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1、研究背景 使用脂质纳米颗粒（LNP）吸入传递信使RNA（mRNA）在治疗肺部疾病或作为粘膜疫苗方面具有巨大的前景。然而，雾化过程中LNP的解体和聚集导致的递送效果不理想是一个主要障碍。为了解决这一问题，我们开发了一种电荷辅助稳定化（CAS）技术，该技术可以将LNPs中的电荷辅助稳定化（CAS）技术应用于聚合物中，并将其应用于LNPs之间的相互排斥，以提高其胶体稳定性。通过使用肽-脂质偶联物优化表面电荷，领先的CAS-LNP在雾化过程中表现出卓越的稳定性，从而在小鼠，狗和猪中有效地传递肺mRNA。吸入CAS-LNP主要转染树突状细胞，触发强大的粘膜和全身免疫反应。我们证明了吸入CAS-LNP作为SARS-CoV-2 Omicron变体疫苗和抑制肺转移的癌症疫苗的有效性。我们的研究结果阐明了雾化LNPs的设计原则，为开发吸入式mRNA疫苗和治疗方法铺平了道路 论文标题：Charge-assisted stabilization of lipid nanoparticles enables inhaled mRNA delivery for mucosal vaccination 论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-53914-x 2、研究结果 结果1：表面负电荷CAS-LNP的制备 mRNA由于核苷酸单体上的磷酸二酯而富含负电荷，主要通过带正电的可电离脂质的静电吸引被包裹在LNPs内。因此，如果引入另一种带负电荷的脂质使LNPs表面带负电荷，则必须仔细考虑该脂质的基团电负性和亲水性。带负电荷的脂质可以与mRNA竞争与可电离脂质的结合，从而干扰mRNA的包封。此外，具有弱亲水性头基团的脂质可能难以分布到LNP表面。除了磷酸盐，羧酸是生物体中另一种常见的带负电荷的基团。磷酸二酯（~ 1.5）的pKa低于羧酸（~ 2-5）。因此，带正电的可电离脂质应该比羧酸对mRNA的磷酸基团有更强的亲和力。在不同来源的羧酸中，我们选择了具有高生物相容性和易于制备的氨基酸28。通过氨基酸序列的设计，可以有效地增强多肽的亲水性，调节多肽的电荷性质。通过将多肽连接到长烷基链脂质上，构建带负电荷的肽脂偶联物，可以稳定地结合在LNPs表面。基于此，我们将肽序列设计为天冬氨酸、丝氨酸、丝氨酸和半胱氨酸（DSSC），因为DSSC有一个半胱氨酸基团，易于与脂质结合，一条含天冬氨酸的羧酸侧链提供负电荷，以及两条不带电的亲水性丝氨酸，以提高肽-脂偶联物的亲水性，从而驱动其在LNP表面的存在。然后，我们使用DSSC合成了带负电荷的两亲性寡肽辅助脂质偶联物（图1b）。虽然LNP表面有PEG-脂质，但我们没有将DSSC与PEG-脂质偶联，因为在雾化过程中，PEG的数量会极大地影响LNP的稳定性。为了消除PEG对LNP29电荷辅助稳定性假设的影响，我们选择1,2-二油基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）偶联寡肽，因为已经证明DOPE主要存在于LNP29的外膜上。此外，用n -琥珀酰酰-3-（2吡啶二硫代）丙酸酯（SPDP）可以很容易地修饰DOPE的氨基，生成PDP-DOPE，随后与DSSC偶联。通过质谱（MS）、1H核磁共振（NMR）和紫外可见光谱（UV-Vis，补充图1-3）证实了PDP-DOPE和DSSC-DOPE的成功合成。 作者采用mRNA-1273 COVID-19疫苗中使用的LNP配方，其可电离脂质为庚烷-9-基8-（2-羟乙基）（6oxo-6-（十一烷基氧基）己基）氨基辛酸酯（SM-102），辅助脂质为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸（dsc），胆固醇和1,2-二肉豆醇-乙酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (DMG-PEG2000)，摩尔比分别为50:10 . 38.5:1.5 (SM102-LNP)30。为了制备CAS-LNP，在微流控混合过程中，将等摩尔量的dsc - dope与编码萤火虫荧光酶（mFluc）的mRNA替换，将dsc - dope掺入SM102-LNP中。我们整合了不同量的DSSC-DOPE（按摩尔计占所有脂质的0.6%、2.5%和10%）来调节CAS-LNP的表面电荷（图1c）。动态光散射（DLS）测量表明，CAS-LNPs和SM102-LNP具有相似的水动力直径，范围在130 ~ 140 nm之间，尺寸分布较窄（图1d）。CAS-LNPs和SM102-LNP的mRNA包封效率均超过80%（图1e）。低温透射电镜（Cryo-TEM）图像描绘了2.5% CAS-LNP的球形形貌，具有实心核（图1f）。这些结果表明，DSSC-DOPE的掺入不影响LNP的组装和mRNA的整体包封。2.5% CAS-LNP的pKa与SM102-LNP相似（图1g）。2.5% CAS-LNP在37°C的PBS中保持胶体稳定性（补充图4）。ζ电位测量表明SM102-LNP具有接近中性的表面电荷（- 2.39 mV），与先前的发现一致31。