fab）仅在药物ABT-737存在的情况下特异性识别人BCL-xL，产生AbCID（图2a）。 虽然已知ABT-737会引起血小板毒性，但该研究组还设计了基于BCL-2和Venetoclax的其他ON-switch变体，这是FDA批准的抗癌药物。尽管这种Venetoclax响应性ON开关的功能尚未在CAR T细胞中进行测试，但它代表了一种有趣的开关模块，可以对临床批准的药物做出反应。 另一个例子，基于人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）和口服小分子A1120设计了ON开关。简而言之，非基于抗体的结合支架被设计为以A1120依赖性方式特异性识别hRBP4，最终产生一个ON开关，该开关也能够实现药物介导的CAR T细胞活性控制（图2a )。 其他研究组使用现有的异二聚化模块并将其重新用于CAR T细胞。例如，使用 FDA批准的药物来那度胺来调节C2H2锌指降解决定子基序和CRL4 CRBN E3泛素连接酶之间的相互作用，最终使他们能够设计具有ON或OFF开关功能的CAR T 细胞 (图2a）。还应该指出的是，除了调节功能性拆分CAR的组装外，ON-switch模块还可以用于调节其他CAR T细胞组件。 例如，诱导型 MyD88/CD40 (iMC) -switch能够在CAR T中实现药物诱导的共刺激（图3a）。简而言之，该开关包含与FKBP12v36结构域的两个副本融合的MyD88和CD40信号传导结构域。给予Rimiducid会导致该开关模块二聚化甚至寡聚化，从而为CAR T细胞提供有效的共刺激，并提高体外和体内的抗肿瘤效力。 图3.(a)诱导型 MyD88/CD40 开关 (iMC) 包含与两个FKBP12v36结构域融合的MyD88和CD40信号传导结构域。添加小分子药物rimiducid后，开关模块会二聚甚至寡聚，从而为CAR T细胞提供共刺激。(b)可通过添加小分子药物来控制的可切换转录因子。(c)基于iCasp9的自杀开关。药物结合二聚化结构域表达为具有Caspase 9结构域的融合蛋白。添加药物rimiducid后，iCasp9发生同二聚化，导致细胞凋亡。 另一个例子是亲合力控制的CAR（AvidCAR），其中CAR的结合亲和力被降低，使其依赖于二价抗原结合。因此，只有二聚体和二价CAR才会被正确激活，从而能够通过小分子介导的CAR二聚化来调节CAR功能（图2a）。 此外，ON-switch还可以实现转录因子的功能控制，其中DNA结合域与激活域分离到两个不同的多肽上，随后在添加各自的小分子药物后可以二聚化（图3b）。 02 关闭型开关（OFF） ON-switch的另一种方法是OFF-switch系统，其中添加小分子药物通过破坏蛋白质-蛋白质相互作用来阻止CAR信号传导（图1）。例如，所谓的STOP-CAR包含一种经过计算设计的异二聚体，可以被小分子A1331852或A1155463破坏（图2b）。在另一项研究中，工程化单域抗体（sdAb）与米诺环素（一种广泛使用的抗生素）结合，然后生成与米诺环素竞争与sdAb结合的环肽（图2b）。 最终，这导致了蛋白质与蛋白质之间的相互作用，这种相互作用可以在添加小分子药物后被抑制。或者，小分子药物也可用于直接阻断与目标抗原的相互作用，正如对甲氨蝶呤产生反应的条件CAR（condCAR）系统所证明的那样。 Labanieh等人采用了不同的OFF -switch策略。工程化的蛋白酶调节受体。在那些所谓的可抑制蛋白酶（SNIP）-CAR信号中和中，蛋白酶作为CAR链的一部分表达，导致CAR内的接头序列裂解，从而从抗原上分解信号链 -结合域。添加蛋白酶抑制剂grazoprevir通过抑制蛋白酶活性来关闭蛋白酶，从而防止CAR裂解并维持功能性全长CAR链（图2b）。 尽管不是基于蛋白质的开关，但通过给予药物达沙替尼来抑制CAR T细胞下游信号传导代表了控制CAR T细胞的另一种有前途的方法。达沙替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，最初开发用于靶向致癌BCR-ABL融合蛋白。最近，它被重新用于阻断 CAR信号传导，从而防止CAR T细胞的耗竭和过度激活。 