Glutathione

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程糖原合成酶激酶-3 （GSK-3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，调节多种细胞过程并与多种疾病相关。其中，GSK-3β（GSK-3的异构体之一）与阿尔茨海默病相关的神经原纤维缠结的形成有关，这主要是由于Tau蛋白的过度磷酸化导致。本文描述了一系列作为GSK-3β抑制剂的咪唑[1,2-b]哒嗪类衍生物的设计和合成，并指明构效关系。此外，体内研究进一步表明，化合物47具有脑渗透性，口服利用度较高，并将显著降低磷酸化Tau蛋白的水平，这为阿尔兹海默症的治疗提供了新思路。GSK-3在组织中普遍表达，在中枢神经系统（CNS）呈现高表达，分为GSK-3α（51kDa）和GSK-3β（47kDa）两种异构体，二者在催化区域上的同源性高达98%。研究发现，GSK-3β以主要亚型存在于CNS的大多区域。GSK-3β过度激活，一方面将导致tau蛋白的过度磷酸化，进一步导致细胞内神经元纤维缠结（NFTs）的聚集以及β淀粉样蛋白（Aβ）的增加，另一方面，也可能促进β、γ分泌酶活性，导致Aβ肽的累积，从而促进Aβ斑块形成。而Aβ与NFT被认为是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的潜在致病原因。由此可见，GSK-3抑制剂具有作为阿尔茨海默病治疗药物的潜力。现阶段被评估用作阿尔茨海默病治疗的GSK-3β抑制剂如图1所示。Tideglusib1是一种非ATP竞争性GSK-3抑制剂，已完成阿尔茨海默病的II期研究。对应地，芳基马来酰亚胺2（SB-216763）则作为一种ATP竞争性GSK-3抑制剂。苯并呋喃化合物3具有脑渗透性，吡唑4具有口服性，化合物5（UDA-680）在小鼠体内的研究表明，它具有显著抑制tau磷酸化的母体结构，氨基吡啶6对激酶表现出良好的选择性。BMS公司首先针对以上发现，系统地探索了相应母核周围的化学空间，在此基础应用构效关系（SAR）研究发现了基于异烟碱酰胺的GSK-3β抑制剂7，不仅表现出良好的激酶选择性，并且具有较好的口服生物利用度。随后展开了一系列基于化合物7的衍生物研究（如化合物8）。图1.代表性GSK-3β抑制剂环丙基羧酰胺部分是该化学型中最受青睐的酰胺之一，具有平衡效力和代谢稳定性的作用。然而，当7的类似物8在小鼠血清中37℃孵育时，在3小时内观察到环丙基羧酰胺基团24%的裂解，在人血清中也检测到微量的裂解。此外，由于一份报告表明，如果环丙羧酸在体内从母体化合物中释放出来，可能会产生特异性毒性，因此是否能够使用其他酰胺或替代基团取代异烟酰胺化学型中的环丙基羧胺部分成为研究新方向。BMS公司在SAR研究与X射线共晶分析时发现：环丙基羧酰胺羰基和上层酰胺NH之间形成的水桥氢键，可能使分子在能量上倾向于生物活性构象，也就是说，环丙基羧酰胺具有平衡效力和代谢稳定性的作用。据此，BMS公司设想将下层酰胺以杂环回接（图2B中红色虚线表示），其中氮取代羰基氧，通过形成更倾向于生物活性构象的内部氢键（图2B中蓝色虚线表示）以及更有利的偶极子排列（图2B蓝色箭头所示）得到新型咪唑[1,2-b]哒嗪环体系，以此作为研发GSK-3β抑制剂的一个有吸引力的杂环支架，见图3。图2.（A）通过分子模拟程序添加氢后，GSK-3β（PDB ID: 8DJD）激酶结构域9的X射线共晶结构。配体以棒状模型表示，绿色的碳原子和黑色虚线表示的氢键。与配体形成氢键的氨基酸残基显示为棒状。在环丙酰胺羰基和酰胺NH之间观察到一个水桥氢键。（B）咪唑[1,2- B]哒嗪基GSK-3β抑制剂支架的原理。红色虚线表示建议的回接以形成一个五元环。蓝色虚线表示内部氢键。所需的酰胺构象与相邻的咪唑[1,2-b]吡啶环系统具有良好的偶极子排列，如蓝色箭头所示。图3.咪唑[1,2-b]哒嗪类GSK-3β抑制剂设计方案构效关系与X射线晶体研究在1型咪唑[1,2-b]哒嗪嘧啶系列中，对吡啶环4位的SAR进行了研究，结果见表1。化合物19对GSK-3β酶的IC50值为220nM。当吡啶在4位上被甲基取代时，效价提高了3.5倍（20），当甲基被异丙醚取代时，效价又提高了10倍（比较21和20）。含有苯基（22）或六元环杂环（23-24）的类似物的效价与化合物21相似。4,4-二氟哌啶基类似物（25）是该组中最有效的类似物（GSK-3β IC50=0.87nM）。总的来说，表1所示化合物对GSK-3β和GSK-3α的效价相差在3倍以内。