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近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。我们将以系列文章的形式对这篇重量级综述进行分享。 因临床致病性小、多种组织嗜性和长期的转基因表达，腺相关病毒（AAV）已成为临床基因治疗的重要递送工具。重组腺相关病毒（rAAV）是在非致病野生型AAV基础上改造而成的特异性更强的基因载体，已成为一种治疗各种疾病的工具。然而，随着rAAV作为治疗手段的广泛使用，需求的增加为现有的生产工艺带来了挑战。尽管已有八种基于rAAV的基因治疗产品获得了监管机构的批准，但人们仍然对在人类中安全使用高剂量的病毒疗法存在担忧，这些担忧包括免疫反应和不良反应，如基因毒性、肝毒性、血栓性微血管病和神经毒性。 本文针对性介绍了基因治疗的背景和AAV生物学，后续将持续推出：  AAV载体开发策略和生产工艺； rAAV在正在进行的临床试验中的应用，这些试验涉及眼科、神经学、代谢、血液学、神经肌肉和心血管疾病以及癌症。  由rAAV引发的免疫反应，相关的副作用，以及减轻这些反应的策略。 希望通过讨论该领域的最新进展和当前挑战，能为rAAV基因治疗领域中的研究人员和临床医生提供有益的帮助。 什么是基因治疗 基因治疗是一种开创性的疾病治疗方法，通过采用非病毒或病毒载体在目标细胞内修改基因表达的一系列策略来治疗遗传疾病。一种常见的策略是基因替代疗法，即向活细胞引入有缺陷基因的功能拷贝。2017年，这一策略达到了一个重要的里程碑，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个基因治疗产品Luxturna，这是一种用于治疗Leber先天性黑蒙症2型（LCA2）的基因替代疗法。另外，基因沉默疗法旨在抑制或沉默目标基因，主要是通过RNA干扰。例如，Patisiran，一种小干扰RNA，用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性。另一种策略是基因组编辑，通过基于簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的技术来直接修改体细胞基因组，或者进行RNA编辑。此外，基因表达还可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰和微小RNA调控等表观遗传方法来改变。这种方法具有可逆和多功能的优势，允许根据疾病进展和治疗反应进行调整。创新策略，如利用抑制性tRNAs来实现过早终止密码子的读通，为挽救病理性无义突变并恢复基因功能提供了途径，且可以在内源性调控下实现。 无论选择哪种策略，基因治疗都可以在体外或体内实施。体外基因治疗涉及提取患者的细胞，对其进行遗传修饰，然后将它们重新回输至患者体内。相比之下，体内基因治疗直接将遗传物质递送到目标组织。到目前为止，总共有14种体外和29种体内基因治疗获得了FDA批准（图1）。在这些获批的基因治疗中，17种是基于非病毒的，而26种是基于病毒的。已报道有多种病毒载体可用于体内基因治疗，包括腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ad）、逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒（HSV）等，其中AAV载体已成为临床试验和FDA批准应用中的首选。这是因为它们具有广泛的组织嗜性、相对良好的安全性和多样化的制造工艺。重要的是，AAV是非致病性的，很少整合到宿主基因组中，并且可以维持长期的转基因表达。此外，基于某些AAV血清型的载体天然能够高效地进入细胞和表达转基因，这增强了转导效率。 图1 获批的基因治疗产品和递送平台。基因治疗产品通常针对以下两种情况开发：（1）体外基因治疗，即分离受影响的患者细胞，在细胞培养过程中进行基因修饰、扩增、富集，然后重新输回患者体内，作为活体药物发挥作用（例如，CAR-T细胞、Lyfgenia、Casgevy）；（2）体内基因治疗，直接给患者施用以实现治疗效果（例如，Gendicine、Kynamaro、Imlygic、Luxturna、Onpattro）。基因治疗药物的递送平台主要分为两种：基于病毒和非病毒的。基于病毒的基因治疗利用病毒作为基因递送载体，包括AAV（腺相关病毒）、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒。基于非病毒的基因治疗包括反义寡核苷酸、siRNA（小干扰RNA）和基于细胞的CRISPR基因组编辑。CAR-T（嵌合抗原受体T细胞治疗），SMA（脊髓性肌肉萎缩症），AADC（芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症），DMD（杜氏肌营养不良症），LCA2（Leber先天性黑蒙症2型），hATTR（遗传性转甲状腺素淀粉样变性）。*表示非FDA批准的基因治疗。 AAV的研究历程 在20世纪60年代中期，AAV首次被发现，最初被当作是腺病毒培养中的污染物。野生型腺相关病毒（wtAAV）是一种无包膜病毒，含有一个单链DNA（ssDNA）基因组，在两端都有反向末端重复序列（ITRs）（图2）。对AAV生物学的研究导致了wtAAV2基因组的成功克隆和测序。在1990年代和2000年代，鉴定出具有不同组织趋向性的多种AAV血清型，从而引入了靶向基因递送方法的途径。研究报告称，wtAAV基因组可以整合到宿主染色体中，促进稳定、长期的转基因表达。在2000年代，开展了工程化AAV衣壳的工作，以增强组织特异性和转导效率，提高rAAV的安全性，这促进了基于rAAV的临床试验的成功，尤其是对于单基因罕见病，最终导致rAAV基因治疗产品的获批。同时，开发了各种扩大rAAV制造规模的方法，引发了对基于rAAV的基因治疗的兴趣。最近，CRISPR技术的出现彻底改变了基因治疗的格局，通过rAAV的递送可实现精准的基因编辑。 图2 腺相关病毒（AAV）生物学研究和基因治疗发展的历史里程碑。几十年来对AAV生物学的研究导致了对其结构、生物学、载体学和基因治疗应用的理解上的关键进展。这些进展为基于rAAV的基因治疗成功进行临床试验和获得监管批准铺平了道路。 rAAV独特的属性，包括小尺寸、非致病性、多种组织嗜性、稳定的转基因表达、复制缺陷、可工程化的衣壳，以及适配多种载荷递送的能力，使得基于rAAV的基因治疗成为了一度无法治疗的遗传性疾病的潜在治疗方法。尽管早期取得了一些成功，但众多的顾虑和挑战限制了其在复杂疾病中的广泛应用。这些顾虑和挑战包括有限的载体容量、对高剂量系统给药的免疫反应、潜在的基因毒性、实现组织特异性的挑战，以及制造的复杂性。在这里，我们描述了作为rAAV基因治疗基础的AAV生物学和工程学，讨论了AAV载体学的关键原则和当前的制造方法，概述了rAAV基因治疗在治疗多种人类疾病方面的临床应用和挑战。 AAV生物学 作为天然病毒的AAV 结构和基因组。AAV具有由60个单体组成的二十面体衣壳和一个4.7 kb的单链DNA（ssDNA）基因组，两端各有145 bp的T形反向末端重复序列（ITR）（图3）。衣壳由病毒蛋白（VPs）VP1、VP2和VP3以1:1:10的比例组装而成。VP3由保守的β-链组成，这些链通过表面暴露的可变环连接。这些结构塑造了AAV的表面形态，并决定了AAV血清型特异性功能。野生型AAV基因组包含两个主要的开放阅读框，编码四个非结构复制基因（Rep）和三个结构衣壳基因（Cap），以及一个参与衣壳组装的组装激活蛋白（Assembly-Activating Protein, AAP）。此外，膜相关辅助蛋白（MAAP）的编码框在Cap基因不同阅读框内，其功能尚不清楚。ITRs主要作为病毒复制的起点，并提供包装信号。 图3 野生型AAV的基因组结构特征示意图。ITR: inverted terminal repeat, 145bp, AAV基因组复制、宿主细胞染色体整合和AAV病毒包装的顺式信号; Rep: 反式调节因子，调节AAV基因组复制、宿主细胞染色体整合；CAP:  组成病毒衣壳的蛋白，三种结构蛋白由不同的翻译起始位点形成; p5, p19是调控Rep蛋白表达的启动子，p40是调控Cap蛋白表达的启动子; AAP: AAV accessory protein, 组装激活蛋白；MAAP: membrane-associate protein, 膜相关辅助蛋白。 血清流行率和非致病性。不同的野生型AAV血清型主要分离自人类和非人灵长类动物（NHPs），以VPs和ITRs的变化为特征。人类血清流行病学研究表明，相当一部分人群拥有针对多种AAV血清型的中和抗体（NAbs）。一项对888份健康志愿者的人类血清样本的研究发现，针对AAV2的NAbs最为普遍，其次是AAV1、AAV7和AAV8。另一项研究显示，在552份人类血清样本中，除AAV2之外，针对最普遍的血清型NAbs是AAV1（74.9%）、AAV6（70.1%）、AAV5（63.9%）、AAV8（60.4%）和AAV9（57.8%）。 作为细小病毒科（Parvoviridae）中的依赖性细小病毒（Dependoparvovirus），wtAAV不能独立复制并产生新的病毒颗粒，其复制需要来自辅助病毒（如腺病毒或单纯疱疹病毒）的必须基因，例如腺病毒的E1、E2a、E4和VA RNA基因。值得注意的是，在体外感染中，大约0.1%的野生型AAV2基因组整合到19号染色体长臂上的一个特定区域（19q13-qter），这个区域被称为AAVS1位点。虽然AAV被认为是非致病性的，但最近的研究报道AAV2与全球儿童中未解释的急性肝炎有关。没有直接证据表明AAV2如何引发肝炎，但已提出对AAV2的异常免疫反应可能导致肝毒性。然而，这些研究承认COVID-19感染可能是一个促成因素，并报告称大多数急性肝炎病例在没有长期免疫抑制的情况下得到了解决。 作为基因治疗递送载体的rAAV 载体学和组织嗜性。自然存在的野生型AAV正在迅速进化，产生了广泛的基因多样性。在过去的二十年中，至少从腺病毒库、人类/非人灵长类动物组织以及其他哺乳动物或非哺乳动物物种中鉴定出了12种AAV血清型和超过1000种变体。这些血清型对各种细胞或组织有不同的偏好，被称为嗜性（表1）。AAV血清型之间的基因组差异主要位于病毒衣壳序列的可变区域，特别是VP3，它在决定嗜性方面起着至关重要的作用。然而，许多其它过程和与宿主蛋白的相互作用可能会影响嗜性，包括细胞表面受体、细胞内摄取、细胞内运输、入核、病毒脱壳、第二链DNA合成以及基因组的环化和串联化。 表1 人类天然AAV受体和组织特异性总结‘ 野生型AAV2基因组最初在20世纪80年代被克隆，是rAAV的模板。rAAV拥有与wtAAV相同的衣壳序列和结构，但不包含任何wtAAV蛋白编码序列，而是整合了治疗性基因表达盒，这些表达盒的大小位于4.7 kb的包装能力范围内。rAAV基因组中唯一的病毒元素是ITRs。rAAV主要是通过在HEK293细胞中瞬转GOI质粒、Rep/Cap质粒和腺病毒辅助基因质粒来生产的（图4）。具有AAV2 ITRs的rAAV基因组可以用其它AAV血清型的衣壳包装，以改变它们的转导特性。 图4 rAAV的生产过程示意图。 rAAV的转导途径。虽然对野生型AAV生物学的理解有所提高，但rAAV如何与细胞表面相互作用并将外源基因递送到宿主细胞核的机制仍然不甚清楚。越来越多的研究表明，病毒衣壳最初通过主要受体如糖链、糖缀合物或唾液酸粘附到细胞表面，然后与共受体蛋白相互作用。