导读:与其他生物制剂和小分子化药相比,RNA疗法具有显著优势,包括较高的安全性、较低的成本和广泛的靶向灵活性,这些优势正在迅速推动核酸领域的发展。这得归功于药物递送领域的突破,其中脂质纳米颗粒(LNP)是临床上最先进的系统之一。目前已在大规模人群中得到验证的 LNP 制剂由四种类型的脂质组成:可电离阳离子脂质、磷脂、胆固醇或胆固醇衍生物,以及聚乙二醇 (PEG)-脂质。每种脂质对于RNA-LNP药物发生正常功效非常关键。也有研究显示,LNP 制剂可以诱导促炎性免疫反应,这可能会影响治疗效果。这些免疫反应以及对 LNP 制剂的其他潜在免疫反应(例如抗炎或耐受反应)背后的机制细节尚未阐明。关于LNP中不同脂质组分触发免疫反应的机制,菌菌在以下文章中找到了答案:加拿大英属哥伦比亚大学Anna Blakney团队在Current Opinion in Biotechnology发表综述文章:《Immune response to the components of lipid nanoparticles for ribonucleic acid therapeutics》,该综述文章重点讨论了脂质纳米颗粒中每种脂质成分如何触发免疫反应以及对RNA疫苗有效性的影响。一、LNP脂质组分的作用概述可电离阳离子脂质与带负电荷的RNA分子形成复合物,其对pH的敏感性增强了LNP的生物相容性。在正常生理pH下,可电离阳离子脂质不带电荷,这减少了其与非靶细胞的阴离子膜的相互作用。一旦 LNP 进入内涵体,可电离阳离子脂质质子化,从而破坏内涵体膜的稳定性并促进 RNA 分子逃逸 。磷脂在颗粒形成过程中起到稳定 LNP 结构的作用,并且还可能在内体逃逸中发挥作用 。胆固醇或其衍生物通过调节膜完整性和刚性来稳定颗粒,并影响递送效率和颗粒的生物分布。PEG-脂质延长了LNP 的循环时间,为颗粒提供空间位阻,减小其尺寸并防止聚集 。可电离阳离子脂质是LNP的关键成分,磷脂和胆固醇及衍生物被称为辅助脂质。辅助脂质可稳定脂质纳米颗粒、提高转染效率并延长颗粒的循环时间。然而,尽管 LNP 已用于大规模人群,但辅助脂质与人体免疫系统的相互作用在很大程度上尚未得到充分研究。常规LNP脂质组分及相关的免疫反应二、LNP脂质组分触发免疫反应的机制2.1 可电离阳离子脂质可电离阳离子脂质是LNP中触发免疫反应的一种关键成分。Alameh等人发现用特定可电离阳离子脂质制备的空壳LNP 作为佐剂的流感蛋白亚单位疫苗免疫小鼠可诱导强烈的体液反应。然而,并非所有用于核酸递送的阳离子脂质都能诱导强烈的体液反应,因为他们发现不可电离阳离子脂质制备的空壳LNP没有佐剂活性。含有可电离脂质的空壳LNP诱导免疫小鼠引流淋巴结中产生 IL-6,激活滤泡辅助 T 细胞 (Tfh) 反应,从而促进体液反应。而且, LNP 佐剂性能优于广泛使用的 MF59 类佐剂 AddaVax。类似地,Tahtinen等人观察到RNA 疫苗可刺激人类免疫细胞释放 IL-1 细胞因子,主要是 IL-1β,这取决于 RNA 和脂质配方。IL-1 反过来会触发广谱性促炎细胞因子(包括 IL-6)。用 modRNA-LNP(SM-102)或空 LNP(SM-102)刺激人外周血单核细胞可检测到强劲的 IL-1β 释放,R848(TLR7/8 激动剂)和空LNP(SM-102)的共同处理进一步增加了IL-1β水平。相反,modRNA-LNP(MC3)无法刺激人外周血单核细胞释放IL-1β,甚至在LNP(MC3)中添加R848也非常弱。LNP通过诱导滤泡辅助 T 细胞和强烈的体液反应来增强 mRNA 和蛋白质亚单位疫苗的功效(左); modRNA-LNP 在体外诱导人 PBMC 释放 IL-1β(右)可电离阳离子脂质成分对局部免疫反应也有着重要影响。Ndeupen 等人在小鼠模型中发现皮内注射缺乏可电离阳离子成分的空壳LNP 可有效消除皮肤炎症反应(发红和肿胀)。