Amiloride Hydrochloride

ChenFJMU内容团队编辑（原创） 思语湖畔Quote I don’t stop when I’m tired. I stop when I’m done. — DavidGoggins 非炎性细胞凋亡通过激活caspase-3裂解GSDME转化为炎性焦亡，这一过程可以作为一种有效的治疗策略。因此，一种选择性强效的活化caspase-3诱导剂在基于热解法的癌症治疗中起着至关重要的作用。该课题组将叠氮修饰的THP-1（人白血病细胞）巨噬细胞膜（TCM）与可瞬时表达水疱性口炎病毒g蛋白（VSVG）的pMD2.G质粒修饰的HEK293T（人胚胎肾细胞）细胞膜（VCM）共挤压制备多功能囊泡（HnV）。将二苯并环辛基（DBCO）修饰的四氨基苯卟啉（DBCO- TAPP）通过点击化学反应嵌入多功能囊泡HnV中，成功制备了用于PDT的人细胞膜囊泡纳米平台（HCNP）设计了一种基于人细胞膜囊泡的纳米平台（HCNP），用于光动力治疗（PDT）。结果表明，HCNP在激光照射下通过产生活性氧（ROS）有效地破坏细胞的线粒体功能；同时，GSDME被活化的caspase-3切割，促进肺癌细胞的焦亡。该研究提出了一种基于光激活PDT诱导焦亡的有效干预策略。 相关研究成果“Bioinspired Nano-Photosensitizer-Activated Caspase-3/GSDME Pathway Induces Pyroptosis in Lung Cancer Cells”发表在期刊Advanced Healthcare Materials。 Results 一、HCNP的制备与表征 N-叠氮基乙酰基氨基半乳糖（Ac4GalNAz）是一种广泛应用于叠氮化物修饰的糖，可作为生物正交化学的化学探针，一旦进入细胞，就被代谢成N-叠氮酰基半乳糖胺（GalNAz），然后整合成糖蛋白和其他生物分子。在本研究中，将THP-1细胞用Ac4GalNAz处理48 h，制备叠氮化物修饰的细胞膜，用于后续的生物正交反应。Ac4GalNAz对的浓度对THP-1细胞具有影响，高浓度下具有毒性，低浓度对THP-1细胞的毒性较小（图a）。流式细胞术检测巨噬细胞膜上叠氮基团的成功表达。如图b所示，叠氮化物与DBCO-Cy5.5发生点击反应后，THP-1细胞表面发出红色荧光，表明叠氮化物成功修饰到THP-1细胞膜上。G质粒免疫荧光染色显示，VSVG蛋白在HEK293T细胞膜上清晰表达（图c）。 为了将TCM与VCM结合形成多功能囊泡，将TCM和VCM的混合膜经过一系列挤压融合形成人细胞膜锚定纳米囊泡（HnV）。如图d所示，HCNP、DBCO-TAPP和游离TAPP的光谱相似，说明TAPP成功接枝到HnV上。同时，为了提供细胞膜囊泡载体功能依赖于亲本细胞的充分证据，通过蛋白凝胶电泳进一步证实HCNP是否成功保留了亲本细胞的功能蛋白；如图e所示，TCM和VCM的总蛋白谱在HnV和HCNP的全蛋白谱上得到了很好的保存，说明制备的HCNP成功地保存了两种亲本细胞膜蛋白。Western blotting还分析了细胞膜特异性蛋白整合素𝛽1、整合素𝛼4和VSVG，这些蛋白在HCNP中保留得很好（图f）。TEM观察HCNP的形貌，结构为球形（图g）。DLS和NTA分别测定了HCNP的粒径和浓度分布。结果表明，HCNP的平均直径约为200 nm（图h，i）。此外，多分散性指数表明HCNP具有良好的尺寸均匀性（图h）。 二、细胞膜锚定光敏剂的实验研究 为了探索细胞摄取机制，进一步研究HCNP在H1299细胞（人非小细胞肺癌细胞）细胞膜上的锚定作用。用相应的抑制剂对细胞进行预处理，以延缓特定的摄取机制。在没有抑制剂的情况下，细胞摄取被用作对照。阿米洛利是一种已知的巨噬细胞抑制剂，通过抑制Na/H交换而起作用，导致细胞内酸化为了研究巨噬细胞在细胞摄取中的作用，用Amiloride预处理细胞。结果表明，HCNP的吸收不受影响。Dynasore是一种GTPase动力蛋白抑制剂，可用于抑制动力依赖途径结果表明，Dynasore对H1299细胞中HCNP的摄取无明显抑制作用。氯丙嗪是一种阳离子两亲性分子，通过阻断网格蛋白的分解和受体的再循环来抑制网格蛋白介导的内吞作用与Amiloride和Dynasore处理的结果相似，HCNP的吸收没有受到影响。综上所述，共聚焦激光扫描显微镜结果显示，当内吞噬途径被阻断时，用3,3'-二十八环氧碳青高氯酸盐（DiO）标记的HCNP处理的细胞仍然有大量的绿色荧光，其荧光定量分析结果一致（图a，b）。此外，我们利用CellMask Deep Red荧光标记HCNP，并用流式细胞术进行定量分析，分析H1299细胞通过不同的内吞途径摄取HCNP，如图c、d所示。这些结果进一步证实了HCNP通过膜融合进入细胞。这表明可能涉及HCNP的其他摄取机制，例如通过VSVG与H1299细胞膜直接融合，这类似于包膜病毒进入细胞。 值得注意的是，一些包膜病毒主要通过膜融合进入细胞随后，CLSM进一步证实了HCNP的膜融合途径。用DiO（绿色）探针对HCNP进行染色，用Cellmask（红色）对H1299细胞膜进行染色。CLSM进一步证实了HCNP的膜锚定能力。如图e所示，非HCNP的绿色荧光明显定位于细胞质而不是质膜，表明其膜靶向能力较差。而在HCNP处理的H1299细胞中，大部分绿色荧光与细胞膜跟踪器的红色荧光共定位良好，说明VSVG锚定在H1299细胞的质膜上具有重要意义。荧光强度光谱分析也显示出突出的荧光共定位，这可归因于VSVG增强的质膜融合行为。总而言之，它可以结论：HCNP可能是有效的膜靶向给药。 三、体外分析显示肺癌细胞死亡增加 基于细胞膜锚定光敏剂可用于高效光动力治疗实验的事实，我们研究了HCNP诱导肺癌细胞的活力。首先，采用Annexin V-FITC/PI双染色法联合流式细胞术分析H1299细胞的存活率，结果表明，单独激光照射和HCNP不光照处理的细胞存活率均未明显下降。而激光照射下的HCNP显著降低了细胞活力（图a）。此外，根据试剂说明书，进行细胞活力/细胞毒性试验，检测不同处理后H1299细胞的细胞活力。绿色表示活细胞，红色表示死细胞。结果显示，“HCNP + L”处理的H1299细胞中，红色荧光细胞显著增加，绿色荧光细胞最少，这与流式细胞术结果一致（图b）。此外，3-（4,5 -二甲基噻唑-2-基）- 2,5 -二苯基溴化四唑（MTT）实验在PDT下测定细胞活力方面也显示出类似的趋势（图c）。细胞死亡率随激光照射时间和光敏剂剂量的增加而增加。值得注意的是，单独长时间的激光照射和HCNP暗细胞毒性可以忽略不计（图d，e）。 四、线粒体功能障碍 在激光照射下，光敏剂TAPP产生单线态氧（1O2），直接氧化并损伤肿瘤细胞。