例如，rAAV2与肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）结合，rAAV1、rAAV4和rAAV5主要与唾液酸相互作用，而rAAV9与N-连接的半乳糖相互作用。衣壳上不同的结合位点被认为决定了其嗜性，因此正在围绕这些位点努力改造AAV变体，以增强对特定细胞或组织的转导能力。近期的全基因组筛选研究鉴定了促进rAAV转导的新宿主蛋白，包括被命名为AAV受体（AAVR）的I型跨膜蛋白KIAA0319L。另一种普遍存在的宿主蛋白，G蛋白偶联受体108（GPR108），在多种rAAV血清型的转导中发挥作用。虽然在体内敲除AAVR和GPR108会减少转导，但细胞表面结合大部分不受影响，这表明这些宿主蛋白主要在附着后对转导过程有所贡献。 在与细胞表面结合后，rAAV通过内吞作用内化（图5），这一过程可能因细胞类型和rAAV血清型而异。在内体中的rAAV颗粒会经历pH依赖的构象变化，然后通过高尔基体网络进行转运。rAAV颗粒从内体和高尔基体网络中逃逸，然后通过核孔复合体进入细胞核。一旦病毒颗粒进入细胞核，ssDNA基因组被释放，并通过所谓的第二链合成过程转化为双链DNA（dsDNA）。然后从基因组3'端的自启动ITR开始启动转录。通过突变内部ITR基序，可以将基因组制成dsDNA结构，与单链rAAV（ssAAV）基因组相比，这种设计复制速度更快，转导效率更高。然而，这种自互补AAV（scAAV）的包装能力只有ssAAV的一半。dsDNA基因组随后经历环化和串联化，稳定了载体基因组，使其在有丝分裂后细胞中以质粒形式持续存在。值得注意的是，ITR序列也可以作为重组元件，促进载体基因组的重组。rAAV转导途径涉及多个细胞事件，可能在任何步骤失败或被宿主破坏，从而削弱或阻止转导。因此，完全理解这一途径将有助于识别影响rAAV转导效率的其他关键宿主因子。 图5 AAV载体入侵细胞和细胞内运输的模型。在与受体和辅助受体的相互作用下，以及在必需的宿主细胞组分（如AAV受体，1）的帮助下，AAV通过内吞作用（2）进入目标细胞，并在一个内吞囊泡内通过逆行运输向高尔基体网络移动（3）。内吞体的酸化以及可能的其他因素触发衣壳内的重大结构变化，暴露出一个磷脂酶A2（PLA2）催化域，允许病毒颗粒逃逸到细胞质中（4）。然后AAV病毒颗粒可以被泛素化以进行降解（5a），或者通过核孔复合体被导入到细胞核中（5b）。在细胞核中，它先在核仁中积累，然后移动到核质中，在那里释放单链基因组（6），并转换成可以在细胞核中以环形游离体或线性或游离体连接体的形式持久存在的双链DNA（7），从而引起基因表达（8）和蛋白质合成（9）。 基因治疗作为一种革命性的治疗手段，对多种遗传性疾病有着强大潜力。从最初的AAV发现，到rAAV载体的设计和优化，再到其在临床试验中的广泛应用，这一领域已经取得了显著进展。然而，rAAV基因治疗仍面临诸多挑战。本文简要介绍了AAV的基本概念。后续我们将持续推出关于rAAV基因治疗的深度剖析文章，带您深入探索这一领域的奥秘与挑战，敬请关注！ 参考资料： 1.     https://doi.org/10.3390/v16030442 2.     https://doi.org/10.1038/s41392-024-01780-w 关于派真生物

摘要：重组腺相关病毒（AAVs）已经成为有前途的基因传递载体，导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基于AAV的基因疗法，欧洲药品管理局（EMA）也批准了一种。尽管AAV是多项临床试验中治疗性基因转移的领先平台，但宿主对AAV载体和转基因的免疫反应阻碍了它们的广泛应用。多种因素，包括载体设计、剂量和给药途径，共同影响了AAVs的整体免疫原性。对AAV衣壳和转基因的免疫反应涉及最初的先天感知。随后，先天免疫反应触发适应性免疫反应，以引起针对AAV载体的强烈和特定的反应。AAV基因疗法的临床试验和临床前研究提供了有关与AAV相关的免疫介导毒性的重要信息，但研究表明，临床前模型未能准确预测基因传递在人类中的结果。本综述讨论了先天和适应性免疫反应对AAVs的贡献，强调了挑战和潜在策略，以减轻这些反应，从而增强AAV基因疗法的治疗潜力。 1.引言 近年来，使用重组腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗取得了令人鼓舞的成果。除了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的三种AAV基因治疗产品Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX，分别用于治疗Leber先天性黑蒙、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和血友病B型，欧洲药品管理局（EMA）最近还批准了一种AAV5-因子8载体（Roctavian）用于治疗血友病A型患者。目前，正在进行大量的AAV基因治疗临床试验，针对多种疾病，包括血友病、神经退行性疾病和肌营养不良症。然而，阻碍这些试验临床成功的一个因素是AAV的免疫原性，这在该领域仍然是一个未解决的挑战。 已经鉴定并分类了13种不同的AAV野生型血清型和100多种衣壳变体。AAV最初在1965年作为腺病毒（Ad）制剂中的污染物被发现，是自然存在于多种脊椎动物物种中，包括人类和非人灵长类（NHPs）的细小病毒，但从未与任何已知疾病相关联。AAV迅速成为体内基因传递的首选载体，并携带一个由反向末端重复序列（ITRs）包围的转基因表达盒，而不是病毒蛋白编码序列。这些ITRs源自野生型AAV2，是复制和包装所需的唯一顺式作用序列，但它们是非编码区域。AAV作为染色体外DNA存在，能够在非复制细胞中实现稳定转基因表达。尽管AAV的免疫原性较弱，但在AAV基因治疗临床试验中观察到的免疫反应限制了其治疗应用。由于AAV载体不包含任何表达的病毒基因组，因此在基因转移过程中引入的唯一外来抗原来源是病毒衣壳和转基因盒。然而，宿主对AAV载体和传递的转基因的免疫反应影响了有效和稳定的转基因表达。 已经做出了重大的研究努力来评估与AAVs相关的免疫介导毒性。免疫系统的主要作用是识别自身与非自身，以保护免受病原体侵害。包括补体系统在内的先天免疫反应可以被AAV衣壳和AAV基因组以及其他宿主特异性因素触发。随后的激活信号有助于招募抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞，这些细胞负责介导适应性免疫。许多报告已经剖析了适应性免疫反应对AAVs的作用。由于AAV在人类中的广泛传播，许多人群中普遍存在针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体（NAbs）。这些抗体可以阻止AAV转导目标细胞。此外，还可能针对传递的转基因产生抗体，这可能中和可溶性转基因产品并干扰成功的基因治疗。此外，针对衣壳的细胞介导的细胞毒性T细胞反应影响转基因表达，并导致转导细胞的清除，阻碍治疗效果。近年来，接受高系统剂量AAV治疗的SMA1、杜氏肌营养不良症（DMD）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）患者经历了不同程度的不良反应。这些结果在很大程度上可以归因于对载体的先天和适应性免疫反应。因此，了解免疫系统对AAV的反应对于提高AAV基因治疗的安全性和治疗效果至关重要。 AAV载体激活宿主免疫反应取决于多种因素，包括给药途径和剂量，宿主细胞和体液遇到载体的部位，载体组分以及转基因产品。直接注射到视网膜下空间，如第一个FDA批准的AAV载体的途径，导致较少暴露于血浆蛋白、循环抗体、血细胞和组织驻留的吞噬细胞。注射到其他部位，如中枢神经系统（CNS），可能在一定程度上限制了血清抗体在目标细胞进入之前的暴露。相比之下，AAV的静脉注射使载体广泛暴露于血细胞、血浆蛋白，包括抗体，以及广泛的组织驻留细胞，如肝脏内的Kupfer细胞。最大限度地发挥潜在的载体-抗体相互作用导致降低基因治疗的有效性或安全性。几乎所有衣壳类型和给药途径，广泛生物分布的AAV载体基因组到肝脏，取决于所给剂量。因此，虽然直接注射途径可能在很大程度上绕过了预先形成的抗体，但对载体组分的新的免疫反应可能仍然很强。最后，某些宿主反应仅在非常高剂量的静脉AAV中观察到，这表明这些宿主反应的阈值效应。这表明在评估AAV基因治疗的免疫反应时，需要考虑多种因素，而不仅仅是AAV载体的组成部分。 在这篇综述中，我们提供了针对AAV衣壳和转基因的先天和适应性免疫反应的概述，并讨论了规避这一主要障碍的策略，以发展成功的基于AAV的治疗性基因传递平台。 2.对腺相关病毒（AAVs）的免疫反应 免疫反应可以分为先天和适应性免疫反应。在以下部分中，我们简要概述了AAVs刺激的先天和适应性免疫途径，并讨论了AAV感染响应中激活的机制，这些机制导致转基因表达的抑制（图1）。 图1 AAV基因治疗中的免疫反应。AAV衣壳或引入的转基因可以被先天免疫系统识别，导致细胞因子产生、先天免疫细胞激活、补体激活，并为适应性免疫反应做好准备。在MHC I分子上的衣壳肽段或传递的转基因呈递导致CD8+ T细胞激活和转基因表达的清除。在MHC II上的抗原呈递激活CD4+ T细胞，这导致细胞因子的产生，并进一步诱导体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。Treg的激活导致细胞和体液免疫反应的抑制以及转基因表达的长期维持。AAV：腺相关病毒，APCs：抗原呈递细胞，FoxP3：叉头框蛋白3，GzmB：颗粒酶B，IFNγ：干扰素γ，MHC：主要组织相容性复合体，NAbs：中和抗体，PFN：穿孔素，rAAV：重组腺相关病毒，TCR：T细胞受体，TLR9：Toll样受体9，TNFα：肿瘤坏死因子α，Tregs：调节性T细胞。 2.1.对AAV的先天免疫反应 暴露于病原体时，先天免疫系统以一种非特异性方式被触发，并随后刺激激活更特异性的适应性免疫反应。在本综述中，我们简要讨论了感知AAV载体元素的关键参与者，这些元素导致先天免疫信号级联的激活。 2.1.1.病原体相关分子模式和模式识别受体 具有独特病原体相关分子模式（PAMPs）的外来病原体被高度表达在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上的模式识别受体（PRRs）识别。PRRs已被分类为不同的家族，即Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）和DNA传感器。相应的PRRs识别PAMPs主要激活信号通路，如通过适配蛋白如MyD88激活NF-κB。这些信号级联诱导主要组织相容性复合体（MHC）基因表达和促炎细胞因子或Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）的分泌。分泌的IFNs和细胞因子反过来介导表达限制病毒复制的基因，并刺激适应性和记忆免疫反应。适应性抗衣壳体液和细胞毒性免疫反应已被证明在体内受到限制，通过抑制先天免疫激活途径。 TLR介导的信号，触发先天免疫和随后激活适应性免疫反应，是重要的AAV感知机制。TLRs主要表达在免疫细胞上，如DCs和巨噬细胞，以及一些非免疫细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。细胞表面TLRs识别病原体的膜成分，如脂蛋白和脂质，细胞内TLRs识别病原体衍生的核酸。研究表明，细胞内TLR9有助于对转基因和衣壳的免疫反应。除了ITRs，插入的转基因、启动子序列和载体表达的RNA可能包含TLRs识别的炎症信号。