Pevonedistat

β-连环蛋白(CTNNB1,β-Catenin)是一种致癌转录因子，驱动许多不同类型的人类癌症的发病机制，包括肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌。CTNNB1作为E-cadherin和α-catenin的大蛋白复合物的一部分调节细胞间的粘附。CTNNB1也是一种转录因子，可被上游Wnt信号通路激活，该信号通路调节参与细胞增殖、存活、上皮-间质转化、迁移和转移的基因。CTNNB1受泛素-蛋白酶体系统的高度调控，其中E3泛素连接酶β-TrCP1在被GSK3α和GSK3β磷酸化后识别CTNNB1的N端。 CTNNB1突变常见于多种癌症，通常位于E3连接酶识别的N端片段，阻止CTNNB1的泛素化和降解，从而增强CTNNB1的致癌转录活性。在Wnt通路中也发现了突变，包括APC和轴蛋白，这些突变可增强CTNNB1的水平和活性。针对Wnt通路的癌症治疗已经做了很多努力，PKF115-584和CGP04090破坏CTNNB1和TCF之间的相互作用。然而，这些化合物的抑制机制尚不清楚，这些化合物含有与泛测定干扰化合物(苦痛)相关的功能基团，如醌或紫黄素ICG-001通过与CBP的结合破坏CTNNB1与CBP之间的结合，并且在微摩尔效应下不是特别有效抑制剂，如IWR-1和XAV939，稳定轴蛋白和CK1激活剂pryivinium，以增强破坏复合物的活性，但这些化合物并不直接与CTNNB1相互作用。此外，虽然Wnt通路抑制剂很有前景，但在许多人类肿瘤中发现的Wnt通路中的许多突变可能使这些间接作用的化合物无效直接作用的CTNNB1抑制剂或降解剂作为潜在的癌症治疗药物是优选的，但由于CTNNB1的结构灵活性、内在无序性和缺乏可配体热点，直接靶向致癌转录因子(如CTNNB1)仍然具有挑战性。来自加州大学伯克利分校的Daniel Nomura教授团队通过筛选共价分子库和蛋白质细胞组学得到的直接与CTNNB1结合作用的化合物NF764。 为了鉴定CTNNB1的共价降解物，作者在HEK293细胞中筛选了2100个由丙烯酰胺和氯乙酰胺组成的半胱氨酸反应性共价配体文库，确定在与蛋白酶体抑制剂硼替佐米或Cullin E3连接酶NEDDylation抑制剂MLN4924预孵育后CTNNB1损失衰减的化合物(图S1)。作者发现EN83是唯一表现出剂量响应性CTNNB1损失的靶标，该损失通过蛋白酶体或NEDDylation抑制而显著减轻，这表明EN83通过泛素-蛋白酶体介导的机制作为CTNNB1降解剂(图1b-d) 作者通过Western blotting进一步证实了HEK293T细胞中蛋白酶体介导的CTNNB1缺失(图1e,f)。EN83以剂量依赖的方式显著抑制CTNNB1转录活性，证明细胞中WNT通路的功能性抑制(图1g)。作者观察到，与CTNNB1降解相比，EN83在细胞中对CTNNB1转录活性的抑制作用更高，这表明EN83可能在较低浓度下与CTNNB1结合以抑制CTNNB1活性，而CTNNB1的降解需要更高的结合或浓度。CTNNB1在由CTNNB1驱动的结直肠癌细胞中的表达，包括HT29、COLO和SW480癌细胞系(图1)。 接下来，作者试图确定EN83是否直接与CTNNB1共价结合。作者发现EN83剂量响应性地取代半胱氨酸反应性荧光探针用凝胶基ABPP标记纯人源CTNNB1蛋白，表明EN83通过靶向CTNNB1上的半胱氨酸直接作用于CTNNB1纯蛋白(图2a)。作者进一步对CTNNB1纯蛋白与EN83孵育后的胰蛋白酶进行串联质谱分析(MS/MS)，发现四种半胱氨酸被EN83修饰C439、C466、C520和C619(图2b)。为了进一步证实EN83与CTNNB1的直接共价结合，作者合成了EN83的炔功能化类似物NF686，并通过NF686对纯CTNNB1蛋白进行了直接共价剂量响应探针标记(图2c,d)。作者进一步证明了共价是必要的，因为EN83的非反应性类似物NF602不显示与CTNNB1结合，并且通过HiBiT或Western blotting检测不会改变CTNNB1水平(图2e-h)。研究结果表明EN83直接与CTNNB1结合。 接下来，作者想确认EN83在细胞中与CTNNB1结合。作者首先在细胞中使用炔探针NF686来证明CTNNB1可以在不富集GAPDH等不相关靶标的情况下从细胞中富集(图3a)。作者使用先前建立的方法进行了基于质谱的ABPP或同位素去硫代生物素-ABPP (isoDTB-ABPP)，以绘制EN83在细胞中整个蛋白质组范围内的半胱氨酸反应性。这些结果表明，EN83与C619的作用大于50%。 