随着DSSC-DOPE用量的增加，CAS-LNPs的表面电位逐渐下降（图1），证实了DSSC-DOPE在LNP外膜上的成功整合。齐电势数据还表明，DSSC的负电荷并没有完全被表面PEG屏蔽 结果2：吸入CAS-LNP的稳定性及mRNA递送效果 接下来，作者评估了CAS-LNP在雾化过程中是否能在高剪切力下保持胶体稳定性。虽然大多数用于静脉或肌肉给药的LNPs分散在磷酸盐缓冲盐水（PBS）32中，但PBS中的高浓度离子可以屏蔽CAS-LNPs之间的静电排斥。为了减轻这种影响，我们将所有LNPs分散在0.3 × PBS中，以降低溶剂的离子强度。我们采用了临床使用的振动网状雾化器（Aerogen Solo），利用多孔金属网的高频振荡雾化SM102-LNP或CAS-LNP解决方案。为了评估雾化过程中LNP的稳定性，我们通过测量雾化前后包裹mRNA的数量来量化LNP的完整百分比。如图1i所示，雾化后检测到~ 17%的完整SM102-LNP，提示明显的崩解和mRNA泄漏。与SM102-LNP相比，所有cas -LNP的稳定性都有所提高，这表明增加LNP的表面电荷是提高其胶体稳定性的有效策略。有趣的是，尽管含有10% DSSC-DOPE （10% CAS-LNP）的CAS-LNP具有最低的表面电位，但其稳定性低于2.5% CAS-LNP。综上所述，这些数据表明，CAS-LNP吸入mRNA的有效递送依赖于雾化过程中其胶体稳定性，从而补偿细胞摄取减少。这些发现强调了雾化给药与全身注射在LNP设计原则上的根本区别。虽然静脉或肌肉给药后LNP的疗效很大程度上取决于它们的细胞摄取和内体逃逸，但吸入LNP需要在雾化过程中的胶体稳定性和随后与细胞的相互作用之间取得微妙的平衡。 结果3：CAS-LNP提高给药效率的机制   为了探讨吸入CAS-LNP稳定性的提高是否由于其表面电荷，我们首先评估了CAS-LNP在不同盐浓度的PBS中雾化时的稳定性。盐的存在可以屏蔽LNPs之间的静电斥力，潜在地损害表面电荷带来的增强稳定性。正如预期的那样，所有CAS-LNPs在1倍PBS中表现出与SM102LNP几乎相同的稳定性，这表明在雾化过程中完全失去了电荷辅助稳定性（图2i）。然而，当我们逐渐降低盐浓度时，我们观察到与雾化后的SM102-LNP相比，完整cas - lnp的百分比逐渐大幅增加。然后，我们研究了SM102-LNP和2.5% CAS-LNP在0.1 ×和1 × PBS中对小鼠的吸入递送效果。SM102-LNP在两种溶液中的mRNA表达量均较低且相似，而2.5% CAS-LNP在0.1 × PBS溶液中表现出较强的肺部发光信号。小鼠和切除肺的定量分析显示，与0.1×PBS中的SM102LNP相比，0.1×PBS中2.5%的CAS-LNP的mRNA表达量分别提高了约5.5倍（图2k）和20.3倍（图2m）。然而，在1 × PBS中使用2.5% CAS-LNP时，mRNA的表达明显降低。综上所述，这些发现表明CAS-LNP在雾化过程中的胶体稳定性源于其表面电荷。2.5% CAS-LNP在低离子强度溶液中使用时，对吸入mRNA递送非常有效。因此，我们选择2.5%的CAS-LNP在0.1 × PBS中进行进一步研究，除非另有说明，否则将其称为CAS-LNP。为了验证DSSC必须携带羧基作为负电荷来源并具有足够的亲水性以呈现在LNP表面的设计原则，我们尝试了不同的带负电荷的分子，包括1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸（DOPA）（携带磷酸单酯，图3a）和十六烷酸（HA）（携带羧基，图3b）作为替代品。我们用等量的DOPA或HA代替CAS-LNP中的DSSC-DOPE，分别得到DOPA- lnp或HA- lnp。所有LNPs均成功合成，尺寸均匀（补充图14a）。然而，DOPA和HA均不能提高LNP雾化过程中的稳定性和雾化输送效率（图3d-f a和补充图14c）。具体来说，DOPA的使用减少了mRNA的包封，仅显示出轻微的表面电位下降（- 4.33 mV，图3c和补充图14b），这表明DOPA的磷酸单酯可能与mRNA竞争与可电离脂质的结合。另一方面，HA的掺入不影响mRNA的包封效果（Supplementary Fig. 14b）和LNP的表面电位（- 2.89 mV, Fig. 3c），这表明HA的羧基的亲水性不足以使其在LNP表面排列。因此，HA被纳入LNPs的核心，无法将表面电荷传递给LNPs。用DSSC肽修饰HA（图3b和补充图15）后，得到的HA-DSSC偶联物有效降低了HA-DSSC-LNP的表面电位（- 9.43 mV，图3c），显著增强了雾化过程中LNP的稳定性（图3d）和雾化后mRNA的表达（图3e， f和补充图14c）。这些结果强调了在选择负电荷分子时仔细设计的重要性，负电荷分子应具有理想的pKa和亲水性。为了进一步验证CAS策略，我们设计了三种肽-SSSC、DDSC和dddc -分别携带1、3和4个羧基（图3g）。SSSC、DSSC、DDSC和DDDC的等电点（pi）计算值分别为5.70、3.57、3.51和3.49（图3h）。这些多肽的pi值均低于5.7，表明在0.1 × PBS （pH = 7.4）中带负电荷。