存在于Kupfer细胞或DCs中的内体TLR9，特别结合双链DNA（dsDNA）载体基因组中的未甲基化CpG二核苷酸。研究表明，密码子优化，一种提高转基因表达的技术，可能增加AAV载体中的CpG基序。TLR9的参与有利于激活AAV特异性细胞毒性CD8+ T细胞反应，由于MHC I上抗原呈递的增加。由IFN诱导的免疫反应导致AAV在小鼠中传递的转基因表达的丧失。此外，TLR9/MyD88途径不仅对激活AAV衣壳的CD8+ T细胞反应至关重要，而且对肝脏和肌肉定向的转基因。研究表明，空AAV衣壳本身也可以触发先天免疫反应，可能通过非实质肝细胞表面的TLR2介导。或者，一些研究报告称，抗AAV衣壳免疫球蛋白（Ig）G2抗体的产生不依赖于任何特定的TLR，而是依赖于B细胞中固有的MyD88信号。此外，其他研究表明，自互补AAV（scAAV）载体与单链AAVs（ssAAVs）相比，表现出对转基因的增加的先天免疫反应，可能由于TLR9/MyD88信号级联的增强激活。 细胞质DNA传感器，如环状GMP-AMP合成酶（cGAS），被AAV基因组激活。AAV转导可能导致细胞将其线粒体DNA释放到细胞质中，从而激活细胞质DNA传感器。另一种可能性是，AAV衣壳的蛋白酶体降解在进入后导致基因组暴露，然后可能被DNA传感器感知。最近的研究指出dsRNA传感器在先天感知AAVs中的作用。ITRs的内在启动子活性可以在细胞质中产生dsRNA中间体，这可能刺激黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因（RIG）传感器。在AAV转导人肝细胞后，一些人类受试者观察到MDA5和RIG-1的上调，触发IFN-β的产生。在灵长类视网膜中AAV转导后，也观察到高水平的MDA5和RIG-1。需要进一步的研究来阐明dsRNA形成在AAV转导细胞中启动适应性免疫反应中的作用。 2.1.2.AAV与补体系统 补体系统由多种可溶性和膜结合蛋白组成，是无细胞先天免疫系统的一部分。它可以通过三种不同的途径被激活——经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径与抗体结合到抗原靶标上协同工作，而替代途径是通过外来大分子与循环补体成分的相互作用而被激活，因此不需要预先形成的抗体。这三条途径汇聚在补体成分C3转化酶上，它将C3蛋白裂解为功能性亚基C3a和C3b，最终形成终端膜攻击复合体。 AAV介导的补体激活成为了许多近期研究的焦点。一项研究表明AAV衣壳与C3相互作用，导致巨噬细胞中AAV2的摄取增加，并随后上调了如IL-8、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白等细胞因子。缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠对AAV没有表现出强烈的体液免疫反应，这表明补体系统在产生AAV特异性抗体中发挥作用。 在DMD和SMA1的临床试验中，接受静脉AAV剂量>1×10^14病毒基因组(vg)/kg的患者表现出补体激活和血栓性微血管病(TMA)的症状。此外，最近在一份新闻稿中报告，两名接受5×10^13 vg/kg AAV-LK03的甲基丙二酸血症(MMA)患者在最近出现了TMA。这些患者中替代补体途径的激活似乎导致血小板激活并与白细胞和内皮细胞结合，从而触发消耗性血小板减少症、微血管性贫血和播散性血管内凝血，这由D-二聚体和纤维蛋白裂解产物的升高证明。在一些患者中，这些机制可以发展成一系列不同程度的症状，如呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）在AAV给药后（NCT03362502和NCT03368742）。这种综合征通常在输注后5-10天发展。Eculizumab的治疗已在AAV接受者中用于TMA综合征，以中断TMA级联。然而，这些试验的结果尚属初步，需要进一步调查。 2.2.适应性免疫反应 除了启动对AAV的初级免疫反应外，先天免疫还为适应性反应做好准备。适应性免疫反应诱导抗原特异性反应，同时创建免疫记忆。适应性免疫由两个主要机制组成：通过B细胞和抗体的体液免疫，以及通过细胞毒性CD8+ T细胞的细胞免疫。CD4+辅助T细胞在体液和细胞免疫中都是关键的中介，通过激活B细胞和细胞毒性T细胞。 在初次接触AAV后，先天免疫细胞通过PRRs的表达和细胞因子的释放被广泛激活。在长期接触AAV后，如DCs的APCs通过转导或吞噬作用摄取AAV颗粒，并向B或T细胞激活呈现处理过的抗原。B细胞识别可溶性或呈现的抗原并产生抗体。T细胞的激活涉及辅助CD4+细胞，它们进一步诱导炎症反应和激活CD8+细胞毒性T细胞，导致去除AAV感染的细胞。在炎症信号解决后，调节性T细胞抑制免疫反应以恢复稳态。以下部分将强调适应性免疫反应在AAV基因治疗中的作用。 2.2.1.体液免疫反应 体液免疫是通过产生针对特定抗原的抗体来介导的。抗体通过多种机制发挥作用：NAbs阻止病原体进入细胞，覆盖在病原体表面的抗体将它们标记为吞噬作用，或抗体结合导致经典补体途径激活的开始。 体液免疫反应，特别是NAbs的产生，对AAV成功基因传递构成了最有效的障碍之一。AAV转导后，APCs向CD4+辅助T细胞呈现抗原，这导致B细胞成熟、扩增、类别转换，并增加针对AAV衣壳的抗体产生。 在人类中，抗AAV NAbs（以其损害AAV感染或病理学的能力为特征）通过自然接触野生型AAVs形成。根据AAV衣壳变体的不同，2-60%的人类血清含有限制AAV基因治疗应用的抗体。其中，抗AAV2和AAV1 NAbs是AAV衣壳变体中最常见的NAbs。然而，抗AAV NAbs通常在多个衣壳变体之间高度交叉反应，可能由于AAV衣壳变体之间的高度同源性。一些研究表明，在AAV给药后，产生的抗体对其他未给药的AAV衣壳变体也具有交叉反应性。对AAV NAbs的表征显示IgG1是NAbs中的主要亚类，其次是IgG2和IgM。接受AAV基因治疗的患者也会发展出特异性抗体，防止AAV的后续再剂量。在一项研究中，NHP中AAV8的再给药没有导致转基因表达增加，但观察到抗AAV抗体水平增加。然而，目前的治疗方法表明，由于载体稀释或丢失，可能需要在新生儿、儿童和成年退行性疾病患者中重复给药AAV。 结合抗体（BAbs）参与免疫细胞的招募和触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。一项研究报告称，在体外存在BAbs的情况下增加了衣壳内化。此外，与接受NAbs免疫的小鼠相比，接受BAbs免疫的小鼠显示出更有效的肝脏转导。BAbs在AAV免疫反应中的作用目前正在进一步调查中，可能会突出BAbs可能的作用以及重新考虑筛选技术的必要性。 大多数系统性（静脉内）AAV基因治疗的临床试验已经排除了针对使用的血清型的显著抗衣壳抗体的患者。例如，BioMarin AAV5-FVIII载体（Roctavian）的关键试验排除了可检测到抗AAV5 NAbs滴度和抗AAV5总结合抗体（TAb）滴度的患者。目前测量抗衣壳抗体的检测包括TAb检测和NAb检测，但NAb检测和TAb检测都难以标准化。NAb检测是基于细胞的或基于小鼠的，因此昂贵、耗时，并有低估TAb滴度的风险。由于TAb检测筛选出针对AAV衣壳的所有抗体，包括中和和非中和的，所得的滴度更为保守和安全。此外，FDA和EMA已经批准了不同的衣壳血清型，每种产品都需要开发不同的抗AAV抗体检测。例如，AAV9的伴随诊断检测不适用于AAV1、AAV2或AAV5。最近的一项研究建立了基于Meso Scale Discovery（MSD）的检测，用于定量BAbs和NAbs，允许快速和定量评估AAV特异性抗体。 除了体液免疫反应外，T细胞介导的反应在限制AAV基因治疗中也起着重要作用，如下一节所强调的。 2.2.2.衣壳特异性T细胞反应 T细胞反应由多种T细胞亚群介导。效应CD4+ T细胞通过细胞因子产生诱导炎症和免疫激活。而细胞毒性CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素和炎症细胞因子介导感染细胞的靶向杀伤。此外，Tregs通过与免疫细胞的直接相互作用或产生免疫抑制细胞因子，防止超免疫激活，并将免疫反应恢复到稳态。 在动物研究中，由AAV引起的细胞介导的免疫反应导致转基因表达丧失并不普遍观察到。启动T细胞反应需要通过APCs进行抗原呈递。内源性或细胞内抗原在MHC I上呈递，而外源性或细胞外抗原在MHC II上呈递。在某些APCs中，交叉呈递允许通常在MHC II上展示的外源性抗原在MHC I上呈递。研究表明，浆细胞样DCs、常规DCs和CD4+ T细胞之间的合作导致AAV颗粒在MHC I上的交叉呈递，随后激活CD8+ T细胞。细胞介导的免疫反应首次在血友病临床试验中观察到，其中AAV2表达人类凝血因子9（hFIX）的肝脏传递导致肝脏转氨酶升高和转基因表达丧失。后续研究证实了衣壳特异性CD8+ T细胞的存在。衣壳特异性CD8+ T细胞的扩增可能清除AAV转导的细胞，导致转基因表达丧失和靶器官炎症。此外，APCs在MHC II上呈递衣壳肽段，导致CD4+ T细胞激活。CD4+ T细胞的激活导致细胞因子的产生，进一步激活体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。在随后的研究中，接受高剂量AAV8-hFIX的人类受试者观察到衣壳特异性T细胞反应，导致肝脏酶升高和hFIX表达下降。类固醇治疗降低了肝脏酶并部分恢复了hFIX表达。此外，中等剂量的AAV给药导致可检测到循环的衣壳特异性T细胞，但没有观察到转氨酶升高和转基因表达丧失。进一步的研究表明，衣壳特异性免疫反应是剂量依赖性的，低剂量的AAV载体给药更有可能引起可由类固醇管理的轻度炎症。额外的表征显示衣壳特异性CD8+ T细胞在体外通过MHC I上的衣壳肽段交叉呈递后消除人类肝细胞。 与其他试验观察到的T细胞免疫反应不同，特别是在肌肉导向的试验中，并没有清除转基因表达。包括在大多数肌肉传递试验中使用非分泌性转基因，以及反应性T细胞的凋亡等因素，使得分析这些结果变得复杂。在α1-抗胰蛋白酶（AAT）缺乏症和Glybera研究中，除了CD8+ T细胞外，还报道了CD4+叉头框P3+（FoxP3）T细胞的浸润。同样，在DMD临床试验中限制或未观察到衣壳特异性T细胞反应。由于Tregs具有抑制免疫反应的能力，因此在局部肌肉导向的AAV基因治疗中诱导免疫耐受和转基因的长期表达归因于Tregs。尽管如此，肢带型肌营养不良的AAV基因治疗导致了衣壳特异性T细胞反应。 需要额外的研究来进一步表征T细胞免疫反应以及Tregs在诱导免疫耐受中的作用，这需要合适的动物模型。一些研究已经集中在模仿在动物中观察到的人类免疫反应。向AAV衣壳引入卵清蛋白免疫优势表位并未能触发特定的杀伤。然而，将扩增和激活的衣壳特异性T细胞转移到小鼠体内，导致转基因表达减少和转导细胞的丧失。此外，用表达VP1衣壳蛋白的AAV或腺病毒免疫小鼠，导致衣壳特异性T细胞的诱导。另一项研究利用嵌合抗原受体（CAR）技术创建衣壳特异性T细胞。AAV-CAR T细胞在体外对多种AAV衣壳变体有反应，并在体内减少了转基因表达。然而，AAV的趋向性和免疫反应在人类和小鼠中并不相同。需要进一步的研究来创建能够准确模拟人类AAV特异性T细胞反应的动物模型。 除了在引入AAV后观察到的细胞介导反应外，免疫记忆在第一次接触AAV后形成，无论是通过AAV基因治疗还是暴露于野生型AAV。这种记忆反应的激活不需要先天免疫反应。与体液免疫类似，衣壳特异性T细胞反应在年幼儿童中较少见，可能在婴儿期在感染野生型AAV后产生。