在体外，我们对PDT过程中H1299细胞产生的特异性ROS进行了表征，以阐明其诱导抗肿瘤活性的可能机制。首先，借助ROS指示剂（DCFH-DA）研究细胞内ROS的生成，其中无荧光的DCFH-DA可以通过与ROS反应转化为发出绿色荧光的DCF。HCNP处理的细胞ROS水平在黑暗中可以忽略不计，但在660 nm照射下（照射功率和时间分别为1.4 W/cm2,5 min）；绿色荧光在细胞内均匀可见（图a）。JC-1线粒体膜电位检测试剂盒进一步评价了不同处理后H1299细胞的线粒体功能，JC-1通常在正常线粒体膜上形成聚集体（J聚集体）时显示为红色荧光，在功能受损的线粒体膜上形成单体（J单体）时显示为绿色荧光。结果显示，HCNP处理后的细胞呈现出与“Control”组和“Control + L”组相似的红色荧光，与之形成鲜明对比的是，“HCNP + L”的细胞红色荧光明显减弱，绿色荧光明显增强（图b），说明“HCNP + L”由于膜靶向性的细胞内ROS生成而导致线粒体损伤。同时，通过流式细胞术定量分析线粒体损伤，从图c的流式细胞术数据可以看出，“HCNP + L”处理组细胞群中红色荧光向绿色荧光偏移最明显，说明线粒体损伤最严重。综上所述，膜锚定PDT通过线粒体途径发挥抗肿瘤作用。 五、HCNP通过GSDME诱导焦亡 本实验中值得注意的是，“HCNP + L”处理H1299细胞时，死细胞的质膜被吹出大气泡，整个细胞肿胀，细胞核完整，这是焦亡细胞的形态学特征，而HCNP处理组的细胞形态在没有照射的情况下没有变化（图a）。同时，通过乳酸脱氢酶（LDH）的释放来评估细胞膜完整性的损失。如图b所示，“HCNP+ L”处理的细胞LDH含量最高。虽然在膜靶向PDT下可以看到肿瘤细胞焦亡，但具体机制还需要在遗传水平上进一步研究，并结合上述膜靶向PDT通过线粒体途径杀伤肿瘤的结果。此外，焦亡是一种由GSDM蛋白家族介导的炎性细胞死亡，其中GSDME属于焦亡的执行蛋白，介导的焦亡与线粒体途径密切相关。为了确定这种焦亡机制，采用western blotting检测不同处理的H1299细胞中GSDME和caspase-3的表达水平。图c-e的结果显示，与未处理的细胞相比，在黑暗条件下培养的细胞中，GSDME和cleaved caspase-3的表达没有显著变化（对照）。然而，在光照下，HCNP处理的细胞中N-GSDME和cleaved caspase-3的蛋白表达显著增加，表明膜靶向PDT有效激活了caspase-3并裂解了GSDME。综上所述，膜锚定PDT可以通过焦亡途径诱导细胞死亡。 六、体内抗肿瘤作用 将H1299荷瘤小鼠随机分为4组：PBS组、PBS + L组、HCNP组、HCNP + L组。如图b所示，“HCNP +L”组肿瘤抑制明显，肿瘤完全消退。与PBS组相比，HCNP和“PBS + L”单独对肿瘤生长无影响。这些结果与肿瘤形态学图像（图c）、肿瘤生长曲线（图d）和小鼠在治疗过程中的形态学图像（图e）一致，说明HCNP在光照下具有良好的抗肿瘤能力。并对HCNP的安全性进行了评价。如图a所示，在给药13天内，HCNP处理组小鼠的体重没有明显下降。此外，对肿瘤组织进行H&E、Ki67和TUNEL染色分析。如图f所示，H&E染色证实“HCNP + L”治疗后肿瘤广泛坏死。Ki67染色显示“HCNP + L”组中Ki67阳性的肿瘤组织最少。此外，TUNEL分析显示，与其他组相比，“HCNP + L”处理显著诱导肿瘤组织凋亡，以绿色荧光表示。综上所述，体内实验结果表明，激光照射下HCNP不仅具有良好的生物相容性，而且具有良好的抗肺癌生长作用。 Conclusions 制备了一种细胞膜锚定光敏剂，在激光照射下在肺癌细胞中产生大量ROS，导致线粒体损伤，进一步激活caspase-3将GSDME裂解为N-GSDME，最终实现肺癌细胞的焦亡。这与以往报道的其他凋亡通路介导的抗肿瘤作用有明显不同，为癌症治疗提供了新的见解，也为抗肺癌药物的开发提供了新的理论基础。焦亡是一种新兴的PCD，它可以重塑肿瘤微环境，激发抗肿瘤免疫，从而成为肺癌的有效治疗方法，提高细胞凋亡逃逸肿瘤的满意治疗效果。生物激发纳米光敏剂可诱导肺癌细胞焦亡，证明焦亡途径也可能在光动力消融癌细胞中发挥重要作用，具有较好的临床应用潜力。在未来，我们还将更全面地探索这种焦亡模式联合免疫治疗抑制肿瘤恶性进展的机制和作用。 拓展：细胞凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡（ChenFJMU） t 细胞凋亡，是第一种被发现的调节性细胞死亡形式，由细胞内 caspase-3 和 caspase-7 进行，它们裂解不同的细胞内底物，导致细胞收缩、染色质碎裂、膜起泡并分解成称为凋亡小体的膜包裹囊泡。 坏死性凋亡，是一种受 RIPK3 介导的蛋白磷酸化控制的受调节坏死性细胞死亡形式。 焦亡，是一种细胞膜 Gasdermin 家族蛋白形成孔道，导致细胞内容物释放和细胞破裂的细胞死亡方式。炎性小体和 GasderminD (GSDMD) 在焦亡中起着关键作用。炎性小体是一种由多种细胞因子和炎症相关受体组成的蛋白质复合物，它可以被病原体相关分子模式 (PAMPs) 或损伤相关分子模式 (DAMPs) 激活，进而募集 caspase-1，引发细胞焦亡。GSDMD是焦亡的关键执行蛋白。GSDMD 被 caspase-1 裂解后，可以形成孔道，导致细胞内容物释放和细胞破裂。GSDMD 孔道可以导致细胞内离子梯度崩溃，水分涌入细胞，最终导致细胞肿胀和破裂。GSDMD 孔道还可以释放大量的促炎 DAMPs，例如 IL-1β 和 IL-18，引发炎症反应。 铁死亡，是一种由铁依赖性脂质过氧化引发的细胞死亡方式。与焦亡和细胞凋亡不同，铁死亡不涉及 caspase 的激活，而是通过脂质过氧化直接损伤细胞膜，导致细胞死亡。 编辑：虞娇娇 排版：周纯情 补充和审核：陈昌买 推送：ChenFJMU 原文链接： https://doi.org/10.1002/adhm.202401616 （欢迎个人转发分享，企业及其他公众号需授权后转载，并注明出处！）

