Alvocidib Hydrochloride

点击蓝字 ↑ 关注药研视角 PharmaView JMC速览 2025.12.18 近日，沈阳药科大学贾景明/王安华团队在药物化学权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为《理性设计氧唑啉黄酮衍生物作为新型高效CDK4/9双靶抑制剂：兼具口服生物利用度与抗CDK4/6耐药肿瘤活性》的研究论文。该研究以天然产物苦参酮K为起点，通过骨架跃迁与结构优化策略，成功设计并合成了一类新型氧唑啉黄酮类CDK4/9双靶点抑制剂，其中候选化合物HS-36在多种肿瘤模型中展现出优异的体内外抗肿瘤活性、良好的口服生物利用度（41.8%）及安全性，有望克服现有CDK4/6抑制剂耐药问题，为抗肿瘤药物研发提供了新的先导结构。 1 min速览 研究背景 CDK4/6 抑制剂（Palbociclib 等）已在乳腺癌临床一线获批，但骨髓抑制毒性和获得性耐药使其疗效受限。CDK9 作为转录调控关键激酶，可驱动 MCL-1、MYC 等抗凋亡蛋白表达，成为逆转 CDK4/6 耐药的重要协同靶点。然而，目前尚无兼具 CDK4/9 高活性、口服生物利用度和安全性的双靶点药物上市。 重点内容 起点与策略：从天然黄酮苦参酮 K（CDK9 IC₅₀ 9.76 µM）出发，通过“骨架跃迁”将 7,8-二氢呋喃替换为氧唑啉环，消除与 Lys48 空间冲突，获得活性提升 6 倍的 HS-1。 系统优化： A 环 5-OH 与铰链区 Cys106 形成氢键，活性跃升 7.5 倍（HS-9）。 侧链从异丙基→(R)-仲丁基，深入 Leu156/Ala166 疏水腔，CDK9 IC₅₀ 降至 5.7 nM（HS-23）。 B 环 4′-OH 与 Asp167 成键，再经哌嗪修饰兼顾溶解度与 CDK4 活性，最终获得 HS-36（CDK4 18.9 nM；CDK9 4.2 nM）。 成药性：小鼠口服生物利用度 41.8%，t₁/₂ 4.3 h；对 82 种激酶仅 5 个>90% 抑制，避开 CDK1/7/12 等毒性靶点；hERG IC₅₀ 1.06 µM 为后续优化留出口。 耐药突破：在 Palbociclib/Abemaciclib 耐药乳腺癌模型中，HS-36 GI₅₀ 维持 0.5–0.7 µM，未见交叉耐药。 体内验证：MV-4-11 异种移植模型 40 mg/kg 口服给药，肿瘤生长抑制率 68.8%，Ki-67/Mcl-1/c-Myc 显著下调，且 1000 mg/kg 单剂量急性毒性无异常。 研究总结 该研究以“天然产物→理性设计→成药性优化”闭环策略，将氧唑啉黄酮骨架开发为高效、口服 CDK4/9 双靶点抑制剂；HS-36 兼具低耐药、高暴露、宽安全窗口，为下一代克服 CDK4/6 耐药的抗肿瘤候选药物提供可直接推进至临床前开发的先导化合物，并确立了可扩展的构效关系与优化方向。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是一组由21种丝氨酸/苏氨酸激酶构成的家族，通过与相应的周期蛋白结合形成活性复合物，精确调控细胞周期进程、转录、DNA修复及凋亡等关键生命活动；其异常激活与多种肿瘤的发生发展密切相关，因此被视为抗肿瘤治疗的重要靶点。CDK4与Cyclin D结合后磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），驱动G1/S期转换，而结构同源性高的CDK6亦参与该过程；已上市的CDK4/6抑制剂Palbociclib、Abemaciclib在乳腺癌治疗中取得临床成功，但剂量限制性血液学毒性和获得性耐药问题突出。为降低毒性，选择性CDK4抑制剂Atirmociclib（PF-07220060）正在III期临床评估。与此同时，CDK9作为正转录延伸因子b（P-TEFb）的催化亚基，通过磷酸化RNA聚合酶II的C端结构域解除启动子近端暂停，驱动MCL1、MYC等促生存转录本的持续表达，成为克服CDK4/6耐药极具吸引力的协同靶点。黄酮类化合物是经典的CDK9抑制剂骨架，代表药物Flavopiridol、IIIM-290等虽活性显著，但存在静脉给药或选择性不足等局限；氨基噻唑/氨基吡啶类CDK9抑制剂如SNS-032、AZD4573亦因毒性或安全性问题临床进展受阻。鉴于CDK4与CDK9在细胞周期和转录调控中的互补作用，以及单药治疗的局限性，联合或同时抑制CDK4/9已成为逆转耐药、增强疗效的重要策略，但迄今尚缺兼具高效、高选择性与良好口服药代性质的CDK4/9双靶点药物。