表3.GSK-3β和GSK-3α对化合物53-57的抑制活性a除非另有说明，数值是两个测定值的平均值。b值是至少三次测定的平均值±SD。化合物22结合在GSK-3β催化结构域的X射线共晶结构如图4所示。蛋白质结晶为二聚体，在每个结合口袋中具有相似的配体相互作用。咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶六元环的sp2氮和环丙基甲基胺取代基的氨基在GSK-3β催化结构域的铰链区与Val135（分别为2.5和2.1Å）形成氢键。吡啶部分的sp2氮与Lys85胺形成氢键（1.9Å）。酰胺羰基与Asp200的主链NH之间存在水介导的氢键。苯基占据了核糖结合位点，分子的这个区域提供了一种优化这种化学型效力的方法，因为它与蛋白质有良好的范德华接触。与表1中的化合物19和20相比，类似物21-25的效力有所提高，这可归因于吡啶环上4位取代基与核糖体结合位点上蛋白质的良好相互作用。在咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶环体系中，酰胺NH与N1氮之间存在内部氢键。图5. 化合物47的S对映体结合在GSK-3β激酶结构域（PDB ID: 8DJC）的X射线共晶结构。（A）配体以绿色碳原子的棒状模型表示，氢键以黑色虚线表示。与配体相互作用的残基显示为棒状。2-甲基吗啉基团占据了核糖结合位点。（B）与GSK-3β的ATP结合位点结合的S -对映体47蛋白的表面表示。在2型咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶环体系的2位与苯基或环丙基取代基结合，探索吡啶环4位的SAR，结果如表2和表3所示。对亲本无取代吡啶基类似物19和36的比较表明，后者的效价是19的11倍（GSK-3β IC50分别为20nM和220nM）。BMS公司发现该系列中R1处的苯基取代类似物的效力比表1中相应的类似物高5-20倍（分别比较37、38、45和47与20、21、23和24）。在吡啶环的4位加入一个甲基（37）得到一个GSK-3β IC50值为3.5nM的化合物。中等较大基团（38-40）的化合物的GSK-3β IC50值为~1nM或更低。在R2（41和42）处含有苯基的类似物被证明是有效的（GSK-3β IC50分别=3.6和1.6nM）。此外，六元杂环取代苯基提供了更高效的化合物，大多数GSK-3β IC50值在亚纳摩尔范围内（43-47）。用手性色谱法将化合物47分离成对映体后，结果表明(S)-47的效价比(R)-47高6倍。在R1的苯基环上加成一个邻甲氧基或对三氟甲氧基取代基是可行的（比较48和49至47以及比较50至45）。还研究了吡啶在R3和R4上的取代。在R3上有甲氧基的类似物比未取代的吡啶类似物的效力低近2倍（比较51和36）。在R4处的氯取代导致效力降低35倍（对比52和44）。表2所示化合物对GSK-3β和GSK-3α具有选择性，其效价差异在3-4倍之内。表2.化合物36-52对GSK-3β和GSK-3α抑制活性a除非另有说明，数值是两个测定值的平均值。b值是至少三次测定的平均值±SD。c值是单次判断的结果。相应地，咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶的2位苯基被环丙基取代后，类似物的效力通常与在该位置具有苯基的相应化合物相当（分别比较54和55与44和42），见表3。化合物53的效力略低于47。化合物53和54的效价与表1中相应的类似物相当（分别为24和25），尽管在铰链区域失去了一个与Val135的经典氢键。然而，当去除咪唑[1,2-b]吡啶的2位苯基时（分别比较56和57与47和44），由于苯基失去了与蛋白质邻近氨基酸残基的疏水接触，观察到效力降低了10倍。表3.化合物53-57对GSK-3β和GSK-3α的抑制活性a除非另有说明，数值是两个测定值的平均值。b值是至少三次测定的平均值±SD。化合物47结合在GSK-3β催化位点的X射线共晶结构如图5所示。化合物47的S-对映体与蛋白质的配合作用更强。重要的氢键相互作用的细节如图5A所示。在咪唑[1,2-b]哒嗪的，并与蛋白质进行有利的疏水相互作用，从而增强其效力。在咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶环体系中，酰胺NH与N1氮之间存在一个内部氢键。图5.