摘要：近年来，溶瘤病毒作为治疗各种癌症的有前途的代理而出现。溶瘤病毒是一种非致病性病毒，由于基因操作，它倾向于在癌细胞中复制并导致癌细胞溶解，同时不影响健康细胞。在这些病毒中，痘苗病毒因其190 Kb的基因组具有高编码治疗有效载荷的能力，因此作为溶瘤平台具有吸引力。将溶瘤痘苗病毒（VV）疗法与其他常规癌症治疗结合使用已被证明具有协同作用，并且比单一疗法更有效。此外，OVV可以用作载体，单独或与其他治疗结合使用，以增加总体疗效。在这里，我们对评估溶瘤痘苗病毒在癌症免疫疗法中疗效的临床前和临床研究进行了全面分析。我们讨论了这些研究的结果，包括肿瘤缩小率、总体生存益处和长期反应。此外，我们提供了与溶瘤痘苗病毒基础疗法相关的挑战和局限性的见解，包括免疫逃逸机制、潜在毒性和抗性发展。 1.引言 近年来，开发新的癌症生物疗法的方法不断创新，包括CAR-T细胞疗法和溶瘤病毒（OV），无论是单独使用还是与传统治疗结合使用。OV在超过三十年的时间里已显示出对不同类型癌症的显著疗效。 溶瘤病毒通过一系列旨在选择性靶向和消除癌细胞的复杂机制的多方面相互作用来执行其抗癌活性。给药后，OV特别识别并感染肿瘤细胞。这种特异性是通过利用癌细胞固有的弱点进行各种遗传操作来实现的。一个主要机制涉及感染的癌细胞直接溶解，其中病毒在肿瘤内的复制导致细胞溶解，释放出后代病毒和细胞内内容物。同时，病毒感染触发免疫原性细胞死亡，促进危险信号的释放并促进抗肿瘤免疫反应的激活。现在招募和激活的免疫系统识别并消除感染和未感染的邻近癌细胞，从而产生系统性的抗肿瘤免疫反应。此外，溶瘤病毒可以在肿瘤微环境中诱导一系列免疫调节效应，增强免疫细胞的招募和激活，如细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞。OV还可以破坏肿瘤血管，阻碍肿瘤的血液供应，从而有助于抗肿瘤效果。除了其主要功能外，OV还可以在感染肿瘤细胞后导致肿瘤微环境中治疗性转基因的表达。这一特性增加了溶瘤潜力，因此对于未来溶瘤疗法和免疫疗法的结合很重要。这些机制允许科学家利用免疫系统来创造OV引发的抗肿瘤免疫。每种机制的相对贡献取决于癌细胞的性质和类型、病毒载体的特性以及病毒、肿瘤微环境和宿主免疫系统之间的相互作用。这些多方面的机制共同促进了溶瘤病毒对癌细胞的选择性消除，为创新和针对性的癌症免疫疗法提供了一个有希望的途径。 OV疗法涉及不同的机制，如肿瘤细胞、病毒和免疫系统之间的相互作用。OV的抗肿瘤活性可以分为两类，即通过细胞表面受体的表达来确定的肿瘤细胞的杀灭，以及宿主细胞的抗病毒反应。另一种机制有利于生成促炎性肿瘤微环境，增强系统的抗肿瘤免疫。 已经开发了几种方法来改造病毒使其成为溶瘤病毒，包括下调病毒基因在健康细胞中复制所需的基因，使用组织或肿瘤特异性启动子。据报道，由于肿瘤细胞在抗病毒I型干扰素信号传导方面的缺陷，OV在肿瘤细胞内更有效地复制。总的来说，溶瘤痘苗病毒可以感染健康和肿瘤细胞，但遗传改造可以使它们选择性地在肿瘤细胞中复制。非侵入性成像技术，如报告基因，允许跟踪和评估OV的肿瘤特异性。 OVV在临床前、1期、2期和3期临床试验中显示出有希望的结果，并且有长期的安全性历史。OVV可以感染肿瘤细胞并不断复制，因此导致溶瘤。通过感染肿瘤细胞，肿瘤相关分子模式被暴露，包括抗原、DAMPs、PAMPs和细胞因子。这些元素随后激活肿瘤微环境中的免疫反应。此外，这些模式刺激先天和适应性免疫。然而，治疗反应可能会根据每个患者不同的基线免疫学概况而有所不同。表1列出了目前正在临床试验中的OVV、它们的特定遗传改造以及任何治疗组合。痘苗病毒是一种带有线性dsDNA基因组的包膜病毒，大约190 Kb，包含大约250个蛋白质编码基因。它是第一种安全有效的人类疫苗，最终根除了天花。由于VV完全在感染细胞的细胞质中复制，因此不必担心核内突变的可能性。认为有广泛的细胞是痘苗的宿主。病毒通过细胞膜的内吞作用进入宿主细胞。VV可以表达多达50 kb的外部DNA，并且可以同时表达多个治疗基因。痘苗具有快速和溶解性的复制周期，触发宿主中强烈的免疫反应和炎症。宿主免疫系统很容易控制感染，然而，在病毒生长失控的情况下，存在抗病毒治疗，如ST-246（tecovirimat）和cidofovir。在VV成熟期间，新组装的未成熟病毒被膜包裹形成传染性的细胞内成熟病毒（IMV），这些病毒进一步被双层膜包裹形成细胞内包膜病毒（IEV）。最外层的IEV膜层随后与细胞质膜融合，释放病毒脱离宿主细胞。Tecovirimat抑制VP37蛋白，这是形成IEV膜包裹以形成IEV所需的。Tecovirimat的可用性支持了OVV疗法的发展，为治疗OVVs的严重不良反应或减少高剂量OVV使用时的不良反应提供了选择。 分子生物学的最新进展使VV成为工程化溶瘤剂的有吸引力的候选者。由于肿瘤类型的遗传多样性及其对常规药物的抵抗力，单一疗法在治疗许多癌症类型方面的成功率有限。联合方法可能更有效，并且在治疗上具有加强效果，但找到这些组合可能具有挑战性。图1说明了已证明与OVV疗法具有协同效应的不同类型癌症治疗。本综述将总结OVV治疗组合的最新应用，并讨论它们在提高治疗反应方面的潜力。 图 1 通过不同治疗方法靶向癌细胞。1. 溶瘤病毒（OVVs）通过进入癌细胞增加干扰素的表达。2. 放射疗法对肿瘤细胞的DNA造成损伤，但由于注射时间的差异，它不会损伤痘苗病毒的DNA。3. 干扰素疗法招募免疫细胞。4. 注射PDL-1蛋白或基因插入增加了对免疫疗法方法的反应。5. 化疗通过引发炎症破坏癌细胞。6. 阻断免疫检查点抑制剂，如抗PD-1，使T细胞识别受体。7和8 T细胞和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）也通过结合受体破坏癌细胞。 2.OVVs作为下一代免疫治疗手段重塑肿瘤微环境 2.1.免疫检查点抑制剂 抗体治疗 免疫检查点分子是细胞表面发现的蛋白质，有助于调节免疫系统对如癌细胞等外来入侵者的反应。这些分子充当“检查点”，要么激活要么抑制免疫反应。一些癌细胞可以利用这些抑制性检查点分子来逃避免疫系统，使它们能够避免被淋巴细胞检测到，从而生长和扩散。免疫检查点抑制剂（ICIs）是一类针对这些检查点分子的药物，以恢复免疫系统攻击癌细胞的能力。目前，ICIs被用作某些类型癌症的治疗，如黑色素瘤和肺癌。已经鉴定出几种抑制性检查点分子，包括CTLA-4、PD-1、CD80/86、MHC II、Galectin-3、FGL1、CD112、CD155、HVEM和Ceacam-1，被称为干扰素（IFN）信号刺激基因（ISGs）。尽管ICIs在治疗不同类型的癌症方面显示出前景，但单一疗法很少为大多数患者提供长期益处。尽管CAR-T细胞疗法能够增强T细胞靶向癌细胞的能力，在治疗血液恶性肿瘤方面有效，但其治疗实体瘤的能力有限。因此，将OVs与ICIs结合使用是一种常见的提高治疗效果的方法，因为这两种疗法都旨在缓解肿瘤的免疫抑制环境。此外，OV感染触发抗癌免疫反应，提高治疗效果。已经开发出各种ICIs，每种都针对不同的检查点分子。例如CTLA-4抑制剂如ipilimumab，PD-1抑制剂如nivolumab和pembrolizumab，以及LAG-3抑制剂如MEDI3039，它们阻断T细胞表面的相应蛋白质的活性。 