基于此，作者团队以天然黄酮苦参酮K为起点，通过骨架跃迁与结构导向设计，系统优化得到候选化合物HS-36，旨在提供一种可口服、能克服CDK4/6耐药的新型CDK4/9双抑制剂。 02 Drug Design ①天然先导的发现与结构简化 作者通过高通量筛选自建天然产物库，发现苦参酮K（kushenmin K）这一具有7,8-二氢呋喃并环的黄酮对CDK9的IC₅₀为9.76 μM，对MV-4-11白血病细胞的GI₅₀为18.92 μM；分子对接显示其2-羟基丙-2-基侧链与CDK9催化位点Lys48发生空间碰撞，迫使B环下倾，破坏与铰链区的氢键网络，导致活性受限。为消除这一位阻并提高合成可及性，团队采用骨架跃迁策略，用代谢更稳定的氧唑啉环整体替换二氢呋喃单元，同时删除3-OH使B环更贴合疏水通道，得到简化衍生物HS-1；该化合物在肝微粒体中清除适中（RLM t₁/₂ 12.8 min、HLM t₁/₂ 29.6 min），血浆稳定性>60 min，且CDK9抑制活性提升至1.57 μM、CDK4抑制达8.87 μM，为后续结构优化提供了可模块化改造的新母核。 HS-1骨架的理性优化：借镜临床药物疏水热点，定向增活与选择性 为了把HS-1的活性再往上提，作者用结构叠合发现其氧唑啉环与临床药物AZD4573和Abemaciclib的关键疏水药效团在空间上高度重合，于是决定在对应位置引入亲脂取代以增强结合；同时，在黄酮A环加回5-OH，与铰链区Cys106形成氢键并校正B环取向；接着，把暴露在溶剂中的B环作为“可调区”，系统改变4′-位取代基的电子与立体性质，以图同时提高CDK4抑制、改善CDK2选择性并优化药代。按这一多维度设计思路，他们合成了聚焦的氧唑啉黄酮衍生物库，为后续构效关系研究奠定骨架。 ②构效关系 作者首先系统考察了氧唑啉氮上烷基侧链对酶活与细胞增殖抑制的影响：直链从H→甲基→乙基→正丙基逐级延长，CDK9抑制和MV-4-11抗增殖活性同步增强；引入末端氰基或乙酯等极性基团则活性完全丧失，提示该区需要纯疏水环境。分支链异丙基比正丙基效力翻倍（HS-7，CDK9 IC₅₀ 243 nM），说明位阻匹配关键。随后在A环加入5-OH，与铰链Cys106成氢键，使CDK9 IC₅₀从243 nM降至32.4 nM（HS-9），并带动细胞GI₅₀由3.24 μM提升至1.91 μM，确立“5-OH+异丙基”为新优化起点。继续延长烷基，发现(R)-仲丁基（HS-23）可同时让CDK9 IC₅₀降至5.7 nM、CDK4 IC₅₀降至242 nM，而(S)-构型活性明显降低，晶体与计算表明(R)-末端甲基可深入Leu156/Ala166疏水腔且保持低能构象。当在B环引入4′-OH与Asp167成键，得到HS-29，CDK9 IC₅₀进一步降至2.6 nM，细胞GI₅₀降至0.66 μM，代谢稳定性亦改善；但极性侧链若直接放在氮上（羟烷基、氨烷基）则酶活丧失>100倍，证实溶剂暴露区与深部疏水腔的改造必须分区进行。将4′-OH衍生为哌嗪醚（HS-36）后，CDK4抑制提升至18.9 nM，CDK9维持4.2 nM，水溶性增至87 μg mL⁻¹，RLM t₁/₂ 35.8 min，实现活性、选择性与药代的最佳平衡，被确立为候选化合物。 图片来源：ACS 03 RESULTS ①HS-36激酶选择性 在82种激酶500 nM单浓度筛选中，HS-36仅对5个靶点抑制率>90%，其中CDK9为98.7%，验证实验体系可靠；主要脱靶为受体酪氨酸激酶EPHA2（96.7%）和EPHB4（95.4%），作者认为这一多靶特征可能通过阻断耐药通路带来额外获益。进一步定量测定CDK家族选择性显示，HS-36对CDK1、CDK7、CDK12的IC₅₀均>500 nM，成功避开与骨髓抑制及广谱毒性相关的成员；对CDK2、CDK5、CDK6的IC₅₀分别为197、217、126 nM，保留适度抑制但低于CDK4/9十余倍，整体选择性优于阳性对照Flavopiridol，支持其作为CDK4/9偏向抑制剂的继续开发。 ②HS-36细胞水平评估 HS-36在9株肿瘤细胞及H9C2心肌、HepG2肝细胞的抗增殖面板中显示广谱活性：对MV-4-11白血病最敏感（GI₅₀ 0.09 μM），与Flavopiridol相当；对A549、4T1、PC3等实体瘤GI₅₀ 0.36–0.76 μM，而对心肌和肝细胞GI₅₀均>10 μM，提示心脏与肝脏毒性窗口较大。