化合物47的S对映体结合在GSK-3β激酶结构域（PDB ID: 8DJC）的X射线共晶结构（A）配体以绿色碳原子的棒状模型表示，氢键以黑色虚线表示。与配体相互作用的残基显示为棒状。2-甲基吗啉基团占据了核糖结合位点。（B）与GSK-3β的ATP结合位点结合的S-对映体47蛋白的表面表示。化合物在细胞试验中进行测试，其中GSK-3β抑制剂在短暂转染Tau蛋白的U2OS细胞中通过高含量成像试验测量其调节Tau蛋白S396磷酸化的能力。化合物25、38、41、44、45、47、(S)-47、(R)-47、48、49、53和54的实验结果见表4。结论如下：（1）在本实验中测试的化合物的pTau IC50值遵循GSK-3β酶实验中观察到的相同趋势；（2）在R2上含有4,4-二氟哌啶或吗啉的化合物在pTau测定中是最有效的（44、45和47）；（3）化合物41（R2=Ph）在R2（例如，45和47）时的效力比含啉基团的类似物低15-20倍；（4）化合物42在pTau测定中的效价无法确定，可能是由于在测定条件下溶解度差；（5）化合物(S)-47是该组中最有效的化合物。表4.咪唑类[1,2-b]哒嗪类GSK-3β抑制剂的pTau抑制活性a值是两个决定的平均数。b值是至少三次测定±SD的平均值。c值是单次测定的结果。体外分析-激酶选择性评估用412种激酶pp (Ambit/DiscoverX/Eurofins)对化合物进行广泛的激酶选择性筛选。单点检测板，设对照组，化合物浓度为1μM，结果如图6所示。对化合物44、45和47的激酶选择性谱的比较表明，与44和45相比，47有提高激酶选择性的趋势。GSK-3和CDKs是CMGC激酶家族的成员。而化合物47对与GSK-3最相似的激酶CDK2（IC50=1.4μM）的选择性超过1900倍，对CDK5（IC50=6.4μM）的选择性超过8700倍。图6.化合物44、45和47的边界径向图每条线表示在1μM测试化合物存在下单个激酶的剩余活性。单个激酶被分成不同的家族，用不同的线条颜色表示。从中心开始，圆圈表示控制绑定剩余的83%、33%和0%。SI33是在1μM的测试化合物存在下，具有≤33%对照结合的激酶的百分比。对于44、45和47,SI33分别= 5.3、5.8和4.1。化合物41、42、44、45、47和53的其他体外分析数据见表5。通过在人和小鼠肝微粒体中共温孵来评估化合物的代谢稳定性，结果表明41和42具有较高的代谢稳定性（10分钟后母体化合物的残留率>75%），而44、45、47和53具有较低的代谢稳定性（10分钟后母体化合物的残留率<50%）。研究表明，这是由于吡啶-2-甲基吗啉部分在自身发生氧化、开环和脱氢反应的同时，也易被肝微粒体氧化和双氧化。实验未观察到谷胱甘肽（GSH）偶联。然而，值得注意的是，在体外代谢稳定性测定中获得的结果并不一定能预测该化学型在小鼠药代动力学研究中化合物的体内分布。尽管这些化合物的血浆蛋白结合率很高，但化合物41、42和44与小鼠0.2-0.3% 无血浆部分的蛋白也表现出较高的结合。化合物45和47在小鼠血浆中的未结合部分也比44高几倍。特别地，用环丙基（53）取代47中的苯基导致未结合部分的额外增加，这可归因于该化合物的亲脂性降低。化合物53在人和小鼠中无血浆含量分别为1.5%和3.1%。平行人工膜透性试验（PAMPA）用于测定膜间被动透性。表5所示的结果表明，这些化合物具有高渗透性。在Caco-2细胞中也测量了通透性，Caco-2细胞中存在转运蛋白和外排蛋白。化合物45、47和53在Caco-2细胞中表现出高通透性，44也表现出高通透性，但比前三种化合物稍差。从B−A/A−B比值（<1）可以看出，这些化合物不是P-糖蛋白（P-gp）底物（表5）。表5中化合物的cLog P值范围为1.6至3.5，tPSA范围为72至85Å，是穿透血脑屏障的理想范围。化合物45、47和53的配体效率（LE）分别为0.43、0.40和0.42，亲脂配体效率（LLE）分别为6.88、6.14和6.98。在pH 1和pH 7.4、禁食状态模拟肠液（FaSSIF，pH 6.5）和进食状态模拟肠液（FeSSIF，pH 5）的溶解度分别为1.22、0.014、0.021和0.788mg/mL。表5.化合物41、42、44、45、47和53的体外分析数据a人（H）和小鼠（M）肝微粒体代谢稳定性；数值为孵育10分钟后母体残留的百分比。ND=未确定。体内药代动力学研究为了解化合物45、47和53在体内的分布，在雄性C57BL6小鼠中进行了药代动力学研究，结果见表6。当以2mg/kg静脉给药时，化合物45和47的清除率较低（分别为10.6和3.8 mL min-1kg-1）。