值得收藏：如何进行ADC的非临床药理和毒理评估？

2024-03-14

抗体药物偶联物临床结果多肽偶联药物

最近ADC（抗体偶联药物）大会一场接一场，各大biotech争相报告自己的ADC管线，预计2024年仍是ADC的主会场。开发一款入门级ADC似乎并不难，但如何评价临床前阶段的药理和毒理成了重中之重。尽管可以借鉴单抗的经验，但鉴于 ADCs 具有区别于单抗的特殊之处，ADCs 的研发与评价存在诸多挑战。ADCs 与裸单抗的不同之处在于 ADCs 必须与肿瘤细胞结合并内化，进而将小分子药物运输并释放到细胞内。抗体、小分子药物、连接子以及连接的方法学均可能影响ADCs 的有效性和安全性。目前有许多体内外的非临床研究方法，也有上市药物的研发经验，但如何通过优化的非临床研究来预测临床有效性和安全性仍然具有挑战，本文就此进行深入分析。01 ADCs的发展历程理想的ADCs应至少具备以下3方面的特性：1.靶向结合能力：理想的ADC靶点，抗原只在肿瘤表面表达；且表达量较高，不易脱落。2.转化过程：在到达靶细胞前，细胞毒素分子应尽可能少的脱落，即，完整的ADC全部被内化到细胞内。3.毒素小分子的释放：小分子只在肿瘤细胞内快速、大量释放；小分子应具有较高的毒性，可高效杀死肿瘤细胞。基于以上的特点，ADCs经历了以下几个阶段的变迁（见图1）图1 ADC的迭代与变迁02 ADC的药理学评价策略表1：ADCs非临床评价常用指导原则梳理药理作用的研究通常集中在药物发现或非临床评价阶段进行，需要开展的试验项目主要有:靶点结合活性、抗体介导的内化、体内外肿瘤增殖抑制作用（针对抗肿瘤的ADCs）、抗体依赖性细胞介导细胞毒性 (ADCC) 和补体依赖性细胞毒性(CDC)。试验中应关注ADCs与裸单抗、非偶联细胞毒药物之间的药理作用差异。体外靶点结合研究对药物研究初期连接子/连接方式的优化，以及体内给药试验相关动物种属选择发挥重要作用。在早期的药物优化筛选中，需要关注 ADCs 的内化，靶抗原的表达水平和 ADCs 的异质性均可能对 ADCs 的内化产生影响。通常采用免疫荧光显影技术观察ADCs 在细胞中的内化以及与溶酶体的交联。在药理作用研究中，还需要考虑 ADCC效应和CDC 效应。效应功能的缺失从某种程度上具有优势，ADCs与效应细胞的结合可能会减少其在肿瘤部位的聚集，阻碍其细胞内化并产生正常细胞毒性。在细胞水平或动物模型水平进行的药效研究是最直观反映 ADCs 药效作用的研究。靶抗原的表达水平是体外或体内药效试验需要考虑的因素。在肿瘤治疗中，即使靶抗原与肿瘤相关，如果表达水平不高可能会影响 ADCs 与靶抗原结合并内化，继而影响细胞毒药物的靶向运输和释放。靶抗原的表达水平与临床有效性显著相关。FDA 批准的 Kadcyla可明显提高 Her2 高表达的乳腺癌 Her2 高表达的乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期，Her2 高表达患者人群的无进展生存期( PFS) 是 10.6 个月，而低表达患者人群的无进展生存期为8.2 个月。高表达人群的总生存期为 34.1 个月，低表达人群的总生存期为 26.5 个月。通常用免疫组化法来确认靶抗原在肿瘤细胞或正常细胞的表达水平，但是免疫组化存在难以预测生理状况下的免疫反应的缺点。动物模型中的生物分布或全身成像试验可以全面直观地了解靶抗原在全身的表达，ADCs 和抗原的结合以及内化，肿瘤组织与其他组织的分布比值。考察ADCs在动物体内的药效时，首先要考虑种属差异。