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点击蓝字 ↑ 更多药化进展 药研视角 2026.10.04 Online 近日，中科院上海有机化学研究所谭立/上海交通大学仁济医院庄光磊、傅于捷团队在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"Development of Potent and Selective EGFR-PROTACs Based on Macrocyclic Fourth-Generation EGFR Inhibitors"的研究论文。该研究以大环第四代EGFR抑制剂BI-4020为靶向弹头，通过系统的E3连接酶配体筛选与连接子（Linker）构效关系优化，开发出高效、高选择性的EGFR降解剂HQY1480。HQY1480能以个位数纳摩尔级DC50选择性降解包括EGFRL858R/T790M/C797S三重突变体在内的多种临床相关EGFR突变，克服了奥希替尼耐药，并具有优异的药代性质——小鼠腹腔注射生物利用度接近理论最大值；在蛋白质组学水平上未观察到脱靶降解。体内实验中，HQY1480在低剂量（3 mg/kg）下即显著抑制异种移植瘤生长，疗效优于其母体抑制剂BI-4020和临床药物奥希替尼，并在患者来源异种移植模型中实现了有效的肿瘤EGFR降解。该研究不仅为克服EGFR突变型NSCLC对第三代TKI的获得性耐药提供了具有临床转化潜力的先导化合物，其"大环刚性弹头+构象适配Linker"的设计策略也为基于TKI的PROTAC开发提供了新的思路与机制启示。 图文摘要 01 INTRODUCTION 研究背景 非小细胞肺癌约占全球肺癌发病的80–85%，表皮生长因子受体（EGFR）是肺腺癌中的关键治疗靶点，其中19外显子缺失（del19）和21外显子L858R取代约占EGFR激酶结构域改变的85%，20外显子插入等较少见的异常也能激活下游信号驱动肿瘤发生。TKI已改变了EGFR突变型NSCLC的治疗格局，但治疗耐药几乎不可避免：目前的标准疗法奥希替尼通过不可逆共价结合EGFR的Cys797发挥作用，这一机制也使患者易于产生C797S获得性耐药突变；为此人们设计了采用非共价抑制方式的第四代EGFR-TKI以克服含C797S突变带来的耐药，尽管这些候选物在临床前研究中显示出有前景的突变选择性抑制作用，但很少有进入临床评价。与依赖化学计量占有来抑制靶点的传统TKI不同，PROTAC策略通过诱导靶蛋白与E3连接酶邻近，实现对靶蛋白的催化式降解，因而有望获得更强更持久的效力、更高的选择性，并去除靶点的全部功能（不止激酶活性）；但PROTAC也常因分子量高、构象柔性过大而面临细胞通透性和药代性质方面的挑战。近期已有若干EGFR-PROTAC被报道，包括可降解含C797S突变体的第四代TKI衍生分子，但这些PROTAC多以线性连接子和柔性骨架构建，其药代特征和体内适用性受到明显限制——虽然有些分子在初步动物实验中显示抗肿瘤活性，但所需的高剂量或静脉给药方式削弱了其相对母体TKI的实际优势；而且这些PROTAC所用的第四代TKI通常基于2,4-二取代嘧啶母核，该骨架与多激酶活性相关。因此，开发选择性更高、更适合体内应用和临床前验证的新一代EGFR-PROTAC仍是未满足的需求。在已获动物模型验证的第四代EGFR-TKI中，BI-4020以其独特的大环骨架而突出；lorlatinib等含大环TKI的临床成功支持了"大环化和刚性化可有效改善激酶抑制剂类药性"这一普遍原则，BI-4020也表现出优异的体内疗效和激酶组选择性。因此，本研究选择BI-4020作为母体TKI来开发下一代EGFR靶向PROTAC，以整合大环赋予的结构刚性、对获得性EGFR耐药突变的高效高选择性以及良好的药代性质；下文将阐述该系列PROTAC的合理设计与构效关系研究，最终优化并表征出先导化合物HQY1480——它能以个位数纳摩尔DC50选择性降解包括EGFRL858R/T790M/C797S三重突变在内的多种临床相关EGFR突变体，并在NSCLC异种移植瘤模型中优于其母体抑制剂BI-4020，支持其作为选择性、体内有效的EGFR降解剂进行后续开发。 02 RESULTS AND DISCUSSION  ①EGFR-PROTAC的合理设计 为开发能强效且选择性降解致癌EGFR突变体的PROTAC，作者选择第四代EGFR抑制剂BI-4020作为靶向弹头（warhead），依据在于：它对L858R、T790M、C797S等典型EGFR突变具有出色效力，具有最佳的激酶组选择性，且刚性大环骨架赋予其良好的类药性。对BI-4020/EGFR复合物晶体结构（PDB: 7KXZ）的分析表明，BI-4020的1-甲基哌嗪基团采取朝向溶剂的取向，可作为连接Linker的潜在位点；为便于衍生化并优化所得PROTAC的药代性质，作者对BI-4020中的哌嗪-苯连接方式进行了改造，得到用于后续Linker筛选的关键中间体1和2。