研究表明，在二次AAV暴露后，衣壳特异性记忆T细胞会产生细胞因子并获得细胞毒性表型。一些研究对健康人类受试者的T细胞反应进行了表征，并报告了10-100%的人类受试者具有针对多种AAV血清型的功能性循环衣壳特异性T细胞。进一步分析证实，大多数AAV特异性CD8+和/或CD4+ T细胞属于中央记忆亚群。尽管AAV特异性免疫反应对基因治疗和再剂量研究至关重要，但传递的转基因可以引起免疫反应。下一节将讨论针对转基因的免疫反应。 3.针对转基因的免疫反应 传递的转基因产品通常包含外来抗原，因此它们可能诱导体液或细胞免疫反应，中和分泌性转基因并清除转导细胞。在暴露于AAV传递的转基因后，APCs通过转导或吞噬作用获得蛋白质产物，并在MHC I或MHC II分子上呈现处理过的抗原，分别导致细胞或体液免疫反应。针对转基因的免疫反应持续到转导细胞被清除，或由Tregs或T细胞耗竭抑制免疫反应。然而，与腺病毒和慢病毒载体相比，由于AAV对APCs的转导效率较低，AAVs诱导针对转基因的免疫反应的风险较低。在这篇综述中，我们总结并讨论了转基因免疫反应的复杂性。 迄今为止，AAV基因治疗中针对转基因的免疫反应主要在肌肉导向的临床试验中报告。在一项研究中，AAV的肌肉传递在一些患者中导致了针对转基因的抗体形成，这在NHP研究中已被预测。此外，研究表明，在没有残留蛋白表达或大片段缺失的基因转移的人类受试者中，针对转基因的免疫反应风险更高，而在具有错义突变的受试者中，基因传递更易被耐受。一些临床试验通过简单地不招募有更高风险发展反应的患者来控制针对转基因的免疫反应。在大多数肝脏导向的临床试验中，排除了有蛋白替代疗法免疫反应史或空突变的人类受试者。然而，在庞贝病临床试验中，AAV被肌肉注射，观察到缺乏功能性酶表达或非常低水平的患者出现免疫反应，类似于蛋白替代疗法中观察到的情况。在一项肌肉传递AAV的AAT临床试验中，只有在一个具有常见非病理性多态性和较不常见的HLA-单倍型的人类受试者中观察到转基因免疫反应。此外，当在肌肉传递hFIX中包括具有错义突变的患者时，未观察到转基因免疫反应。最近的一篇摘要表明，包括在转基因蛋白中存在的N-末端表位的基因组缺失的DMD患者，对转基因免疫反应的风险更高。这些观察表明，残留蛋白表达水平和患者基因型在影响针对转基因的免疫反应方面发挥了更关键的作用。此外，在临床环境中，眼部和鞘内AAV基因传递显示出有限的与转基因相关的免疫反应，可能是由于它们的分隔和减少的抗原呈递。AAV衣壳变体是另一个促进针对传递转基因的免疫反应的因素。在APCs中转导效率较低的衣壳可能具有较低的风险诱导针对转基因的免疫反应。 总结来说，针对转基因的免疫反应主要在没有残留蛋白表达的患者中观察到；因此，临床研究更倾向于选择具有错义突变的受试者或在蛋白替代疗法中没有反应的受试者。然而，这种方法排除了需求最迫切的目标人群。为了满足这一未满足的需求，已经采用了几种策略，将在第5.3节中描述。 4.监管批准后的AAV载体免疫反应 临床试验在标准化条件下进行，涉及的小规模、同质人群与批准后的患者选择和治疗条件不同。因此，可能会观察到安全性概况和反应的差异。迄今为止，已有三种基于AAV的药物（Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX）获得FDA批准，为许可后研究提供了更大的数据集。在这一部分，我们简要讨论与Luxturna和Zolgensma相关的整体安全性概况和免疫反应。 4.1.Luxturna Luxturna（voretigene neparvovec）是FDA批准的第一种用于治疗双等位基因视网膜色素上皮特异性65千道尔顿（RPE65）突变相关视网膜营养不良的眼部AAV基因治疗。通过单次AAV基因传递，将RPE65基因的功能性拷贝直接传递到视网膜细胞，恢复患者的视力。无论是对AAV2衣壳还是转基因，都没有观察到有害的免疫反应。报道了Luxturna的轻微免疫反应，并通过Luxturna的视网膜下传递前后的系统性皮质类固醇治疗得到了控制。同样，在用AAV2-ND4（玻璃体内注射）治疗的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中，体液和细胞免疫反应有限。Luxturna和LHON患者观察到的轻微免疫反应可以归因于局部注射到含有高浓度免疫调节神经肽和细胞因子的分隔环境中。 4.2.Zolgensma Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）是FDA批准的第一种基于AAV的基因替代疗法，用于治疗SMA。Zolgensma由一个自互补的、复制缺陷的AAV9组成，编码功能性SMN蛋白，通过单次静脉注射以1.1×10^14 vg/kg体重的剂量给药。 Zolgensma能够实现临床相关的治疗结果，并在减少SMA患者的过早死亡方面取得了有希望的结果。来自临床试验和市场后监测的数据显示，存在诸如肝毒性、血小板减少、TMA、心脏事件和神经节病等安全风险。在SMA许可后，报告了肝转氨酶的暂时升高，这些通过强的松治疗得到了解决。所有SMA患者都接受了预防剂量的强的松，但激素治疗的剂量和持续时间是可变的。当转氨酶水平低于正常上限的两倍时，才开始逐渐减少剂量。表现出急性肝衰竭的患者接受了暂时的高皮质类固醇剂量。对于接受长期激素治疗的患者，建议咨询内分泌学家以评估肾上腺功能不足。 肝毒性可能归因于衣壳特异性的细胞介导免疫反应。在急性疾病的情况下，即使经过长期皮质类固醇治疗，也可能考虑使用氢化可的松进行应激剂量。迄今为止，强的松已被证明在SMA临床试验和许可后经验中有效地恢复了肝转氨酶水平。然而，尽管接受了类固醇治疗，仍有SMA患者出现急性肝毒性的证据。诺华最近报告了两名儿童SMA患者因急性肝衰竭死亡。这些患者的肝功能严重受损，并迅速发展为肝性脑病和多器官衰竭。死亡发生在Zolgensma治疗后6-7周，开始逐渐减少强的松后。 除了肝毒性，其他不良反应包括短暂的血小板减少症。在一个患者中，观察到血小板减少症和多器官衰竭的晚期发作，但机制仍然不明。在接受Zolgensma治疗的1400多名患者中，FDA报告了9例TMA病例。EMA报告了在接受Zolgensma治疗的800名患者中有5例TMA病例。在基因治疗后第12天被诊断为TMA的一名患者，由于多种因素，面临致命结果。有趣的是，报告了该患者补体激活的生物标志物可溶性C5b9复合物（sC5b9）的水平增加。患者逐渐恶化，症状符合非典型溶血性尿毒症（aHUS）。根据儿童aHUS的治疗建议，患者接受了依库珠单抗治疗，这是一种单克隆抗体，已知可抑制补体因子C5的裂解。依库珠单抗注射导致EsC5b9 C3水平恢复正常，C3减少，C4正常，血小板计数轻微增加，表明1个月后TMA恢复。然而，在第40天，由于表皮葡萄球菌感染的发生，TMA复发，患者不幸心脏骤停。另一项研究报告称，在Zolgensma治疗1周后，也有三名患者发展为TMA，这表明了免疫介导的病因。其他因素，如并发细菌感染和最近的疫苗暴露，也促成了TMA。在两个病例中报告了通过替代途径激活补体系统，接受依库珠单抗治疗的一名患者没有显示出显著的临床改善。需要进一步调查，以评估依库珠单抗在由AAV基因治疗引起的TMA中的有效性。值得注意的是，其他基于AAV9的基因治疗在DMD和Danon病中也报告了伴有补体激活的TMA。未来的研究需要阐明补介导因素在SMA患者TMA中的作用。 最近的一项研究报告了一名接受Zolgensma治疗的SMA患者出现血嗜性淋巴组织细胞增多症（HLH）。连续3天使用高剂量的甲泼尼龙，随后几天逐渐减量，导致临床改善。因此，需要仔细监测炎症标志物，以避免因HLH导致的致命性。 5.少AAV基因治疗中免疫反应的策略 在这一部分，我们讨论可能的策略，以规避针对AAV衣壳和转基因的有害免疫反应，从而实现成功的转基因传递和表达（表1）。 表1 AAV基因治疗中的免疫反应及可能的调节策略 5.1.减少针对AAV的先天免疫反应的策略 正在积极开发免疫调节技术，以减少AAV载体的免疫原性，并允许安全和重复的干预。尽管在大多数试验中施用的皮质类固醇有助于调节免疫介导的毒性并实现长期转基因表达，但有些病例需要更复杂的类固醇方案和额外的方法，以潜在地减少载体和转基因的免疫原性。 5.1.1.克服Toll样受体激活和DNA感应 TLR激活在触发针对AAV载体的先天免疫反应中起着关键作用。规避TLR激活的策略旨在减轻这些反应。TLR9缺陷的小鼠显示出高水平的转基因表达，这一观察促使几个小组修改转基因序列，以干扰TLR9介导的识别。通过耗尽AAV基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR9信号，已被证明可以增强AAV介导的基因表达。耗尽CpG二核苷酸在免疫原性AAVrh32.33.33载体中显示出稳定的转基因表达，并减少了效应T细胞（Tef）的浸润。此外，CpG缺失在血友病B小鼠的肌肉注射中导致显著减少的CD8+ T细胞浸润，但没有影响抗体水平。ITR区域也含有高CpG含量，因此一项研究产生了功能性无CpG ITR。然而，由于ITR在包装中的关键作用，载体产量减少了约三倍。在另一项研究中，已报告在AAV基因组中加入TLR9抑制（TLR9i）DNA序列可以减少小鼠和猪的免疫反应。TLR9i由多个TTAGGG副本组成，也可以阻断DNA传感器，如cGAS。此外，抗疟药羟氯喹（HCQ）可能作为TLR9抑制剂。在小鼠和人体组织中，HCQ在AAV传递前1小时给药增强了转导效率。其他修改包括工程化表达盒，以便从3′ ITR阻断转录。因此，不会生成dsRNA，并且可以避免源自与细胞质dsDNA和dsRNA结合的先天免疫反应。在AAV表达盒中引入设计用于dsRNA传感器或其下游信号通路的短发夹RNA，可能用于规避dsRNA介导的先天免疫反应。采取多学科方法阻断TLR9激活和DNA感应，以规避先天免疫反应，可能会改善临床反应。 5.1.2.逃避补体系统激活 限制补体激活可能防止炎症反应和随后的组织损伤。Apellis Pharmaceuticals提出了使用一种名为APL-9的聚乙二醇化合成环状肽，它抑制补体激活的所有三条途径，以防止对AAV的补体激活。在I期测试中，静脉注射单剂量的APL-9能够限制补体激活，持续时间长达12小时。没有报告严重的不良事件，APL-9治疗能够完全抑制AH50溶血活性。在最近的一项研究中，APL-9减少了APCs上的CD86水平，AAV摄取和细胞因子/趋化因子分泌，以响应体外的AAV。由于在IgG耗尽的血清中确认了经典途径的参与，减少AAVs与抗体之间相互作用的治疗可能在防止补体激活方面有效。正在测试大量的补体抑制剂，从小分子抑制剂、siRNAs、适体、反义寡核苷酸、抑制肽、药理学药物到阻断抗体等，以抑制补体激活。依库珠单抗是一种针对补体超激活的单克隆抗体，通过抑制C5和MAC形成发挥作用。依库珠单抗已成功用于限制SMA和DMD AAV基因治疗中的补体激活(NCT03362502, NCT03368742, NCT03381729, NCT02122952)。未来需要进行进一步的研究，以抑制AAVs通过补体系统激活。 5.1.3.减少抗原呈递细胞中的转基因表达 正在开发限制免疫细胞激活的策略。例如，TLR9抑制性寡核苷酸恢复了由scAAV给药触发的增加的巨噬细胞浸润。限制泛素化并逃避蛋白酶体介导降解的蛋白酶体抑制剂可以减少MHC I分子上衣壳肽片段的呈递。通过阻断其他细胞的不需要表达，实现目标组织和细胞特异性表达的microRNA(miRNA)介导的去靶向是另一种策略。这种方法可以减少先天免疫细胞的抗原呈递，并随后阻断对AAV传递的转基因的适应性免疫反应。下面讨论了限制对AAV衣壳和转基因的适应性免疫反应的其他方法。 5.2.