程序性死亡受体（PD-1），也称为CD279，是一种由PDCD1基因编码的I型跨膜蛋白，属于CD28免疫球蛋白超家族。PD-1长288个氨基酸，有一个Ig可变型（IgV）细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个细胞质结构域。它主要在活化的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和单核细胞中表达。其表达由T或B细胞受体途径诱导，并可被肿瘤坏死因子的刺激增强。初始T和B细胞几乎不表达PD-1。PD-1的生物学功能依赖于两个配体：PD-L1（也称为B7-H1或CD274）和PD-L2（也称为B7-H2或CD273）。PD-L1在T细胞、B细胞、DCs、癌细胞、巨噬细胞等上恒定表达，并可被活化的促炎细胞因子进一步上调。PD-1/PD-L1相互作用主要负责癌症的免疫逃逸。当PD-L1与PD-1结合时，PD-1细胞内结构域的免疫受体酪氨酸基开关基序（ITSM）区域的两个酪氨酸被磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸然后磷酸化B细胞受体（BCR），SHP-2，一种磷酸酶，与PD-1的C末端结合。随后，磷酸化的SHP-2去磷酸化BCR，导致Ca2+离子生成受损和长期生长停滞。在正常细胞中，PD-1/PD-L1结合防止T细胞过度刺激并维持对抗原的免疫耐受，防止自身免疫疾病的发展。在癌细胞中，PD-L1与PD-1的结合产生负信号，诱导T细胞凋亡并降低免疫能力，帮助癌细胞避免被免疫系统识别。此外，PD-1/PD-L1途径的激活对效应T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞（Treg）和耗竭T细胞（61）的分化产生负面影响，大大降低了T细胞对肿瘤细胞的作用。有趣的是，外泌体携带的PD-L1可以通过循环系统被运输到身体的远端区域。这种迁移的PD-L1在到达转移性病变之前远程抑制T细胞活性。阻断PD-L1与PD-1的结合抑制这些负面后果，从而保持T细胞功能及其杀死癌细胞的能力。 一项当前的研究表明，使用一种共同表达PD-L1抑制剂和GM-CSF（VV-iPDL1/GM）的牛痘病毒，可以加强各种临床前肿瘤模型中的全身抗肿瘤效果。这一提议有效地抑制了肿瘤和免疫细胞中PD-L1的表达，从而增加了肿瘤特异性T细胞的浸润和激活。这些反应针对来自突变的新抗原表位，导致成功地排斥了病毒注射和远处肿瘤。 今天，ICI免疫疗法在治疗各种实体瘤癌症和血液恶性肿瘤方面显示出前景，具有持久的反应和长期生存益处。阻断ICIs可以与OVV疗法结合使用两种策略：将抗ICI抗体基因插入OVV基因组，然后归类为免疫肿瘤病毒，或者患者在接受OVV疗法之前或之后接受抗ICIs抗体注射。免疫肿瘤病毒将在下一节中进一步讨论。表2显示了不同的ICI与OVV组合疗法研究，一些应用基因插入技术，而其他则使用抗体注射。在2022年的一项研究中，设计了包括一种名为GLV-1h68的OVV、美法仑、TNFa和腹腔内注射重组PD-1蛋白的4种不同疗法的方案，随后完成放疗。这些疗法的组合招募了CD4+和CD8+ T细胞，并显著改变了TME。在另一项研究中，OVV mpJX-594（mpJX）单独或与PD-1剂量一起静脉注射到功能性和转移性胰腺神经内分泌肿瘤（PanNETs）中。同时注射PD-1与mpJX对NK、CD8+ T细胞的分泌产生协同效应，导致胰腺肿瘤细胞的凋亡和增殖抑制。这种治疗组合在肝转移模型小鼠中增加了存活率和抗转移活性。 一项类似的研究表明，使用mJX-594（JX），一种装备有GM-CSF（细胞因子）的牛痘病毒，作为重塑肿瘤微环境并增强对aPD-1和/或aCTLA-4免疫疗法敏感性的方法。JJ肿瘤中，以及与免疫相关的基因高表达。它不仅增加了肿瘤内CD8+ T细胞的渗透，还增强了远处肿瘤的远隔效应。将瘤内JX与系统性aPD-1或aCTLA-4结合使用，增强了抗癌免疫反应。值得注意的是，当包括JX、aPD-1和aCTLA4时，展现出了最强的抗癌免疫，导致肿瘤完全消退并延长了总生存期。 2.2.免疫检查点抑制剂免疫溶瘤病毒疗法 溶瘤病毒可以被基因工程改造，创造出免疫溶瘤病毒（IOVs），它们自身编码免疫调节因子。IOVs可以用于局部表达免疫调节靶蛋白，从而省去了病毒疗法后单独免疫疗法的需要。一种免疫溶瘤病毒疗法涉及将抗PD-L1抗体（anti-PD-L1）表达盒插入到OV中。这种OV直接介导癌症杀伤，并诱导产生抗PD-L1抗体。这种抗PD-L1减少了免疫抑制，通过改善抗肿瘤免疫细胞功能，增强了治疗的溶瘤效果。 图2展示了肿瘤细胞和抗原呈递细胞（APCs）上的各种ICI配体，以及它们在T细胞上的相应受体。肿瘤细胞表面ICI表达越高，对免疫疗法治疗的反应可能性越大。针对PD-1/PD-L1轴的ICIs在实体肿瘤中有效，如非小细胞肺癌（NSCLC），具有高水平的PD-L1表达和活跃的淋巴细胞浸润。不幸的是，依赖单一靶标的ICIs在胰腺导管腺癌（PDAC）患者中失败，即使是那些肿瘤过表达PD-L1的患者。低抗原识别限制了细胞毒性T细胞的招募，异常的共刺激免疫检查点信号被认为是PDAC免疫疗法成功的重大障碍。CF33-hNIS-antiPDL1是一种使用强大的嵌合正痘病毒骨架CF33基因工程改造的OV，包含人类钠碘共转运体（hNIS）和抗PD-L1。未修饰的CF33先前已被证明在剂量上比目前临床前和临床研究中的其他OVs低几个数量级的情况下是安全且耐受良好的。CF33-hNIS-anti-PD-L1被证明以剂量依赖性的方式裂解PDAC细胞，在第三天实现了>90%的细胞杀伤。被感染的细胞被证明产生生物活性抗PD-L1，阻断了PD-1/PD-L1的相互作用。在体内，工程病毒的单剂量既减少了肿瘤负担，又延长了治疗小鼠的生存期。 图 2 当免疫检查点与肿瘤细胞和抗原呈递细胞（APCs）上的配体结合时，T细胞受到抑制。PD-L1/L2、CD40、CD80/86在肿瘤细胞或APCs上表达。它们的表达是由许多因素诱导和维持的。耗竭效应T细胞上表达CTLA-4、PD-1、CD40L和CD28。CTLA-4与其配体B7-1/CD80和B7-2/CD86相互作用，或PD-1与其配体PD-L1结合，产生抑制信号，减弱T细胞免疫反应。这些受体，CTLA-4和PD-1，是免疫检查点抑制剂（ICIs）如抗CTLA-4、PD-1和PD-L1的目标，旨在减少免疫细胞的抑制。 研究人员将编码抗PD-1抗体（anti-PD-1）和抗人肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9，也称为CD134或4-1BB）的两个基因插入到名为DTK-ARMED-VACV的OV中。