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白细胞介素-1受体相关激酶4（IRAK4）是先天免疫信号通路的关键调控因子，其激酶活性和支架功能双重作用导致传统抑制剂难以完全阻断炎症反应。近日，清华大学饶燏团队在《Chinese Chemical Letters》发表了题为 “Developing potent anti-inflammatory IRAK4-targeting PROTACs with simplified CRBN ligands ”的研究论文，报道了一种基于简化CRBN配体的IRAK4靶向PROTAC降解剂LZ-07，该化合物DC₅₀为1.14 nM，在抗炎活性上优于临床Ⅱ期的IRAK4降解剂KT-474，为自身免疫疾病治疗提供新的策略。IRAK4通过Toll样受体（TLR）和IL-1受体（IL-1R）信号通路激活NF-κB、p38、IRF5/7和MAPK等信号通路，驱动炎症因子释放。即使IRAK4的激酶活性被抑制，其支架功能仍可维持炎症信号传递（图1A）。临床IRAK4抑制剂（如PF-06650833）仅靶向激酶活性，无法阻断支架功能，导致抗炎效果受限。PROTAC技术通过降解IRAK4蛋白可同时消除其酶活和非酶活功能，对炎症的抑制更彻底。目前临床上现有IRAK4靶向PROTAC降解剂KT-474（图1B）的合成步骤较为复杂，从简单易得的商业化原料开始合成，需要经过19步反应。因此，开发合成路线更简洁、同时具备高效抗炎活性的IRAK4降解剂，仍具有重要的研究与应用价值。图1. IRAK4信号通路及代表性的IRAK靶向PROTACs。（A）IRAK4靶向小分子抑制剂和PROTACs的作用机制。（B）代表性的IRAK4靶向PROTACs。针对以上问题，研究团队进行了三个阶段的PROTAC库构建与筛选工作（图2A-C），最终获得高效IRAK4靶向PROTAC降解剂LZ-07，具体研究如下：1.首轮筛选：基于传统E3泛素连接酶配体（CRBN/VHL），以及不同类型的IRAK4配体，结合不同长度的刚性和柔性linker构建了第一轮靶向IRAK4的PROTAC分子库，并结合高内涵成像筛选技术，快速发现了先导分子PL-01，但降解效率仅26%。2.二轮优化对第一轮建库筛选到的高效IRAK4配体进行了结构优化，提高了合成的可及性，并结合度胺类CRBN配体进行了第二轮建库，获得PL-18（100 nM蛋白降解超过75%）。3.三轮优化：针对度胺类CRBN配体可能的IKZF1和IKZF3等脱靶效应，引入结构简化的CRBN配体，最终获得具有优异降解活性的LZ-07（DC₅₀ = 1.14 nM）及LZ-22（10 nM诱导超过80% IRAK4蛋白降解）。图2. IRAK4靶向PROTAC库的设计与构建。（A）第一代IRAK4靶向PROTAC库。（B）第二代IRAK4靶向PROTAC库。（C）使用简化的CRBN配体构建的第三代IRAK4靶向PROTAC库。接下来，研究团队对LZ-07的降解效率和降解机制进行了研究，通过WB实验发现LZ-07能够浓度和时间依赖性的降解IRAK4蛋白（图3A-C），在DOHH2和TMD8两种细胞的DC50值分别为1.14和2.7 nM，最大降解超过90%。Rescue实验进一步证实，IRAK4的降解是通过CRBN介导的蛋白酶体途径实现（图3D）。图3. LZ-07的降解效率评估和降解机制研究。（A）用LZ-07和KT-474处理TMD8细胞16小时后，IRAK4水平的免疫印迹分析。数据以均值±标准差（SD）表示（n = 3）。（B）用LZ-07和KT-474处理DOHH2细胞16小时后，IRAK4水平的免疫印迹分析。数据以均值±标准差（SD）表示（n = 3）。（C）用50 nmol/L的LZ-07处理TMD8细胞不同时间点后，IRAK4的免疫印迹分析。（D）在TMD8细胞中，预先用DMSO、MG132（0.5 μmol/L）、MLN4924（0.5 μmol/L）、pomalidomide（1 μmol/L）和抑制剂compound E（1 μmol/L）处理2小时后，再用LZ-07（30 nmol/L）处理8小时，IRAK4水平的免疫印迹分析。