在作者的isoDTB-ABPP实验中，作者没有检测到EN83参与的其他三种半胱氨酸，可能是因为这些半胱氨酸不是基于碘乙酰胺反应性的探针的目标，或者这些肽可能不能很好地通过基于MS的方法从复杂的蛋白质组中电离。因此，作者无法确定其他三种半胱氨酸的参与，但作者的数据显示C619在CTNNB1中有显著的参与。然而，半胱氨酸化学蛋白质组学分析还揭示了许多其他靶点被EN83-308显著参与CTNNB1的直接共价靶向导致其降解，作者仍然对EN83能否通过很感兴趣，并将该化合物视为“探路者探针”，以确定CTNNB1配位性的途径，随后可通过药物化学的努力进行优化。EN83细胞处理的细胞热移实验显示CTNNB1在细胞中具有明显的热不稳定性。这些结果进一步证明了EN83直接作用于CTNNB1，也表明CTNNB1的降解可能是通过直接共价靶向CTNNB1引起的，导致CTNNB1折叠不稳定，随后泛素化和降解(图3c,d)。 接下来，作者试图确认EN83在CTNNB1中靶向的半胱氨酸是否有助于其降解。作者在细胞中表达了flag标记的野生型、C439S、C466S、C520S或C619S突变型CTNNB1，结果表明，C466、C520或C619的丝氨酸突变(而不是C439)显著减弱了细胞中CTNNB1的降解(图4a,b)。与这三种半胱氨酸在CTNNB1降解中的作用一致，C466、C520和C619突变为丝氨酸导致FLAG-CTNNB1减少完全衰减(图4c,d)。这些结果表明，直接靶向CTNNB1中鉴定的四种半胱氨酸中的三种会导致CTNNB1的降解，并且CTNNB1的下调不是通过间接机制或通过EN83的许多脱靶之一。 为了提高EN83对CTNNB1的活性并探索其构效关系，作者合成了几种EN83的类似物。EN83是两种对映体的外消旋混合物。作者首先用手性色谱法分离单个对映体，以确定是否有一个特定的对映体更有效。EN83的两种对映体通过HiBiT和蛋白酶体介导的CTNNB1降解显示出相当的CTNNB1水平降低，并且显示出相同的CTNNB1结合，表明两种对映体之间没有差异。 作者还寻求替代氯乙酰胺半胱氨酸反应弹头，优化其代谢特性。不幸的是，在许多口服共价药物(如BTK抑制剂ibrutinib或KRAS G12C抑制剂sotorasib)中发现的丙烯酰胺(NF601)替代11损害了与CTNNB1的结合，并且在HiBiT或Western blotting检测方法中均未显示CTNNB1减少。 作者发现，用三氟甲基部分NF740和NF741取代甲氧基基团，可以耐受凝胶基ABPP与CTNNB1结合，并以剂量反应方式降低HEK293细胞中CTNNB1 HiBiT水平。 作者发现用含NF764的氧苯基丁烯酰胺战斗部替换氯乙酰胺战斗部可以改善CTNNB1的结合(图5a,b)。分析纯CTNNB1蛋白的NF764修饰位点发现，只有C619被NF764内聚，而C439、C466和C520没有被NF764内聚。NF764的半胱氨酸化学蛋白质组学分析显示，CTNNB1 C619在HT29结直肠癌细胞中以3.7的比例显著参与，表明在10nM处参与73%。引人注目的是，NF764有效降解CTNNB1, 50%的降解浓度(DC50)为3.5nM, Dmax。81%的HT29细胞(图5e,f)。CTNNB1蛋白水平的丧失仍然依赖于蛋白酶体(图5g)。因此，虽然这些变化可能是由于NF764的脱靶效应，但蛋白质水平的许多变化可能是通过靶机制发生的。 作者进一步发现几个CTNNB1靶基因的mRNA水平显著下调，包括MYC、S100A6、AXIN2和CCND1。因此，作者证明NF764是一种更有效和选择性的CTNNB1结合剂和降解剂。 为了进一步验证NF764仅通过靶向C619而不是通过靶向三种半胱氨酸作用的EN83来降解CTNNB1，作者证明了与表达FLAG-CTNNB1野生型蛋白的细胞相比，表达HEK293T的FLAGCTNNB1 C619S突变的细胞对NF764介导的CTNNB1损失具有完全的抗性，并且表达C466S/C520S/C619S三重突变的细胞对NF764介导的CTNNB1损失具有完全的抗性。除了单个C619S突变外，细胞没有表现出任何额外的响应(图6a,b)。NF764的细胞热移分析也显示，HT29细胞中CTNNB1的不稳定性更为明显，NF764处理后，熔化温度从62℃上升到55℃，变化7℃(图6c,d)。因此，虽然作者的化合物可能仍然有脱靶，但作者证明NF764对CTNNB1的降解是通过C619对CTNNB1的直接共价靶向介导的。因此，作者将NF764指定为一种先导化合物，该化合物揭示了一种新的可配体半胱氨酸C619，可以用于降解CTNNB1。 