减轻对AAV衣壳的适应性免疫反应 AAV基因传递后的适应性免疫反应限制了转基因表达，并产生了抑制AAV重复剂量的免疫记忆。因此，正在采用几种策略来限制适应性衣壳特异性免疫反应。在以下部分中，讨论了克服针对AAV衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应的策略。 5.2.1.克服体液免疫反应的策略 AAV基因治疗受到NAbs形成的阻碍，因此采用了多种策略来克服体液免疫反应。需要系统给药AAV的患者尤其处于NAbs的更大劣势。一种方法是剂量受试者缺乏对AAV的预先存在的免疫力，这在年轻患者中更为常见，但在青少年和成人中则相当少。 由于NAbs的高流行率，已经采用了几种策略来抑制或消融基因治疗受试者的体液免疫反应。抑制体液免疫的主要方法是使用免疫抑制药物（IS）。一种广泛适用的策略是使用B细胞耗竭单克隆抗体。研究表明，使用利妥昔单抗，一种抗CD20抗体，进行B细胞耗竭后，NAb滴度降低的有希望的结果。利妥昔单抗与雷帕霉素，mTOR抑制剂，或与雷帕霉素和皮质类固醇的组合，在临床试验中成功诱导耐受并防止抗体形成。贝利木单抗，一种抗B细胞激活因子(BAFF)的抗体，是另一种B细胞耗竭抗体，在控制自身免疫疾病方面显示出有希望的结果。此外，使用ibrutinib，一种B细胞抑制剂，在小鼠模型中减少了针对AAV的初级抗体反应。然而，全身性IS可能增加感染风险，并且对于完全缓解高滴度NAbs无效。除了传统的IS，AAV载体和合成疫苗封装雷帕霉素(SV[rapa])的联合给药，ImmTOR，是另一种有希望的方法。ImmTOR治疗导致抑制AAV特异性抗体形成，并减少了B和T细胞的激活。最近的一篇摘要显示，ImmTOR与贝利木单抗联合给药减少了抗AAV IgM抗体，提供了更持久的抗AAV IgG抗体抑制，并允许在小鼠中多次重新给药AAV8载体。当ImmTOR与ibrutinib组合时，观察到减少的效果。然而，将ImmTOR与空AAV8联合给药给健康人体受试者只延迟了NAbs的形成。 多种方法专注于直接逃避NAbs。一种方法利用细菌衍生的抗体降解酶。另一种方法是血浆置换，它用于减少循环抗体，但可能无法完全根除NAbs或需要多个周期。此外，血浆置换去除总抗体含量，因此增加了传染病的风险。为了克服这个障碍，一项研究使用AAV特定的血浆置换柱从NHP的血浆中耗尽抗AAV NAbs，而不影响总IgG水平。另一项研究表明，AAV9颗粒结合到Sepharose珠子上在大鼠中选择性地耗尽抗AAV抗体。这种方法的治疗窗口有限，因为血浆置换不去除产生抗体的细胞。在另一项研究中，使用盐水冲洗或带气囊导管隔离目标组织与系统循环。这种策略相对侵入性，并且可能不适用于所有目标组织和AAV的系统给药。此外，在这项研究中，使用了NAbs低的NHP，这种方法在NAbs高的动物中的有效性需要进一步评估。建议使用最小暴露于NAbs的途径。在一项血友病临床试验中，与系统给药途径相比，AAV的肌肉传递对预先存在的NAbs不太敏感。此外，在动物模型中，直接将AAV传递到CNS被良好耐受。然而，改变给药途径可能会潜在地减弱转导效率并改变AAV载体的生物分布。 其他方法专注于AAV衣壳以调节体液免疫反应。一种方法是使用诱饵空衣壳吸收循环NAbs。空衣壳的添加通常不是有效的，可能会加剧AAV的免疫毒性并降低转导效率。此外，除了携带转基因的衣壳外，还生产大量空衣壳，这给过程增加了额外的复杂性和相关成本。 衣壳工程是另一种方法，用于生成具有所需趋向性和降低免疫原性的重组AAV。在NAb识别位点的修改可以提高转导效率。或者，通过定向进化产生的衣壳可以逃避NAb感应。与自然变体相比，由AAV2、AAV8和AAV9变体的残基组成的工程化AAV-DJ变体已被证明在存在人类静脉注射IgG的情况下转导肝细胞。此外，从人源化小鼠模型中分离的AAV3b对NAb识别不敏感，并且在人类肝细胞中具有更高的转导效率。尽管如此，与使用当前可用且研究充分的衣壳相比，工程化AAV衣壳是耗时的、劳动密集的，并且需要识别NAb识别位点。为了避免工程化AAV衣壳的复杂性，建议对AAV衣壳进行化学修饰，包括聚乙二醇化和聚合物封装。然而，这些化学修饰可能会潜在地降低转导效率，降低产量，改变AAV载体的生物分布，并导致抗聚合物抗体的形成。除了化学修饰的衣壳外，多项研究表明，外泌体封装的AAV可以在预先存在的免疫存在下转导目标细胞，诱导耐受性，并赋予AAV改变的趋向性。然而，用外泌体封装AAV可能进一步复杂化生产过程并引入核酸或蛋白质污染。 通常，AAV基因治疗的单一治疗可能不够。除了AAV基因治疗后的免疫反应外，暴露于野生型AAV导致预先存在的免疫力，阻碍了AAV再剂量。多项研究表明，CD28/B7和CD40/CD40L阻断导致炎症反应的缓解并允许载体再给药。在这个策略中，CTLA4融合蛋白与B7的相互作用比CD28具有更高的亲和力，导致免疫反应的下调。这种方法与一种抗CD40配体抗体结合使用，阻断了B细胞的刺激信号。尽管结果有希望，但CD28/B7和CD40/CD40L阻断广泛抑制NAbs并需要进一步调查。此外，血浆置换、衣壳诱饵和更换衣壳变体的缓解策略不是有效的。此外，免疫抑制和使用抗体降解酶不针对AAV特异性免疫反应。需要进一步研究开发更具体和有效的方法。更换衣壳变体是另一种允许AAV再剂量的选择，但受到AAV衣壳的不同趋向性、NAbs的交叉反应性和开发不同产品的复杂性的限制。逃避允许基因治疗的体液免疫反应仍然难以捉摸。包括给药途径、所需剂量和目标组织在内的几个变量在选择适当策略中起着关键作用。此外，使用除B细胞耗竭之外的其他策略，如针对IL-1β和IL-6的抗体、etanercept（TNFα抑制剂）或anakinra（IL-1R阻断剂）可能有助于调节AAV基因治疗中的体液免疫反应。使用一种或多种策略可能允许在否则不符合条件患者中进行AAV基因治疗。 5.2.2 克服细胞介导免疫反应的策略 与可以预测的患者体液免疫反应不同，患者对AAV的细胞介导反应在临床试验中差异很大。自从在血友病临床试验中首次观察到以来，通过免疫抑制方案广泛抑制了衣壳特异性T细胞反应。在AAV临床试验中使用的IS治疗包括类固醇、单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。类固醇通常用于临床试验，以通过影响T细胞受体信号减少T细胞激活和细胞因子产生。此外，它们增加抗炎细胞因子的产生和Treg增殖。类固醇通过抑制血管生成、白细胞迁移到炎症部位以及改变免疫细胞死亡和迁移来抑制炎症反应。如前所述，糖皮质激素被用于所有人类受试者中，以抑制Zolgensma试验中的衣壳特异性T细胞反应，然而在类固醇逐渐减少期间，两名患者死于急性肝衰竭。多项临床研究表明，使用类固醇未能防止转基因逐渐丧失。因此，一些研究专注于使用免疫抑制剂药物组合和优化治疗时机。环孢素和他克莫司下调IL-2转录，从而抑制T细胞增殖和激活。他克莫司的日常给药允许NHP中AAV传递的转基因持续表达。麦考酚酸莫非特（MMF）优先耗尽T和B淋巴细胞中的鸟苷核苷酸，并抑制它们的增殖。环孢素和MMF的组合在Glybera临床试验中使用，但未能抑制所有人类受试者的免疫反应。后续研究表明，在AAV剂量之前开始免疫抑制和额外的皮质类固醇治疗是有益的。体外研究表明他克莫司和环孢素抑制Treg增殖。一项研究表明，他克莫司治疗损害了肾脏和肝脏移植患者的Treg功能，而雷帕霉素对Treg有有益的效应。因此，雷帕霉素与利妥昔单抗或强的松的组合已在AAV临床试验中频繁用于诱导耐受。此外，环孢素和非耗尽性CD4受体抗体诱导Tregs并允许在小鼠中重新剂量。建议使用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米。体外和临床前动物研究表明，硼替佐米的给药可以防止内化的AAV降解，减少衣壳呈递，并增加通过增强AAV的核转移来提高转导效率。尽管应用广泛，系统性免疫抑制可能会导致Treg抑制和多种不良效应，包括肠道并发症、肌肉疼痛和头痛，这使得其他策略受到关注。 在AAV运输过程中，AAV衣壳表面的酪氨酸残基可以被磷酸化并随后泛素化，这导致衣壳降解并呈现在转导细胞表面。因此，建议突变表面酪氨酸，这导致AAV衣壳的呈递减少，T细胞毒性降低，并需要治疗剂量。多项研究减少了AAV的治疗剂量，并使用了转基因的超活性变体。并非每个转基因都有超活性版本，并且可能并不总是导致减少的T细胞反应。 除了前面讨论的策略外，降低给药剂量和去除空衣壳已被提出。这种方法试图减少AAV衣壳对抗原呈递的可用性。然而，降低AAV剂量可能会降低转导效率，并导致NAbs中和AAV。 Tregs的浸润和肌肉导向AAV基因治疗试验中转基因的长期表达强调了Treg在诱导免疫耐受中的作用。因此，Treg诱导表位，Tregitope，被纳入AAV衣壳结构，成功扩大了Treg并抑制了CD8 T细胞。除了工程化AAV衣壳，ImmTOR颗粒在衣壳特异性T细胞和体液免疫反应方面显示出有希望的结果。然而，这些新策略需要进一步的功效和安全性调查，因为它们是非抗原特异性治疗。 为了诱导局部和特异性耐受，另一项研究结合了Tregs抑制免疫反应的能力以及CAR的抗原特异性。在这项研究中，使用了AAV特异性CAR Tregs和多克隆Tregs，尽管存在衣壳特异性T细胞反应，但允许转基因表达。 在临床上，衣壳特异性T细胞反应主要通过使用类固醇来控制。免疫抑制增加了感染风险，并且在需要高剂量AAV时效果较差。因此，开发一种新的抗原特异性策略似乎是不可避免的。 5.3.减轻转基因免疫反应 为了避免针对传递转基因的免疫反应，已提出几种方法，包括限制目标人群、免疫抑制、使用组织特异性启动子、miR技术以及免疫细胞疗法。 短期使用环磷酰胺治疗，这是一种烷基化剂，可减少促炎细胞因子的产生，在小鼠和犬模型中成功实现了基因表达。此外，在犬研究中，使用环孢素、抗胸腺细胞球蛋白和MMF的短暂免疫抑制预防了免疫反应并实现了转基因表达。除了系统性免疫抑制外，临床前研究指出了组织特异性启动子在减少针对传递转基因的免疫反应中的作用。当转基因由普遍性启动子驱动时，与肌肉特异性启动子相比，观察到较低水平的转基因表达和强烈的体液和细胞免疫反应。此外，使用肌肉特异性启动子在犬模型中实现了转基因的稳定表达，而没有免疫反应。此外，NHP的一项研究报告称，肝脏导向的表达可能有助于限制抗转基因抗体，诱导耐受，并允许重新使用不同衣壳变体的再剂量。 其他研究利用Tregs来抑制与转基因相关的免疫反应。一项研究使用多克隆Tregs来抑制蛋白替代疗法中因子8和9的免疫反应。然而，Tregs的低频率和潜在的非特异性免疫抑制限制了多克隆Tregs的应用。因此，多项研究产生了转基因特异性CAR Tregs，在抑制转基因诱导的免疫反应方面显示出有希望的结果。TRuC Tregs是通过将抗人凝血因子VIII (hFVIII) 的单链可变片段与T细胞受体融合而开发的。这项研究表明，与FVIII-CAR Treg相比，F8-TRuC Treg具有更优越的抑制功能。B细胞抗体受体（BAR）是通过将因子8抗原和T细胞刺激信号域结合而产生的。BAR T细胞在体外和体内成功消除了FVIII反应性B细胞。随后，通过将Tregs与BAR构建物共转导而创建的BAR Tregs，在抑制转基因特异性B细胞方面显示出有希望的结果。尽管免疫细胞疗法在抑制转基因免疫反应方面取得了有希望的结果，但其临床安全性和有效性需要进一步调查。 目前，临床研究中招募了可能具有较低转基因免疫反应风险的受试者。利用新开发的方法使我们能够包括更多的代表性研究对象。 6.结论 关于患者对AAV基因治疗的免疫反应仍有许多未知之处。然而，基于正在进行的临床试验和治疗数千而非少数患者的许可后数据，不断积累的证据。