我们合成了SSSC-DOPE、DDSC-DOPE和DDDC-DOPE，并用它们代替DSSC-DOPE制备了SSSC-LNP、DDSC-LNP和DDDC-LNP 结果4：CAS是一种通用战略。吸入CAS-LNP穿透黏液层，转染免疫细胞。 为了评估CAS策略的普遍性，我们将CAS策略分别应用于用于治疗遗传性经甲状腺视黄醛介导的淀粉样变性（MC3-LNP）和BNT162b2 COVID-19疫苗（ALC0315-LNP）的其他临床LNP制剂。MC3-CAS-LNP和ALC0315-CAS-LNP是通过加入2.5%的DSSC-DOPE取代等摩尔量的dsc来制备的（补充图23a）。zeta电位测量（图4e）表明，MC3-LNP和ALC0315-LNP也具有接近中性的表面电荷（分别为- 3.99 mV和- 3.92 mV）， MC3-CAS-LNP和ALC0315-CAS-LNP的表面电位下降（- 11.33 mV和- 9.14 mV）。然后，我们评估了它们在雾化过程中的稳定性和随后在体内的mRNA递送效果。虽然MC3-LNP和ALC0315-LNP不适合雾化递送，但MC3-CAS-LNP和ALC0315-CAS-LNP在雾化过程中的稳定性（图4f）和mRNA表达比原始配方显著增强（图4g， h和补充图23b）。这些数据清楚地表明，CAS策略可以很容易地应用于其他LNP制剂，使其成为将原本不适合雾化输送的LNP转化为可吸入制剂的理想策略。此外，作者还比较了CAS-LNP与最近报道的吸入制剂的mRNA递送效果。 图23)。我们的研究结果表明，与T1-525、nld19和LNP2-236相比，CAS-LNP具有显著更高的mRNA递送效率。图23b， c)。值得注意的是，这些吸入制剂都利用了带正电荷的DOTAP脂质（T1-5中28%，NLD1中5%，LNP2-2中50%）。与可电离脂质的叔胺相比，DOTAP携带的季胺对mRNA具有更强的结合亲和力。因此，DOTAP主要存在于LNP内部。例如，使用10%或40% DOTAP（摩尔）的SORT LNPs的表面电位分别为~ 1.34和7.57 mV37。50% DOTAP的肺SORT LNP表面电位为- 0.89 mV38。这些结果表明，添加DOTAP不会给LNP带来表面电荷。DOTAP可能通过另一种尚未完全阐明的机制改善LNP的肺输送。 作者研究了CAS-LNP是否能有效地在大型动物中传递mRNA，这些动物的呼吸系统生理比小鼠更接近人类39,40。我们首先比较了吸入SM102-LNP和CAS-LNP后巴马小型猪mRNA的表达效率。猪在LNPs中雾化注射0.3 mg/kg mFluc。给药3小时后，腹腔注射荧光素，分离气管和肺，进行生物发光成像。如图4i所示，cas - lnp处理组的mFluc表达高于sm102 - lnp处理组。此外，我们证实CASLNP也可以成功转染Beagle犬的肺（图4j）。这些结果表明，CAS-LNP可以通过吸入有效地将mRNA传递给不同的物种，包括小鼠、狗和猪，这表明其具有进一步临床转化的巨大潜力。 结果5：吸入CAS-LNP诱导强烈的全身和粘膜免疫反应 为了评估CAS-LNP作为COVID-19吸入疫苗的潜力，我们合成了编码SARS-CoV-2 Omicron变体（mCOVID）刺突蛋白的mRNA，并将其封装到CAS-LNP或SM102-LNP中。然后将这些LNPs雾化、收集，并在第0、14和28天通过口咽滴入雌性C57BL6小鼠，每次剂量含有5µg的C o V I D p（图6a）。以吸入PBS的小鼠为对照。 随后，我们分离血清、支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织，分析第三次免疫后一周的全身和粘膜免疫反应。我们首先用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中抗原特异性总IgG抗体。与SM102-LNP相比，CAS-LNP诱导的总IgG应答更高（图6b和补充图32）。然后，我们使用基于Omicron假病毒的测定分析了血清的中和能力。值得注意的是，与接受SM102-LNP和PBS治疗的小鼠相比，接种CASLNP的小鼠表现出显著增强的中和能力（图6c），表明CAS-LNP在诱导全身体液免疫应答方面的有效性。 COVID-19病毒通过呼吸道进入血液。 粘膜IgA在抵抗病毒试图通过呼吸道粘膜进入的初始防御中起着关键作用。为了研究粘膜免疫反应，我们使用ELISA检测了BALF中抗原特异性IgA水平。SM102-LNP表现出与PBS组相当的IgA水平（图6d），表明其触发IgA反应的能力有限。相比之下，CAS-LNP诱导的IgA水平显著升高，导致BALF具有强效的病毒中和能力，这是通过基于Omicron假病毒的实验测量的（图6e）。这些结果表明，CAS-LNP刺激气道内有效的体液免疫反应，这可能赋予对呼吸道病毒的优越保护。此外，我们通过用Omicron肽池重新刺激肺细胞，分析了肺细胞的免疫反应。采用IFN-γ酶联免疫吸附斑点（ELISpot）法分析产生干扰素γ (IFN-γ)的细胞。值得注意的是，CAS-LNP处理的小鼠产生IFN-γ的细胞数量最多，分别是SM102-LNP和pbs处理小鼠的15.5倍和46.4倍（图6f， g）。