流式检测MV-4-11经200 nM处理12 h后G0/G1期细胞由58%升至70%，24 h凋亡率由6.4%增至52.5%；Western blot显示8 h内即可见caspase-3与PARP切割、抗凋亡蛋白Bcl-2下调，证实其通过CDK4阻断周期并经由CDK9下调Mcl-1/c-Myc触发凋亡。在MCF-7细胞中，HS-36剂量依赖抑制Rb Ser807/811磷酸化，1 μM显著、3 μM几乎完全阻断；qRT-PCR与蛋白水平均显示MCL1、MYC转录及翻译同步下降，且CDK9伴侣Cyclin T1亦减少，提示其可能破坏P-TEFb复合物。以上结果共同表明HS-36在细胞内同时有效抑制CDK4与CDK9，并通过下调关键下游效应分子发挥强效的促凋亡与周期阻滞作用。 ③HS-36的ADMET性质 体外ADMET测试显示，HS-36在人、小鼠、大鼠肝微粒体的半衰期分别为85.9、56.9、35.8 min，比先导物HS-1显著延长；人/大鼠血浆中>240 min 无显著降解，血浆蛋白结合率96.8%。hERG 钾通道IC₅₀ 1.06 μM，与MV-4-11细胞GI₅₀ 0.09 μM相比仅12倍治疗指数，提示QT延长风险为后续首要优化点。CYP抑制面板（10 μM）显示，除对2C9为44%外，其余亚型抑制均<35%，预示药物-药物相互作用风险较低。小鼠/大鼠体内药动学表明：2 mg kg⁻¹ i.v.后，小鼠t₁/₂ 2.35 h、口服20 mg kg⁻¹ Cₘₐₓ 404 ng mL⁻¹、生物利用度41.8%，AUC随剂量线性增加；口服Tₘₐₓ约4 h，提示吸收速率可能受溶解度限制。综合代谢稳定性、暴露量及口服吸收数据，HS-36具备可接受的临床前药代基础，但需进一步降低hERG活性并提升溶解度以拓宽治疗窗。 图片来源：ACS ④HS-36体内安全评价 单次口服急性毒性试验中，BALB/c小鼠给予1000 mg kg⁻¹ HS-36后连续14天观察，未出现死亡、显著体重下降或明显异常行为；解剖后心、肝、脾、肺、肾的H&E染色未见药物相关组织损伤或病理改变，表明其单次给药最大耐受剂量（MTD）高于1000 mg kg⁻¹，未显示急性器官特异性毒性。 图片来源：ACS ⑤体内抑瘤实验 在MV-4-11异种移植模型中，HS-36经口给药表现出剂量依赖性抑瘤效果：20 mg/kg组肿瘤生长抑制率与阳性对照阿糖胞苷（Ara-C 20 mg/kg皮下）相当，40 mg/kg组肿瘤生长抑制率达68.8%，终末瘤重显著降低且镜下Ki-67、Mcl-1、c-Myc免疫组化信号随剂量同步下调，证实靶点抑制与药效相关；整个治疗期间各剂量组小鼠体重无显著下降，主要脏器H&E切片未见药物相关组织损伤，显示该剂量范围内抗肿瘤活性与耐受性良好。 ⑥HS-36在CDK4/6抑制剂耐药模型中的活性 作者利用长期递增暴露法从MCF-7母系分别建立Palbociclib耐药株（MCF-7/Palbociclib-R，对Palbociclib GI₅₀升高5.7倍至11.21 μM）和Abemaciclib耐药株（MCF-7/Abemaciclib-R，对Abemaciclib GI₅₀升高5.4倍至3.81 μM），以验证HS-36能否克服CDK4/6抑制剂获得性耐药。结果显示，HS-36在母系、Palbociclib-R及Abemaciclib-R三株细胞中的GI₅₀分别为0.55、0.48和0.66 μM，活性几乎无衰减；而泛CDK抑制剂Flavopiridol在Palbociclib-R株中GI₅₀由0.46 μM升至1.05 μM，效果明显下降。该结果直接证明HS-36通过同时抑制CDK4与CDK9，可绕过导致CDK4/6抑制剂耐药的信号旁路，保持对耐药乳腺癌细胞的强效抗增殖活性。 CONCLUSIONS 本研究通过骨架跃迁与多轮结构优化，将天然黄酮苦参酮K转化为口服有效的氧唑啉黄酮类CDK4/9双抑制剂HS-36；该化合物对CDK4 IC₅₀ 18.9 nM、CDK9 IC₅₀ 4.2 nM，在MV-4-11异种移植模型中40 mg/kg口服抑瘤率达68.8%，且1000 mg/kg单次给药无急性毒性。HS-36通过同时阻断CDK4-Rb通路引起G1期阻滞，并抑制CDK9介导的RNA Pol II磷酸化，下调Mcl-1和c-Myc诱导凋亡；在Palbociclib及Abemaciclib耐药乳腺癌细胞中仍维持亚微摩尔抗增殖活性，显示克服获得性耐药的潜力。