其中中间体1经Mitsunobu醚化、亲核芳香取代、Pd催化偶联、分子内酰胺化关环等步骤构建出大环骨架后脱除Boc保护获得；中间体2则采用相关路线，使哌嗪基团直接连于苯环——与中间体1相比，这一改变缩短了分子总体长度并降低了Linker柔性，与其后CRBN系列PROTAC的设计思路一致。与此同时，设计中还引入了基于pomalidomide和lenalidomide的CRBN配体衍生物，并选用了第二代VHL E3连接酶配体，以丰富设计策略的多样性；VHL招募型PROTAC（化合物3–11）通过将带PEG或烷基Linker（长度不同）的VHL配体衍生物与关键中间体1经亲核取代等方式偶联获得。 ②结构优化与构效关系 在选定EGFR弹头与E3连接酶配体后，作者首先基于VHL配体进行连接子（Linker）优化：将关键中间体1经长度不同的PEG或烷基Linker与VHL配体偶联得到化合物3–9，在依赖耐药型EGFRL858R/T790M/C797S三重突变的Ba/F3LR/TM/CS细胞（悬浮培养）和由EGFRdel19驱动的PC9细胞（贴壁培养）中评价抗增殖活性。这些化合物对Ba/F3LR/TM/CS细胞的IC50为77–230 nM，但在PC9细胞中仅呈中等至较弱活性；与PEG Linker（3、4）相比，烷基Linker（5–9）使效力轻度改善，其中Linker最短、刚性最强的9对PC9细胞活性最高，而向Linker中再引入脂肪环（10–11）并未进一步提高活性。随后作者转向CRBN配体：最初采用较长、柔性的PEG型Linker得到的12–14对Ba/F3LR/TM/CS仅有中等活性、对PC9很弱，与VHL系列类似，线性柔性Linker的化合物降解能力有限且激酶抑制活性大幅下降，推测源于细胞通透性不佳（贴壁细胞模型通常不如悬浮Ba/F3系统敏感）；改用明显更短的Linker（15–16）后，对Ba/F3LR/TM/CS细胞的IC50降至个位数纳摩尔级，在PC9及另一EGFRdel19细胞系HCC827中也呈现显著活性。受ARV-110和ARV-471的Linker结构启发引入脂肪环（17–19）虽保留了对Ba/F3LR/TM/CS的活性，却显著降低了对PC9和HCC827的效力。降解实验显示，100 nM处理8小时，15–19均能在HCC827细胞中将EGFR蛋白水平降低75–91%，但在PC9细胞中降解明显较弱（17最强，降低68%）；值得注意的是，这些PROTAC的降解能力与它们在PC9、HCC827中的抗增殖效应并不相关——含哌啶基连接的22呈中等至良好的降解活性，而吡咯烷基连接的23降解效果明显较差；24的降解能力显著强于20，而含刚性酰胺Linker的25、26、28总体降解活性低于亚甲基连接的对应物21、22，提示合适的空间几何构型和一定程度的Linker柔性对EGFR靶向PROTAC高效形成三元复合物至关重要。在此基础上，作者改用哌嗪基直接连于苯环的中间体2进行偶联以缩短分子长度、降低Linker柔性：含短乙二胺型Linker的20或额外脂肪环的21仅具边际抗增殖活性，而含环状仲胺连接的22、23活性显著增强；进一步在连接处引入更刚性的酰胺键（24–28）使该系列对Ba/F3LR/TM/CS的抑制达亚纳摩尔级IC50，26–28对PC9和HCC827也呈两位数纳摩尔级抑制。最后围绕24进一步优化：将Linker在CRBN结合亚基上的连接位点从邻苯二甲酰亚胺的4位移至5位，这一细微改变使抗增殖活性显著提高（PC9中IC50为22 nM、HCC827中<1 nM），尽管靶标降解能力略有下降（29）；将29中的胺连接换成醚键使EGFR降解效力明显下降（尤其在PC9中，化合物30），将Linker中的酰基替换为烷基链则显著削弱抗增殖与降解活性（31）；引入环状仲胺构建更刚性Linker时，含吡咯烷基Linker的32抗增殖活性与29相当，而含氮杂环丁基的33活性完全丧失（提示该修饰可能干扰与EGFR的结合），且32、33均仅表现弱EGFR降解活性；另一方面，将pomalidomide替换为lenalidomide对24和29的活性得以保留（34、35），却显著增强了30和31的活性（36、37），表明5位取代的lenalidomide亚基对该系列EGFR-PROTAC更为有利。 ③先导EGFR-PROTAC HQY1480的确定 受化合物35–37有前景的活性鼓舞，并借鉴同样采用5位取代lenalidomide亚基、已进入后期临床开发的ARV-471，作者对该CRBN结合基序的EGFR-PROTAC进一步开展Linker优化：为降低疏水性和电子密度、消除不必要的氢键供体/受体，在Linker中引入末端炔基——含alkyne-C2 Linker的38抗增殖活性略有下降，但保持了与35相当的EGFR降解能力，而alkyne-C1 Linker的39则使两项活性均大幅下降；含哌啶基Linker的40和41表现出优异的抗增殖活性，其中具有更柔性亚甲基连接的41诱导的EGFR降解明显强于40，这与此前观察到的含刚性酰胺Linker的25–28表现较弱的趋势一致。