最后，研究团队在PBMC细胞中对LZ-07的抗炎效果进行了研究，发现LZ-07的抗炎效果要优于KT-474（图4A-D），并且具有很好的安全性（图4E）。图4. LZ-07和KT-474在健康供体（供体ID：P122071008C）来源的外周血单核细胞（PBMCs）中的抗炎效果评估。 PBMCs先用LZ-07和KT-474预处理2小时，随后用10μL脂多糖（LPS，100 ng/mL）刺激24小时。采用ELISA法测定细胞因子（IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α）的水平。（A-D）分别显示LZ-07和KT-474对IL-10、IL-6、TNF-α和IL-1β水平的抑制作用。数据以均值±标准差（SD）表示（n=2）。最终的半数抑制浓度（IC50）由GraphPad Prism 9生成。（E）LZ-07和KT-474在两名健康供体（供体ID：P122071008C和Y1828）来源的PBMCs中的细胞毒性评估。（F）用LZ-07和KT-474处理PBMCs细胞16小时后，IRAK4水平的免疫印迹分析。通过比较LZ-07与KT-474在PBMC细胞中的降解表现，研究发现KT-474对IRAK4的降解效率显著优于LZ-07，然而在抑制多种炎症相关细胞因子分泌方面，LZ-07却表现出更强的活性。研究团队推测，这可能归因于LZ-07保留了一定的PI3Kδ抑制活性（图5），而PI3Kδ已知与炎症反应密切相关。实验结果显示，LZ-07对PI3Kδ的抑制活性为IC₅₀ = 92 nM，这解释了LZ-07更优的抗炎效果。图5. 经LZ-07处理后对PI3Kδ的激酶抑制效果，以PI103作为阳性对照。数据以均值±标准差（SD）表示（n = 2）综上，LZ-07是基于简化CRBN配体开发的IRAK4高效降解剂，相较于KT-474具有其独特优势（图6），其合成更为简便，抗炎效果更强，并且能避免传统度胺类CRBN配体带来的脱靶风险，为红斑狼疮、特应性皮炎等自身免疫疾病提供全新治疗思路。 图6. LZ-07和KT-474在IRAK4蛋白降解能力、抗炎效果以及合成难度上的对比。本文作者：LZ声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

近期，中国科学院上海药物研究所徐石林团队和暨南大学药学院张章副研究员合作，开发了一类RET PROTAC降解剂，对RET溶剂前沿突变耐药有效，细胞活性显著优于抑制剂；相关工作以“Discovery of an Efficacious RET PROTAC Degrader with Enhanced Antiproliferative Activity Against Resistant Cancer Cells Harboring RET Solvent-front Mutations”为题发表在药物化学TOP期刊Journal of Medicinal Chemistry上。  RET是一种跨膜受体酪氨酸激酶，其信号传导通过胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF）家族配体与其受体结合来介导。RET的基因融合和突变与多种癌症密切相关，例如在60%的甲状腺髓样癌、10%-20%的甲状腺乳头状癌以及1%-2%的非小细胞肺癌中均有发现。因此，RET被视为人类癌症治疗的潜在靶点。 过去几十年中，研究人员开发了多种RET小分子抑制剂。第一代多靶点激酶抑制剂（如Vandetanib和Cabozantinib）因脱靶相关的毒副作用以及守门员突变（V804M/L）引发的耐药性而在临床应用中受到限制。第二代RET抑制剂Selpercatinib和Pralsetinib，通过提高选择性并增强对V804M/L突变的抑制活性，显著提升了安全性和有效性，现已获FDA批准用于治疗非小细胞肺癌和甲状腺癌。然而，这些选择性RET抑制剂对溶剂前沿G810突变导致的耐药性仍然束手无策，推动了第三代RET抑制剂的研发。因此，作者探索了一种新的替代策略，旨在克服溶剂前沿突变引起的选择性RET抑制剂耐药问题。 作者以第二代选择性RET抑制剂Selpercatinib为基础，设计并合成了一系列RET PROTAC降解剂。