其代谢稳定性高、口服生物利用度41.8%、CYP抑制风险低，但hERG IC₅₀ 1.06 μM提示心脏毒性需后续优化。总体而言，研究确立了一类新颖的氧唑啉黄酮骨架，为开发下一代可口服、能逆转CDK4/6耐药的CDK4/9双靶抗肿瘤药物提供了可直接推进至临床前研究的先导化合物及明确构效关系。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02206  喜欢此内容的人还喜欢 【JMC】沈阳药科大学秦铭泽/王立辉团队：新型异山梨醇黄嘌呤氧化酶抑制剂，强效降尿酸 药研视角 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点击蓝字 关注我们 汇报人：卢嘉杰 研究生一年级 AlphaFold 助力 30 天锁定肝癌新靶点，7 种化合物即筛出有效分子！——当 AlphaFold 在 2020 年破解整个人类基因组蛋白质结构预测难题时，科研界便期待着它能为药物研发带来颠覆性突破 —尤其是那些缺乏实验结构信息的新靶点，曾是药物设计路上的 “拦路虎”。如今，这一期待终于落地！一篇研究文献揭示，科研团队成功将 AlphaFold 嵌入端到端 AI 药物发现引擎，联动生物计算平台 PandaOmics 与生成化学平台 Chemistry42，仅用 30 天、合成 7 种化合物，就为肝细胞癌（HCC）新靶点 CDK20 找到首个小分子命中物；后续优化更得到强效分子 ISM042-2-048，不仅结合力提升近 20 倍，还能选择性抑制 CDK20 过表达肝癌细胞。这是 AlphaFold 首次在药物命中识别环节 “实战” 告捷，也为 AI 驱动的高效、低成本药物研发打开了新想象空间！ 文献来源     Ren F, Ding X, Zheng M,et al.AlphaFold accelerates artificial intelligence powered drug discovery: efficient discovery of a novel CDK20 small molecule inhibitor. Chem Sci. 2023 Jan 10;14(6):1443-1452.  研究背景   蛋白质的三维结构与其在细胞中的功能及氨基酸突变引发的生物学效应密切相关。作为研究基因-疾病关联和作用机制（MoA）的多功能工具，蛋白质结构为评估治疗靶点的可药物性提供了重要依据。基于结构的药物研发（SBDD）一直是发现命中分子和优化先导化合物的核心方法，但该过程需要目标蛋白的三维结构数据。经过20年持续努力，目前仅有少量已知蛋白质实现了实验确定的结构。精准的蛋白质结构预测长期面临技术瓶颈，直到AlphaFold在CASP14大赛中横空出世。AlphaFold预测的结构准确度已与实验方法相媲美。科学界对DeepMind的突破性成果表示热烈祝贺，并对其发布的全蛋白质组AlphaFold数据库给予高度评价，该数据库目前该数据库已扩展至包含超过804,000个蛋白质结构，涵盖21个物种。尽管AlphaFold预测的蛋白质模型质量参差不齐，但其提供的局部距离差异测试分数作为置信度指标，可指导使用AlphaFold生成的三维结构。AlphaFold模型已被用于辅助确定晶体衍射14和冷冻电镜15的实验结构、指导PINK1的功能研究、帮助识别致病突变以及探索蛋白质间相互作用。公共数据库如UniProt、治疗靶点数据库和APPRIS均将AlphaFold模型作为参考。该方法启发了速度更快、成本更低且准确度足够的蛋白质预测工具RoseTTAFold，以及蛋白质设计框架AlphaDesign。人工智能驱动的蛋白质预测技术被《Science》和《Nature》期刊评选为2021年突破性成果之一。 研究方法  本研究通过整合AlphaFold预测的蛋白质结构与PandaOmics及Chemistry42两大端到端AI药物研发平台，实现了从零开始快速筛选新型靶点候选分子。该流程涵盖适应症筛选、靶点定位、活性分子生成及分子识别等关键环节。尽管AlphaFold2在科研领域的应用已广为人知，但其算法在商业应用中的优化调整仍存在诸多未解之谜。我们以AlphaFold数据库中公开的预测结构为起点，对算法进行了系统性改造。   图1展示了本研究的总体工作流程，选择肝细胞癌（HCC）作为研究对象，因其在肝脏肿瘤中高发且缺乏有效治疗手段。通过分析10个HCC数据集的文本和OMICS数据，PandaOmics筛选出前20个靶点。