流式细胞术显示皮内注射可电离阳离子脂质制备的空壳LNP的皮肤样本中存在大量且快速的白细胞浸润,以中性粒细胞为主,并在第 14 天缓慢消退。皮内注射LNP触发强烈的炎症反应Miao 等人在Nature Biotechnology发表文章:Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation,他们发现与线性可电离阳离子脂质制备的空壳LNP相比,杂环可电离阳离子脂质制备的空壳LNP可上调小鼠骨髓源性树突状细胞 (BMDC) 中的某些激活标记物,例如 CD40 和 MHCII,该激活是由环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷合酶 (cGAS)-干扰素基因刺激剂 (STING)-I 型干扰素 (IFN) 途径介导的。这项研究确定了介导可电离阳离子脂质成分触发炎症反应的细胞途径,并将这些反应与脂质结构特性直接联系起来。然而,并非所有的可电离阳离子脂质引起的炎症反应都涉及 STING 途径。在小鼠模型中,C1可电离阳离子脂质配置的LNP触发的炎症反应通过不依赖于 STING途径的TLR-4诱导。总而言之,这些研究表明LNP制剂中的可电离阳离子脂质成分在介导炎症反应中发挥着极为关键的作用。这些炎症反应一方面涉及RNA 疗法中观察到的副作用,但也可能起到佐剂作用。2.2 Phospholipids 磷脂磷脂,也称为甘油磷脂,根据极性头基可分为 5 类:磷脂酰胆碱 (PC)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰甘油 (PG)、磷脂酰肌醇 (PI) 和磷脂酰丝氨酸 (PS)。二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC) 和二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE)是 LNP 配方中最常用的磷脂。在哺乳动物细胞中,PC 和 PE 分别占总磷脂的 40-50% 和 25%。为维持细胞稳态,在磷脂酶介导下,磷脂会经历水解,产生多种代谢产物,包括氧化磷脂(非酶氧化形式和酶氧化形式)和溶血磷脂,它们都具有免疫调节作用,例如,氧化磷酸胆碱充当“损伤相关分子模式”(DAMP)并调节炎症。此外,它们通过 CD14、TLR-4 和 NLRP3 炎症小体调节信号,影响各种细胞过程,如吞噬作用、炎症小体激活和树突状细胞迁移。PS 也具有免疫调节作用。PS 存在于凋亡细胞表面,充当“吃我”信号,促进吞噬细胞摄取。病毒和其他病原体可以在其表面呈现 PS 来模拟凋亡细胞,促进进入细胞并有助于免疫逃避。研究者发现含有 PS 的 LNP 制剂(PS-LNP)可以提高转染效率,并增强递送 RNA 的蛋白表达。研究者将 PS 添加到基于 MC3制备的LNP (PS-LNP) 中,静脉注射到小鼠体内。与非PS-LNPs相比(蛋白表达主要分布在肝脏),PS-LNP 在淋巴结和脾脏中均实现有效的蛋白质表达。PS-LNP 更多地分布到颈浅淋巴结,这种次级淋巴器官的靶向性由单核细胞和巨噬细胞介导。磷脂酰丝氨酸脂质纳米颗粒靶向次级淋巴器官外源重组因子 VIII (FVIII) 治疗 A 型血友病的一个主要临床并发症是中和抗体的产生。FVIII 与磷脂酰丝氨酸 (PS) 复合物可降低血友病小鼠中总抗体滴度和中和抗体产生。PS 通过调节细胞因子分泌来调节树突状细胞成熟(减少共刺激标记物CD86和CD40上调)和减少T 淋巴细胞增殖,从而降低 FVIII 的免疫原性。含PS/溶血PS的纳米颗粒可通过诱导耐受性树突细胞的产生并促进调节性T细胞(Treg)扩增,将免疫原转化为耐受原。