DTK-ARMED-VACV被证明具有肿瘤特异性细胞毒性，并且抗体基因的编码不影响病毒复制。在体内研究中，DTK-ARMED-VACV抑制了肿瘤生长并增加了治疗小鼠中的IFN-g。T细胞免疫球蛋白和ITIM域（TIGIT）是一种抑制免疫系统活性的免疫检查点。在2021年，Zue等人设计了VV-scFv-TIGIT，一种编码针对TIGIT的单链可变片段（scFv）的OVV。VV-scFv-TIGIT的抗肿瘤效果单独和与PD-1或淋巴细胞激活基因3（LAG-3）阻断剂联合使用进行了探索。将VV-scFv-TIGIT注射到小鼠模型中表明，这种病毒专门在肿瘤细胞中复制，并通过招募CD8+ T细胞到现场将冷肿瘤转化为热肿瘤。VV-scFv-TIGIT组表达的IFN-g、TNF-α、Grant B、IL-6和IL-10多于野生型VV或PBS对照组。VV-scFv-TIGIT增加了肿瘤细胞表面的PD-L1表达，这可以增加肿瘤免疫原性和对免疫疗法的反应。PD-1或PD-L1可以插入到OVV中以诱导ICI过表达，并且抗PD-1、抗PD-L1或其相关抗体可以阻断ICI配体和受体的相互作用，使T细胞保持活跃以更有效地去除癌细胞（图3）。在小鼠中，将3种形式的mPD-1结合物编码，包括整个抗体（mAb）、片段抗原结合或单链可变片段（scFv）到Western Reserve（WR）溶瘤牛痘病毒中，提高了这种病毒的溶瘤能力。重要的是，这种病毒的瘤内注射与皮下注射相比，增加了mAB分泌1900倍。 图 3 不同类型的免疫检查点抑制剂（ICIs）应用。(A) 单独注射溶瘤病毒（OVV）增加ICIs的表达，这是由于通过JAK/STAT途径干扰素γ水平的增加。(B) 在OVV中插入PD-1或PD-L1诱导ICIs的过表达，这增加了免疫疗法的成功率。(C) 插入抗PD-1或抗PD-L1抗体，阻断ICIs与T细胞的相互作用，因此T细胞可以抑制肿瘤细胞。(D) 按照设计好的方案注射OVV和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体，不仅招募免疫细胞，还抑制ICIs与T细胞的相互作用。 2.3.细胞因子表达OVs 细胞因子在协调针对肿瘤的免疫反应中起着关键作用，各种白细胞介素有助于消除癌细胞。白细胞介素-2（IL-2）是一种强大的细胞因子，刺激细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的增殖和激活，增强它们识别和消除肿瘤细胞的能力。rVVDD-hIL2是一种携带人类白细胞介素-2（hIL2）的基因改造溶瘤牛痘病毒。这种重组病毒有效地感染并杀死肿瘤细胞，同时表达越来越多的hIL2，表明其作为癌症治疗有前景的载体的潜力。插入hIL2并不损害病毒复制能力，突出了这种方法的治疗潜力。 白细胞介素-12 (IL-12) 促进T细胞分化成细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），并增强它们的抗肿瘤活性。携带IL-12的溶瘤痘苗病毒将“冷”肿瘤，其特征是T细胞肿瘤浸润稀少，转化为“热”肿瘤，具有丰富的肿瘤浸润T细胞，增强免疫反应，而不产生系统毒性和细胞因子释放综合征。一种包含人IL-7和鼠IL-12基因的溶瘤痘苗病毒通过增加炎症免疫状态表现出抗肿瘤活性，并使肿瘤对免疫检查点阻断敏感。在动物的另一侧发现的未治疗的远端肿瘤中也观察到了免疫反应的激活。这些令人鼓舞的结果，在具有人类癌细胞的人源化小鼠中得到验证，强调了对非炎症实体瘤个体进行进一步研究的潜力。IL-15支持自然杀伤（NK）细胞和记忆T细胞的发育和功能，有助于持续的抗肿瘤免疫。在一项研究中，从莫斯科俄罗斯病毒制剂研究所（LIVP）的VV Lister菌株开发的OVVs表达白细胞介素-15（IL-15）或其受体亚单位α（IL-15Ra）。使用小鼠结肠和乳腺癌模型，评估了这些新变体的溶瘤活性，每种病毒单独以及两者的组合。Shakiba等人证明，这些重组变体的组合促进了IL-15/IL-15Ra复合物的产生。在体内，携带同源4T1肿瘤的小鼠在接受LIVP-IL15-RFP和LIVP-IL15Ra-RFP的组合治疗后，肿瘤显著缩小，存活率增加，淋巴细胞被招募到肿瘤部位，并且在肝脏或脾脏中未观察到有害影响。包括IL-36a、IL-36b和IL-36g在内的IL-1细胞因子家族，尽管在肿瘤免疫方面的研究较少，但已被牵涉到炎症中，并可能对调节对癌症的免疫反应有潜在影响。IL-36g以前已被证明可以促进干扰素-γ（IFN-g）的产生，增加肿瘤微环境中的1型免疫反应，并促进抗肿瘤免疫反应。几个VV基因已被牵涉到调节IL-1家族成员的功能，使这些细胞因子在调节OVV免疫原性时成为有吸引力的目标。这些基因包括A46R，一种假定的IL-1拮抗剂，B13R，也称为SPI-2，抑制将前IL-1b转化为IL-1b的酶，以及B15R，一种可溶性IL-1b受体。Yang等人开发了一种表达IL-36g的OVV（IL-36g-OV）。Yang等人开发的表达IL-36g的OVV（IL-36g-OV）在多种小鼠肿瘤模型中显示出显著的治疗功效。此外，IL-36g-OV调节了肿瘤微环境，促进了树突细胞和淋巴细胞的浸润，并减少了骨髓源抑制细胞和M2样肿瘤相关巨噬细胞进入肿瘤。因此，这些编码各种细胞因子的工程病毒不仅诱导直接溶瘤作用，而且能够调节肿瘤微环境，并可能导致免疫细胞的增加渗透，减少免疫抑制元素，以及T细胞向效应细胞的增加分化。OVs与多种细胞因子的组合展示了一种多方面的方法，利用病毒溶瘤作用和细胞因子介导的免疫调节，为推进癌症治疗策略提供了巨大潜力。 2.4.IFN治疗 将IFN-g基因引入OVVs是战略性设计，以增强OVVs的溶瘤潜力。这种遗传修饰旨在放大OVVs的抗肿瘤效果，利用干扰素β（IFN-g）的免疫调节特性。干扰素在人体的先天免疫反应中起着至关重要的作用，特别是IFN-g，因其能够调节免疫功能并表现出抗病毒和抗肿瘤活性而受到认可。插入OVVs的IFN-g基因可以增加抗肿瘤效果，但也会增加非癌细胞中病毒的灭活。这种组合疗法的临床前测试使用了VV B18R缺失突变体作为表达IFN-g的骨架。这种新工程化的OVV显示出依赖IFN的癌症选择性和体外肿瘤细胞及肿瘤相关血管内皮细胞的疗效，以及体内小鼠模型中的肿瘤靶向和疗效。 2.5.化疗 将痘苗病毒疗法与化疗药物结合使用是癌症治疗的有前途的方法。例如，VV与紫杉醇的结合产生了由I型干扰素介导的协同效应，该干扰素在感染后不久分泌，以及在细胞死亡后分泌的高迁移率族蛋白B1。索拉非尼和VV的组合在一些模型和患者试验中显示出有希望的抗肿瘤结果。