我们采用多维度筛选标准，包括新颖性、生物制剂可及性、安全性、小分子可及性和组织特异性。最终选定周期蛋白依赖性激酶20（CDK20）作为初始靶点，因其与疾病关联性强、实验结构信息有限，且过去三年内该疾病领域获批药物或临床化合物匮乏。基于Chemistry42的化学结构预测生成化合物，通过AlphaFold预测CDK20结构后，共生成8918个分子，经分子对接和聚类筛选，最终选定7个进行合成与生物测试。其中化合物ISM042-2-001在CDK20激酶结合试验中表现出9.2 ± 0.5 mM的Kd值（n=3）。借助Chemistry42和AlphaFold预测的蛋白质结构，我们仅用30天就发现了首个命中化合物。该预测结合模式随后指导第二轮化合物生成、合成与测试，最终获得效力达纳摩尔级别的命中分子ISM042-2-048。据我们所知，这是第一个成功利用AlphaFold预测的蛋白质结构来识别早期药物发现中一个新靶点的确证命中案例。 Figure 1 The pipeline to combine AlphaFold with Insilico Medicine end-to-end, and AI-powered drug discovery platforms PandaOmics and Chemistry42 in the drug discovery for hepatocellular carcinoma from target selection and hit generation to hit identification. 一、靶区的选择与筛选       根据国际癌症研究机构（IARC）发布的《全球癌症数据2020》更新报告，原发性肝癌是全球第六大常见癌症，也是癌症死亡的第三大原因。其中，HCC占据主导地位，约占患者总数的75%。由于预后极差，全球各地区的肝癌发病率与死亡率几乎持平。28种PD-L1抑制剂阿特朱单抗联合贝伐珠单抗已对于晚期HCC患者，新标准治疗（SoC）一线治疗方案在12个月总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）方面较前代标准治疗Nexavar有所改善，但HCC患者仍存在巨大的未满足医疗需求。       PandaOmics是一款自动化药物发现AI引擎，旨在加速并优化药物研发早期阶段的关键步骤。该生物计算平台将生物信息学方法与先进的多模态深度学习技术相结合，用于数据分析、可视化和解释，同时支持靶点识别。PandaOmics的治疗靶点与生物标志物识别系统基于文本证据优先级排序和OMICs的数据分析，通过综合多维度评分结果，精准锁定在科学文献和资助项目描述中高频出现的基因。而基于OMICs的评分则通过差异表达分析、基因变异检测、互作组拓扑结构研究、信号通路扰动算法、基因敲除/过表达实验等手段，深入挖掘基因与疾病之间的分子关联。这种创新方法能帮助用户发现传统认知或基础生物信息学分析难以揭示的潜在假说。AI工具在高效生成靶点假设方面发挥着重要作用。整体评分方法可为特定疾病生成目标假设的排序列表，后续可根据其新颖性、小分子及抗体可及性、安全性、组织特异性、晶体结构可用性以及主要生物结构进行调整。         PandaOmics平台另一独特优势在于能整合不同实验数据形成单一荟萃分析，并通过综合多源数据实现精准靶点优先级排序。针对HCC研究，我们构建了包含10个数据集的分析（含1133例患者样本和674例健康对照）。通过应用PandaOmics工具筛选出符首创新药特征（详见方法部分）且满足当前晶体结构不可用条件、但经AlphaFold预测具有可折叠结构的最具潜力靶点，最终筛选出前20个候选靶点。其中CDK20因最高得分匹配首创新药特征而被选为肝癌治疗首选。该靶点随后被导入Chemistry42平台进行小分子抑制剂自动化合成。 二、CDK20作为癌症治疗的一个有前途的靶点       CDK20，又称细胞周期相关激酶（CCRK），是细胞周期依赖性激酶家族最新被发现的成员。近年来，由于其在多种人体组织中具有细胞周期依赖性和非依赖性功能，该激酶家族备受关注。CDK20在许多人体组织中广泛表达，其翻译水平相当。包括大脑、肺、肝脏、胰腺和胃肠道。更重要的是，越来越多的临床前证据表明，CDK20在多种肿瘤细胞系中过度表达，包括来自不同癌症类型患者的肿瘤样本，如结直肠癌、肝细胞癌（HCC）、肺癌和卵巢癌。