CAS-LNP对IFN-γ产生细胞的强大诱导表明，激活了肺中有效的抗原特异性细胞免疫反应，可以有效地靶向和消除感染细胞，从而增强病原体清除能力，限制感染严重程度。 组织常驻记忆T （TRM）细胞在抵抗各种呼吸道病原体方面起着至关重要的作用，并被认为是粘膜免疫反应的基准47。研究表明，粘膜组织中的TRM细胞可以长期保护粘膜病原体，包括SARS-CoV-2，其中TRM细胞在重症和轻度COVID-19患者的肺部诱导并持续长达10个月48。我们用流式细胞术分析了肺和balf中T细胞和TRM的数量（补充图33-37）。SM102-LNP和CAS-LNP处理的肺中CD4 +和CD8 + T细胞数量相似，均高于PBS处理（图6h， k），表明LNPs在吸入后引起促炎反应。TRM的发展需要首先将T细胞暴露于抗原。因此，与SM102-LNP相比，CAS-LNP mRNA表达的增强可能导致TRM水平升高。事实上，与SM102-LNP和PBS治疗相比，CAS-LNP治疗导致肺中CD4 + TRM （CD4 + CD44 + CD69 + CD11a +，图6i， j）和CD8 + TRM细胞（CD8 + CD44 + CD69 + CD103 +图61，m）的显著增加。此外，CAS-LNP增加了BALF内CD8 + T细胞和CD8 + TRM细胞的数量（图6n-p）。 综上所述，这些发现强调了CAS-LNP在触发强大的全身和粘膜免疫反应方面的效力。作为一种吸入式COVID-19候选疫苗，CAS-LNP能够刺激免疫系统的多个分支，提供全面的病毒保护。与SM102-LNP相比，CASLNP在雾化过程中的优越稳定性对其疗效起着至关重要的作用，因为它可以显著增强呼吸道中抗原的mRNA传递和表达。这些发现强调了脂质纳米颗粒制剂在调节粘膜免疫反应中的重要性，并为未来旨在加强粘膜免疫以保护呼吸道的免疫策略的设计提供了有价值的见解。 识别微信二维码，可添加药时空小编 请注明：姓名+研究方向！

曾经轻松坐拥上亿患者的玻璃酸钠滴眼液，业绩开始扶不住了。数据显示，2020年以来，玻璃酸钠滴眼液在院内的销售额持续走低，尤其是在被纳入医保后，玻璃酸钠滴眼液的销售额更是急转直下。 如今，玻璃酸钠滴眼液可谓内忧外患。一边是环孢素滴眼液横扫海外干眼病市场后，开始席卷到国内。另一边是各大药企频频下注，干眼病几乎成为兵家必争之地，新机制治疗药物不断取得临床试验的突破进展。 01 一代神药 在所有的干眼症药物中，玻璃酸钠滴眼液是人们最熟悉的一类。 有研究数据显示，玻璃酸钠眼用制剂是我国医院市场销售规模最大的干眼症眼药水，市场占比超25%。早在2018年，玻璃酸钠滴眼液在我国终端销售额就突破了10亿元，2019年到达销售峰值12亿元。其中，国内玻璃酸钠滴眼液市场长期被德国悟兹法姆药业、日本参天制药等海外药企占据，份额占比超8成。除此之外，珠海联邦、齐鲁制药、江西珍视明药业等国内药企开发的玻璃酸钠滴眼液，也占有一定的市场份额。 2020年以来，玻璃酸钠滴眼液的销售额虽然仍保持在10亿元以上，但已经呈现明显的下滑趋势。2021年5月，玻璃酸钠滴眼液药被纳入第四批集采品种。到2022年上半年，玻璃酸钠滴眼液的终端销售额同比下滑超30%。 玻璃酸钠滴眼液一度统治干眼症用药市场的背后，是在临床实践中，干眼症诊疗的规范程度仍有待提升。 所谓干眼症，是指眼表失去了泪膜的保护，直接暴露在外界刺激下，往往会产生眼部干涩感、烧灼感、异物感、针刺感、眼痒、畏光、眼红、视物模糊、视力波动等症状。在眼球表面，有一层泪膜，每次眨眼，就会有新的泪膜形成，均匀覆盖在眼表。而一旦泪膜的质或量或液体动力学异常，就可能会出现各种眼部不适症，甚至视功能障碍。 作为一种慢性眼表疾病，干眼症形成的原因有很多。总体而言，睑板腺功能障碍造成油脂层减少，导致泪膜蒸发过快，是造成干眼症最直观的因素。比如，长时间凝视电子屏幕，或者生活在大风、空气过于干燥的环境中，都有可能干眼症。 在所有的眼科疾病中，干眼症是发病率第二高的一类。发病率最高的是近视，而近视的治疗手段以器械为主。数据显示，干眼症患者约占眼科就诊患者的60%以上，但有临床医生表示，干眼症就诊率很低，仅5.38%。 临床上，滴人工眼液是干眼症治疗首选的给药形式。人的眼睛是一个复杂的稳态器官，由于血-房水屏障的存在，药物很难通过全身给药进入眼表组织。因此，现阶段，市场上90%的眼用制剂均是直接作用于眼部的局部给药形式。而干眼症作为一种眼表疾病，往往需要长期治疗才能重建和维持眼表系统稳态。 干眼症的分类及治疗方式  数据来源：动脉网根据公开资料整理 尽管对于不同类型和阶段的干眼症，临床指南给出了明确的差异化治疗方案，但在国内的临床实践中，原本被定义为轻度干眼症患者用药的人工泪液，几乎被用于任何阶段的干眼症患者。其中，最常见的人工泪液，即玻璃酸钠滴眼液。 通常，人工泪液采用等渗或低渗滴眼液的形式，可以润滑眼球、增加眼表润湿度、稀释炎症因子、降低泪膜渗透压等。不过，包括玻璃酸钠滴眼液在内的人工泪液，疗效都十分有限，患者用药的依从性也不高，对于干眼症流行的控制效果并不明显。 02 闯入者席卷而来 近年来，玻璃酸钠玻璃酸钠滴眼液的市场地位岌岌可危。其中，最大的威胁来自环孢素滴眼液。 