在肺腺癌的小鼠模型中，CPA和GLV-1h68具有协同抗肿瘤效果。在人类结直肠腺癌的研究中，OVV与伊立替康协同作用以降低肿瘤细胞的存活率。组合疗法显著提高了存活率，超过了任何单一疗法。环磷酰胺（CPA）和GLV-1h68对PC14PE6-RFP异种移植瘤具有协同抗肿瘤效果。对未处理、CPA-、GLV-1h68-和组合治疗的肿瘤裂解物进行蛋白质分析表明，宿主源性促炎细胞因子和趋化因子，如嗜酸性粒细胞趋化因子、MIP-1b、MCP-1、MCP-3、MCP-5、TNF-a和MPO，在病毒感染和组合疗法后肿瘤组织中上调。OVVs可能与人类结直肠腺癌中的伊立替康（CPT-11）协同作用。这种组合疗法与每种单一疗法相比，显著降低了肿瘤细胞的存活率。假设化疗和病毒疗法的给药顺序影响这两种治疗方法之间的相互作用。许多癌细胞分泌高水平的抗凋亡蛋白（IAPs）并通过这种方式逃避凋亡。线粒体蛋白Smac抑制IAPs，如XIAP，以及caspases的活性，从而在癌细胞中诱导凋亡。在溶瘤病毒VV-Smac中，插入了Smac基因。当与化疗结合使用时，除了引起Smac蛋白的表达外，VV-Smac降低了癌细胞的存活率。 mpJX-594，一种具有复制能力的VV，与舒尼替尼的联合治疗增加了血管修剪、渗漏和CD8+ T细胞的募集；并减少了癌细胞的侵袭和转移。这种协同作用通过舒尼替尼减少肿瘤血管，随后切断肿瘤血管生成，使mpJX-594的效果是单独病毒治疗的三倍。对阿霉素耐药的卵巢癌细胞（A2780-R），对OVV的溶瘤作用有抵抗力。这种耐药性的机制是通过在耐药细胞中的STAT3蛋白激酶抑制剂抑制OVV复制。为了克服这种双重耐药性，使用了OVV和曲美替尼的联合治疗，显著减少了异种移植瘤的生长。在一项病例报告研究中，对化疗有耐药性的人预先使用腹腔镜下的OVV GL-ONC1和化疗药物（紫杉醇、卡铂、贝伐珠单抗）的组合，增加了对治疗的反应。在那些仅接受手术作为唯一治疗，而没有先前化疗的患者中，注射一剂OVV可以通过分泌IFNa和其他趋化因子增加对治疗的反应。表3显示了OVV菌株与化疗药物的不同组合。 使用隔离肢体灌注（ILP）技术可以实现将化疗药物直接输送到特定部位。这种方法涉及将导管插入通往肿瘤区域的血管，使用止血带将器官与系统循环隔离，并进行高剂量化疗。标准的ILP治疗使用含有肿瘤坏死因子α（TNF-a）的苯丙氨酸，并已用于治疗晚期肢体肉瘤和转移性黑色素瘤。GLV-1h68的ILP在肿瘤中显著沉积病毒，并有病毒在肿瘤内复制的证据。同时，病毒不能损害健康细胞。GLV-1h68与苯丙氨酸ILP的组合加强了病毒治疗的效果。 2.6.放射治疗 放射治疗在局部疾病控制中有着确立的作用，可以在术前或术后给予。将放射治疗和OVs结合使用在癌症治疗中显示出潜力。放射治疗和OVV治疗的协同效应可以在许多研究中看到。从放射治疗和OVV治疗的组合方案中获得的表达数据显示，这种协同不是由于病毒复制的增加。而是通过诱导内在凋亡来介导的。一项研究表明，GLV-1h68治疗降低了抗凋亡BCL-2蛋白MCL-1和BCL-XL以及凋亡抑制因子的下游抑制因子，导致效应性caspases 3和7的裂解。在ILP大鼠模型中，OV和放射治疗的组合显著延迟了肿瘤生长，并与单一药物疗法相比延长了存活时间。在体外评估头颈癌的OVV和放射治疗的疗效被证明是剂量和时间依赖的。在CD-1裸鼠中，这种相同的组合诱导了caspase活性并增加了长期消退（104）。OVV GLV-1h151和放射治疗的组合在AsPC-1，一种人类胰腺腺癌细胞系，异种移植瘤的小鼠中抑制了肿瘤生长，并对小鼠没有毒性。放射治疗和OVV的结合增加了肿瘤中的坏死和凋亡以及随后的DAMPs释放。这种组合增强了体内抗肿瘤效果，并增加了脾脏CD4+Ki-67+ 辅助和CD8+Ki-67+ 细胞毒性T淋巴细胞，以及肿瘤浸润CD3+CD4+ 辅助和CD3+CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞。相反，使用这种相同的OVV和高剂量低分割立体定向体放射治疗的组合减少了肿瘤浸润调节性T细胞。在静脉注射OVV GL-ONC1与顺铂和放射治疗的第一阶段试验中，包括19名晚期头颈癌患者在接受治疗后30个月内没有疾病进展，报告的总生存率为74.4%。然而，由于治疗剂的静脉注射，病毒输送到肿瘤具有挑战性，一些患者报告了1、2和3级副作用。由于VV具有DNA基因组，人们担心它可能在放射治疗后被破坏或修改。为了研究这种效应，Wilkinson等人通过ILP向大鼠注射GLV-1h68的剂量，然后对他们进行外部光束放射治疗（EBRT）。这项研究表明，GLV-1h68的DNA不仅对EBRT有抵抗力，而且这种组合具有附加的甚至可能是协同的效果（103）。这项研究的这一结果的原因可能是在时间上控制了辐射对病毒的有害影响。看来，开出一个合适的病毒注射和放射治疗或任何其他组合治疗的程序不仅可以限制这两种方法对彼此的影响，而且还可以具有更多的溶瘤效果。 2.7.CAR-T细胞疗法 嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法最近改变了难治性血液癌症的治疗，包括急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。CAR-T细胞疗法涉及体外设计、修改和扩增T细胞，使它们能够使用T细胞表面转导的CAR结构识别肿瘤细胞表面抗原。这使得这些CAR-T细胞能够进入“热”肿瘤的肿瘤微环境并杀死显示认知抗原的细胞。2017年，FDA批准了CD-19特异性CAR-T细胞治疗难治性B细胞淋巴瘤。尽管如此，在患有多种实体瘤的患者中，只观察到轻微和短暂的反应，也许是由于肿瘤渗透性差和这些T细胞在“冷”肿瘤环境中功能受损。OVs能够与CAR-T细胞疗法产生潜在的协同作用，因为它们可以促进T细胞的迁移、增殖和激活，特别是当它们被设计为传递免疫刺激性细胞因子、T细胞吸引趋化因子或免疫检查点靶向分子时。T细胞的迁移取决于细胞分泌的趋化因子和效应细胞上的趋化因子受体的正确组合。通常，肿瘤只产生名义量的趋化因子，导致免疫学上“冷”肿瘤表型，很少有效应者成功到达肿瘤。修改后的OVV（VV.CXCL11），通过插入CXCR3配体CXCL11增加T细胞进入肿瘤。VV.CXCL11有能力将总的和抗原特异性T细胞招募到TME中。同样，与CAR-T细胞直接输送CXCL11相比，VV.CXCL11显著增强了招募的T细胞的抗肿瘤效果。同样，工程化的OVV（OV19t），表达一个非信号、截短的CD19（CD19t）蛋白，使CAR-T细胞能够针对感染的细胞。