最后，将41中的哌啶基替换为更小、疏水性更低的氮杂环丁基环，即得到HQY1480——它在本系列PROTAC中表现出最优活性：抗增殖方面，PC9细胞IC50为14 ± 4 nM、HCC827细胞<1 nM；EGFR降解方面，100 nM处理8小时可在PC9和HCC827细胞中分别降解86%和96%。由于用于SAR分析的降解数据是在单一浓度下获得的，作者进一步对代表性化合物进行了24小时处理的剂量依赖性降解实验，得到Ba/F3LR/TM和Ba/F3LR/TM/CS细胞中的DC50值（HQY1480分别为0.9 nM和0.7 nM），这一定量分析支持选择HQY1480进行后续表征；此外，HQY1480的抗增殖效力与临床使用的EGFR抑制剂吉非替尼、奥希替尼以及其母体抑制剂BI-4020相当或更强。分子对接与随后的分子动力学（MD）模拟预测了EGFR-HQY1480-CRBN三元复合物的优势结合模式：HQY1480与EGFR残基Met793、Thr854、Lys745之间以及其与CRBN残基His378、Trp380、His353、Asn351之间形成多个氢键，稳定了该分子与两种蛋白的结合，为观察到的降解活性提供了结构解释；结构类似的类似物41（以哌啶环替代Linker中的氮杂环丁基）采用与HQY1480高度相似的结合模式，二者柔性的亚甲基Linker提供了构象适应性，使分子能达到有利的结合构象。相比之下，Linker中以羰基代替亚甲基的40在模拟中无法像HQY1480或41那样采取利于三元复合物形成的构象（酰胺键将Linker限制为平面几何），这与实验结果一致——三者抗增殖活性相当，但40降解EGFR突变体的能力显著弱于HQY1480和41。综上，这些结果确定HQY1480为有前景的先导EGFR-PROTAC候选物。 ④HQY1480强效且选择性地抑制EGFR突变体依赖的细胞增殖和体外强效且选择性地抑制EGFR突变体 在确证HQY1480的细胞效力方面，作者首先在更多EGFR突变驱动的细胞系中将其与奥希替尼、BI-4020及无降解能力的对照化合物1480ND进行比较，包括Ba/F3LR/TM、Ba/F3LR/TM/CS、依赖EGFRL858R/T790M的H1975细胞系，以及过表达EGFRL858R/T790M/C797S的PC9变异株。四种化合物在Ba/F3LR/TM细胞中均呈相当强的抗增殖活性（个位数纳摩尔IC50）；在Ba/F3LR/TM/CS细胞中，只有奥希替尼失去活性，这与C797S突变导致其对共价EGFR抑制剂耐药的已知事实一致；在H1975细胞中，奥希替尼明显强于其他化合物，但HQY1480（IC50为62 nM）比BI-4020和1480ND强约两倍；在亲本PC9细胞中四者活性相当，而在过表达EGFRL858R/T790M/C797S的PC9变异株中仍只有奥希替尼失活。结晶紫实验进一步证实HQY1480比BI-4020和1480ND更有效地抑制NSCLC细胞生长，表明作为第四代EGFR抑制剂衍生降解剂，HQY1480能有效克服耐药的EGFR突变，并在某些EGFR突变细胞情境中可能优于其母体激酶抑制剂及非降解对照。为确证HQY1480作用于靶点并通过阻断EGFR驱动的致癌信号发挥抗增殖作用，作者对四种化合物进行剂量梯度处理，检测EGFR及其下游效应分子的磷酸化水平和EGFR总蛋白水平：在PC9和H1975细胞中，四者均在亚微摩尔浓度下抑制EGFR自磷酸化，其中HQY1480最强，1 nM即可降低p-EGFR水平，其他抑制剂至少需要10 nM才能达到相当效果；同时HQY1480在低至0.1 nM的浓度下即可驱动EGFR蛋白降解，且在更高浓度时降解减弱，呈现PROTAC典型的"钩状效应（hook effect）"；各化合物对AKT和ERK磷酸化（受体酪氨酸激酶的经典下游节点）的抑制总体与其对p-EGFR的抑制一致；据报道在NSCLC中作为EGFR下游的促转移受体酪氨酸激酶MET的磷酸化也被这些EGFR抑制剂抑制，其中HQY1480作用最强。相反，在A549细胞中HQY1480对野生型EGFR蛋白水平和p-ERK水平均无 detectable 影响，支持其活性依赖于EGFR突变体。在激酶选择性方面，作者采用包含400余种野生型激酶及疾病相关突变体的KINOMEscan（DiscoverX）激酶组分析：HQY1480在很大程度上保留了母体BI-4020的良好激酶组选择性——1 μM时优先结合多种EGFR突变体，在排名靠前的结合靶标中，400多个野生型激酶里仅11个的结合得分与EGFR突变体相当，而BI-4020有17个野生型激酶以相近得分进入前列；1480ND的选择性特征与HQY1480和BI-4020相当。