化合物45的半衰期为3.1h，而化合物47的半衰期较长，为5.2h。化合物45和化合物47的分布体积（Vss）超过了体内总水量。当以10mg/kg的剂量作为溶液口服时，化合物45和47都被很好地吸收，并表现出较高的口服生物利用度（F%=~100和64%）。当静脉给药时，化合物53表现出中等清除率（49.5 mL min-1kg-1），半衰期短，为1.1h。当化合物53口服给药时，暴露量低于45和47，口服生物利用度为37%。化合物45、47和53的体外代谢稳定性和体内药代动力学特征之间的脱节可能归因于这些化合物的高血浆蛋白结合。然而，更高的内在清除率会导致更高的体内清除率，因此血浆蛋白结合的程度在体内化合物的清除率中也起着重要作用，并且可以改变相对于体外代谢稳定性结果上可能预期的药代动力学特征。在小鼠体内研究中，较差的水溶性妨碍了对41、42和44的评价。表6.化合物45、47和53在小鼠体内的药动学参数a静脉注射剂量2mg/kg，载体:40%聚乙二醇（PEG）400/35% 50mM柠檬酸盐（pH 4）/15%羟丙基β环糊精（HP-β-CD）/10%二甲基乙酰胺（DMAC，n=3）。b PO剂量10mg/kg，载体:83.3%聚乙二醇400/14.7% 50mM柠檬酸盐（pH 4）/2%聚维酮（PVP）-K30， (n=3)。抑制Tau磷酸化在上述药代动力学研究的3种化合物中，化合物47在小鼠药代动力学研究中清除率最低。进一步对化合物47在LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠的三重转基因小鼠阿尔茨海默病模型中进行了评价。LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠过度磷酸化的Tau（pTau）蛋白水平升高，并逐渐形成斑块和缠结，证明阿尔茨海默病造模成功。以剂量为250mg/kg （ip）的氯化锂作为阳性对照组，以30mg/kg（n=6）的剂量口服47作为实验组，实验结果显示化合物47导致pTau396减少52%。这种效果与用氯化锂观察到的还原水平相当，见图7。实验结束时（5h）测量了终端血浆和脑暴露，发现化合物47以3.8± 0.8μM的水平浓度暴露在血浆和1.3±0.4μM的浓度存在于脑中，脑-血浆（B/P）比为0.34。小鼠脑组织匀浆中47的未结合分数（fu,b）为0.9%，与小鼠血浆中未结合分数相当，未结合的脑与未结合的血浆比（Kp,uu）为0.34。图7.三转基因小鼠阿尔茨海默病模型的体内实验结果在LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠（n=6）中，以30mg/kg剂量（83.4% PEG 400/14.7% 50mM柠檬酸盐（pH 3）/2% PVP-K30）。以250mg/kg（ip）剂量口服氯化锂作为阳性对照，口服化合物47可使pTau396减少52%。在给药后5h得到结果。数据采用方差分析（ANOVA）和Dunnett事后检验进行分析，**与对照比较P<0.01结论抑制GSK-3β是治疗阿尔茨海默病的一种潜在方法。这篇报道描述了一类新的咪唑[1,2-b]哒嗪基GSK-3β抑制剂，并发现了具有亚纳摩尔GSK-3β酶抑制剂效力的高效类似物。SAR研究结合X射线共晶结构结果表明，只需在激酶的铰链结合区与Val135进行一次经典的氢键相互作用，GSK-3β就能获得优异的效价。在X射线共晶结构中，咪唑[1,2-b]吡啶环体系的酰胺NH与N1氮之间存在内部氢键。这种内部氢键以及有利的偶极相互作用使酰胺有利于生物活性构象。该化学型化合物在PAMPA和Caco-2检测中表现出高通透性。在包含412个激酶的Ambit面板和大约30个激酶的内部面板中筛选选定的化合物表明，具有良好的总体激酶选择性，对CDK2具有出色的选择性。在体内对化合物47进行了评估，发现该化合物在小鼠药代动力学研究中具有较高的口服生物利用度，并在三重转基因小鼠阿尔茨海默病模型中显着降低了tau磷酸化。对47的血浆和脑水平的测量表明，该化合物是一种中等脑渗透GSK-3β抑制剂。总之，本研究结果为进一步优化该类GSK-3β抑制剂化合物的物理化学和药代动力学性质提供了基础。