体外研究表明，雄激素受体（AR）、CDK20和β-连环蛋白构成一个正反馈回路，促进HCC细胞周期进程，且CDK20过表达常与原发性HCC组织样本中AR和β-连环蛋白的异位表达相关，并与患者肿瘤分期及较差的总体生存率相关。在肺癌细胞中，CDK20与核因子红系2相关因子2（NRF2）竞争结合Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1），从而阻止NRF2降解并增强其转录活性，进而降低细胞内活性氧（ROS）水平。此外，在肺癌细胞中敲除CDK20会导致细胞增殖能力受损、G2/M期阻滞缺陷以及放化疗敏感性增加。除了通过调控细胞周期和致癌信号通路发挥促肿瘤作用外，CDK20还参与某些类型肿瘤的免疫抑制。周等学者研究发现，通过激活EZH2-NF-κB信号通路，肝细胞癌（HCC）细胞中表达的CDK20不仅能促进白细胞介素-6（IL-6）的生成，还能诱导外周血单个核细胞分化为具有免疫抑制功能的髓源性抑制细胞（MDSC）。当抑制肿瘤细胞中的CDK20时，可显著增加肿瘤浸润区域中γ+TNF-α+CD8+T细胞的数量，并上调肿瘤组织内程序性死亡配体（PD-L1）的表达水平。这些发现为联合使用PD-L1阻断剂治疗HCC提供了更有力的临床依据。因此，最新科学研究表明，CDK20抑制剂有望成为癌症治疗领域的重要新策略，尤其在HCC治疗方面展现出广阔的应用前景。 三、利用AlphaFold预测的结构，生成靶向CDK20的新药      截至目前，尽管针对CDK家族其他成员的抑制剂已取得巨大成功，但报道的CDK20抑制剂仍十分有限（Figure 2）。其中一个可能的原因是该靶点目前缺乏可用的三维结构信息。2005年，Nikolai及其同事描述了一种名为RGB-286147的潜在CDK20抑制剂，但未报告任何结合亲和力数据。Eurons披露BMS-357075是一种CDK20结合剂，其Kd值为56 nM。AAPK-25也被报道为一种CDK20抑制剂，其Kd值为8020 nM。此外，Mueller等人在其近期海报中描述了多种潜在的CDK20抑制剂，包括Palbociclib、Flavopiridol、Dinaciclib和Roscovitine，其半抑制浓度值范围从1260 nM到8680 nM。此外，他们还鉴定出另一种强效CDK20抑制剂MER-128，其半抑制浓度值为2 nM；然而，该分子的结构未予公开。图3描述了我们通过SBDD方法从结构提取到命中生成的CDK20抑制剂鉴定流程utilizingChemistry42。 Figure 2 Reported CDK20 inhibitors from the literature and the novel inhibitor ISM042-2-048 discovered in this paper. The Tanimoto similarities of reported molecules to ISM042-2-048 are calculated from Morgan fingerprints using RDKit Figure 3 Insilico Medicine generative procedures for CDK20 hits.       当用户将蛋白质结构上传至Chemistry42平台时，系统会自动采用内置的能量分析方法来确定潜在结合位点。蛋白质表面均匀分布着甲基探针，每个探针都会计算其与受体原子的非共价相互作用能量。能量低于用户自定义阈值的探针会被聚类为独立口袋。每个识别出的空腔都会通过口袋体积、表面面积和深度等参数进行评分。基于这些参数，Chemistry42会生成一份已识别的结合位点列表。    如图4A所示，由AlphaFold预测的CDK20结构（AF-Q8IZL9-F1- model_v1）除C端外整体置信度较高。在置信度极低的AlphaFold预测结构中，C端构象会阻塞蛋白质的溶剂暴露区域，且C端的Arg305残基占据了ATP口袋（见图4A）。C端存在一个可变环，该环具有多种构象。由于AlphaFold预测结构中的C端占据ATP口袋的构象不利于抑制剂设计，因此移除了C端（Pro303-Gly346），仅使用Met1至Ile302残基的结构作为Chemistry42分子生成的输入。通过该结构模型，Chemistry42识别出一个浅层ATP结合口袋，其体积估计约为150 A˚³（见图4B）。在铰链区残基Met84附近，Phe81残基占据守门员位置，阻止配体进入后部口袋。预测的结合口袋呈现DFG-in构象，其溶剂化区域包含两个酸性中心（Asp87和Glu90）。