在体外，OV19t感染的肿瘤细胞在病毒介导的肿瘤细胞溶解之前，导致新的细胞表面CD19表达，与共培养的CD19-CAR-T细胞分泌细胞因子并显示出对感染的肿瘤细胞的强细胞溶解活性。在体内，OV19t在给予CD19-Car-T细胞后帮助肿瘤控制，并针对肿瘤细胞的局部免疫，肿瘤浸润了内源性和注射的CAR-T细胞。CAR-T细胞介导的肿瘤杀伤也导致OV19t从垂死的细胞中释放出来，这传播了肿瘤表达CD19t，允许更大的病毒传播和更广泛的反应。 2.8.携带双特异性T细胞引导因子的OVV 双特异性T细胞引导因子（BiTEs）是一种旨在增强身体对癌细胞免疫反应的免疫疗法。这些分子被设计为同时结合T细胞和癌细胞，将它们拉近。这种双重结合允许形成免疫学突触，激活的T细胞可以分泌穿孔素和其他颗粒酶，导致癌细胞溶解。OVVs可以被设计为编码BiTEs。T细胞引导CD3-scFv为T细胞的激活提供了一种替代方法，用于癌症免疫疗法。2014年，Yu等人构建了一种这样的VV，编码一个由CD3的scFv和一个特定于EphA2的BiTE组成，EphA2是一种肿瘤细胞表面抗原，命名为EphA2-TEA-VV。体外分析显示，与表达GFP的双重删除WR对照相比，具有相似的复制和癌细胞溶解能力。类似地，EphA2-TEA-VV将T细胞导向癌细胞，通过分泌IFN-g、IL-2和结合CD3激活T细胞，并诱导未感染肿瘤细胞的旁观者杀伤。在SCID-Bg小鼠中的A549 NSCLC异种移植模型的体内分析表明，与GFP对照相比，EphA2-TEA-VV具有强大的抗肿瘤效果。EphA2-TEA-VV和来自健康捐赠者的未刺激的外周血单核细胞的联合治疗，与每种治疗作为单一疗法相比，具有更强的抗肿瘤效果。因此，这表明用T细胞引导因子武装溶瘤VVs有可能通过促进T细胞激活和促进更广泛的肿瘤细胞破坏，包括未感染的细胞，来提高治疗效力，为推进癌症治疗中的溶瘤病毒疗法提供了一种有希望的策略。Yu等人的团队还创建了一种携带针对小鼠CD3和成纤维细胞激活蛋白（FAP）的BiTE的溶瘤痘苗病毒，称为mFAP-TEA-VV。他们的主要目标是解决与FAP靶向免疫疗法相关的安全性问题，这些疗法与非靶向激活有关，并且已经显示出显著的抗肿瘤效果。与EphA2-TEA-VV类似，mFAP-TEA-VV展示了与未修改的VV对照相似的复制能力和溶瘤作用，并且也能够在与小鼠T细胞的共培养测定中触发未感染FAP表达细胞的旁观者杀伤。在体内免疫能力B16-F10模型中，mFAP-TEA-VV增加了肿瘤内的病毒载量，并且与VV对照相比具有强大的抗肿瘤效果。值得注意的是，mFAP-TEA-VV病毒的增强传播与肿瘤基质的降解有关，表明改善的病毒分布与肿瘤周围支持组织破坏之间的相关性。“双重删除”的Western Reserve痘苗病毒（vvDD），被设计为表达抗FAB/CD3 BiTE。这证明了改善的病毒复制，并促进了黑色素瘤同源模型中活性T细胞的浸润，证明了肿瘤回归。此外，表达抗FAP/CD3 BiTE的Ad ICOVIR15K显示出更好的抗肿瘤反应和肿瘤内T细胞。此外，除了BiTE方法外，编码抗FAP的VV在与未武装的VV相比，显示出适度的肿瘤生长回归。然而，观察到与癌症相关的成纤维细胞（CAF）的显著减少。这种适度的抗肿瘤活性回归可能是使用细胞毒性FAP阻断抗体而不是细胞毒性抗FAP BiTE引起的。FAP阻断抗体确实允许CAF重新生长并恢复TME。2022年，Wei等人开发了VV-EpCAM BiTE，通过调节免疫抑制性TME来增强实体瘤中的抗肿瘤免疫。这种重组病毒分泌针对上皮细胞粘附分子（EpCAM）的BiTE，EpCAM是与实体瘤相关的抗原，以及CD3。VV-EpCAM BiTE有效地感染并溶解癌细胞。通过分泌的EpCAM BiTE介导的表达EpCAM的恶性细胞和T细胞上的CD3ϵ的结合，激活T细胞并导致IFN-g和IL-2的释放。当瘤内给药时，VV-EpCAM BiTE显著提高了抗肿瘤活性，特别是在EpCAM表达高的肿瘤中。这种治疗还增加了TME免疫细胞浸润，减少了CD8+ T细胞的耗竭，并增强了T细胞介导的免疫激活。Lei等人设计了一种表达CD19特异性BiTE（OVV-CD19BiTE）的溶瘤痘苗病毒。与非工程化类型相比，OVV-CD19BiTE可以招募更多的CD3、CD8和原始CD8 T亚群到肿瘤组织，同时保持在肿瘤细胞内复制和溶解的相似能力。 2.9.光动力疗法 光动力疗法（PDT）是一种基于光激活肿瘤定位剂、光敏剂，产生细胞毒性单线态氧（1O2）[37。在这种治疗方式中，PS与免疫蛋白结合，允许PS传递到癌细胞。当应用光时，PS杀死癌细胞并引起免疫反应，这可能导致进一步的癌细胞死亡。第二代，基于叶绿素的2-（1-己氧基乙基）-2-devinyl pyropheophorbide-a（HPPH）敏化剂在临床试验中显示出良好的光物理和药代动力学特性，与基于卟啉的光合成器Photofrin相比。在2004年的临床前研究中，HPPH-PDT显示出不同的血管、细胞和炎症反应模式，长期肿瘤控制率取决于所使用的特定治疗方案。HPPH敏化的PDT可能与TK-和VGF-删除的VV联合具有治疗活性。这种VV表达了增强型绿色荧光蛋白，EGFP，用作标记，以追踪在同源小鼠和人类FaDu异种移植中建立的NXS2神经母细胞瘤。与单独使用任何一种单一疗法相比，PDT和OVV的组合在控制原发和转移性肿瘤生长方面最有效。一种剂量组合甚至在治疗后六周内导致NXS2和FaDu肿瘤的肿瘤体积减少。由于PDT导致肿瘤血管化的破坏，与溶瘤单疗法相比，组合中的病毒滴度更高，这表明这两种治疗方法结合协同作用，并没有对彼此产生负面影响。 2.10.RNA治疗 RNA治疗是一种基于RNA分子的治疗类型，在这种治疗中，RNA被用来操纵目标分子的表达和活性。第一个基于RNA的药物在1990年代使用，在此期间，mRNA被注入小鼠以靶向蛋白质生产。最近，微小RNA，单链成熟miRNA约22个核苷酸，已被用来治疗疾病，特别是癌症。 在这种方法中，miRNAs通过靶向肿瘤抑制基因充当致癌miRNA，或者通过靶向癌基因充当肿瘤抑制因子。miRNAs与信使RNA（mRNA）的3'-非翻译区（UTR）中的互补序列结合，因此它们可以在转录后抑制基因表达。因此，通过结合miRNA治疗和OVV治疗，可以去除病毒的致病基因，提高OV治疗的安全性。例如，通过let-7a miRNA介导的B5R蛋白下调被证明可以降低病毒致病性并损害VV的溶瘤活性。这种let-7a miRNA调节的VV（MRVV）能够选择性地复制并诱导肿瘤细胞的溶瘤作用，同时对健康细胞没有毒性。B5R表达和MRVV复制取决于感染细胞内源性let-7a表达水平。在小鼠模型中使用瘤内注射MRVV，比较了B5R阴性LC16m8D和B5R阳性LC16mO病毒在人癌异种移植模型中的溶瘤潜力。