文章来源J. Med. Chem. 2023, 66, 4231−4252请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就GSK-3β抑制剂举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于GSK-3β相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中绿色字体“高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于GSK-3β相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程阿尔茨海默病(AD)的病理特征之一是由磷酸化的Tau片段组成神经原纤维缠结（NFT）形成。天冬酰胺内肽酶（AEP）是一种关键的Tau蛋白切割酶，可产生易于聚集的Tau蛋白片段。抑制AEP以降低毒性Tau片段形成水平可能是一种很有前途的治疗策略。这篇文章报道了第一种具有不可逆结合模式的选择性、口服生物可利用性和脑渗透抑制剂，从可逆分子开始概述了该系列的发展，并在体外和体内证明了AEP抑制与Tau N368片段减少之间的联系。阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症形式，2020年全球有5500多万人受到影响。阿尔茨海默病大脑的两个主要组织病理学病变是淀粉样斑块，包括聚集的Aβ肽和神经原纤维缠结（NFTs）。缠结的主要成分是Tau蛋白，通常是一种与微管相关并稳定微管的高可溶性蛋白质。在AD和其他Tau病变中，Tau蛋白经历结构变化导致其聚集。总之，Tau聚集在Tau病变中起着重要的作用。特别地，AD患者认知能力与Tau聚集负荷呈负相关。此外，AD患者的多模态成像显示Tau聚集沉积与区域性脑萎缩和功能障碍相关。因此，减轻Tau聚集的策略是一种很有前途的方法来调节AD。Tau含有几个（3-4）串联重复序列，存在31或32个残基，每个都有一个特征的PGGG基序。重复区是分子的关键部分，使原纤维组装成核。结构研究表明，位于中心的重复区域通常被N端和C端区域覆盖，从而排除了溶液中Tau-Tau相互作用。翻译后修饰，如磷酸化和蛋白水解，诱导Tau蛋白的构象变化，暴露重复区域，促进聚集。溶酶体半胱氨酸蛋白酶天冬酰胺内肽酶（AEP）已被证明可以在重复区域的两侧切割Tau蛋白，从而暴露重复区域并促进聚集。AEP水平和活性在AD中上调，导致产生更多的Tau N368片段。AD患者脑脊液中Tau N368/total-Tau比值显著降低，且与18F-GTP1 Tau PET信号呈强负相关。这一观察结果与Tau N368片段容易聚集的假设相一致。除了切割Tau外，AEP还通过促进Tau磷酸化影响Tau聚集，因为AEP间接抑制蛋白磷酸酶2A（调节Tau去磷酸化的关键酶），AEP可能在促进Tau聚集之外参与AD的发病机制。AEP切割片段Tau N368最近被证明可以通过与BACE1转录因子STAT1结合来增加BACE1的表达和Aβ的产生。这意味着AEP抑制可能通过直接减少Tau N368片段或间接抑制BACE1途径对AD患者提供治疗益处。除Tau蛋白外，AEP被报道具有广泛的底物范围包括与神经退行性疾病相关的其他蛋白，如α-synuclein15和TDP-43。AEP在人体组织中普遍产生，与大脑相比，肾脏和淋巴器官中的AEP水平相对较高。AEP KO小鼠表现出肾近端小管上皮细胞（PTEC）增生和增生的进行性肾脏病理，并表现为免疫系统过度刺激的噬血细胞综合征。因此，该项目的第一个目标是通过使用目标化合物进行药理学抑制并降低潜在的外周毒理学影响的风险。第二个目标是使用脑渗透目标化合物证明AEP在阿尔茨海默氏症或其他Tau病变中的参与机制。先前寻找AEP抑制剂的努力是由Bogyo（化合物1）和Williams（化合物2和3）组推动的。此外，Ye组报道化合物4和5可能通过一种变构抑制机制在体内表现出促进认知的作用。图1.已报道的AEP抑制剂不幸的是，这些抑制剂由于高极性和部分低代谢稳定性以及高蛋白质结合而导致渗透性差。它们不适合测试疾病假说或降低体内外周毒性。在体内可以获得AEP-配体复合物的X射线晶体结构，揭示了催化位点的分子识别（图2）。其与天冬酰胺和天冬氨酸（低pH）残基C端蛋白质底物的特异性切割一致，S1口袋相对较小且极性很强。与Arg-44（2.8和3.0Å）和Asp-231（2.6Å）的侧链形成氢键。肽型氯甲基酮抑制剂AcYVAD-CMK通过与Ser-216和Ala-218附加的主氢键进入子口袋S2−S4。此外，还检测到与Cys-189的共价键（图2）。图2.AEP与Ac-YVAD-CMK共晶（PDB代码: 4aw9）。