如果 ADCs 与小鼠的抗原没有结合活性或结合活性较低，需要考虑采用转基因动物进行药效试验，或者采用动物源抗体开展体内药效研究。转基因动物可以避免采用替代抗体，对于靶抗原在宿主血管或基质表达时，转基因动物不仅可以考察药效作用，还可以在一定程度上观察毒性反应。如果靶抗原只在人肿瘤细胞表达，不需要采用转基因动物，可以在接种人肿瘤细胞的裸鼠模型中考察药效作用。在进行细胞水平或动物模型水平的药效研究时，同时进行PK /PD 研究、分析药物靶向分布、受体占有率、药物暴露量与效应关系，有助于临床给药方案的设计和安全性研究结果的分析。图2 ADCs药理学评估策略03 ADC的毒理学评估策略图3 ADC非临床评价策略动物种属选择：为了使非临床安全性研究充分暴露ADCs毒性特征，以支持ADCs的临床开发，评估动物试验物种的相关性和非临床研究结果的可转译性是至关重要的。这种测定通常涉及检查ADCs对非临床物种中目标抗原相对于人类的结合亲和力，以及在组织交叉反应研究中对免疫组化染色谱进行比较。由抗体的效应功能或免疫原性也因物种的差异而不尽相同。暴露参数和代谢：此外，与其他药物和生物产品一样，对人类的非临床研究结果的外推应包括暴露参数和代谢的比较。例如BR-96，该ADC是通过6-马来酰基己酸腙连接子将阿霉素（DOX）与人源BR96单克隆抗体的半胱氨酸残基共价连接而成。毒理学研究表明，与大鼠和猴子不同，犬BR-96毒性作用更敏感，且因出血性肠炎毒性作用作为剂量限制毒性。且令人惊奇的是，BR96-DOX和未修饰的单抗BR96具有相同的剂量限制毒性，表明毒性是由单抗产生。与未偶联的DOX不同，ADCs在大鼠模型中没有诱导心肌病。因此，BR96-Dox在人类受试者中的I期临床试验的剂量选择是基于在犬的毒理结果。抗体靶标的表达：与治疗性单克隆抗体的情况一样，ADCs的非临床评估可能因在动物试验物种中缺乏抗原靶点而受到阻碍。ICH S6（R1）关于生物技术衍生药物的临床前安全性评价（2011年）的指南指出，“对含有新型毒素/毒物的抗体-药物/毒素偶联物（ADC）的物种选择应遵循与未偶联抗体相同的一般原则。单克隆抗体测试的相关动物物种是表达抗体所需表位并显示与人体组织相似的组织交叉反应谱的物种。因此，物种和疾病的特异性可能决定或限制非临床评估。一个例子是Polatuzumab vedotin，与人类B细胞上的CD79b结合，但发现不与小鼠、大鼠或食蟹猴CD79b结合，缺乏与药理学相关的非临床种属。非临床毒性研究采用替代ADCs进行，该替代ADCs与食蟹猴CD79b结合，亲和力与Polatuzumab vedotin和人类CD79b相似，这是ICH S6（R1）指南中描述的生物制剂非临床安全性评估的另一种方法。替代抗体药物偶联物（ADC）使用了与polatuzumab vedotin相同的连接子-药物，即微管抑制剂甲基奥瑞他汀E（MMAE），通过可在溶酶体中切割的二肽缬氨酸-瓜氨酸（vc）链接，并且与抗CD79b单克隆抗体（mAb）结合的vc-MMAE分子的平均DAR值相似，但是替代抗体与临床抗体的不同之处在于它是一种嵌合结构，具有非人源化（小鼠）互补决定区。当时用替代抗体时，需要充分鉴定用于ADCs安全性评价的替代物（如表位结合、活性和效力以及PK）。另一个具有人源化ADC的例子是Anetumab-ravtansine，人源化抗间皮素抗体与DM4(一种maytansinoid微管蛋白抑制剂)偶联而成，显示出对表达间皮素的肿瘤细胞的有效杀伤作用。由于ADC仅与人间皮素结合，因此不能在非临床动物模型中研究靶点介导的毒性；然而，在大鼠和食蟹猴中评估了ADC与抗原无关的脱靶毒性。