为了进一步了解AAV基因治疗的免疫反应的发展，需要对入选受试者进行进一步的免疫监测，包括监测血清因子的策略、外周血免疫细胞的表征以及组织分析。然而，缺乏免疫测定的标准协议以及无法收集相关样本导致研究间的变异性，并进一步复杂化了研究结果的解释。开发标准协议以监测AAV临床试验中的受试者将有利于该领域的更好比较。然而，当前试验中存在的剂量、给药途径和使用多种衣壳血清型的变异性可能进一步使比较和解释AAV基因治疗的免疫反应更加复杂。 在大多数试验中，系统性免疫抑制被广泛施用以调节AAV基因治疗临床试验中的免疫反应，尽管有一些显著的不良效应。然而，免疫抑制方案、剂量和时机也都非常多变，并且该领域没有共识。适当的动物模型来测试当前或新药物并不容易获得，这使得标准化协议变得困难。应用新开发的战略可能比广泛、非特异性的免疫调节更有针对性，可能有助于改善结果并减少并发症。 自1995年第一次AAV临床试验以来，已经观察到有关AAV安全性和免疫反应的显著临床数据，然而免疫反应仍然是成功AAV基因治疗的障碍。克服免疫反应的新兴策略将使AAV基因治疗的全部潜力对数千人的生活产生积极影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：腺相关病毒（AAV）是治疗遗传性疾病的新兴方法中的领先载体。为了更广泛的临床应用，需要更高的转导效率和细胞特异性，这激发了对病毒-宿主分子在细胞进入过程中相互作用的调查。高通量方法更全面地鉴定宿主蛋白，随后的分子研究揭示了意想不到的复杂性和血清型特异性。冷冻电子显微镜（cryo-EM）为这些有时是不均匀的病毒-宿主复合物的结构细节提供了一条途径，并且有望更充分地阐明进入的步骤。这里介绍的，是理解糖基附加和受体介导的进入/运输的不同步骤的进展。与抗体复合物的结构比较为免疫中和提供了新的见解，这对改进基因治疗载体的设计具有重要意义。 亮点 高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构详细说明了腺相关病毒（AAV）受体蛋白的结合相互作用。AAV的糖基“主要受体”被重新定义为“附着因子”。AAV5类病毒与受体的不同结构域相互作用，其结合位点与其他AAV不同。许多AAV中和抗体的表位与衣壳上的受体结合位点重叠。未来的结构研究重点将放在AAV受体非依赖途径以及进入和运输的其他步骤上。 1.病毒-宿主相互作用：改进基因治疗载体的基础 AAV（见术语表）是一种小的单链DNA病毒，属于细小病毒科，其三个病毒衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）构成了一个二十面体对称的非包膜壳。由于野生型（wt）AAV具有广泛的组织趋向性和低致病性（作为复制缺陷的依赖性细小病毒），重组生产的AAV载体（rAAV）现在已成为治疗性基因传递的杰出载体，临床有效载荷取代了约4.7 kb的天然基因组。在过去的3年中，FDA批准了两种AAV疗法，LUXTURNA™（rAAV2用于RPE65相关视网膜营养不良）和ZOLGENSMA®（rAAV9用于脊髓性肌肉萎缩症）。尽管取得了成功，但目标特异性载体优化和更高的转导效率仍然是更广泛临床应用的关键。我们发现，每个被发现、工程化或衍生的AAV衣壳变体，都可以通过其独特的序列编码表型，揭示改善靶向、转导和免疫逃逸的线索。特别是AAV衣壳与宿主细胞进入因子的相互作用，一直是最近研究的焦点，并取得了令人兴奋的成果。 高通量筛选和结构测定的进步正在被AAV界用来识别和可视化对细胞转导至关重要的AAV-宿主分子相互作用。日益高分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构有助于阐明受体、抗体和细胞表面糖基相互作用的分子决定因素。在这里，我们总结了当前对AAV进入因子及其鉴定的理解，以及高分辨率结构对未来载体设计的潜在影响。Riyad和Weber最近的一项综述提供了关于AAV进入和运输细胞过程的极好视角，而这里则强调了生物物理化学和分子相互作用的详细表征。 2.AAV细胞进入：事件序列 AAVs对细胞表面糖基的广泛附着被认为增加了通过增加与介导进入的跨膜受体蛋白的接触来内化的可能性。正如后面所详述的，特定糖基类型的表达可能会以血清型特异性的方式影响结合和内化，这可能会对趋向性产生潜在的影响。当我们考虑各种病毒-宿主细胞的相遇时，我们将需要区分成功的感染或转导所需的有效进入和运输，以及即使在非许可受体敲除突变体中也可能被检测到的背景“死路”内化。AAV病毒通过受体介导的内吞作用穿过质膜。特定的机制仍然是讨论的话题，但在识别AAV宿主附着因子和受体，并物理表征它们与衣壳的相互作用方面已经取得了实质性进展。附着因子和受体的术语被谨慎选择，以反映我们的新理解，混淆的潜力最好通过提供一些历史文献的背景来解决。 早期研究集中在血清型2上，将其作为模型AAV。在其中，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）被证明对细胞结合和转导是必要的，并被认为是第一个已知的受体。不同的糖基随后被确定为其他血清型的特异性，例如，AAV5、-1、-6和-4的唾液酸（SIA）的组分，以及AAV9的半乳糖。这些蛋白多糖被称为“主要受体”，因为它们是细胞趋向性的决定因素，但也被认为需要其他蛋白质“核心受体”来进行内化。AAV-核心受体关联在覆盖层分析中最直接地被证实，但与其他已知病毒-受体对的结合亲和力从未建立，AAV-核心受体复合物仍有待分离。 正如在历史文献中使用的，“主要受体”可能适当地暗示了一个早期的相互作用，其中一个糖基的作用是低亲和力、广泛的附着，隔离和浓缩AAV在宿主细胞质膜上。通过类比其他病毒，我们将这些糖基（具体来说，蛋白多糖的糖胺聚糖部分）称为附着因子，这是现在需要与历史AAV文献不同的称呼。进一步复杂化的情况是，越来越多的证据表明，AAV2对HSPG的强结合可能是一种适应细胞培养中病毒传播的方式。根据最近的筛选结果，报道的核心受体也需要在功能上重新考虑。 3.AAV与细胞糖基的相互作用 到2014年，已确定了13种血清型中有8种使用的糖基。除了半乳糖（AAV9）[7]外，糖基带有负电荷：硫酸肝素（HS）用于AAV2、3B、6和13[6,8-10]，唾液酸（SIA）用于AAV1、5和6（α2-3和α2-6 N-连接）以及AAV4（α2-3 O-连接）。通常通过调节细胞表面糖基和/或糖胺类似物的竞争抑制后的转导测定来识别。 通过晶体学/电镜分析糖基复合物（表1）以及定点突变来确定AAV糖基结合位点。AAV2的晶体结构[1]允许Kleinschmidt和Muzyczka小组通过突变分析来表征位于Arg585和Arg588之间的RXXR基序作为肝素结合域（HBD）。在分辨率上，冷冻电镜开始时很难验证与结合肝素的微妙差异。一项研究似乎显示肝素在RXXR外某处结合，这与可能引起它们结合并触发病毒解壳的构象变化相合理化。另一项研究表明肝素片段缠绕在每个三重相邻的突起周围，由带正电荷的AAV2残基结合，包括前述的Arg585/Arg588。这种配置，没有提议的构象变化，将通过更高分辨率的冷冻电镜得到验证，其中可识别的硫酸根团确认了糖基与HBD紧密接触的位置。 表1. 带有附着因子、受体或抗体结构域的AAV结构 表1列出了与糖基附着因子模拟物（第一区块）、受体（AAVR）域（中央区块）以及针对这些衣壳的抗体结合的AAV复合物。b衣壳类型：wt，野生型；rAAV，重组腺相关病毒；VLP，病毒样颗粒。 3.1.结构生物学 - 中分辨率的挑战 由于技术进步（见下文）推动的冷冻电镜“分辨率革命”，自2010年以来EMDB数据库沉积物增加了十倍，对AAV结构病毒学的日益增长的影响引起了极大的兴奋。越来越多地，冷冻电镜可以在比晶体学更好的分辨率下进行，但并不总是能够实现，且分辨率并不总是在整个给定图中均匀的，后者对于解释即使是最新的结构也有影响。 当我们从原子模型分析生物学推断时，我们应该强调原子模型不是主要的可观察现象，而是在晶体学中从实验推导出的电子密度图，或在冷冻电镜中的电势图的解释。验证模型和估计准确性的方法对晶体学来说已经发展了多年，对冷冻电镜来说还没有成熟。通常未声明的是，准确性在冷冻电镜模型之间和内部有显著变化，因此对机械推断的信心也有所变化。即使在最高分辨率下，原子很少单独解决，通过识别化学基团并执行已知的立体化学（键长、角度等）来实现精度。因此，地图显示化学基团的独特特征的地方精度更高。蛋白质主链通常比更灵活的（模糊的）侧链和可能不那么牢固锚定的配体更可靠。冷冻电镜结构的部分可能有模糊的解释，有时很难区分真实特征和实验噪声。 在实践中，电子显微镜模型通常仅通过与理想立体化学的一致性来验证。然而，这只有在模型也适合独特地图特征时才有意义，因为仅优化立体化学是非常容易的。此外，由于空间限制，论文可能只展示最令人印象深刻的区域，因此建议下载地图和模型，检查对生物学结论重要区域的良好立体化学和适应独特地图特征，在差异图中检查一致性的敏感度。 3.2.糖基相互作用的细节 得益于更高分辨率的数据，AAV-糖基结合复合物的后续结构较少引起争议。对于AAV3B，与硫酸化蔗糖（SOS）的共晶体揭示了一个由三重轴上的三个Arg594副本独特形成的位点。AAV5与唾液酸（SIA）的晶体在3.5 Å分辨率下揭示了两个结合位点（A和B）。A位点也在三重轴上，当突变时显示SIA介导的转导减少，而B位点突变，位于五重轴附近，揭示了SIA独立的作用在转导中。对于AAV1，三糖浸泡的晶体揭示了三重轴突起底部的五重轴上的SIA位点，相应位点在同源AAV6中的突变证实了其作用。 一个重要的警告是，高分辨率结构使用生物相关多糖的短模拟物。单糖官能团、异构体和连接的多样性使均匀试剂的合成复杂化，并且糖基的添加通常对病毒晶体具有破坏性。高分辨率冷冻电镜需要均匀的糖基，因为重建需要平均许多颗粒。然而，在体内，这种多样性肯定占主导地位，并且可能是功能性的。通过表面等离子共振（SPR），肝素类的亲和力随着链长增加而增加，直到n = 5，可能对应于单个结合位点，然后在n = 16时再次增加，足够长以与AAV2上的第二个与对称性相关的结合位点结合。使用小模拟物的高分辨率结构显示了每个位点的核心相互作用，但没有显示更长聚合物如何可能在多个位点结合。 通过将配体结合结构（和突变位点）叠加到AAV1上，比较了不同的血清型。代表性的糖基位点稍后在AAVR蛋白受体结合分析中进行了说明（见图2）。结合位点围绕AAV表面突起，特别是在它们之间的三重凹陷处。从这里，一条山谷通向两重轴，由于地形的原因，它在免疫监视下受到一些保护，也许受到的选择压力较小。虽然不同血清型的糖基结合位点看起来在类似的位置，但它们没有在系统发育上对齐的氨基酸。例如，HBD的Arg585/Arg588，特别是高肝素亲和力是AAV2独有的。血清型特异性的糖基结合为重新定位基因治疗载体带来了希望，而广泛的相互作用多样性引发了一个问题，即糖基结合机制是冗余的还是累加的。 我们发现，AAV2和/或AAV3样肝素位点的糖基结合和转导都可以在嵌合体中调节。通过将类似AAV9的半乳糖结合位点移植到AAV2中，也可以增加转导效率。人们强调了对载体工程的影响，但也有助于对AAV的糖基相互作用是大量、累加和非特异性特征的日益认识。糖基阵列已经测量了不同类型的SIA的结合差异，Linhardt和Chapman小组测量了AAV2和AAV-DJ对合成肝素类的文库的亲和力。令人惊讶的是，几种肝素类比涉及细胞感染的HS具有更强的结合力。Heilbronn小组对AAV1、4、5和6的SIA亚型特异性，以及AAV3和AAV2的肝素特异性的阵列分析也发现了类似的结果。不同的糖基偏好可能对组织和宿主范围很重要，如流感病毒，可能对载体工程有影响，但另一个不可避免的结论是：糖基特异性很低。 