在这项研究中，作者发现了一种CTNNB1的降解物，它通过C466、C520、C619或仅C619对CTNNB1的直接共价靶向作用，以蛋白酶体依赖的方式破坏和降解CTNNB1。作者推测，在本研究中观察到的降解模式可能不同于传统的靶向蛋白降解模式，如靶向嵌合体(PROTACs)和分子胶降解剂的蛋白水解，而是通过CTNNB1的热力学不稳定发生，直接共价结合导致不稳定介导的CTNNB1降解。许多转录因子由于缺乏用于小分子结合的定义明确的结合口袋，并且许多转录因子具有大片段的非结构化或无序区域，因此常常无法通过传统的药物发现努力。无论是通过抑制、激活、不稳定还是降解，共价配体都可以进入高动态和内在无序的蛋白质(如转录因子)的动态和瞬时状态或罕见但动态可达的状态，以独特的方式调节其功能。虽然难以证明，但作者推测转录因子内部这些内在无序的区域可能采用一种瞬时结合口袋，可以被共价配体分子识别，形成不可逆的键。鉴于这些无序转录因子可能已经是热力学不稳定的，作者假设它可能不需要显著的结合能来进一步破坏这些动态区域的稳定，从而导致它们的展开并最终泛素化和降解这些靶标。 与之前描述的CTNNB1抑制剂相比，CTNNB1抑制剂要么间接作用于Wnt通路的其他组分，要么潜在地直接作用于CTNNB1，但不能有效地或以未知的机制或选择性调节其功能，作者提出了一种高效的CTNNB1降解剂，它通过一种独特的机制共价靶向一种新的可配体C619来破坏和降解CTNNB1。总的来说，作者的研究证明了使用共价化学蛋白质组学策略来识别独特的配体位点和共价配体的实用价值，这些配体可以直接靶向经典的难以处理的靶标类，如转录因子，最终降解CTNNB1等靶标，用于潜在的未来癌症治疗应用。 参考文献 Covalent Degrader of the Oncogenic Transcription Factor β-Catenin. J Am Chem Soc. 2024， doi: 10.1021/jacs.4c05174. 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

引言 细胞死亡是生命体在生长发育以及组织清除多余或受损细胞的一个基本生理过程，作为新陈代谢的环节之一，其对维持机体正常稳态有重要意义【1】。肿瘤的特征性细胞死亡抵抗主要体现在肿瘤细胞进化出各种策略限制或避免死亡，进而赋予肿瘤细胞优于正常细胞的特异性增殖能力。铁死亡是新近发现的一种新型程序性死亡形式，通过特定化合物或调控相关基因的表达诱导铁死亡，可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移；同时，通过诱导铁死亡，可以增加如抗肿瘤放化疗及免疫治疗的功效【2】，因此，铁死亡是近年来肿瘤治疗方法的热点研究方向。揭示铁死亡的调控机制，将为肿瘤发病机理的认识提供全新的突破口，并为其临床靶向治疗提供新的策略与手段。 2024年7月3日，浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所/浙江大学转化医学研究院孙毅教授团队在PNAS发表题为The CRL3KCTD10 ubiquitin ligase-USP18 axis coordinately regulates cystine uptake and ferroptosis by modulating SLC7A11的研究论文，报道了E3泛素连接酶CRL3KCTD10和去泛素化酶USP18协同调控胱氨酸转运蛋白SLC7A11的稳定性，从而调控肿瘤细胞的胱氨酸吸收和铁死亡。 拟素化 (neddylation) 是一种调节蛋白活性或功能但不介导其被26S蛋白酶体降解的蛋白质翻译后修饰，其过程与泛素化过程类似，通过三联酶促反应将拟素NEDD8与目标蛋白共价结合。拟素化修饰的生理性底物为Cullin家族蛋白， Cullin的拟素化激活Cullin-RING ligase (CRL) E3泛素连接酶，负责细胞内经泛素-蛋白酶体信号通路降解蛋白的泛素化。因此，拟素化修饰与蛋白泛素化降解紧密关联【3】。孙毅课题组前期通过非靶向代谢组学研究，发现拟素化修饰在整体上显著调控细胞代谢【4】，细胞代谢通路通过分析显示谷氨酰胺代谢变化最为显著。阻断拟素化修饰后，肿瘤细胞谷氨酰胺吸收及其代谢显著增加【5】。在一些肿瘤中，为维持谷氨酰胺代谢的有序进行，谷氨酰胺代谢产物谷氨酸需外排至细胞外并将胞外胱氨酸运送至细胞内，而催化此反应的是谷氨酸与胱氨酸交换的关键转运蛋白SLC7A11【6, 7】。基于此，课题组发现拟素化修饰抑制后，培养基上清中胱氨酸含量显著降低，且SLC7A11水平增加；同时，细胞中敲减SLC7A11，可逆转抑制拟素化修饰所诱导的胱氨酸吸收，提示：抑制拟素化修饰，使CRL E3泛素连接酶功能失活，导致SLC7A11累积，促进细胞胱氨酸摄取及其代谢。 