与玻璃酸钠滴眼液主要通过润滑眼球，来缓解干眼症症状不同，环孢素滴眼液的作用原理，促进泪液的生成。具体而言，环孢素滴眼液是一种钙调神经磷酸酶抑制剂免疫抑制剂，选择性及可逆性地抑制T淋巴细胞的功能，并能抑制包括白细胞介素-2在内的淋巴因子的生成和释放，抑制NK细胞的杀伤活力，可作为局部免疫调节剂用于干燥性角膜结膜炎引起的眼炎症使得泪液分泌收到抑制的患者，从而促进泪液的生成。环孢素滴眼液治疗干眼的药物浓度为0.05%~1.00%，使用频率多为每天2次。在国外，环孢素是最常见的干眼症药物。 2002年，全球首款环孢素滴眼液获批上市。美国艾尔建(Allergan)研发的环孢素滴眼液Restasis，被FDA批准用于中重度干眼病治疗的药物是。在Restasis上市后的十余年间，一直没有干眼症新药获批上市。Restasis的销售额也一路走高，2019年，Restasis在美国销售额达到11.88亿美元，此后的峰值年销售额更是达到近15亿美元，成为眼科用药中一个现象级的存在。 Restasis的大卖，将环孢素滴眼液的开发推向高潮。 2015年，日本参天维卡思®（环孢素滴眼液（III）），在欧洲上市。2022年5月，这款药物获得中国国家药品监督管理局（NMPA）的正式批准，在国内上市，用于治疗4岁及以上儿童和青少年的严重性春季角结膜炎。2018年，印度太阳药业开发的环孢素Cequa在美国获批上市，成为FDA批准的首款胶束型滴眼液。2023年6月8日，Novaliq宣布FDA批准0.1%的VEVYE™（CyclASol）用于治疗干眼病的体征和症状，VEVYE™是第一种也是唯一一种用于治疗干眼症体征和症状的环孢素溶液。 仿制药方面，环孢素的开发竞争也十分激烈。2022年2月，FDA批准上市了Restasis的首个仿制药，即Mylan的环孢素眼用乳剂0.05%。此外，梯瓦制药、辉瑞、Akorn等9家药企都在推进Restasis仿制药上市。 在国内，包括环孢素在内的干眼症新药，已经对玻璃酸钠滴眼液形成了围剿之势。 现阶段，国内获批上市的环孢素滴眼液只有2款。除了前文提到的日本参天维卡思®外，2020年6月，兴齐眼药研发的干眼症治疗药物0.05%环孢素滴眼液（II）（兹润®）获国家药监局批准上市，用于与角结膜干燥症相关的眼部炎症所导致的泪液生成减少症状，成为国内首家获批上市的干眼症眼用制剂。 此外，更多的国内药企，则通过授权合作的方式，正大力引进海外畅销的干眼症新药。 2019年6月，太阳制药将Cequa®在大中华区的开发和商业化授权给了康哲药业。不过，在2021年5月，太阳制药在美国主动召回一批0.09%环孢素滴眼液，基于此，康哲药业决定主动暂停中国III期桥接试验，待收到符合公司质量要求的新批次试验用产品后，再启动桥接试验。 2019年11月，恒瑞医药从Novaliq公司获得CyclASol中国独家授权，代号为SHR8028。2021年3月在中国进行3期研究。2024年3月20日，恒瑞医药宣布，SHR8028的药品上市许可申请已获NMPA受理，申请上市的适应症为：治疗干眼的体征和症状，希望能够早日在国内上市。 国产方面，兆科眼科的环孢素A眼用凝胶为公司自研的2.2类改良型新药，目前新药上市申请已于2022年6月8日获国家药监局CDE受理。该药2023年1月陆续通过国家药监局的药品注册及临床试验现场核查，并通过广东省药品监督管理局的GMP符合性检查，向着最终注册及商业化迈进。该药如果上市，也将是兴齐眼药的强势竞争对手。 在环孢素滴眼液的合围之下，玻璃酸钠滴眼液的市场地位已然岌岌可危。那么，环孢素滴眼液又可以稳坐干眼症药物的江山吗？ 03 等待新霸主 实际上，还没有一款药物，可以长期占据干眼症用药的榜首。这也是越来越多MNC、Biotech都愿意在这一赛道落子的重要原因。 前文提到，全球干眼症患者人数众多。随着电子产品在日常生活中的应用普及，干眼症的发病率还在持续上升，这种原本被认为是老年病的眼疾，已经开始在中青年人群中爆发。 干眼症流行病学调查显示，全球干眼症患者3.44亿，占眼科门诊人次的30%，每年10%增长。在国内，根据《中国干眼专家共识（2020年）》统计，我国干眼症发病率约高达21%~30%。其中，各年龄段人群均有较高干眼症患病率，其中21岁至50岁人群干眼症发病率为22.5%，65岁以上人群干眼症发病率为33.75%。 与此同时，治疗干眼症尚没有一款长期行之有效的药物。医学上，对于干眼症发病机制已经颇完善，但能够采用的干眼症药物，治疗效果却往往差强人意，玻璃酸钠滴眼液、环孢素滴眼液都是如此。 背后的原因还是在于，眼睛的特殊结构对药物制备技术提出了更高要求。首先，眼睛的眨眼反射、鼻泪管引流等作用使药物在眼表的停留时间短、到达靶组织的药物量低。其次，泪膜、角膜等特殊构造降低了药物的渗透量。第三，滴眼液处方导致的限制，例如增粘剂容易出现视力模糊，防腐剂容易加重患者症状，患者对部分辅料耐受性差，局部不良反应发生率增加等。 现阶段，针对干眼症用药的特点，多种药物递送系统的药物陆续被开发出来。它们通常具备眼部滞留时间更长、生物利用度更高、安全更长效等特点。 2016年，武田制药开发的LFA-1拮抗剂Xiidra滴眼液，获FDA批准上市，用于治疗干眼症。2019年5月，诺华从武田制药手中收购干眼症药物Xiidra的全球权益。