与结合结果一致，HQY1480对EGFR突变体酶活性的IC50为1.0–2.7 nM，对野生型EGFR的IC50为60 nM；值得注意的是，尽管1480ND在酶学实验中的效力与HQY1480相当，BI-4020却表现出明显更强的生化活性——对EGFR突变体亚纳摩尔级IC50、对野生型EGFR为13 nM。综上，HQY1480在体外和细胞水平均能强效且选择性地抑制EGFR突变体；虽然与E3连接酶配体偶联使其体外活性相对母体化合物略有下降，但HQY1480在NSCLC细胞系中仍实现了对下游致癌信号明显更强的抑制，凸显了催化式蛋白降解相对于占位驱动型激酶抑制的药理学优势。 ⑤HQY1480通过泛素-蛋白酶体系统诱导EGFR降解 在表征了HQY1480抑制EGFR突变体激酶活性的效力与选择性之后，作者进一步评估其在NSCLC细胞中降解这些突变体的能力：在PC9（EGFRdel19）、H1975（EGFRL858R/T790M）和PC9_TM（EGFRL858R/T790M/C797S）细胞中，HQY1480处理24小时可诱导各EGFR突变体的剂量依赖性降解，最大降解幅度（Dmax）均至少达86%，DC50处于亚纳摩尔至个位数纳摩尔范围；降解动力学快速而显著——10 nM的HQY1480在6小时内即明显降低EGFR蛋白水平，并在12小时内几乎消除可检测到的EGFR；值得注意的是，在三种细胞系中均观察到高浓度下出现钩状效应。为阐明其作用机制，作者将HQY1480分别与泛素化通路抑制剂（MLN4924或MLN7243）、CRBN结合竞争剂（lenalidomide）或蛋白酶体抑制剂（PS341）联合处理，结果显示每种联合处理均在受试细胞系中显著挽救了HQY1480诱导的EGFR突变体降解；结合非降解对照1480ND的结果，证实HQY1480通过依赖CRBN和泛素-蛋白酶体系统的机制诱导EGFR降解。鉴于激酶组分析提示HQY1480可能结合其他激酶，作者进一步评估其是否会在NSCLC细胞中诱导非EGFR激酶的降解：质谱蛋白质组学分析显示，50 nM HQY1480处理PC9细胞24小时可显著降低若干蛋白的丰度，其中EGFR是下降最显著的蛋白；更重要的是，将HQY1480与非降解对照1480ND直接比较时，EGFR是唯一被显著降解的靶标，凸显了HQY1480卓越的降解选择性。总体而言，HQY1480在保留BI-4020不作用于野生型EGFR的能力并表现出相当激酶组选择性的同时，其仅诱导EGFR突变体降解的特性可能在细胞情境中带来比BI-4020更高的选择性。此外，作者对经BI-4020、HQY1480或1480ND处理的PC9细胞进行了RNA测序分析：主成分分析和热图可视化显示各处理组清晰分离，支持不同处理引起不同的转录变化；值得注意的是，HQY1480引起的转录组重塑范围比BI-4020或1480ND更广——韦恩图显示1659个差异表达基因为三种化合物共同调控，而HQY1480还独特地额外改变了1591个基因，表明EGFR降解比单纯抑制EGFR激酶引起更广泛的转录响应；功能富集分析也显示HQY1480的影响最强（尤其对下调通路，并经基因集富集分析证实）。这些结果共同提示，HQY1480造成更严重的转录扰动，其特征是对DNA复制和细胞周期相关基因程序的强烈抑制。 ⑥HQY1480药代动力学与体内抗肿瘤 为评估先导EGFR-PROTAC的体内适用性，作者在小鼠中考察了化合物22、24和HQY1480的药代性质：总体上，24和HQY1480经腹腔（i.p.）给药后的生物利用度高于口服（p.o.）给药，而22在10 mg/kg单次口服后很快在血浆中检测不到；虽然HQY1480经静脉（i.v.）注射后的半衰期和系统暴露与24相近，但i.p.给药（10 mg/kg）时其药代性质较24显著改善——AUC达10,908 h·μg/L、半衰期3.7小时、生物利用度经剂量折算后接近理论最大值；口服给药（10 mg/kg）时HQY1480同样优于24，Cmax（228 μg/L）约为其两倍、AUC0–t（977 h·μg/L）约高1.6倍，尽管其口服生物利用度仍不高（10.7%），提示可能存在胃肠道吸收受限或较大的首过/系统前损失，这很可能归因于其高分子量、较高的分配系数（clogP = 4.40）以及固有的理化复杂性。这些结果表明，柔性更低、疏水性更弱、氢键供体更少的Linker显著提高了该系列PROTAC的生物利用度，并确证HQY1480是适合进一步体内研究的优化先导化合物。在体内疗效方面，作者在HCC827和PC9_TM（携带EGFRL858R/T790M/C797S）两种异种移植瘤模型中进行了评价：HCC827模型中，溶媒、1480ND、BI-4020或HQY1480均以3 mg/kg每日一次腹腔注射给药20天；PC9_TM模型中则以同样剂量给药27天（对照组换为奥希替尼）。