图中标注了结合口袋S1~S4，以及关键蛋白-配体氢键（红线）和与Cys-189的共价键（蓝线）。化合物设计与SAR研究受益于氰基与Cys-189共价结合，丙酰胺取代基与P1 Asn残基相似，二级酰胺NH和三级酰胺C=O分别与Ser-216和α-218的主链相互作用（图3），选择以通式6的腈（表1）为起点，并重点优化了指向S3和S4袋的R1-R3取代基。最初的SAR研究（表1）表明，芳基乙酰胺具有最好的效价，通过在α位置安装环丙基或环丁基等取代基，可以进一步提高5-20倍（比较化合物6e和6f与6a）。这可以用模型中通过S3口袋中的范德华相互作用来合理化解释。此外，芳基环对位的亲脂取代基对效价和渗透性都有有益的影响。图3.覆盖晶体结构（PDB ID：4aw9）的支架6（黄色）模型表1.P3和P4残基的初始优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10−6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。在亲脂性、高通透性和低清除率之间取得平衡对于获得具有良好体内药代动力学（PK）特征的化合物至关重要。在此基础上，将化合物6o确定为第一个进一步分析的化合物（见下表4）。化合物6o在小鼠中表现出良好的PK谱，生物利用度为41%，脑穿透Kp,uu为0.22。接下来，测定化合物的细胞效力。不幸的是，酶促试验的荧光底物Z-AAN-Rh110不能渗透细胞。其他例如通过Western blot观察内源性底物或使用化学探针，如LE28或AP-1是可行的，但不适合高通量。于是，Roche公司设计了一种细胞渗透的荧光底物，结合亲和力和选择性，提供化合物6o的左手边（即1-(4-(三氟甲氧基)苯基)环丙羧酸(7)的酰胺）连接荧光氨基甲基香豆素（AMC）（图4）。图4. 用于细胞试验的荧光可渗透底物有了底物8，使用过表达HEK293细胞的AEP建立了细胞实验。用这种方法分析化合物，发现腈在细胞水平具有很好的酶促抑制作用，其效力变化约为200倍（表2）。表2.选定腈的细胞潜能a至少2次测定的几何平均值±SEMRoche设想了一种更持久、潜在不可逆的抑制剂，以确保AEP的完全阻断。弹头是多种多样的，不同的不可逆反应基团附着在相应的肼支架上（表3）。化合物孵育0.5h后的酶抑制活性总体上与亲电中心的反应活性相关，氯乙酰胺12被认为是最有效的，但存在一些稳定性问题。自氟乙酰胺11，反应性逐渐降低。表3.含不可逆结合基（弹头，WH）的6o衍生物的效价及表征a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10-6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。氟乙酰胺11在二级功能分析中具有良好的效力，具有良好的选择性和药物代谢和药代动力学（DMPK)谱，并在体内进一步表征（表4）。表4.化合物6o和11的生化、物理化学和DMPK性质a至少2次测定的几何平均值±SEM。b从抑制试验开始测定。c小鼠肝细胞孵育后清除率。dP-gp抑制剂作用下P-gp过表达的小鼠LLC-PK1细胞的顶端外排比和表观通透性。e血浆蛋白结合、未结合部分。fClean是指在10μM条件下，所有检测结果的结合率<50%，或者酶检测结果的选择性>1000倍。g用自动膜片钳yy y测量。C57BL/6小鼠单次给药1mg/kg iv和10mg/kg po灌胃（11）和3mg/kg iv和30mg/kg po灌胃（6o）后的PK参数。药代动力学评估化合物11在给药后表现出中等的生物利用度和良好的半衰期，但由于细胞渗透性低，故化合物11的脑渗透性较差。此外，尽管p -糖蛋白（P-gp；MDR1）转运蛋白含量较低（表4），根据以往经验，Roche公司认为这可能是由主动外排的显著贡献所引起的。P-gp测定法对低被动渗透率化合物的定量达到极限。然而，由于其高效、选择性和不可逆的结合模式，它仍是一种合适的目标化合物，可以解决体内潜在的靶外周毒性，这在KO动物中观察到。为了评估外周AEP抑制剂的体内安全性，给CD1小鼠口服化合物11，每天2次，剂量水平分别为40和60mg/kg/天，持续8周。在这项研究中，没有观察到生活中的发现和复合相关死亡率。在两种剂量的组织病理学分析中均无不良发现。NOAEL考虑为20mg/kg/BID。脱靶特征是睾丸中生殖细胞的中度耗损和变性，少量至中度的腔细胞碎片，以及少量至显著的附睾精子细胞减少。不能排除与11治疗有关。