通过分析Selpercatinib与RET激酶域的共晶结构（PDB ID: 7JU6），发现其吡唑并[1,5-a]吡啶母核6位的2-羟基-2-甲基丙氧基暴露于溶剂区域。结合已有的构效关系数据，作者将该基团替换为吡唑基团，并将其作为连接手柄（图1）。随后，作者对连接链进行优化，最终筛选出具有强效降解活性和抗细胞增殖活性的RET PROTAC降解剂20（QZ2135）。  图1：针对RET的PROTAC降解剂的设计 作者首先对化合物20的降解活性进行了表征，结果显示其能够在Ba/F3-KIF5B-RET细胞中高效降解RET蛋白（DC50 = 4.7 nM，Dmax = 83%）（图2）。随后，在表达RET融合蛋白的人类肺腺癌细胞系LC-2/ad中评估其降解活性，结果表明化合物20同样能够有效诱导RET蛋白降解（图3）。此外，作者还对化合物20进行了蛋白降解动力学研究、RET蛋白稳定性分析以及洗脱实验，这些结果进一步证实化合物20是一种高效且作用快速的RET PROTAC降解剂。  图2：化合物20的降解活性表征  图3：化合物20在LC-2/ad细胞中对RET蛋白水平的影响 作者进一步验证了化合物20的降解机制。通过Selpercatinib、MLN4924、MG132、Lenalidomide和阴性对照物26等竞争性实验，表明其通过泛素-蛋白酶体系统介导RET蛋白的降解（图4）。  图4：化合物20的降解作用机制 作者评估了化合物20在携带RET耐药突变的Ba/F3细胞中的降解活性（图5）。结果显示，化合物20不仅对RET V804M突变具有较高的降解活性（DC50 = 17.2 nM），还能够有效降解溶剂前沿突变RET G810C（DC50 = 73.8 nM）。  图5：化合物20在携带耐药突变的Ba/F3细胞中介导的RET降解 在细胞增殖抑制实验中（图6），化合物20在携带溶剂前沿突变的Ba/F3-KIF5B-RET-G810C/R/S细胞中表现出有效的抗增殖活性，其IC50值分别为0.05μM、0.15μM和0.09μM，相较于Selpercatinib分别提升约14倍、7倍和6.3倍。此外，化合物20在这些突变细胞系中的抑制活性也明显优于其阴性对照化合物26。这一结果表明，化合物20作为PROTAC降解剂的作用机制，可能是其抗增殖活性优于传统RET抑制剂的关键原因。  图6：化合物对携带不同RET融合蛋白和耐药突变的Ba/F3细胞的抗增殖活性 此外，在细胞水平上，化合物20相比于Selpercatinib，对携带溶剂前沿突变G810C/R的RET磷酸化表现出更强的抑制活性（图7）。此外，化合物20还能够以剂量依赖的方式诱导Ba/F3-KIF5B-RET-G810C细胞发生凋亡（图8）。  图7：化合物20在携带KIF5B-RET融合蛋白和耐药突变的Ba/F3细胞中对RET磷酸化及下游信号传导的抑制作用  图8：化合物20在Ba/F3细胞中诱导的凋亡 鉴于化合物20在体外的优异表现，作者进一步评估了其在体内的抗肿瘤疗效。利用Ba/F3-KIF5B-RET-G810C异种移植小鼠模型，作者每天对小鼠腹腔注射化合物20（10 mg/kg或30 mg/kg）。14天后，化合物20有效抑制了肿瘤生长，其中在30 mg/kg剂量下的肿瘤生长抑制率为49.2%。在整个治疗过程中，与对照组相比，小鼠未出现显著的体重变化（图9）。此外，作者进一步检测了连续三天腹腔注射化合物20后，小鼠肿瘤组织中RET蛋白的水平。结果显示，化合物20在10 mg/kg和30 mg/kg剂量下分别诱导了47.0%和55.3%的RET蛋白降解。这些结果充分证明了化合物20的体内有效性和良好的安全性。  图9：化合物 20 在 Ba/F3-KIF5B-G810C 细胞异种移植小鼠模型中的体内抗肿瘤疗效。 本研究利用PROTAC靶向蛋白降解技术，成功设计并鉴定出一种高效的RET PROTAC降解剂——化合物20，为克服由溶剂前沿突变引发的RET抑制剂耐药性提供了一种替代策略。 本论文通讯作者为中国科学院上海药物研究所徐石林研究员和暨南大学张章副研究员，共同第一作者分别为南京中医药大学硕士生张倩、暨南大学硕士生何颖祺和中国科学院上海药物研究所博士生饶丹妮。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