HQY1480在两种模型中均显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为105.3%（HCC827）和81.7%（PC9_TM），且未见明显体重下降或其他不良反应，心、肝、脾、肺、肾等主要器官的H&E染色也未显示明显的组织病理学异常。值得注意的是，在HCC827模型中HQY1480略优于BI-4020（TGI = 77.5%），而无降解能力的对照1480ND未产生显著抗肿瘤作用——最可能的原因是其在低剂量下于实体瘤内不利的外排和暴露不足，导致对活化EGFR激酶口袋的占据不充分且不持久；HQY1480预计会存在同样的药代劣势，但其在极低浓度下催化降解EGFR突变体的能力可在同样低的剂量下实现对癌细胞更彻底、更持久的抑制。在PC9_TM模型中，HQY1480同样优于BI-4020（TGI = 45.4%），而对EGFR C797S突变预计无效的奥希替尼仅表现出极小的肿瘤生长抑制作用；与抗肿瘤活性一致，对移植瘤组织的免疫组化分析显示，HQY1480在两种模型中均显著降低Ki67、EGFR、P-AKT和P-ERK染色，同时增加cleaved caspase-3染色，支持其在体内实现EGFR降解、抑制下游信号并增强细胞凋亡。此外，作者在来源于携带EGFRL858R突变的NSCLC患者样本的PDX模型中评价了HQY1480（3 mg/kg每日一次腹腔注射20天）：HQY1480能有效降解肿瘤组织中的EGFR，但未观察到显著的抗肿瘤作用，提示这些PDX模型的肿瘤生长可能依赖EGFR突变以外的驱动因素，这种靶标降解与肿瘤响应之间的脱节有待进一步研究。总体而言，HQY1480是一种有效且耐受良好的EGFR突变体降解剂，能够在体内抑制EGFR驱动的肿瘤生长。 总结与展望 刚性大环抑制剂BI-4020可作为开发下一代EGFR靶向PROTAC的强效且高选择性的配体。虽然本研究同时探索了基于VHL和CRBN的两种E3连接酶招募策略，但CRBN-based设计在这一系列中更为有效。通过以连接子（Linker）优化为重点的系统构效关系研究——优化对象不仅包括两个配体之间的连接部位，还包括配体自身固有结构元素的修饰——作者最终获得了兼具高效EGFR降解能力和强抗增殖活性的PROTAC。总体上，更短的长度和更高的刚性改善了抗增殖活性；然而，要维持有效降解，则需要与二肽相当的长度和一个柔性的亚甲基单元。分子动力学模拟进一步支持：完全刚性的Linker会使PROTAC采取不利于三元复合物形成的构象。作为优化得到的先导化合物，HQY1480能强效降解多种临床相关EGFR突变体，包括导致奥希替尼及其他现有共价EGFR-TKI耐药的EGFRL858R/T790M/C797S三重突变体。HQY1480的降解活性如预期依赖泛素-蛋白酶体系统，而蛋白质组学分析有些出人意料地未显示明显的脱靶蛋白降解，表明其在细胞情境中的选择性甚至高于BI-4020。在两种不同的NSCLC异种移植瘤模型中，HQY1480表现出优于BI-4020和奥希替尼的疗效，有效克服了EGFRL858R/T790M/C797S三重突变，并在低剂量下抑制肿瘤生长，进一步凸显了其在低药物浓度下于实体瘤中催化靶标降解的能力。另一方面，HQY1480处理在两个PDX模型中均能持续有效地降低突变型EGFR水平。总之，该研究发现了一种强效且高选择性的EGFR-PROTAC，它既是宝贵的化学工具，也是克服NSCLC中EGFR突变耐药的、有前景的临床前先导化合物，同时为基于TKI的PROTAC开发提供了替代性设计原则和机制层面的启示。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01760  声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 一种转录因子，既能促进炎症相关基因表达，又能防止组织发生严重炎症——这听起来似乎有些矛盾。 干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2，IRF2）就是这样一个令人困惑的分子。过去的研究发现，IRF2能够促进Gasdermin D（GSDMD）等先天免疫相关基因表达，但IRF2缺失却会导致明显的皮肤炎症。那么，IRF2究竟是在“促炎”，还是在“抗炎”？ 近日，《Cell》的研究报道“Switching of transcriptional control from interferon regulatory factor 2 to interferon regulatory factor 1 drives innate immune cell activation”，给出了一个更有意思的答案。研究人员发现，问题的关键并不在于IRF2简单地“打开”或“关闭”炎症，而在于细胞如何在IRF2和另一个转录因子IRF1之间切换转录控制权。 