毒性动力学分析显示，第56天最大（Cp,max,free）和平均（Cp,avg,free）游离血浆暴露分别至少为464/436nM（男性，m/女性，f）和123/204nM（m/f）。因此，在HEK细胞中，游离暴露与细胞效力的比值至少为2.7/2.6（m/f）（Cp,max,free）和0.7/0.7 （Cp,avg,free）。在第1天测定799/838nM的Cp、max、free水平（4.6/5.0倍）和224/204nM的Cp、avg、free水平（1.3/1.2倍）。考虑到不可逆的结合方式，外周AEP抑制剂在安全性研究中通过。由于脑脊液-血浆Kp,uu较低，AEP在脑内仅部分受到抑制。接下来，Roche公司将注意力转向了炔10，以提高脑外显率和代谢稳定性。炔以前被描述为不可逆的弹头，并与半胱氨酸形成硫烯醇醚，与结合口袋近距离结合。37-39它们比氟乙酰胺亲脂性更强，因此被认为更适合于实现脑渗透。此外，化合物6o的代谢物鉴定研究表明脯氨酸部分是代谢热点。因此，接下来探索了化合物10中的多种脯氨酸替代品，并研究了它们对效力和代谢稳定性的影响（表5）。表5.脯氨酸核心片段的优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10-6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。首先，(4R)-甲基取代脯氨酸（16）优于其(4S)配置的非对映体（17），无论是细胞效力还是微粒体稳定性，这一趋势也适用于氟取代类似物(18)。环合的环丙基环提高了细胞效力，但微粒体稳定性较差（化合物19、20和21）。苯基环接吡咯烷对这两个参数都有良好的影响（化合物22）。总体而言，也考虑到进一步的表征，例如对肝细胞的稳定性和P-gp转运体外排比和通透性，化合物18显示出最平衡的特征（表5和8）。接下来，通过炔取代基的变化来研究炔的电位活化的影响（表6）。可以看出取代基不仅是耐受的，而且确实导致了显著的效价增加。表6.杂芳基取代对炔的活化作用a至少2次测定的几何平均值±SEM。b小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。cd6（μg）DMSO相对于经颅磁刺激。d与补充NADPH和还原性GSH的人肝微粒体复合孵育后，发现谷胱甘肽（GSH）加合物（Flag）或未发现（No Flag），采用MS/MS分析测定。e可逆结合模式。如图5所示，似乎有两个主要因素影响不同炔取代的pIC50值。首先，与炔基亲电中心的13C位移有相关性，这是衡量弹头亲电性的一个指标。其次，与具有相似反应活性但没有这种结构特征的类似物相比，在邻位上具有氮孤对的杂芳基取代始终显示更高的pIC50值。例如，化合物34（R=Ph）和29（R=o-pyr）在Cel处具有相似的化学位移，但效价相差10倍（表6）。图5.在d6-DMSO中，相对于TMS，酶对碳原子细胞13C位移的效力散点图，单位为ppm。带有邻氮原子的杂芳基片段（蓝色）比没有这个特征的片段（红色）具有更高的效价。谷胱甘肽加合物形成用圆圈表示，而不是加合物形成（菱形）。配体复合物X射线晶体结构研究为了进一步阐明这一有趣的发现，他们测定了化合物36与AEP配体复合物的X射线晶体结构。尽管在底物结合位点附近存在晶体接触，但这些接触在不对称单元中的四个AEP分子之间是不同的，并且存在一致的抑制剂结合模式。此外，围绕炔段的AEP相互作用非常相似。如图6所示，其中显示了内部炔碳原子与Cys-189的共价键，导致sp→sp2杂化变化。噁唑环与相邻的乙烯π系接近共面（扭转角~16°），其氮原子与一个水分子形成弱氢键（d=3.5Å），该氢键通过与Glu-190和Ser-215侧链的相互作用保持在原位。推测该炔抑制剂与相邻杂环中的邻氮的亲和力增加是由于额外的氢键相互作用，并进一步稳定了蛋白质结合的水分子。此外，这种杂环与相邻双键共轭作用的增强可能进一步贡献结合能。图6. AEP与化合物36共晶（PDB ID：7fqk）。氢键用红线表示，与Cys189的共价键用蓝线表示。水晶触点已从图中省略。不幸的是，大多数这些化合物在微粒体稳定性试验中的表现很差，可能是由于三键亲电中心的高反应性（表6）。这种反应性可以通过谷胱甘肽（GSH）加合物形成试验中的广泛标记来证实。无法推导出13C位移、芳香片段R中邻位氮的存在与GSH加合物形成之间的相关性（图5）。随后基于炔基弹头，进一步优化了与S3和S4口袋的相互作用（表7），发现五元杂环在S4中是耐受的，并且邻位的硫原子或氯取代基可以提高配体效率LE41（化合物38和40）。