Moderna:IL-12 mRNA-LNP蛋白替代疗法序列设计与验证

2024-03-25

信使RNA临床结果基因疗法

导读：IL-12作为一种天然存在的细胞因子，在机体对癌症的免疫抑制过程中起着关键作用，并且在多项临床前研究中IL-12始终显示出有效的抗肿瘤活性，但在人体可耐受剂量下，重组IL-12蛋白在临床试验中无法显示其预期的治疗效果。因此，人们开始考虑将IL-12局部递送至肿瘤微环境。随着LNP递送技术的日渐成熟，人们转向基于mRNA技术的IL-12抗肿瘤药物。2020年，Moderna研究团队在Clinical Cancer Research（1区, 影响因子11.5）发表文章：《Intratumoral IL-12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment》。研究者开发了一种IL-12 mRNA-LNP瘤内注射制剂，用于治疗实体瘤，在细胞、多种小鼠模型和肿瘤患者立体培养物中证实了IL-12 mRNA-LNP IL-12 mRNA-LNP具有强效的抗肿瘤活性。本期内容，我们将详细讨论IL-12 mRNA-LNP的序列设计、体内外表达及其抗肿瘤机制。01IL-12抗肿瘤机制响应PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂（ICB）的患者往往具有炎性T 辅助细胞（TH1）极化肿瘤微环境（TME），其特征是表达干扰素γ（IFNγ）和 PD-L1。因此，诱导患者肿瘤微环境转向TH1 可能会增强对 ICB 无反应患者的抗肿瘤反应。上篇文章中，我们详细解读了IL-12通过 TH1参与细胞免疫：一文读懂|IL-12 mRNA蛋白替代疗法实体瘤研究进展IL-12作为 TH1 免疫反应的中枢介质，在启动抗肿瘤免疫中发挥着关键作用。IL-12 诱导TH1 细胞分化，并增强自然杀伤细胞（NK）、自然杀伤 T 细胞（NKT）和细胞毒性 T 细胞的活化和细胞毒性活性。IL-12 的许多下游效应是通过先天性和适应性免疫细胞诱导关键的 TH1 细胞因子 IFNγ 介导的。IL-12 直接或通过 IFNγ 起作用，以促进抗原呈递，减少髓系免疫抑制，并通过产生其他 TH1 趋化因子包括 IFNγ 诱导蛋白 10 （IP-10）来增强 T 细胞募集。02mIL-12 mRNA序列设计mIL-12 mRNA 由野生型小鼠 IL-12b 和 IL-12a 序列（NM_001303244.1 和 NM_001159424.2）组成。MEDI1191 mRNA由优化的人 IL-12A 和 IL-12B mRNA 序列（人 NM_002187.2 和 NM_000882）组成。在MEDI1191 和 mIL-12 mRNA序列中， IL-12B 和 IL-12A序列之间添加接头序列，以生成连接单体 IL-12p70 （IL-12B-IL-12A）。保留IL-12B信号肽，使其能够分泌。根据Uniprot（小鼠P43431和人P29459）序列，去除掉小鼠和人IL-12A的头22个氨基酸。对于膜结合型mIL-12来说，将单链 IL-12B-IL-12A C末端通过多肽连接子（SG3SG4SG4SG4SG3SLQ）与PDGFRβ 跨膜结构域相连，然后，在细胞内末端连接上G4S连接子和 V5 肽标签。在IL-12 mRNA 3′ UTR 中掺入了一个 miR122 结合位点，抑制肝细胞中 IL-12 蛋白的产生，而不影响癌细胞中的水平。除常规mRNA外，近年来自复制RNA(saRNA)和环状RNA(circRNA)也备受关注。耀海生物基于三种RNA技术，设计并制备了IL-12 mRNA、IL-12 saRNA和IL-12 circRNA预制品，均在细胞中高表达。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）。另一点需注意的是，由于人源IL12p70在小鼠体内没有生物学活性，因此研究者设计了小鼠(m) IL12 mRNA用于小鼠模型。03IL-12 mRNA表达验证3.1 mIL-12 mRNA体外表达验证mIL-12 mRNA-LNP转染MC38 细胞，mIL-12 表达水平呈现剂量依赖效应。mIL-12 mRNA 转染细胞后表达释放至上清中的mIL-12p70 蛋白与异二聚体重组蛋白 mIL-12p70 具有相当的活性，刺激CD8+T细胞分泌相同水平的IFNγ。左图:不同剂量的mIL-12 mRNA-LNP转染MC38细胞24h后的mIL-12 表达水平右图: 异二聚体重组蛋白或者源自mIL-12 mRNA转染的Hela细胞上清的mIL-12p70刺激CD8+T细胞分泌相同水平的IFNγ。3.2 mIL-12 mRNA体内表达验证研究人员在皮下同基因肿瘤移植小鼠（对 ICB 具有不同敏感性）中研究了mIL-12 mRNA 的药效作用和抗肿瘤活性。