这个切换过程，把DNA结合、蛋白降解、先天免疫感知和干扰素信号串成了一条完整的调控链。 一个反常识现象：少了IRF2，炎症反而更强了 理解这项研究，首先要认识一类重要的免疫基因——干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）。 当细胞遭遇病毒或细菌时，模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）会感知病原体相关信号。经典模型中，细胞随后产生I型干扰素（type I interferons），例如IFN-β；IFN-β与干扰素受体（interferon-α/β receptor，IFNAR）结合，启动JAK-STAT信号通路（JAK-STAT signaling），形成包含STAT1、STAT2和IRF9的ISGF3复合物，进一步诱导大量ISGs表达。 这些基因对于抗感染非常重要，但持续、过量表达同样可能造成组织损伤。 IRF2长期以来被认为具有抑制炎症的功能。研究中的Irf2缺失小鼠在大约8周龄开始出现脱毛，到了12～20周龄发展为严重皮炎。 研究人员进一步对皮肤进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）。结果发现，ISG异常升高并不是局限在一种细胞中，而是广泛存在于多个细胞群。其中，巨噬细胞的变化尤其明显：Irf2缺失皮肤中的巨噬细胞约富集了10倍，同时表现出最强的ISG表达特征。 有趣的是，这些细胞并没有表现出与之匹配的IFN-β或IFN-α明显升高。 也就是说，细胞似乎在没有大量增加干扰素的情况下，就已经启动了一套很强的“干扰素样”基因表达程序。 问题随之出现：是谁绕过了经典干扰素通路，把这些ISG打开了？ 答案指向IRF1。删除IRF1后，296个异常升高的ISG几乎被“拉回原位” 研究人员进一步构建了同时缺失Irf1和Irf2的小鼠。 结果非常直接。 在Irf2缺失皮肤中升高的296个ISG，在进一步删除Irf1后，其异常表达全部得到恢复。与此同时，Irf1和Irf2双缺失小鼠没有出现Irf2单独缺失小鼠所表现出的典型皮肤病变。 IRF2缺失本身并不是炎症基因表达的直接发动机；失去IRF2之后，被释放出来的IRF1才是关键驱动力。 这个结果改变了理解IRF2功能的角度。 IRF2或许并不是一个经典意义上的“转录抑制因子”。它可能本身也在促进转录，只不过它的转录激活能力比IRF1弱。 于是，一个看似矛盾的现象就变得容易理解了。 正常情况下，IRF2占据某些DNA调控区域，维持一个相对温和的转录状态；IRF2一旦消失，活性更强的IRF1接管这些位点，ISG表达随之被放大。 这并不是简单的“开”和“关”，而是弱激活状态向强激活状态的转换。725个IRF1结合位点中，93%已经被IRF2占据 这一假设得到了染色质层面的支持。 研究人员在未刺激的骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）中进行了染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）。 结果检测到：IRF1结合位点725IRF2结合位点3082 更关键的是，在725个IRF1结合位点中，有676个同时存在IRF2结合，占93%。重新计算一下，676÷725约为93.2%，与论文报告一致。 这676个位点中，496个位于增强子区域，180个位于启动子区域，其中包括Gbp2、Ifit1和Zbp1等典型ISG相关位点。 当IRF2缺失后，这些区域出现了一系列一致变化。 代表活跃启动子和增强子的组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27 acetylation，H3K27ac）增加；转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin sequencing，ATAC-seq）显示染色质开放程度增加；与此同时，IRF1结合也增强。 值得注意的是，IRF2结合并没有伴随典型抑制性染色质标记H3K27me3或H3K9me3富集。这进一步说明： IRF2并不像传统转录抑制因子那样，通过建立“关闭”的染色质环境压制ISG。 更合理的解释是，IRF2本身是一个转录激活因子，只是它在这些位点上的激活能力弱于IRF1。因此，IRF2占据这些区域时，客观上限制了IRF1产生更强的转录输出。 但这里还有一个容易被过度简化的地方。 IRF1和IRF2并不一定只是在DNA上“抢位置”。研究人员进行DNA结合实验时，观察到了IRF1-IRF2-DNA复合物，提示两者在某些条件下可能存在一定协同性。 因此，这个系统比简单的竞争模型更加复杂。细菌信号一来，细胞同时做两件事：增加IRF1，减少IRF2 如果IRF2在静息状态下限制IRF1，那么免疫反应启动时，细胞怎样完成控制权切换？ 