此外，虽然对位上的环烷基甲氧基取代基对效价有有利影响（化合物42和43），但与简单的三氟甲氧基（化合物10，LE 0.36）相比，配体效率没有提高，而且代谢稳定性降低。表7. P3和P4残基的进一步优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。c配体功效，见（41）。一般可以通过将炔作为亲电共价反应基团来获得两位数纳摩尔范围内的细胞电位。不可逆的结合模式有助于在细胞环境中胜过内源性底物并增加了炔的渗透性。通过抑制动力学起始实验（图7）和共晶结构研究了丁腈和炔作为战斗部的结合模式。两个示例性化合物，腈6q和炔43与Cys189形成共价键。随着腈6q浓度的增加，酶的进程曲线呈线性，这表明了一种快速、可逆的结合模式（图7B）。相比之下，炔43存在时的进展曲线显示出平台曲率（图7C），表明不可逆的结合模式。抑制开始的速率常数kobs与炔43浓度呈线性关系（图7D），这与不可逆失活的一步机制一致。利用斜率确定的Kinact/KI为10,361/s/M，是衡量化合物43失活效率的总体指标。优化后的化合物具有良好的生物化学和细胞效力，具有良好的体外DMPK谱。这些化合物的选择在体外和小鼠体内进行了更详细的表征（表8）。据知，这是第一类既可口服又可脑渗透的AEP不可逆抑制剂。其中，化合物18的生物利用度为83%，脑外显率约为30%。这些化合物在体外能够抑制Tau N368片段的形成，如表8所示。那么该片段的形成在体内是否也同样受到抑制？事实上，在表达含有P301L突变Tau蛋白2N4R亚型的Tau转基因小鼠中，经过5天的处理，化合物18表现出显著抑制脑内AEP活性（图8A），并在所有测试的外周器官中完全抑制。同时，观察到Tau N368片段的形成减少（图8B），证实了体外测量的结果。对总Tau蛋白的影响不显著（图8C）。原因是Tau与Tau N368片段的大量过剩。另一个偏差可能是由于只有一个裂解位点被监测，并且只有未磷酸化的物种被基于质谱的分析检测到。表8.候选化合物的体外和体内表征a至少2次测定的几何平均值±SEM。b从抑制试验开始测定。c测定SH细胞中Tau N368片段还原的有效浓度。dP-gp抑制剂存在时P-gp过表达的小鼠转染的LLC-PK1细胞的外排比和表观通透性。e血浆蛋白结合，未结合部分。FGSH加合物与补充NADPH和还原性GSH的人肝微粒体复合孵育后发现（Flag）或未发现（No Flag），采用MS/MS分析测定。gClean表示在10μM的所有测试中，与酶分析中的AEP相比，在所有测试中<50%的结合或>1000倍的选择性。hIC50（Casp 3）>100μM, IC50（Cat S）>100μM。IC57BL/6小鼠单次iv给药1mg/kg和20mg/kg po给药后的PK参数。图8. AEP抑制剂18、20mg/kg BID给药5 d后对TauP301L转基因小鼠AEP的抑制作用。（A）最后一次处理后4小时脑组织样本相对于载药对照组的AEP活性。（B）Tau N368片段浓度。（C）未裂解Tau水平，均与总蛋白和载体平均水平归一化Tau N368片段数量减少导致Tau聚集减少并最终改善认知的基本假设仍有待长期实验证明。这次实验的结果将在之后报告。结论研究首次鉴定出具有细胞活性、可口服、脑渗透性不可逆结合的AEP抑制剂，并在体内证实了靶向性。酶学和X射线共晶分析证实了未开发炔类的不可逆作用模式。在此过程中，已经开发了一种细胞渗透荧光，AEP选择性底物，并降低了潜在靶诱导肾毒性的风险。不可逆抑制剂被证明具有持续的细胞效应，并且在未来的研究中可作为选择性的，体内适用的候选化合物。最后，AEP的正位抑制与大脑中Tau N368片段的减少之间的联系得到了证实。文章来源J. Med. Chem. 2023, 66, 17026−17043请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就阿尔兹海默症靶点Tau举例如下：首页输入Tau，即得。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于Tau相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于Tau相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。其中绿色高亮展示了潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。