为明确拟素化修饰抑制后SLC7A11累积的机制，课题组通过一系列遗传学筛选和生物化学实验发现：CRL3KCTD10E3连接酶促进SLC7A11的K48连接的多聚泛素化降解，进而降低其稳定性。而去泛素化酶USP18去除SLC7A11泛素化修饰，从而增加SLC7A11蛋白的稳定性。在胱氨酸胁迫环境中，SLC7A11和KCTD10相互作用减弱并抑制KCTD10对其泛素化作用，而SLC7A11和USP18相互作用增加并增强USP18对其去泛素化作用，进而促进SLC7A11的累积。鉴于SLC7A11在胱氨酸吸收和细胞铁死亡中的重要作用，作者验证了KCTD10和USP18通过靶向SLC7A11，分别负向和正向调控胱氨酸的摄取和细胞铁死亡。 由于抑制拟素化导致的细胞胱氨酸吸收对肿瘤细胞存活有保护作用，研究者使用拟素化抑制剂小分子MLN4924联合SLC7A11抑制剂Erastin（或IKE），体外细胞实验及体内肿瘤模型实验结果均显示同时靶向拟素化通路和胱氨酸吸收可显著抑制肿瘤细胞增殖。研究结果为MLN4924联合用药提出了可行的方案。 为探究此发现的临床意义，课题组分析了人体乳腺癌肿瘤组织样本，发现KCTD10呈低表达而USP18和SLC7A11高表达状态，KCTD10和SLC7A11呈负相关性，而USP18与SLC7A11呈正相关性。从癌旁到癌组织，KCTD10表达逐渐降低，而USP18和SLC7A11表达逐渐增高。最后，课题组发现乳腺癌组织中胱氨酸含量低于癌旁组织，说明乳腺癌对胱氨酸有高吸收和代谢，而肿瘤微环境中胱氨酸含量的降低，会重塑肿瘤细胞中KCTD10和USP18的水平来调控SLC7A11的稳定性，从而进一步调控肿瘤细胞对胱氨酸的吸收和代谢。 CRL3KCTD10负向而USP18正向调控SLC7A11，从而调控胱氨酸的摄取和细胞铁死亡（Credit: PNAS） 参考文献 1. A. Strasser, D. L. Vaux, Cell Death in the Origin and Treatment of Cancer. Molecular cell 78, 1045-1054 (2020). 2. B. R. Stockwell, Ferroptosis turns 10: Emerging mechanisms, physiological functions, and therapeutic applications. Cell 185, 2401-2421 (2022). 3. S. Zhang, Q. Yu, Z. Li, Y. Zhao, Y. Sun, Protein neddylation and its role in health and diseases. Signal Transduct Target Ther 9, 85 (2024). 4. Q. Zhou et al., Inhibiting neddylation modification alters mitochondrial morphology and reprograms energy metabolism in cancer cells. JCI insight 4 (2019). 5. Q. Zhou et al., Neddylation inhibition induces glutamine uptake and metabolism by targeting CRL3(SPOP) E3 ligase in cancer cells. Nature communications 13, 3034 (2022). 6. L. A. Timmerman et al., Glutamine sensitivity analysis identifies the xCT antiporter as a common triple-negative breast tumor therapeutic target. Cancer cell 24, 450-465 (2013). 7. A. Muir et al., Environmental cystine drives glutamine anaplerosis and sensitizes cancer cells to glutaminase inhibition. eLife 6 (2017). https://doi.org/10.1073/pnas.2320655121 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述