研究人员用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬细胞。LPS通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）激活先天免疫。 刺激后出现了一个非常清晰的变化： IRF1的mRNA和蛋白增加，而IRF2蛋白逐渐减少。 但Irf2的mRNA并没有明显下降。 这意味着IRF2减少不是因为细胞“不再生产它”，而更可能是因为已有的IRF2蛋白被主动清除。 研究人员随后加入蛋白酶体抑制剂MG-132，IRF2的下降被阻止；使用MLN4924抑制Cullin家族E3泛素连接酶后，IRF2同样得以保留。 由此，IRF2蛋白减少被定位到泛素-蛋白酶体降解系统（ubiquitin-proteasome system）。 而且这并非LPS特有。 TLR3激动剂poly(I:C)、TLR1/2激动剂Pam3CSK4、TLR7激动剂Imiquimod以及IFN-γ，都能够诱导IRF2下降。 换句话说，多个先天免疫刺激最终都可以推动一个共同方向： IRF1增加，IRF2减少。更重要的是：这条通路可以先于干扰素启动 这项研究中一个很值得关注的发现，是IRF1介导的ISG激活并不完全依赖经典的IFN-JAK-STAT通路。 研究人员使用JAK抑制剂ruxolitinib和baricitinib阻断信号。 药物能够有效阻断STAT1磷酸化，但并没有阻止LPS诱导IRF1，也没有阻止IRF2降解。 更有意思的是，ruxolitinib虽然明显降低了ISG表达，却没有把ISG表达完全消除；只有在阻断JAK信号的同时缺失IRF1，ISG诱导才进一步受到强烈抑制。 因此，研究提出了一个“两阶段”模型。第一阶段： TLR首先直接诱导IRF1并推动IRF2降解，从而快速启动第一波ISG表达；第二阶段：随后细胞产生并释放IFN-α/β，激活IFNAR-JAK-STAT-IRF9通路，形成第二波放大反应。 这意味着我们熟悉的“先产生干扰素，再启动ISG”并不是唯一顺序。 在某些先天免疫场景中，ISG程序可以在完整的干扰素旁分泌环路建立之前就开始启动。谁负责清除IRF2？答案是SPOP，但过程比想象中更巧妙 接下来是整项研究最重要的机制之一。 既然IRF2需要经过Cullin E3泛素连接酶系统降解，具体是谁在识别它？ 研究人员首先发现，删除Cullin-3（CUL3）可以阻止LPS诱导的IRF2下降。 CUL3需要底物适配蛋白帮助识别降解目标。研究人员进一步筛选了巨噬细胞中表达较高的18种CUL3底物适配蛋白，结果只有删除SPOP（speckle-type POZ protein）能够明显阻止IRF2降解。 但一个意外情况出现了： SPOP能够与IRF1发生共免疫沉淀，而研究人员没有检测到SPOP与IRF2稳定结合。 也就是说，SPOP似乎并不是简单地找到IRF2，然后直接把它送入蛋白酶体。 研究进一步显示，当Irf1缺失时，即使细胞仍表达SPOP，LPS刺激之后IRF2也不会正常下降。 反过来，在Irf1缺失细胞中重新导入Irf1 mRNA，1小时后IRF1大量表达，2小时后IRF2开始明显减少。而在缺失SPOP的细胞中，即使重新表达IRF1，也不能有效诱导IRF2下降。 IRF1不仅是转录激活因子，还是把SPOP带到IRF2所在染色质区域的重要媒介。 IRF1增加之后，它与SPOP形成联系，并把SPOP带到IRF2所在的基因调控区域，随后通过CUL3-SPOP相关的泛素-蛋白酶体系统促进IRF2清除。 于是，IRF1实际上同时完成了两件事： 一方面加强自己的转录作用，另一方面推动原有IRF2控制状态退出。IFN-β带来了另一个转折：IRF2不是只会“消失”，还会重新分布 故事到这里还没有结束。 当细胞受到IFN-β刺激时，IRF1同样会上升，但研究人员最初并没有看到IRF2蛋白明显减少。 原因并不是IRF2没有被降解。 实验显示，IFN-β仍会促进IRF2经蛋白酶体降解，只不过与此同时，IRF9又促进了Irf2基因转录，使新合成的IRF2补充进来，从整体蛋白水平上“掩盖”了降解过程。 染色质分析进一步发现，IFN-β刺激之后，IRF2在基因组中的位置也发生了重新分配。IRF2结合减少位点443IRF2结合增加位点1429 有443个位点的IRF2结合减少，同时1429个位点的结合增加。 结合减少的区域通常只有2～3个IRF基序重复，并较多分布于先天免疫基因启动子；而结合增加区域平均含有约11个IRF基序重复，部分位点甚至达到60～80个重复。 因此，在IFN-β条件下，细胞并不只是通过“降解IRF2”完成转换，还可能把IRF2从部分ISG启动子重新分配到其他远端基因组区域。 这使IRF1和IRF9更容易在关键ISG调控区域发挥作用。