随后采用基于口袋生成的方法进行构建。       新型分子结构设计。铰链残基Met84被确定为关键结合位点。基于ATP结合口袋的三维结构信息（包括口袋三维形态、体积参数及原子空间排布等特征），我们优化了分子设计以提升靶向结合能力。通过Chemistry42平台共设计出8918种分子候选，经分子对接与聚类分析筛选后，最终选定54种具有不同铰链核心结构的化合物进行后续合成。 Figure 4  4 (A) The AlphaFold predicted structure of CDK20(AFQ8IZL9-F1-model_v1); (B) ATP pocket of CDK20 with a DFG-in (residue Phe146) conformation. Met84 is the hinge residue. P-loop is colored in green. Two acid centers Asp87 and Glu90 are located in the solvent exposed region of the protein. 研究结果       图5展示了用于合成并评估对CDK20结合能力的7种化合物的化学结构。在所选化合物中，一种名为ISM042-2-001的化合物在CDK20激酶结合试验中显示出9.2 ± 0.5 mM的Kd值（n = 3，代表性结合曲线见图6A），并在CDK20激酶活性试验中表现出>6000 nM的半抑制浓度值。我们仅用30天就发现了该命中分子。我们还通过分子对接提出了ISM042-2-001的结合模式，如图6B所示：四个氢键相互作用以虚线表示。除与铰链残基Met84形成的两个氢键外，ISM042-2-001还通过酰胺-NH基团与残基Leu85相互作用，并通过吡咯-NH基团与P-loop中的残基Ile10相互作用。此外，酰胺-NH基团或吡咯-NH基团可能与溶剂化区域内的两个酸性中心Asp87和Glu90形成氢键。 Figure 5 Chemical structures for the selected 7 molecules from the first round Chemistry42 generation for synthesis and testing in CDK20 binding assay Figure 6 (A) Representative binding affinity curve of ISM042-2-001 in CDK20 kinase binding assay. Data points are presented as the mean of duplicate wells in one experiment. Similar results were obtained in three independent experiments and the KD is the mean ± SD of three independent experiments.  (B) Predicted binding pose for ISM042-2-001 with CDK20       基于预测的结合构象和效力数据，我们使用生成式AI工具Chemistry42进行了第二轮化合物生成。通过两种策略成功开发出16种新型分子以提升结合亲和力：(1)在门控区附近的疏水口袋中引入喹唑啉环功能基团；(2)对吡咯-2-甲酰胺基团进行修饰以进入溶剂化区域并与酸性残基Asp87或Glu90相互作用。如图7所示，合成测试了16种分子中的6种，其中ISM042-2-048和ISM042-2-049的结合亲和力较ISM042-2-001分别提升了15倍和24倍，测得Kd值分别为566.7 ± 256.2 nM和360.0 ± 14.1 nM。图8B展示了ISM042-2-048与CDK20的预测结合模式。根据该模式分析，除铰链区和溶剂区的相互作用外，ISM042-2-048的吡唑基团还与Lys33残基形成氢键，这解释了其结合亲和力的显著提升。如图2所示，ISM042-2-048与已报道的CDK20抑制剂存在骨架结构新颖、分子相似度低等显著差异。此外，ISM042-2-048对CDK20激酶活性的抑制作用已得到证实，其平均半抑制浓度为33.4 ± 22.6 nM（n = 3），与对照筛选细胞系HEK293（半抑制浓度= 1706.7 ± 670.0 nM)相比，在过表达CDK20的HCC细胞系Huh7中显示出选择性抗增殖活性，如图9所示。