细胞外蛋白靶向降解(eTPD): 六大药物发现模式

2024-03-19

蛋白降解靶向嵌合体

靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)在过去十年中作为一种主要的新型药物模式出现，用于去除细胞内具有双特异性小分子的蛋白，这些小分子将感兴趣的蛋白(POI)招募到E3连接酶上，以便在蛋白酶体中降解。与传统的基于占位的药物不同，细胞内TPD (iTPD)消除了靶标并催化起作用，因此可以更有效和持续，剂量要求更低。最近，这种方法已经扩展到细胞外蛋白质组，包括分泌蛋白和膜蛋白。细胞外蛋白靶向降解(eTPD)利用双特异性抗体、偶联物或小分子将细胞外POI运送到溶酶体降解。在这里，我们重点介绍了eTPD的最新进展，包括降解系统、靶标、分子设计和推进它们的参数。现在几乎任何蛋白质，细胞内或细胞外，原则上都可以用TPD处理。01 细胞内蛋白靶向降解(iTPD)：PROTAC和分子胶近年来，细胞内靶向蛋白降解(iTPD)已成为小分子药物的重要新模式(图1)。目前，已经开发出两类这样的分子。第一类是蛋白质水解靶向嵌合体（PROTACs)，是由一个linker连接的大的双特异性小分子;诱导POI泛素化，被细胞质中的蛋白酶体降解。第二类被称为分子胶，分子胶增强了E3连接酶和POI之间的相互作用，导致其泛素化和蛋白酶体降解。与传统的基于“占位驱动”的抑制剂相比，iTPD具有显著的优势。首先，PROTACs或分子胶理论上可以结合POI上的任何地方，而抑制剂通常需要结合活性或变构位点。其次，靶标的降解会去除整个蛋白质，包括其支架功能，因此药物的治疗活性应该持续更长时间，并且更接近基因敲除实验的结果。第三，这些分子是催化作用，而不是像经典的药理学抑制剂那样是化学计量作用，所以低剂量可以达到同样的治疗效果。目前有二十多个临床试验涉及PROTACs和分子胶，其中一些已进入II期和III期研究。图1.细胞内靶向蛋白质降解途径的一般机制02 细胞外蛋白靶向降解(eTPD)：新兴药物模式胞质蛋白的iTPD激发了生物学和化学学界对细胞外蛋白质组的研究，称之为细胞外TPD (eTPD)。除了目标POI的位置之外，iTPD和eTPD之间至少有三个显著的区别(图2)。首先，细胞通过两种主要途径回收蛋白质:蛋白酶体和溶酶体途径。iTPD几乎完全依赖蛋白酶体途径，这通常用于处理细胞内蛋白质。eTPD涉及双特异性生物制剂或小分子，这些生物制剂或小分子将膜结合或分泌的POI募集到膜结合循环受体，并将POI输送到溶酶体，这是细胞外蛋白降解的典型途径。其次，这两种蛋白水解破坏模式具有不同的动力学，并使用不同的蛋白酶。iTPD更快——通常在几分钟到几个小时内，因为所有成分都在细胞内。相比之下，eTPD的速度通常较慢，通常在6–48小时，因为它涉及从膜通过早期和晚期内体的囊泡运输，并最终与溶酶体融合导致蛋白质降解。第三，几乎所有的iTPD系统都只使用少数E3连接酶，主要是CRBN或VHL，在寻找E3连接酶结合物方面存在挑战。这两种连接酶在组织中广泛表达，这限制了组织选择性靶向。相比之下，eTPD可以使用多种降解系统，这允许更特异的组织选择性。最后，与典型的小分子相比，抗体的药代动力学非常长，因此给药频率较低。因此，eTPD代表了一种新兴的生物药开发的新模式。图2.细胞外靶向蛋白质降解途径的一般机制03 eTPD的六种不同策略目前，eTPD主要有降解可溶性POI的清除抗体eTPD、基于聚糖的循环受体eTPD、基于跨膜E3连接酶靶向膜蛋白的eTPD、基于细胞因子靶向膜蛋白的eTPD、基于整合素的eTPD、从内部降解膜蛋白的eTPD六种不同的方法策略。3.1降解可溶性POI的清除抗体eTPD抗体的Fc区对抗体循环和免疫细胞活化具有重要的功能。新生Fc受体(FcRn)负责回收内化到核内体中的抗体，在它们到达溶酶体降解之前将它们送回细胞外，并且增强抗体与FcRn的结合可以将其在人类血清中的半衰期延长至21天。“清除抗体”通过设计，使FcRn以pH可切换的方式将POI传递给酸性内体，释放POI用于溶酶体降解(图3a)。这是受到低密度脂蛋白(LDL)摄取的自然循环机制的启发，LDL与LDL受体结合，并在低pH下释放到内体进行溶酶体降解。tocilizumab (Tcz)，一种被批准用于治疗类风湿性关节炎的人源化抗体，与IL-6受体(IL-6R)具有pH依赖性结合。通过将Tcz重新设计成清除抗体，利用已知的突变提高了其对FcRn的亲和力，然后通过互补决定区域CDR的突变在pH 6.0的情况下将对IL-6的亲和力降低约20倍，同时在pH 7.4保持亲和力。修饰的抗体可以将IL-6R输送到溶酶体，同时保持与FcRn的连接，并循环回质膜以收集更多的IL-6。pH可切换的Tocilizumab于2020年被批准用于治疗视神经脊髓炎谱系障碍，这代表了eTPD中第一个被批准的抗体。