还需要改进的冷冻电镜来解决化学均匀的小合成糖基模拟物。我们在4.8 Å分辨率下看到的AAV-DJ与SOS的复合物，以及在2.8 Å分辨率下看到的五糖fondaparinux，证实了直接在HBD处的结合，并揭示了能够适应不同糖基序列的硫酸的侧链相互作用。低特异性因此得到了结构上的合理化。 3.3.变革的种子 如果没有糖基，那么报道的核心受体（如FGFR1、HGFR、EGFR、PDGFR、LamR和alphaVbeta5整合素）是主要的特异性介导者吗？我们尝试将核心受体外细胞结构构建与AAV2体外结合，并通过siRNA敲除进行转导抑制，但未成功。实验并不全面，对负面结果的原因也不明确，但对这些核心受体的角色越来越担忧。后来，CRISPR-Cas9敲除表明核心受体对转导的影响远小于糖基附着因子或AAVR。核心受体可能在进入中起辅助作用，但也有可能它们的调节通过改变信号影响转导。 我们担心AAV进入的主要决定因素尚未被识别：（i）糖基相互作用的特异性低于预期的经典受体， （ii）核心受体-AAV复合物的生物物理表征证明是难以处理的。使用新兴技术进行无偏见的重新检查是必要的，用于全基因组筛选。 4.AAV受体的鉴定 4.1.与新兴的全基因组筛选的共识 多种技术进步已经增进了我们对AAV感染（或载体转导）的理解。siRNA敲减筛选是首先识别出多种宿主因子的方法，包括干扰素反应、DNA修复、细胞检查点、RNA剪接和SUMOylation。令人惊讶的是，siRNA敲减对转导只有适度的影响，筛选也没有突出当时的候选细胞核心受体。 敲除筛选更具决定性。这首先在一种近乎单倍体的人类细胞系（Hap1）和一种衍生的基因陷阱库中成为可能，该库具有随机位置的单基因敲除，已证明在鉴定流感病毒和埃博拉病毒的受体。通过选择表现出抗性的突变细胞，然后进行深度测序，鉴定了感染所需的宿主基因。对于AAV，Carette和Chapman小组使用编码荧光的rAAV载体，并迭代使用荧光激活细胞分选（FACS），选择转导抗性。深度测序富含AAV抗性引起的突变的细胞，鉴定了进一步通过CRISPR-Cas9和其他方法表征的基因。现在，使用CRISPR-Cas9库的类似筛选已经证实了这些结果，并鉴定了额外的宿主因子。虽然预计结果会因不同的库技术和选择方法而有所不同，但Meisen等人已经通过针对八种AAV血清型的双重筛选测试，证实了KIAA0319L、GPR108、TM9SF2和其他几个顶级命中的重要性（表2）。 Table 2. 与AAV进入相关的细胞蛋白 a人类基因，这些基因编码跨膜蛋白、糖基生物合成或内质网/高尔基体运输，它们通过全基因组筛选被认为与AAV2转导有关，根据每个筛选中结果的统计显著性进行排名。b缩写：不适用。*在Meisen等人的筛选中，只在一个筛选中被识别，而不是两个筛选都被识别。 值得注意的是，GPR108也作为另一个筛选中的下游因子出现，该筛选使用了在AAVRKO背景下准备的GeCKO库，使用AAVR非依赖性载体AAVrh32.33进行探测，试图表征AAVR非依赖性途径。Pillay等人和Meisen等人研究之间的一致性为结果提供了信心。在Pillay等人的前50个筛选命中中，有37个与膜相关（高尔基体或内体）或参与糖基合成（表2）。 应该注意到敲除筛选的警告。首先，细胞库不包含是致命的突变或在细胞复制所需的基因中。其次，选择是通过降低转导来进行的，所以通过突变AAV限制因子（如核DNA损伤反应元件）增强转导没有被记录。最后，最重要的敲除比siRNA抑制报告的影响更大，而且可能在一组具有冗余功能的基因中发生突变不会被认为是显著影响。这种考虑与在核中与载体基因组的宿主分子相互作用有关，这些内容在其他地方进行了综述。 4.2.  AAVR作为进入/运输因子 基因陷阱产生了50多个基因，在为AAV抗性选择的细胞中具有很高的敲除频率（表2列出了一个子集）。排名第一的是KIAA0319L，它编码一个特性较差的膜蛋白，该蛋白似乎短暂出现在细胞表面，但主要位于核周的跨高尔基体。它可能作为回收受体本地功能，用于未知配体，而AAV可能已经进化到利用逆行KIAA0319L受体运输。 通过CRISPR-Cas9敲除和在HeLa细胞中的补充，以及在八个细胞系中，验证了七个AAV血清型对KIAA0319L的需求。AAV2的转导被抗KIAA0319L抗体或竞争KIAA0319L外细胞结构域抑制，而在体内，KIAA0319L KOs在转基因小鼠中废除了载体转导。因此，KIAA0319L具有以前从未为AAV建立的病毒进入受体的特征。由于没有经过充分表征的功能，KIAA0319L被命名为AAVR，即AAV受体。 5.AAVR的特性及其与AAV的相互作用 5.1.域结构与作用 AAVR具有单个跨膜区域和短的C末端细胞质域，该域需要逆行运输至跨高尔基体网络（TGN）。其外细胞结构域，与AAV的衣壳结合，包括五个串联的Ig样PKD（多囊肾病）域、一个MANEC域和一个N末端信号肽。在Hap1 AAVRKO细胞中表达PKD缺失突变体显示，进入决定因素位于N末端PKD域1-3，并且通过ELISA检测到AAV2结合位点。高亲和力，通过SPR估计的KD约为~150 nM，表明强结合特异性。复合物的稳定性和涉及域的鉴定允许进行结构分析，这对于之前报道的核心受体已经证明是难以处理的。 5.2.冷冻电镜下的高分辨率AAV结构 得益于冷冻电镜技术的戏剧性进步，现在可以对病毒-宿主相互作用进行结构表征。改进包括直接电子探测器、帧收集和束流诱导运动校正、更稳定的透镜以及用于对异质复合物进行对齐和分类的算法。第一个AAV结构，AAV2在~3 Å分辨率，来自2002年的X射线衍射。多年来，冷冻电镜为难以结晶的复合物提供了低分辨率结构，但现在冷冻电镜经常等于或超过X射线分辨率。病毒组装的体型大和对称性使它们特别容易处理。偶尔，实现了异常分辨率，AAV-DJ在1.56 Å下，是分辨率最高的生物分子冷冻电镜结构之一。冷冻电镜现在也在为与蛋白质受体的复合物提供原子结构的路径，这些受体的结晶将非常困难或不可能。 5.3.AAV2-AAVR结构 冷冻电镜已经定义了受体结合足迹，这对血清型特异性和宿主免疫有影响（表1）。2019年发表了两项研究。Zhang等人使用包含所有五个PKD域的构建，在他们的2.8 Å EM图中看到了其中之一。Meyer等人结合了类似复合物的较低分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET），揭示了更灵活的域，并从2.4 Å的冷冻电镜中获得了细节，来自两个域复合物（PKD1-2）。两个高分辨率图（2.4和2.8 Å）都只显示每个三重轴周围的突起上紧密结合的一个AAVR域。独特的侧链识别它为PKD2。其他域只通过低分辨率冷冻ET看到，它不假设二十面体对称性，从而揭示了AAVR的低分辨率轮廓，未结合域以几种配置连接。PKD1-2复合物中PKD2的精炼占据率为0.59，反映了部分结合和更高的无序性（比病毒），但它足够高，可以排除PKD1-2结合到对称病毒表面上邻近位点的冲突。 AAV2-AAVR结构相似，两者都得到定点突变的支持。Zhang等人报告了针对观察到的界面的突变，而Meyer等人分析了Colosi实验室的98个替代在64个表面位点上的数据。Muzyczka实验室的数据添加在图1D中。虽然不是完全隔离的，但影响转导的突变（红色）在PKD2接触界面内更为普遍。不足为奇的是，一些结合位点残基的保守突变影响很小（绿色）。值得注意的是，当比较不同实验室的结果或在同一位点分析多个替代时，测量转导的变化很大（橙色），提醒我们，需要冗余数据才能进行稳健的表型推断。 图 1. 腺相关病毒（AAV）与AAV受体（AAVR）的相互作用位点。(A) AAV2衣壳结构具有五个、三个和两重对称轴（箭头），共有60个与AAVR PKD2（青色）等效的结合位点。这些与AAV5上的PKD1位点在映射到AAV2时（黄色）有所不同。红色框架勾勒出后续面板的视图。(B,C) 在AAV2和AAV5复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构上，显示了AAVR PKD2和PKD1（及其对称等价物）的青色和黄色主链轨迹。每个实验结构仅显示一个域，但在这里通过叠加结构添加了另一个域。在AAV5复合物中，可以看到AAVR PKD1，残基S392–K399（PKD1），在AAV2复合物中，残基N405–V499（PKD2）可以被看到。对于AAV2（而不是AAV5），PKD1和PKD2都有助于结合，尽管只有单个域在高分辨率下被解析。尽管将两个叠加的结构连接起来很诱人，但这将需要移动域以便连接链能够到达。(D) AAV2的表面根据氨基酸对细胞转导的影响着色。单点突变从多个来源综合而来，按照从红色（转导消除）到绿色（中性/增强）的规模着色。对于不同作者或同一位点的不同替代，增加了黄色调。（通过结构比对添加了AAV1的突变数据。）(E) AAV5的表面使用可用的突变数据进行类似的着色。另见在线补充信息中的图S1–S5，对应于A–E面板。 5.4.AAVs展示不同的AAVR结合模式 在AAV2-AAVR复合物的结构之后，报道了AAV5与AAVR PKD1-5的复合物在3.2 Å分辨率下。同样，只看到一个域，但现在是PKD1，与之前的结合、转导和覆盖一致。PKD1的图特征较弱，平均约为AAV-5内类似特征强度的40%。如果图的弱点主要是由于未饱和结合，PKD1应该均匀地弱。然而，PKD1在与AAV5的三重轴突起结合界面附近显得强大，并逐渐减弱，向域的N末端，靠近五重轴。这与由于旋转无序而增加的模糊一致。对于最靠近五重轴的三分之一域，主链特征低于1σ显著性，在该区域，除了定位同源模型（如PDBid：2E7M）之外，不应解释为超出范围。即使在PKD1-2 AAV5复合物的更高（2.5 Å）分辨率结构中，只有在域的结合端才能看到预期的这种分辨率的细节。如果PKD1的C末端端被AAV5强相互作用锚定，旋转这个支点导致远离结合位点的逐渐无序，那么两个结构都可以合理化。 最值得注意的是PKD1在AAV5上和PKD2在AAV2上的近乎独特的足迹，它们仅在V708AAV2/Q697AAV5处相交（图1B,C）。PKD1的N末端接近AAV5的五重轴，然后该域横跨峡谷，其C末端锚定在三重突起的二重侧[靠近AAV5的Y542、N546、F698和R710以及可变区（VR）VII和IX环，图1C]。如果将AAV2和AAV5复合物叠加，PKD2（来自AAV2）从Asn405开始，距离AAV5中PKD1的C末端Lys399 19 Å，爬上另一个突起的肩部（通过五重对称性相关）其C末端靠近顶部。对于AAV2，尽管只有PKD2紧密结合到足以进行高分辨率可视化，PKD1也增加了相互作用。然而，看到的域与AAV5和AAV2不能通过看不见的五残基域连接子以立体化学上合理的配置连接。人们只能推测，PKD1和PKD2与类似AAV2的病毒的相互作用在进入的不同时间点，这些域来自不同的AAVR亚基，或者涉及构象重排。 来自一些AAV5丙氨酸替代突变体的低转导表型的证据支持了不同的AAVR足迹（红色，图1E），但并非全部（绿色），注意到突变数据并不像AAV2那样全面（图1E）。与早期的推测相关，AAV2表面，对应于AAV5上的PKD1足迹，包含一些突变会引起对转导的显著影响的残基，以及一些突变影响微不足道的残基（图1E）。 两种结构中PKD1之间的差异（2.3 Å rms）大于3 Å分辨率下预期的误差，尽管基本相似。统计数据被扩大了，因为域的N末端附近差异高达10 Å，相邻环（334-336和386-387）的背骨差异为2 Å，该区域的图很弱，以及Gly361附近的路径不清晰时差异为6 Å。 