总的来说,这些研究表明,磷脂有望成为 LNP 制剂免疫调节组分。2.3 胆固醇及其衍生物从结构上讲,胆固醇形成并维持细胞膜。最近的研究还表明,胆固醇代谢会影响免疫细胞活性,包括激活、分化和功能。细胞内胆固醇的积累会激活炎症小体,而氧化的胆固醇种类在免疫反应中发挥重要的调节作用 。然而,胆固醇的这些生理作用主要是在动脉粥样硬化和心血管疾病的背景下研究获得,尚未研究其作为LNP组分在体内引发的免疫反应。Kaur 等人发现,与不含胆固醇的脂质体相比,含胆固醇脂质体被巨噬细胞摄取率较低。在免疫反应方面,早期(免疫后12天)IgG反应因胆固醇的加入而降低。胆固醇衍生物可以替代 LNP-mRNA 制剂中的胆固醇,并且在某些实验背景下可能会产生更高的转染效率和体内蛋白质表达 。然而,尚不清楚这些观察结果是否涉及免疫途径。在脂质体中引入胆固醇对免疫反应的影响(左),筛选可提升LNP制剂转染效率的胆固醇衍生物(右)有研究保持可电离脂质(C12-200和cKK-E12)和聚乙二醇化脂质的量恒定,用β-谷甾醇替代胆固醇和不同比例的融合脂质DOPE来优化mRNA递送效率。对于髓树突状细胞 (BMDC)的激活和T细胞增殖来说,不同细胞系表现出不同的转染效率和激活程度。在LNP中引入胆固醇衍生物β-谷甾醇可刺激T细胞增殖因此,在 LNP 背景下,胆固醇及其衍生物的生理作用尚未得到充分定义。此外,有人还发现如果LNP制剂配方中包含过量胆固醇会造成LNP核心中形成不容性胆固醇结晶。Toll 样受体 (TLR) 的激活会改变巨噬细胞中的胆固醇代谢,导致胆固醇合成和输入增加 。LNP 直接摄入胆固醇和LNP 激活 TLR 都会重塑巨噬细胞中的胆固醇代谢并改变其免疫功能。胆固醇免疫代谢参与先天性和适应性免疫反应,对 LNP 中的胆固醇成分如何促进其免疫调节活性的需要更进一步的研究。2.4 聚乙二醇脂质脂质纳米颗粒和其他纳米载体中的聚乙二醇化被广泛用于提高其稳定性和血浆半衰期。然而,无论是预先存在的还是从头形成的PEG 抗体都可以通过与纳米颗粒表面结合来诱导超敏反应并加速血液清除,从而导致补体系统的激活。Senti 等人发现PEG 抗体触发的补体激活会损害脂质体双层/表面完整性,导致药物过早释放或将其 mRNA 内容物暴露于血清蛋白。抗PEG抗体还可以诱导补体片段沉积到聚乙二醇化脂质纳米颗粒的表面上并诱导液相补体激活产物的释放。新冠mRNA苗接种会提升血清中PEG 特异性抗体滴度,并且 PEG 特异性抗体的增加与反应原性和人体血液中 PEG 颗粒-白细胞复合物的增加有关。此外,还有人证明不同形式的 PEG(例如,未结合的 PEG 、 新冠mRNA疫苗、其他脂质体制剂中的 PEG-脂质)不同程度地激活嗜碱性粒细胞,并且这些差异可能与过敏反应相关的免疫反应有关系。PEG 抗体通过补体损害聚乙二醇化LNP完整性(左); LNP- mRNA 疫苗提升血清PEG 抗体水平(右)由于环境暴露,人类通常具有低水平的聚乙二醇 (PEG) 抗体。考虑到PEG抗体触发的免疫反应风险,人们正在努力寻找比 PEG 具有更少免疫介导作用的替代聚合物,但迄今为止测试的许多聚合物并不具有免疫惰性。三、小结如下表总结,目前批准用于临床的 LNP 制剂的每种成分可能都有助于整体免疫原性,但是,这背后详细的机制和相互作用在很大程度上尚未得到充分探索,特别是对于脂质特定结构(例如脂质“尾部”的数量、“尾部”的长度以及线性头基与杂环)与对LNP 制剂免疫原性的整体影响。对于每种脂质成分触发免疫反应的机制进行重复的研究,才能不断提升RNA-LNP疗法的安全性,更好地优化筛选下一代递送系统的LNP制剂配方。LNP 制剂的脂质成分以及所涉及的潜在免疫反应参考文献[1] Chen SP, Blakney AK. 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