3.2 基于聚糖的循环受体eTPD使用聚糖靶向的再循环受体，如阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（CI-M6PR）或去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），可以促进膜和可溶性POI的溶酶体降解(图3b)。一种方法被称为溶酶体靶向嵌合体（LYTAC），它涉及CI-M6PR的多个聚糖配体与靶向POI的抗体的生物偶联，LYTAC–POI复合物与CI-M6PR结合后被内化，导致POI在溶酶体中降解。另一种方法被称为MoDE或ASGPR靶向嵌合体（ATACs）的双功能小分子，被用于开发基于ASGPR的类似方法。CI-M6PR是一个300 kDa二聚体I型受体，是pH可切换受体，其在中性pH下与配体结合，并在内涵体与溶酶体融合之前在酸性内涵体中释放。CI-M6PR已被用于将携带M6P的外源性溶酶体酶穿梭到溶酶体，以治疗溶酶体疾病。ASGPR主要在肝细胞上高表达，并可快速清除非唾液酸化糖蛋白。总之，基于聚糖的eTPD降解方法主要利用ASGPR或CI-M6PR。3.3 基于跨膜E3连接酶靶向膜蛋白的eTPDE3连接酶除了600–700个细胞内的成员外，还有一个约包含30多个成员的含有跨膜结构域的E3连接酶家族。利用靶向该家族成员和POI的双特异性抗体可以降解靶蛋白，被称为基于抗体的蛋白降解靶向嵌合体（AbTACs）、蛋白降解靶向抗体（PROTABs）或通过E3泛素连接酶招募的受体消除（REULR）（图3c）。一项研究构建了一种PD-L1的AbTAC，POI臂选择与PD-L1结合的atezolizumab的Fab结构域，降解臂使用RNF43胞外结构域的Fab。Atz-AbTAC采用了经典的KIH模式，Atz AbTAC诱导了PD-L1的降解，DC50为3.4nM，24小时最大降解（Dmax）约为63%，全细胞蛋白质组学显示细胞蛋白质组没有显著的总体变化，也没有显著的细胞毒性。总之，已有研究表明，与跨膜E3泛素连接酶家族成员的双特异性分子（AbTACs、PROTABs和REULRs）可以共同选择降解一些重要的膜蛋白，从而达到治疗目的。3.4 基于细胞因子靶向膜蛋白的eTPD众所周知，许多细胞因子可以通过穿梭到溶酶体而被其受体吸收和降解。这为利用eTPD的内源性机制提供了另一个机会，方法称为细胞因子受体靶向嵌合体（KineTAC）（图3d）。KineTACs一个臂结合到天然细胞因子或生长因子，而另一个臂专门结合到POI上。这使得它能够针对膜结合型和可溶性蛋白发挥作用，实现高效且特定的蛋白降解。与AbTAC一样，KineTAC可以降解多种细胞类型上的广泛膜蛋白。而且与LYTAC类似，它们也可以降解可溶性蛋白，因为循环不依赖于泛素化。此外，POI的转录水平可以显著高于降解物，并且仍然可以有效降解。3.5 基于整合素的eTPD受利用整合素αVβ3靶向递送抗癌药物的启发，eTPD引入了基于整合素的降解系统（图3e）。它涉及使用双特异性抗体，这种双特异性抗体一个臂专门结合到整合素，而另一个臂结合到POI。将POI引导至溶酶体进行降解，同时利用整合素的循环能力来增强目标定位和效率。作为原理证明，使用整合素αVβ3-结合生物素嵌合体靶向生物素结合蛋白NeutrAvidin。该分子含有与生物素共价连接的环状RGD基序（cRGD），在20 h内成功内化A549细胞中的NeutrAvidin。总体而言，这种基于整合素的降解系统为膜或可溶性蛋白的肿瘤选择性降解显示了令人兴奋的潜力。3.6 从内部降解膜蛋白的eTPD受体酪氨酸激酶（RTK）已有PROTAC靶向的研究，该PROTAC含有与各种RTK抑制剂连接的CRBN或VHL的经典E3连接酶结合物（图3f）。这种PROTAC一部分结合受体酪氨酸激酶（RTK）的细胞内激酶结构域，而另一部分与E3连接酶结合。从而使得受体酪氨酸激酶的泛素化，诱导受体酪氨酸激酶在蛋白酶体中被降解。总之，使用与VHL或CRBN结合的PROTAC可以从内部降解RTK。尽管这种方法仍处于初级阶段，但使用靶向膜蛋白细胞内结构域的PROTAC已显示出应用潜力。图3.六种不同的降解细胞外蛋白的方法04 小结eTPD领域正处于起步阶段，并迅速跟随iTPD领域的发展，目前各种设计以及各种方法都正在研究中。不过，eTPD领域仍有许多重要问题需要解决。eTPD在哪些靶标方面具有明显优势？最重要的POI是什么？在哪些治疗领域？这些对慢性病或急性病更有用吗？eTPD主要针对可溶性或膜POI，还是同时针对两者？安全有效的eTPD药物的组织选择性有多重要？eTPD将形成什么类型的耐药性机制，与其他药物模式相比，对eTPD药物的耐药性是否更可能出现？这些问题亟待解答。总之，对于eTPD领域来说，这是一个激动人心的时刻，未来还会有更多的发现。可加入群聊，互相交流。参考文献：Extracellular targeted protein degradation: an emerging modality for drug discovery声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