Zhang等人的原子模型有AAVR Val305与AAV5 Ser319相互作用，但是N末端区域在两个图中都不清楚。当低通滤波到10 Å时，在这个分辨率下主链无法解析，PKD1的包络清晰，并认为结构可能与同源物相似，没有差异允许N末端区域与AAV5在Zhang等人的模型中相互作用。的确，很可能缺少这样的相互作用允许域围绕其C末端旋转，解释了图中观察到的无序。 在其C末端，PKD1通过其与AAV5的相互作用被锁定到位。与2.1 Å未结合结构比较，AAV5诱导的变化很小。在2.5 Å分辨率下可视化复合物可以识别推定的氢键和盐桥。特别值得注意的是AAV5表面上的两个负电荷口袋，AAVR Arg353和His351（PKD1的）插入其中。 AAV-1与AAVR的复合物结构与AAV2非常相似。这与早期的域敲除结果一致，对于AAV1和AAV8，像AAV2一样，关键的要求是PKD2，但PKD1比AAV2有更大的影响。类似AAV4的病毒不与AAVR结合，AAV5（和很可能类似的病毒）仅与PKD1结合，但是考虑到AAV1、2和8代表了AAVs最大分支的系统发育多样性，很可能，除了已知的例外，AAV2代表了其他AAVs。然而，足迹内序列变异如何更微妙地调节相互作用还有待确定。 5.5.AAVR受体结合与糖基附着 在分析了AAV2、AAV5和AAV1之后，Zhang等人得出结论，AAVR结合与糖基附着无关。虽然对AAV5来说可能正确，但对于大多数AAVs来说，以AAV1和AAV2为例，考虑到病毒的对称性，PKD2足迹与糖基附着位点重叠（图2）。在图2中，与AAVR结合的冲突被低估了，因为小模拟物在结构中是生物相关多糖的替代品。在类似AAV2的病毒上，AAVR结合似乎与糖基附着竞争。因此，如果糖基和AAVR同时参与，它必须是在AAV2的不同对称等位点上。图1还显示，PKD2糖基化位点远离病毒，表明是其他细胞表面糖基介导附着。 图 2. 腺相关病毒受体（AAVR）结合位点与糖基附加位点的比较。AAV2（棕色）和AAVR（青色PKD2）如主文本图2B所示。叠加上的是fondaparinux（空间填充，灰色碳原子），一种肝素类似物，来自AAV2复合物，以及唾液酸（SIA，绿色碳原子）来自AAV1复合物，以及它们的对称等价物。还指出了来自与AAV3B的低分辨率复合物的蔗糖八硫酸盐（SOS）的位点，AAV3B是一种使用精氨酸（R594）在三重表面上结合肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）的血清型。AAV5的SIA 'A'位点映射到相同的SOS区域，而涉及AAV4和AAV6糖基附加的残基也接近三重凹陷。AAVR的糖基化位点，Asn472和Asn487向外，远离AAV，表明AAV附着到其他细胞外糖基，这与AAVR的结合不依赖于其糖基化一致。AAV上的糖基附加位点是通过使用比细胞外糖基小得多的类似物揭示的。可以想象，结合的多糖与AAVR PKD2之间存在广泛的冲突，这意味着，如果两者都结合在类似AAV2的复合物中，那么必须是结合在病毒上不同的对称等价位点上。对于较小的AAV5样病毒组，三重位点上的'A'位点，涉及SIA依赖的转导，与AAVR的PKD1结合位点相距较远。另见在线补充信息中图S6的相应立体图。 5.6.抗体和AAVR足迹的重叠 尽管结构相似，但两篇论文在评估AAVR结合位点与强烈中和单抗A20[61,62]表位的重叠程度上有所不同。当考虑到二十面体病毒对称性，在叠加结合蛋白的结构时，AAVR与Fab′ A20表位的核心重叠（图3A）。Meyer等人报告了与AAV2中和抗体和其他表位的重叠，并提出AAVR结合的竞争性抑制，因此病毒进入，可能是AAVR依赖血清型中和的几种可能机制之一。 图 3. 腺相关病毒受体（AAVR）与抗体足迹的比较。视图方向和颜色方案与主文本图1中的相似。(A) AAV2与AAVR（青色）和单克隆抗体（mAb）A20（红色）的复合物结构被叠加，突出显示了重叠，暗示进入抑制可能是中和机制。(B) PKD1的足迹与AAV5中和抗体（NAb）ADK5b （蓝色）的接触面有广泛的重叠，但与NAb HL2476（白色/绿色）没有重叠。(C) 突出显示了被认为是非中和性的抗-AAV5单克隆抗体的接触面：3C5为蓝色，ADK5a为洋红色，两者均为紫色。AAVR与ADK5a之间的重叠之前没有预料到，但在高ADK5a浓度下现在已经报道了竞争性结合抑制。另见在线补充信息中图S7-S9的相应立体图。 对于AAV5，PKD1结合位点与中和抗体ADK5b的重叠程度令人惊叹（图3B）。对AAV5的重叠评估更加困难，因为相关抗体结构没有存放在公共数据库中（表1）。PKD1和NAb HL2476（图3B）的AAV5接触残基是不同的，但复合物的插图表明在AAV5表面以上几埃的地方可能存在冲突。对于mAb 3C5和ADK5a（图3C），可以提出类似的论点，据报道它们是非中和性的。的确，ADK5a和AAVR之间的竞争现在已经通过实验确定，这引发了ADK5a可能在比以前测试的更高滴度下具有中和性的可能性。 空间重叠只是决定抗体能否在体内保护免受AAVR介导进入的几种决定因素之一。每个衣壳上有60个对称等价的结合位点，抑制程度将取决于抗体结合强度和饱和度。抗体可能通过多种机制中和AAV。然而，随着我们最近认识到基于糖基的附着和AAVR介导的进入是不同的，细胞结合不能再被假定为感染性的代理。是时候重新评估中和机制了，进入抑制可能比之前认为的更常见。 6.超越AAVR，一个并非完全普遍的受体 多项研究表明，40多个宿主基因影响AAV转导（表2）。虽然AAVR最初是研究的焦点，但其他基因可能在进入和运输中发挥作用。它们可能是AAVR的合作伙伴，或者在AAVR介导的途径上与AAV在不同步骤发生相互作用。有些可能还在AAVR非依赖性进入中发挥作用，稍后将讨论。需要注意的是，涉及的基因产物并不一定直接与AAV相互作用，但可能调节所需的细胞功能，特别是糖基合成和内体运输。注释潜在角色，并充分表征最感兴趣的角色是一项艰巨的任务，才刚刚开始（见未解决问题）。 正如前面提到的，Dudek等人揭示了AAVR非依赖性AAV菌株。他们在转导野生型和AAVRKO A549、HeLa和Huh7细胞中测试了18种自然分离株，以及定向进化变体和假定的祖先构建物。AAV4（源自非洲绿猴）和相关的猕猴衍生嵌合体AAVrh32.33在AAVRKO细胞中以野生型水平转导，表明存在替代的进入途径/受体。有趣的是，对于AAVR依赖性AAV6.2和AAV3，加入辅助病毒Ad5在AAVRKO细胞中产生了一些转导，这表明进入机制的复杂性需要进一步考虑。 6.1.探索其他候选宿主因子 AAVR非依赖性AAV4样类群的发现，重新聚焦了对G蛋白偶联受体GPR108的关注，它在基因陷阱筛选中突变频率排名第三，并且在AAVRKO背景下筛选CRISPR敲除库时变得突出。事实证明，它不仅对AAVR非依赖性AAVrh32.33很重要，而且是许多AAVR依赖性血清型（除了AAV5）的第二个要求。然而，对于这些血清型，GPR108的过度表达并不能补偿AAVR的缺失。Dudek等人将GPR108依赖性定位于VP1u区域，该区域在内体逃逸之前的构象变化中被隐藏在AAV衣壳内。这和GPR108在TGN的位置暗示了它在运输到核周区域或内体释放中的下游作用。GPR108也最近被Meisen等人的CRISPR筛选所涉及。它的确切作用机制、与AAV的关联表征以及分子相互作用的映射仍是优先事项。 在基因陷阱和CRISPR筛选中被涉及的是ATP2C1（表2），编码SPCA1钙泵。ATP2C1的敲除降低了多种AAV血清型的转导，但可以通过细胞内Ca2+螯合剂来挽救。影响可能主要是间接的：低Ca2+似乎需要触发VP1u的暴露，但可能存在多效性效应。TM9SF2在基因陷阱列表中排名第四，并被CRISPR筛选所涉及。Meisen等人验证了它的重要性，并提出它可能通过适当定位NDST1来支持用作附着因子的糖基合成，而不是与AAV直接关联。反过来，NDST1与其他筛选命中的EXT2和SLC35B2在HS合成中起作用，可能是以MOI依赖的方式。已经对GPR108、ATP2C1、TM9SF2和NDST1（表2）进行了部分表征的工作强调了完成我们对AAV附着、进入、运输和解壳的理解所需的工作。 7.AAV库筛选将功能映射到衣壳结构 对受体介导进入的理解进展（前面讨论）始于对宿主细胞基因组的系统探测，但也可以查询病毒基因组。Nakai实验室开发的丙氨酸扫描突变体的条形码库，例如，允许在Illumina条形码测序后，使用KIAA0319L敲除突变体特异性非编码标签，将可选择表型映射到衣壳结构。这为开发改进载体的库筛选设计提供了信息，并有助于定位参与受体结合、中和抗体逃逸和血液清除等表型的相互作用位点，补充了结构研究。 Church实验室的一个令人兴奋的发展是对所有单密码子替代、插入和删除的病毒库的表型进行了分类。一个新的开放阅读框（ORF）被涉及在衣壳组装中，并且为高效选择所需的衣壳特性指明了路径。通过成功比较中和逃逸突变体的分布与之前AAV2与单抗（mAb）A20结合的结构，证明了研究病毒相互作用的潜力。 未解决问题： AAV2样和AAV5样组内AAVR足迹的血清型变异程度有多大？ AAV血清型和载体变体的宿主特异性（或组织特异性）能否通过AAVR相互作用合理化？ AAV在细胞进入时必须与哪些其他宿主因子相互作用？ 在AAVRKO背景下使用敲除库，GPR108被确定为AAV-4样AAVR非依赖性病毒所必需，但也增强了许多AAVR依赖性病毒的转导。 能否通过在双重敲除中准备的库对AAVR和GPR108依赖性血清型进行额外筛选来识别替代途径？ 使用敲除库涉及的约40个宿主基因产物中，哪些与AAV有直接相互作用，哪些只是支持AAV所需的细胞过程？ 有证据表明更高阶的相互作用吗，即AAV与一个宿主蛋白的相互作用是否取决于其他宿主因子的存在？ 关键宿主因子在细胞进入、运输和解壳的哪些阶段参与？ 有任何必需的宿主因子介导AAV所需的构象转变吗？ 受体能通过差异表达、亚型、翻译后修饰等，调节AAV的组织特异性吗？ AAV对细胞的转导能否通过受体结合界面的突变在上调和下调中调节？ 中和抗体的表位在多大程度上也是受体相互作用的关键？能在保持细胞转导效率的同时设计出免疫逃逸载体吗？ 8.结论 虽然AAV已成为许多新批准的临床基因治疗的首选载体，但在传递效率和特异性以及对所需高剂量的免疫反应方面仍存在挑战。为了工程化解决方案，我们应该解决我们对AAV-宿主相互作用基本分子理解上的空白。最重要的是AAV进入细胞的机制。 我们可以很容易地想象受体相互作用作为AAV细胞特异性的决定因素。在调节细胞趋向性方面将面临许多挑战，包括现在明显的关键受体AAVR的高度保守性。在短期内可能对AAV载体进行修改以减少免疫中和，并且至关重要的是要了解病毒的哪些部分参与了对进入至关重要的相互作用，并且在免疫调节方面是禁区。 我们的理解在5年内发生了多么大的变化是令人惊讶的。糖基已从“主要受体”降级为低特异性附着因子。全基因组筛选已经鉴定出几个对转导影响更大的宿主蛋白，而不是糖基或之前报道的核心受体。其中最重要的是AAVR，它在运输中很重要，GPR108在下游过程中很重要，这些过程尚待阐明。 到目前为止，只有AAVR的相互作用通过最近的冷冻电镜进展进行了详细表征。它产生了自己的惊喜。我们仍然需要解释AAV2和AAV5的相互作用为何如此不同。我们还看到AAVR与抗体结合之间的干扰比预期的细胞结合试验要多，促使我们重新评估我们对中和机制的了解。可以预期，AAV与其他宿主分子的相互作用的表征将提供对转导至关重要的过程的见解，我们可能现在还无法想象，这将为改进载体的设计提供更加坚实的基础。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。