2022年，Xiidra的销售额达到4.87亿美元，直接导致主要竞争对手Restasis的销售额出现下滑。在国内，箕星药业引进的酒石酸伐尼克兰鼻喷雾剂，在11月末获批上市，成为国内首个获得批准的鼻用干眼治疗药物，也将对国内传统的干眼症用药市场形成冲击。 部分进展较快的干眼症新药  数据来源：动脉网根据公开渠道整理 当然，更重要的是，越来越多不同机制的干眼症新药密集进入临床开发的中后期。比如，Regene Rxe开发的抗炎类干眼症药物胸腺肽β4，Alcon AGe开发的促粘蛋白粉密剂Icomucrete、Sylentis SA开发的生物新药SYL1001、Senjue开发的SJP-0132等，都已经进入III期临床试验阶段。其中，眼下最重磅的干眼症新药，莫过于Aldeyrae开发的Reproxalap。 刚刚过去的11月，FDA正式接纳Aldeyra申请审查其用于干眼症的新药Reproxalap，并指定2025年4月2日作为药品评审的截止日期。作为这款药物在美国市场的受权许可方，该消息一处，艾伯维公司的股价迎来六连涨。 Reproxalap是一款有潜力成为“first-in-class”的在研小分子促炎性活性醛类物质（RASP）抑制剂，能降低RASP水平，达到抑制炎症缓解症状的作用。据报道，Reproxalap已在2000多名患者中进行了研究，未观察到明显的临床安全问题，轻度和短暂的滴注部位刺激是临床试验中最常见的不良事件。此前的临床试验显示，Reproxalap与溶媒相比，可减少眼睛发红并改善泪液产生，验证了良好的耐受性与安全性。 伴随更多干眼症新药上市，作为闯入者的环孢素滴眼液，或许也很快将迎来被围剿的命运。但我们更乐于见到的，是在这个过程中，持续增长的全球干眼症群体，能有更好的治疗方案。 *封面图片来源：壹图网 如果您认同文章中的观点、信息，或想进一步讨论，请与我们联系；也可加入动脉网行业社群，结交更多志同道合的好友。 近 期 推 荐 声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。 动脉网，未来医疗服务平台

来源：小药说药 前言 人类基因组的破译加上生物技术的进步，特别是单克隆抗体（mAbs）的里程碑式发现，使得生物治疗极大地改善了病人的生存时间和生存状态。目前，已经有超过300种生物疗法获得美国食品和药物管理局（FDA）批准，其中许多被批准用于治疗免疫和炎症性疾病。 2022年全球TOP100畅销药合计实现了4868亿美元的销售收入，自免疾病领域已经是仅次于肿瘤的第二大药物市场。跻身TOP100榜单的自免产品共18款，总金额达861.7亿美元。如今，自免领域已成为重磅炸弹的密集诞生地，也成为各大制药巨头业绩贡献的主要来源。 治疗靶点与开发药物 下表列出了经FDA批准用于自身免疫疾病适应症，以及处于关键3期临床试验或阳性的2期临床试验中的生物疗法。 白细胞介素-1 IL-1α和IL-1β定位于对无菌状态下和微生物介导的炎症反应的迅速响应。当上皮细胞、内皮细胞和血小板对组织损伤作出反应时，IL-1α作为一种报警素发挥作用。相反，髓系来源的亚型IL-1β是作为一种非活性蛋白合成的，需要炎症小体驱动的蛋白水解过程才能发挥活性。IL-1α/β属于较大的IL-1细胞因子家族，它利用IL-1受体辅蛋白（IL-1RAcP）与IL-1R1亚基配对产生MyD88依赖性信号。IL-1α/β功能也受天然拮抗剂IL-1Ra、sIL-1RAcp和诱饵受体IL-1R2的调控。IL-1α/β表达失调与以发热、皮疹、关节炎和器官特异性炎症为特征的多种全身性自身炎症性疾病（SAID）有关。 FDA已经批准了三种不同性质的生物疗法，但都是针对IL-1的。Anakinra是一种天然拮抗剂IL-1Ra的改良版本，它同时抑制IL-1α和IL-1β。Anakinra被批准用于治疗RA和CAPS，其半衰期短，为5-6小时，因此需要每天皮下注射。Anakinra对痛风也有效，尿酸单钠晶体刺激NLRP3激活和IL-1β产生。Canakinumab是一种IL-1β中和抗体，每4-8周皮下给药一次，被批准用于治疗全身性青少年特发性关节炎（SJIA）和SAIDs。Rilonacept编码IL-1R和IL-1AcP的胞外结构域，与IgG的Fc部分相连，优先中和IL-1β，批准用于SAIDs的每周皮下给药。 白细胞介素-6 IL-6是gp130细胞因子家族的一员，是许多稳态和炎症过程的中心组成部分。IL-6最初被鉴定为促进B细胞分化的T细胞衍生因子，现在因其在适应性免疫中的多效性活性而受到重视。它有助于Th17和T滤泡辅助细胞（Tfh）的分化，驱动髓样细胞分化，并与Th2细胞因子协同促进巨噬细胞极化为促纤维化表型。IL-6在肝脏急性期反应中起重要作用，增加包括C反应蛋白（CRP）在内的炎症蛋白，增强补体与病原体或死亡细胞的结合，对内皮细胞功能和上皮细胞完整性也有重要影响。 IL-6的广泛生物活性源于其调节多个细胞靶点的复杂性质。IL-6由多种细胞合成，并通过三种不同的细胞表面信号机制（即经典信号、反式信号和反式呈递）激活靶细胞，最终产生JAK/STAT信号。 Tocilizumab和sarilumab是FDA批准的两种IL-6R阻断性单抗，许多其他药物正在临床开发中。