03 自杀基因 在出现严重毒性的情况下控制CAR T细胞的另一种策略是自杀基因的共表达，该基因能够通过药物诱导消除CAR T细胞。例如，在诱导型caspase-9（iCasp9）系统中，可以通过AP1903（rimiducid）处理来诱导该融合蛋白的同二聚化，从而导致细胞凋亡（图3c）。在另一个系统中，单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）在CAR T细胞中表达。给予前药更昔洛韦导致CAR T细胞的特异性消除。最近的另一项研究引入了CRISPR诱导的自杀开关（CRISISS）方法，其中转导的靶细胞的基因组在小分子诱导的Cas9变体表达后被片段化。 04 ON开关、OFF开关和自杀基因各自的的优缺点 上面讨论的所有类型的调控系统在应用于CAR T细胞时都有其优点和缺点。自杀基因的一个重要优点是它们对药物的快速反应。由于CAR T细胞会在几个小时内被消除，因此可以在出现严重毒性时进行快速干预。相比之下，ON-switch系统的停用需要从患者体内有效清除激活的小分子药物，这（取决于半衰期）可能需要相当长的时间。 自杀基因的另一个优点是，只有在发生不良事件时才需要施用药物，而如果需要永久的CAR T细胞活性，ON-switch以及SNIP-CAR则需要连续施用药物。同样，如果需要连续灭活CAR T细胞，关闭开关预计也需要相应小分子药物的中长期给药。由于这种长期给药的要求，与自杀基因相比，小分子药物的安全性对于开关系统来说更为重要，自杀基因中的药物可能只给药一次或两次。 另一方面，ON和OFF开关系统可实现可逆调节，同时触发自杀基因，导致CAR T 细胞不可逆消除。此外，一小部分T细胞中ON开关的突变失活不会对临床结果产生重大影响，因为这些细胞只是失活，因此随着时间的推移而丢失。相反，功能丧失突变或低表达水平可能是自杀基因等负调控因子的问题。 事实上，在人类患者中证明，表达iCasp9自杀基因的T细胞的消除是有效的，但仍然不完全（约90-99%的消除），这部分是由突变引起的iCasp9基因失活（例如，通过提前终止密码子）或通过低且不足的表达水平。因此，当完全消除CAR T细胞至关重要时，这代表了自杀基因的局限性。 值得注意的是，不同的开关系统也可以在同一细胞中共表达，例如以并行调节不同的细胞功能和/或存活、或通过组合例如ON开关与自杀基因来进一步提高安全性。Duong等人就证明了这一点，他们将iMC开关与自杀基因共同表达，从而能够使用两种不同的药物独立调节CAR T细胞的共刺激和凋亡。 — 结论 — 虽然许多讨论的小分子依赖性开关系统在未来的临床实施中都有希望，但据我们所知，只有自杀开关和rimiducid诱导的MyD88/CD40共刺激开关已在临床上用于同种异体干细胞移植和CAR T产品。 一般来说，在CAR T中引入额外的调控元件可能会导致宿主免疫系统对CAR T细胞的免疫原性和排斥。如上所述，开关系统的临床经验有限，其中大部分是通过自杀基因获得的。与基于人类蛋白质成分的iCasp9开关系统相比，基于HSV-TK的自杀基因是非人类来源的。事实上，已有研究表明，HSV-TK特异性免疫排斥限制了造血细胞移植后HSV-TK修饰的T细胞的持续存在。 虽然非人类蛋白质通常被认为更具免疫原性，但应该注意的是，任何工程蛋白质（甚至是基于人类亲本序列的蛋白质）都含有突变，因此可能形成可以被宿主免疫系统识别的免疫原性表位。 值得注意的是，尽管大多数开关系统尚未应用于临床，但这些开关中使用的许多小分子已被批准用于其他适应症（表格1），这将大大降低将其应用于CAR T细胞调控的临床进入门槛。因此，我们预计小分子调节开关模块的出现将在CAR T细胞疗法中实现多种应用（图4），其中一些将在下面讨论。 表1. 本文讨论的开关系统的小分子药物 图4. 小分子响应开关调节CAR T细胞的潜在应用的不同领域。 参考文献: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14712598.2024.2371034?src=exp-oa#d1e223 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