SC A20 淋巴瘤模型是一个完善的ICB 敏感系统。与 MC38 敏感 (MC38-S) 肿瘤相比，在皮下植入MC38 结直肠细胞系的 MC38 耐药 (MC38-R) 变体后，小鼠对 PD-1 /PD-L1 的抑制反应较差。在这两种肿瘤模型中，mIL-12 mRNA 在瘤内诱导 mIL-12p70 呈现剂量依赖性表达，同时，这也使得循环血浆中的mIL-12p70 浓度增加。IL-12 水平在给药后 7 天仍保持升高，相反，注射重组 IL-12 只有5 至 10 小时的半衰期。在MC38-R皮下荷瘤小鼠中瘤内注射不同剂量的mIL-12 mRNA-LNP 在A20皮下荷瘤小鼠中瘤内注射不同剂量的mIL-12 mRNA-LNP04抗肿瘤活性研究在A20、MC38-S 和 MC38-R 荷瘤小鼠中，瘤内注射单剂量mIL-12 mRNA可剂量依赖性地延迟肿瘤生长、消退肿瘤，并且，在某些情况下，能够出现完全缓解（CR）。与 mIL-12 mRNA 相比，注射非翻译对照mRNA对于肿瘤生长或者小鼠存活率没有影响。在三种荷瘤小鼠模型中，即使注射最低剂量0.05ug mIL-12 mRNA也可显著延长小鼠存活率，当然，如果将注射剂量提升至0.5 μg 和 5 μg mIL-12 mRNA ，小鼠存活率也随之增加。与 MC38-R 模型相比，mIL-12 mRNA 在 A20 和 MC38-S 模型中具有更高的抗肿瘤活性，与之前观察到的 A20 和 MC38-S 模型对 PD-1/PD-L1 阻断的敏感性高于 MC38-R 一致。在MC38-S、A20或MC38-R模型小鼠中，与单剂注射 mIL-12 mRNA ，每周重复注射并不能显著增强mIL-12 mRNA抗肿瘤活性。mIL-12 mRNA耐受性良好。更重要的是，在几乎所有对mIL-12 mRNA具有 CR 的三种小鼠模型中，重新植入肿瘤部位均未出现肿瘤生长。研究者认为，在大多数注射mIL-12 mRNA且出现CR的小鼠中，已经建立起对A20、MC38-S 或 MC38-R 肿瘤细胞的免疫记忆反应。在多个同基因模型中，单次瘤内注射 mIL-12 mRNA 可诱导剂量依赖性肿瘤消退05总结研究设计了一款IL-12 mRNA-LNP(MEDI1191)药物，其mRNA序列特征为：优化后的人源IL-12b 和 IL-12a 序列通过多肽连接，并且在IL-12 mRNA的3′ UTR 中掺入了一个 miR122 结合位点，以抑制肝细胞中IL-12的产生，但不影响癌细胞的水平。但需注意的是，由于人源IL12p70在小鼠体内没有生物学活性，因此研究者设计了小鼠(m) IL12 mRNA用于小鼠模型。随后，研究通过体内外试验验证了IL-12 mRNA-LNP的翻译表达效率和抗肿瘤活性，一系列临床前研究为MEDI1191的进一步开发提高了数据支撑。后续文章，菌菌将持续更新MEDI1191的抗肿瘤机制和临床研究结果，敬请关注！专业名词解释同源肿瘤异体移植小鼠模型（Syngeneic model）：是将同种背景来源的肿瘤细胞系接种至免疫健全的近交系小鼠。受体小鼠拥有完整的鼠源免疫系统，具有完全的免疫活性，其免疫系统与同种移植肿瘤组织相容，能最大化模拟肿瘤微环境的真实生活情况；且重复性和可操作性好，适用于大规模筛选。MC38：一种常用的小鼠结肠癌细胞系。它具有高突变负担，对免疫检查点免疫疗法敏感，并且已经报道了对新抗原的内源性CD8+ T细胞反应。SC A20：一种常用的小鼠B细胞淋巴瘤模型，20模型可作为皮下和全身（静脉注射）模型提供。A20模型适用于评估免疫治疗药物的效力，包括免疫检查点抑制剂和免疫激动剂的作用。参考文献 [1] Hewitt SL, Bailey D, Zielinski J, et al. Intratumoral IL12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment. Clin Cancer Res. 2020 Dec 1;26(23):6284-6298. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-047.[1] Hewitt SL, Bailey D, Zielinski J, et al. Intratumoral IL12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment. Clin Cancer Res. 2020 Dec 1;26(23):6284-6298. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-047. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。