Tocilizumab和sarilumab被FDA批准用于治疗中重度RA，其中受影响关节滑液中IL-6水平升高，血清IL-6水平与疾病活动相关。这两种药物都能改善RA患者的炎症症状并减少影像学进展。 细胞因子释放综合征（CRS）是一种急性全身炎症性疾病，与许多基于抗体的治疗、化疗和T细胞参与的免疫治疗（如CAR-T细胞）以及严重感染相关。与T细胞参与疗法相关的CRS被认为是由活化的T细胞产生TNF-α，进而触发单核细胞和活化的巨噬细胞产生IL-6和IL-1β。CRS症状（例如发烧和低血压）的缓解通常在单剂量的Tocilizumab后实现。给药tocilizumab似乎并不影响T细胞参与疗法的抗肿瘤效果。 肿瘤坏死因子 TNF-α主要由免疫细胞和内皮细胞产生，并通过促炎信号和细菌产物显著上调；TNF-β(LTα)主要由淋巴细胞产生。TNF-α以三聚体膜结合形式（mTNF）表达并经历蛋白水解裂解产生可溶性三聚体sTNF。TNFR1广泛表达，而TNFR2主要表达于神经元、免疫细胞和内皮细胞。TNF-α具有多效性功能。TNF-α对病原体的最佳防御、淋巴器官的正常发育以及在神经元再髓鞘化、心脏重塑和软骨再生中的重要修复作用都是必需的。 目前有五种TNF抑制剂被FDA批准用于临床，全部都靶向TNF-α，其中依那西普另外抑制TNF-β。肿瘤坏死因子拮抗剂的分子类型反映了近二十年来生物治疗药物的发展。依那西普（TNFR2-Fc）是FDA批准的第一个Fc融合蛋白；infliximab是第一代嵌合单抗；adalimumab是来源于噬菌体展示的人源单抗；golimumab是来源于表达人IgG的转基因小鼠的人源单抗；certolizumab-pegol是一种从小鼠杂交瘤中分离的人源化Fab片段，经聚乙二醇化可延长其体内半衰期。 大多数肿瘤坏死因子拮抗剂显示出共同的临床疗效。然而，依那西普在克罗恩病（CD）的随机双盲安慰剂对照试验中无效，可能反映了TNF抑制剂治疗机制的差异。除了中和sTNF-α外，抗TNF抗体和certolizumab-pegol(而不是依那西普)可通过结合mTNF或阻断抗凋亡信号诱导固有层T细胞凋亡。此外，抗TNF单抗（而非依那西普或certolizumab-pegol）可通过Fc依赖机制诱导M2型创伤愈合巨噬细胞应答。因此，TNF拮抗剂之间的机制差异可能是导致其在CD中不同临床效果的原因。 CD20 CD20是一种B细胞标志物，其表达始于早期的前B细胞，但在向浆细胞的终末分化过程中丢失。它是一种四肽蛋白，是B细胞发挥最佳功能和免疫反应所必需的。 Rituximab是一种嵌合单抗，是FDA批准的第一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的抗CD20单抗。基于其在肿瘤学中令人惊讶的良好安全性，研究人员开始探索其在严重自身免疫性疾病患者中的应用。Rituximab目前被FDA批准用于治疗多种自身免疫性疾病。由于CD20既不在HSC上表达，也不在终末分化的浆细胞上表达，因此抗CD20单抗选择性靶向CD20+B细胞与先天性B细胞缺乏具有不同的免疫学后果。例如，用抗CD20抗体治疗后，血清IgG水平没有显著影响，而严重的X连锁无丙种球蛋白血症（其中B细胞不发育）则观察到缺乏免疫球蛋白。 最近的一项2期研究使用了obinutuzumab，一种具有增强ADCC和诱导B细胞凋亡能力的II型抗CD20单抗，已报道狼疮性肾炎患者的临床获益（NCT 02550652）。需要对obinutuzumab进行进一步的研究，以确认额外的B细胞消耗是否对狼疮性肾炎有益。 BAFF/APRIL肿瘤坏死因子超家族成员 BAFF和APRIL是TNF配体超家族的两种II型跨膜蛋白，它们的受体BAFFR、BCMA和TACI在B系细胞的存活和成熟以及功能中起着重要作用。 血清BAFF和APRIL水平在许多自身免疫性疾病中升高，包括SLE、Sjögren综合征和RA。Belimumab是一种人IgG1λ单抗，被批准用于治疗活动性自身抗体阳性的SLE。它抑制sBAFF三聚体，但不与mBAFF或APRIL结合。在关键的临床试验中，与SOC组相比，belimumab在SLE应答指数和健康相关生活质量终点方面有更大的改善。此外，belimumab降低了循环中原始B细胞、活化B细胞和浆细胞的数量；抗dsDNA水平降低，补体水平正常化。与对循环记忆B和T细胞缺乏影响一致，治疗一年后，先前存在的抗肺炎、破伤风和甲型流感抗体没有受到影响。 Atacicept是融合TACI胞外区的Fc融合蛋白，结合BAFF、APRIL和BAFF/APRIL异源聚体。在系统性红斑狼疮患者中应用Atacicept治疗后，血清IgM（∼70%）、IgG（∼30–40%）和IgA（∼50–60%）迅速下降，抗双链DNA抗体下降了∼40%。终止治疗后，抗体和自身抗体水平恢复到预处理水平。 整合素家族 整合素通过调节白细胞与血管的粘附来调节免疫细胞的运输，并促进白细胞向组织中的外渗。整合素异二聚体由18个α亚单位和8个β亚单位之间的配对组成，形成24种不同的受体复合物，它们在表达模式、配体特异性和功能上存在差异。 