下一阶段优化工作即将启动以进一步提高效力，并将评估其ADME特性及激酶选择性。 Figure 7 Chemical structures for the second-round Chemistry42 generation for synthesis and testing in CDK20 binding and kinase activity assays. Biological data with a standard deviation are presented from three independent experiments. Figure 8 (A) Representative binding affinity curve for ISM042-2-048 in CDK20 kinase binding assay. Data points are presented as the mean of duplicate wells in one experiment. Similar results were obtained in three independent experiments and the KD is the mean ± SD of the three independent experiments.  (B) Predicted binding pose for ISM042-2-048 in CDK20. Figure 9 (A) Representative dose–response curve for ISM042-2-048 in CDK20 kinase activity assay. Similar results were obtained in three independent experiments and the IC50 is the mean ± SD of the three independent experiments. (B) Cell viability curves for ISM042-2-048 in cell line Huh7 and counter screen cell line HEK293. Data points are presented as the mean of duplicate wells in one experiment. Similar results were obtained in three independent experiments. 研究结论       基于结构的药物发现（SBDD）一直是识别命中分子并进行先导化合物优化的主要方法。而AlphaFold预测的蛋白质结构被认为是一种强大的工具，可用于识别具有无或有限结构信息的新靶点的命中分子。本文展示了通过将AlphaFold预测结果作为输入，利用自动化药物发现AI引擎PandaOmics和Chemistry42在30天内快速识别CDK20命中分子的案例，该流程涵盖靶点选择、分子生成、化合物合成及生物测试。在合成的7种化合物中，ISM042-2-001在CDK20激酶结合试验中显示出9.2 ± 0.5 mM的Kd值（n = 3）。根据初步构效关系分析，我们进行了第二轮人工智能驱动的化合物生成，并在发现首个命中分子ISM042-2-001后的30天内合成了6种新化合物进行测试。令人欣喜的是，我们发现了效力更强的命中分子ISM042-2-048，其平均Kd值为566.7 ± 256.2 nM（n = 3），平均半抑制浓度值为33.4 ± 22.6 nM（n = 3）。此外，ISM042-2-048在CDK20高表达水平的HCC细胞系Huh7中表现出良好的抗增殖活性（半抑制浓度= 208.7 ± 3.3 nM)，而在对照筛选细胞系HEK293中则未观察到显著效果（半抑制浓度= 1706.7 ± 670.0 nM)。初步实验结果表明，我们研发的CDK20抑制剂并未引发无选择性的细胞毒性，反而对过表达CDK20的肝癌细胞表现出更强的抑制效果。这一发现使其成为评估该靶点生物学功能的理想工具分子。目前我们正在对该分子进行进一步优化，并同步开展ADME特性（吸收、分布、代谢、排泄）研究。值得注意的是，本研究成功实现了利用AlphaFold预测的蛋白质结构筛选新型靶点的首次应用，针对GPCR受体和E3连接酶等其他靶点类别的拓展性研究也正在持续推进中。 END