有人认为，在人体中观察到的毒性可能与健康组织中间皮素的生理表达有关，这限制了临床试验中的最大耐受剂量，低于非临床研究的预测。正常组织中靶抗原的表达是ADC治疗的一个主要安全问题。理想情况下，目标抗原在正常细胞上的表达应非常低；然而，正如上述两个例子，抗体在实践中并非这样。其他与缺乏特异性相关的ADC靶点的潜在毒性例子包括NaPi2b，一种钠依赖的磷酸盐转运体，在几种肿瘤类型中表达，但在正常组织中也以可检测到，它在无机磷酸盐稳态中发挥作用。一种ADC（抗NaPi2b-vc-MMAE）由人源化的IgG1抗NaPi2b单抗通过vc肽连接子与MMAE偶联，证实在正常人类和食蟹猴组织中具有特异性的结合亲和力。然而，尽管在猴子的正常肺中高水平表达，这种交叉反应的安全性可被接受，具有与正常组织表达无关的剂量限制毒性。在正常大鼠、非结合物种和猴子中，毒理学效应与MMAE的药理学一致。一般毒理设计原则：一般情况下，单抗/裸抗、Linker/ Linker-毒素通常无需单独设置组别，单抗分子主要是影响或决定系统暴露的主要因素之一，剂量设计需综合考虑ADCs药效学剂量、抗体分子特征及小分子毒素的毒性特点。关注Payload相关毒性：虽然通过靶向性释放小分子化合物实现了靶组织药物富集，提高了治疗窗，但 ADC 的主要毒性反应特征仍然与所连接的小分子化合物毒性特征相似。大部分 ADC 的毒性反应程度比小分子化合物直接给药减弱，但有些 ADC 可能会增加抗体靶结合或脱靶结合的组织毒性反应。ADC 虽然增加了小分子化合物的靶向释放，但是仍然有一部分小分子化合物提前释放，有些游离小分子化合物也可从靶细胞中快速扩散或转运至周围组织、体循环中，或者靶细胞的凋亡、损伤可能导致游离小分子化合物进入体循环。ADC 中的抗体部分，还可能与其他非靶组织器官细胞表面受体或者抗原表位结合，例如，由 Fc 受体介导的细胞吞噬作用，药物经过分解代谢后会对相应组织细胞产生毒性作用。因此，ADC 的毒性作用与抗体、小分子化合物、以及连接子的特性密切相关，随着抗体、小分子化合物、连接子的变换，其毒性反应特征也会产生变化。非临床安全性研究中，应关注药物组成结构、药代特征对毒性作用的影响，综合分析试验结果。遗传毒性：生物大分子一般不与 DNA 直接相互作用，ADC 及其抗体部分通常无需进行遗传毒性试验。ADC 潜在的遗传毒性来自于小分子化合物。如果荷载小分子化合物为全新化合物，需对其开展遗传毒性试验；对于机体中产生的新游离小分子化合物和/或新的连接子的情况，应基于 ADC 的理化性质、裂解特征和裂解物结构等因素评估确定需开展相关遗传毒性研究的目标检测物；若已有充分数据提示目标检测物具有遗传毒性，则无需开展遗传毒性研究。生殖毒性：ADC 中小分子化合物、连接子和裸抗体可能对生殖器官、生育力、胚胎-胎仔发育、子代发育等产生不良影响，因此应关注 ADC 的生殖毒性风险。ADC 生殖毒性评价的研究策略、试验设计、实施和评价等应参考 ICH S5 指导原则，同时结合ADC 的作用机制和适应症人群等，采用具体问题具体分析的评价策略。拟用于晚期肿瘤患者的 ADC 可参考 ICH S9 指导原则开展生殖毒性研究。对于生物制品，通常在药理相关动物种属中评价生殖毒性。如果啮齿类动物和兔均为靶结合相关动物种属时，应采用两个动物种属进行胚胎-胎仔发育毒性试验，除非在一个种属中已经确认有胚胎致死性或者致畸性。若靶结合动物种属为非人灵长类动物或者无相关动物种属，通常可首先考虑采用大鼠或兔开展生殖毒性试验，考察游离小分子化合物的生殖毒性。