在MS中，α4β1（CD49d/CD29，VLA4）在T和B细胞上表达，并通过VCAM1与血脑屏障内皮细胞的结合促进淋巴细胞向中枢神经系统（CNS）的外渗。在胃肠道中，表达于T细胞上的α4β7可与Peyer氏斑高内皮小静脉和固有层小静脉上的MADCAM-1结合，促进炎症性肠病（IBD）致病性T细胞的外渗。 Natalizumab是一种α4阻断性单抗，被批准用于治疗CD和RMS患者。然而，RMS抑制淋巴细胞进入中枢神经系统的有效性的机制基础也为进展性多灶性白质脑病（PML）的罕见病例的发展提供了基础。第二代抗体，包括vedolizumab（对α4β7复合物有选择性）和etrolizumab（抗β7），通过针对IBD的肠道特异性整合素降低PML的可能性。Vedolizumab可诱导临床反应和缓解，FDA已批准用于溃疡性结肠炎（UC）和CD。除了阻断α4β7:MADCAM1相互作用外，etrolizumab还干扰E-钙粘蛋白+肠上皮细胞对αEβ7+IELs的保留。在一项2期临床试验中，与对照组相比，对UC患者使用etrolizumab治疗导致临床病情缓解的可能性更大。由于αEβ7+IELs是UC患者炎症细胞因子的重要贡献者，因此阻断α4β7和αEβ7整合素可能有额外的临床益处。 抗αL抗体Efalizumab阻断T细胞和B细胞表达的αLβ2（LFA1）与ICAM1的相互作用。除了阻断整合素外，Efalizumab还下调LFA-1的表达，LFA-1是T细胞与抗原呈递细胞（APC）形成突触所必需的。Efalizumab被FDA批准用于治疗中度至重度斑块型银屑病。然而，4名使用Efalizumab治疗3年以上的患者出现了PML，该药物已退出市场。 白细胞介素-12和-23及其下游效应物 IL-12和IL-23是两种密切相关的APC衍生的异二聚体细胞因子，分别由p35和p19亚单位组成，它们与一个共同的p40亚单位配对。这两种细胞因子，主要的应答细胞是T细胞和固有淋巴细胞（ILCs），在不同的细胞类型中，IL-12上调Th1主转录因子T-bet的表达并诱导IFN-γ的产生。以类似的方式，IL-23刺激诱导转录因子RORγt的表达和下游细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22和GM-CSF的表达。疾病的临床前模型和全基因组关联研究表明IL-12/23通路参与炎症性肠病和银屑病。 设计用于干扰IL-12/23通路各种成分的多种疗法已进入临床。两种单抗（ustekinumab和briakinumab）靶向p40亚单位，从而中和IL-12和IL-23。最近，效应细胞因子的IL-17家族引起了广泛关注，有5种单抗选择性中和IL-17A；2种单抗中和IL-17A和F；brodalumab靶向IL-17RA，一种IL-17A、B、C、E和F成员的共同受体。然而，虽然IL-17B-E的不同功能已被描述，但这些细胞因子不受IL-23的调节，它们在人类疾病中的作用仍未被充分研究。 此外，对阻断IL-22（fezakinumab）、IFN-γ（fontolizumab）和GM-CSF（namilumab和mavrilimumab）治疗的研究将提供进一步的见解，尽管它们还处于早期研究。 自免疾病的全球和中国市场 经统计，全球自身免疫疾病治疗药物处于稳定增长的趋势。弗若斯特沙利文数据显示，全球自身免疫疾病药物市场预计将由2021年的1,277亿美元，增长至2030年的1760亿美元，复合年增长率为3.6%。2021年，自身免疫疾病生物制剂市场规模为891亿美元，预计到2030年将增至1421亿美元，分别占2021年及2030年全球自身免疫疾病药物市场的69.8%及80.8%。 来源：弗若斯特沙利文报告 鉴于中国庞大的患者群体及自身免疫疾病创新疗法的进步，中国自身免疫疾病药物市场有望快速增长，由2017年的17亿美元增长至2021年的30亿美元，复合年增长率为15.2%，估计2030年将达到231亿美元，2021年至2030年复合年增长率为25.5%。估计生物药在中国自身免疫疾病中的份额将由2021年的32.9%增加至2030年的71.8%。 来源：弗若斯特沙利文报告 虽然中国的自免市场在快速增长，但潜力仍未完全发掘。一方面是由于中国自免药物市场仍以传统小分子为主导，而进口自免新药已进入中国，但众多的自免患者由于分布在经济欠发达地区，支付能力仍有限。另一方面，则由于自免疾病作为慢性病并不致死，导致患者认知程度不高，因此，该领域许多疾病的诊断和治疗率一直很低。 不过，随着治疗手段的升级，疗效更好的生物制剂逐渐将被医生和患者所接受。而中国创新药的崛起也将凭借价格优势覆盖更广泛的患者群体。此外，银屑病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮等自免疾病主要影响年轻群体，这类新生代人群更注重个人生活品质的提高，对身体、形象的受损容忍度低，因此有更强的支付意愿。多种有利因素将促进中国自免市场规模的快速增长。 参考文献： 1.30 Years of Biotherapeutics Development-What Have We Learned? Annu Rev Immunol. 2020 Apr 26;38:249-287     2. 弗若斯特沙利文报告