SPOP缺失揭示了另一件事：IRF2并不是越多越“抗炎” 如果SPOP负责帮助控制IRF2，那么没有SPOP会发生什么？ 答案并不是简单的“IRF2增加，因此ISG下降”。 LPS刺激后，SPOP缺失巨噬细胞中有242个基因组区域的IRF2结合发生改变，其中224个、也就是约92%，表现为IRF2结合增加。 转录组分析则发现124个差异表达基因，其中105个上调、19个下调。 研究人员通过CUT&RUN检测到了4422个SPOP基因组结合位点；LPS刺激后，其中316个位点的SPOP占据增加。这些增加位点中，有207个、约66%同时出现IRF2信号。 功能上，SPOP缺失巨噬细胞受到细菌成分刺激后，会释放更多CCL2、CCL7、CXCL1和IL-22，但IL-6和TNF并没有相应增加。 这说明SPOP并不是一个简单的“总炎症开关”。 它更像是在特定染色质区域控制IRF1和IRF2蛋白稳定性，从而避免某些细胞因子（cytokines）和趋化因子（chemokines）出现异常表达。 这里也进一步解释了IRF2最初的悖论：IRF2既可以参与促进GSDMD、Tlr3以及部分细胞因子基因表达，又可以通过限制IRF1的强烈转录活动，防止另一批ISG过度表达。 一个转录因子究竟表现为“促炎”还是“抗炎”，取决于它在哪里、与谁共同存在，以及当时细胞处于什么信号环境。这项研究值得关注的，不是又找到了一条信号通路 如果只把这项研究概括成“IRF1-SPOP促进IRF2降解”，其实会错过它更值得思考的部分。 传统上，我们很容易把转录因子分类成“激活因子”和“抑制因子”。 但这项研究展示了另一种调控逻辑： 两个都具有转录激活能力的因子，也可以因为激活强度不同而形成抑制效果。 IRF2不必主动把染色质关闭，只要它长期占据某些调控区域，并产生比IRF1弱的转录输出，就能够把整个系统维持在较低水平。 当TLR信号到来后，细胞同时提高IRF1水平并降低IRF2稳定性，使调控系统迅速转换到高输出状态。 从这个角度看，免疫反应的调节并不仅取决于“某个因子有没有”，还取决于谁正在占据调控区域、不同转录因子的相对丰度、蛋白稳定性以及它们出现的时间顺序。 这也是为什么时间维度在免疫信号研究中如此重要。 同一个基因组位点，在静息状态、TLR刺激早期和IFN信号建立之后，可能处于完全不同的转录因子组合之下。仍有一个关键问题没有答案：为什么IRF1比IRF2更强？ 这项研究建立了一个相当完整的机制框架，但并没有回答所有问题。 研究人员明确指出，目前虽然有充分证据表明IRF1在这些ISG调控区域上的转录激活能力强于IRF2，却缺少生化证据解释这种差异究竟来自哪里。一种可能性是IRF1和IRF2招募了不同的共激活因子（co-activators），但目前仍属于假设。 此外，人源实验主要集中在原代单核细胞来源巨噬细胞。IRF1-IRF2调控回路在其他人类细胞，尤其是非髓系细胞中的作用，目前仍不清楚。 研究也没有直接证明，在SPOP缺失动物中，IRF1和IRF2稳定性的变化究竟在多大程度上决定整体炎症表型。 所以，这项工作更适合被理解为： 它建立了一套具有较强实验支持的转录控制模型，而不是为所有IRF1、IRF2相关炎症现象提供了统一答案。 不过，它已经提出了一个值得继续关注的问题： 当我们观察一个免疫基因“表达升高”时，我们是否应该只寻找哪个信号通路被激活？ 还是应该进一步问—— 在这个基因的调控区域上，究竟是谁被换掉了？ 有时，决定免疫反应强弱的，不是有没有按下一个新的开关，而是转录控制权在什么时候，从谁的手里转移到了谁的手里。 参考文献 https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(26)01022-6 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ 往期热文： Cell | 不是简单“老化”：一种韧带干细胞的异常激活，可能推动腰椎管狭窄发生 Nature | 脂肪肝终于有药可治了？MASH治疗新格局：从司美格鲁肽到基因靶向，下一步是“分型用药” ？ Science | 线粒体不是坏了，而是“到不了”：研究发现化疗神经毒性的新干预靶点 Science | 抗氧化剂为什么可能帮了肿瘤？ 新研究揭示一种被忽视的免疫逃逸机制 Cell | 蛋白降解也能被“记录”：新研究开发可放大、可记忆、可多重读取的RTA系统 Nature Genetics | 缺氧、免疫抑制、EMT如何一步步接力？新研究重建肺腺癌转移全过程 Nature | 把mRNA写进核糖体：一种“自带编码信息”的翻译系统诞生了 Nature | RNA递送迎来新路线：AI设计的STV-C8，体外转染效率超过LNP千倍 Nature Methods | 不只看位置，还能看方向：SPIFFI实现单帧超分辨与六维信息成像 Nature | 基因没有融合，RNA却先“融合”了：研究揭示跨染色体转录本的新机制