若研究结果确证阳性，无需再采用靶结合相关动物种属考察生殖毒性；否则，需要考虑采用非人灵长类动物或者采用转基因动物或替代分子进行试验，以识别抗原介导的生殖毒性。若 ADC 中的抗体或小分子化合物已有文献数据明确显示具有潜在生殖毒性风险，则无需开展生殖毒性研究，可基于文献信息进行相关风险控制。致癌性：可根据 ADC 的特性，基于 ICH S1、ICH S6、ICH S9 等相关指导原则考虑致癌性研究的必要性。免疫原性/免疫毒性：ADC 进入生物体后可能会引起免疫原性，产生抗药抗体。对 ADC 的免疫原性评价有助于对药物药代动力学、药效和安全性结果进行分析，因此通常在 ADC 的非临床安全性研究中应伴随进行抗药抗体检测。抗药抗体可能产生自 ADC 中的抗体部分和连接部分等，应基于免疫原性风险，考虑是否需要进一步考察抗原表位。有关 ADC 的免疫原性分析方法学开发、验证以及分析检测策略应遵循《药物免疫原性研究技术指导原则》。可参考 ICH S6、ICH S8、ICH S9 等指导原则，结合 ADC的种类、作用机理等因素，合理设计免疫毒性检测指标。除了常规免疫毒性研究，必要时还应考虑进一步开展附加的免疫毒性研究。光安全性：在Ⅰ期临床试验前，应根据小分子化合物（包括连接子）的光化学特性和药理/化学类别初步评估潜在光毒性。如果这些数据评估后提示有潜在风险，应对临床试验受试者采取合适的保护措施。如果根据非临床数据或临床经验，无法充分评价其光安全性风险，应在大样本量受试者的临床试验（Ⅲ期）前提供符合ICH S10所述原则的光安全性评估。组织交叉反应：组织交叉反应研究是采用免疫组织化学技术进行的体外组织结合试验，确定抗体与抗原表位在组织内的结合特征。组织交叉反应研究可以为靶标分布的认知提供有用的补充信息，还可以提供潜在非预期结合的信息。使用人体组织进行的组织交叉反应研究，是支持抗体类药物进行初始临床给药的系列安全性评价的有机组成。当没有靶点结合相关动物种属时，组织交叉反应信息对人体毒性风险的预测尤为重要。对于拟用于晚期肿瘤适应症的ADC，可采用相关动物种属评价毒理作用，并且没有特殊担忧时，组织交叉反应研究不是必需的。图4 动物种属选择策略04 结语目前 ADCs 的非临床药理毒理研究ICH、FDA、NMPA等已出台相关技术指导原则，研究中 ADCs 也可参考ICHS6 和 ICHS9 等指导原则，同时基于药物特点来设计科学合理的非临床药理毒理研究，最大限度地将非临床动物水平的药效作用和毒性反应外推至人，预测ADCs 在临床应用中的有效性和安全性，从而提高临床试验的成功率，降低开发风险。新药研发者可以就初步研究结果和存在问题与审评机构沟通交流，以期获得科学规范的非临床研究支持信息。参考文献：抗体偶联药物非临床研究技术指导原则.（NMPA,2023年9月25日）Fisher JE Jr. Considerations for the Nonclinical Safety Evaluation of Antibody-Drug Conjugates. Antibodies (Basel). 2021 Apr 19;10(2):15. doi: 10.3390/antib10020015. PMID: 33921632; PMCID: PMC8167597.闫莉萍,王海学,王庆利.抗肿瘤抗体偶联药物非临床药理毒理研究的考虑要点[J].中国新药杂志,2017,26(16):1894-1899. 部分资料参考了ADC非临床评价策略讲座（汤纳平.2024-01-24）作者：乘船远航免责声明“药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！