尽管两种病毒在感染后18天都减少了肿瘤大小，但LC16mO处理的小鼠在21-28天内因严重的病毒毒性症状（包括体重减轻和尾巴、爪子、面部和身体其他部位的痘疮病变）死亡或被牺牲，而LC16m8D小鼠没有表现出这些相同的症状。该组表明，这种转基因插入不影响let-7a调节的溶瘤活性，MRVV复制在正常组织中受到抑制，MRVV降低了病毒致病性，同时保持溶瘤活性。OVV治疗被证明在紫杉醇耐药的KFTX卵巢癌细胞中比KFlow紫杉醇敏感细胞更有效。长非编码RNA（lncRNA）尿路上皮癌相关1（UCA1）在紫杉醇耐药细胞中过表达，UCA1表达被证明与OVV在各种原发卵巢癌细胞系中的溶瘤效果相关。这表明UCA1参与调节OVV的溶瘤效果。UCA1还通过激活Rho GTPase Cdc42增强了OVV的细胞间传播，从而在卵巢癌中取得了更好的治疗效果。类似地，已经显示UCA1显著增加了OVV在结直肠癌中的细胞间传播。UCA1抑制miR-18a和miR-182，促进Cdc42激活，通过伪足形成增强OVV传播。 2.11.激素治疗 醛固酮是一种矿物质皮质激素，通过保留钠和释放钾来控制肾脏中的水和盐平衡。在JX-594的I期肝癌临床试验中，JX-594是一种源自Wyeth菌株的OVV，Park等人注意到大多数患者中存在病毒复制，而在有严重腹水和外周水肿的癌症患者中检测到的病毒复制更多。腹水是由于晚期癌症导致的腹腔内异常积液。这种腹部液体隔离导致肾脏进一步保留液体，这是由于醛固酮等激素的刺激效应，这可能导致进一步的外周水肿。随后假设这些患者的醛固酮水平增加，并可能增加肿瘤细胞系的增殖。在另一项研究中，与JX-594和醛固酮同时处理的A2780、PC-3和HepG2细胞中病毒复制显著增加，但U2OS细胞中没有。醛固酮处理的不同时间改变了每个细胞系中病毒复制的不同方式。醛固酮受体抑制剂螺内酯抑制了JX-594进入细胞的质膜。类似地，通过用5-N-乙基-N-异丙基阿米洛利（EIPA），一种Na+/HA+交换抑制剂处理，显著降低了病毒进入，但在醛固酮处理后恢复。这些发现表明OVV治疗和激素水平之间存在相互作用，以至于在溶瘤病毒治疗和激素治疗之间可能观察到协同作用。 3.保护OVVs免受先天和适应性体液免疫 OVs治疗使用的局限性之一是免疫系统对病毒的抑制。已经探索了包括瘤内注射和系统给药在内的多种不同的OV传递方法。瘤内注射的OVs已经显示出成功，但只允许治疗容易接触的实体瘤，依赖于病毒在TME内的复制和随后传播到远处部位以治疗转移。由于对OV的免疫反应，这种复制和传播通常是无效的。系统OV传递允许治疗原发性肿瘤和任何转移，无论是明显的还是未诊断的，是治疗转移性和无法接触的实体瘤和血癌的有吸引力的选择。基于疫苗的OVs在肿瘤内诱导强烈的免疫反应，以帮助杀死肿瘤靶标，但这种相同的免疫反应有时可能干扰病毒的溶瘤活性。因此，OV研究的主要焦点是如何保护治疗性病毒免受患者免疫系统的影响。在感染期间，病毒进入细胞增加了细胞内干扰素的分泌，导致炎症。在炎症反应期间，先天免疫细胞（如NK细胞和吞噬细胞）的分泌增加。同时，病毒抗原进入淋巴结，并在如DCs这样的抗原呈递细胞的帮助下，激活B和T细胞的适应性免疫反应。激活的B细胞分化为分泌抗体的浆细胞，通过阻止进入易感细胞来破坏病毒生命周期。T细胞通过细胞毒性效应直接攻击和破坏病毒。类似地，系统VV传递受到预先存在的免疫力的限制。对于OVV来说，由于在天花根除期间进行了全球性的VV免疫，许多目前发展癌症的个体都对这种病毒有免疫力。补体是先天免疫系统第一道防线的关键组成部分，针对外来病原体进行调理、中和、吞噬和从循环系统中清除。在一些癌症患者中，由于天花疫苗接种而产生的中和抗体可能会限制OV治疗的效力。血液中的自然屏障，包括这些抗体和补体，可能会限制重复静脉注射OV的效力。使用眼镜蛇毒因子（CVF）耗尽补体蛋白改善了大鼠中OV的传递和肿瘤感染。此外，在猕猴中补体抑制和OV治疗的联合策略在早期时间点展示了增强的肿瘤控制。 考虑到现有溶瘤疗法和研究的良好结果，显然必须在抗病毒和抗肿瘤免疫之间取得平衡。这种平衡可以通过注射足够高的初始病毒量、将OV治疗与其他免疫疗法结合以及采用保护病毒免受免疫系统影响的方法来实现，因为增加OV剂量并不是一个好选择，因为这可能导致与病毒疾病相关的症状，尤其是在治疗开始时已经免疫缺陷的患者中。局部瘤内病毒注射可以在很大程度上克服这个问题，并在病毒被免疫系统靶向之前将病毒输送到肿瘤细胞。以下讨论了保持OVV免受免疫系统影响的各种方法。 3.1.涂层 保护治疗性病毒免受免疫系统影响的一种方法是使用物理屏障。这些物理保护剂可以是细胞衍生的纳米囊泡、脂质体或化学聚合物。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）是一种生物相容性和生物可降解的合成材料，广泛用于纳米技术和药物输送的研究。PLGA纳米纤维已被用作将OVV靶向输送到结直肠癌（CRC）肿瘤的支架，并在体外细胞培养和体内动物肿瘤异种移植中进行了研究。在CT-26细胞中，从PLGA膜释放的OVV的感染性和抗肿瘤活性得以保留，细胞活力以剂量依赖的方式降低。类似地，这项研究显示嵌入的病毒在48小时内持续释放。然而，使用病毒涂层可能存在限制，妨碍其使用。例如，涂层可能会阻止OVs接触和影响肿瘤细胞，并因大幅增加成本而对商业化构成障碍。 3.2.细胞载体 保护病毒免受免疫系统影响的另一种方法是使用细胞载体。在这种方法中，载体装载病毒，以便在体内进行无检测运输。细胞载体在脑癌的OV输送中可能适用。由于存在血脑屏障，OVV难以进入脑肿瘤。然而，肿瘤切除后血液和脑脊液的涌入可以被利用，通过使用细胞载体将溶瘤病毒治疗输送到大脑。这些细胞载体可以来源于多种细胞。例如，它们可以来自间充质干细胞（MSCs）。从脂肪组织提取的MSCs，称为脂肪组织来源干细胞（ADSCs），被感染了VV LIVP菌株，并与血单核细胞共同培养。结果表明，OVV与这些间充质细胞载体（ADSCs）的共培养提高了OVV的疗效。然而，由于NK细胞和适应性T细胞的异体反应，这些细胞载体在临床研究中的使用面临限制，并且由于患者的免疫细胞去除了ADSCs，治疗效率可能降低。细胞载体也可以来源于实体肿瘤。由于潜在风险，将这些类型的载体注射到患者体内尚未进入临床试验。除了利用OVV和T细胞或CAR-T细胞外，这些细胞也可以被视为病毒的载体。将T细胞和人类HER2-CAR-T细胞与双重删除的痘苗病毒vvDD-GFP注射到小鼠中，表明结合T细胞和OVV疗法可以成功且精确地将OVV输送到肿瘤部位，而不降低每种疗法的个体效果。此外，这些T细胞载体不面临其他细胞载体的相同限制，例如被免疫系统消除。因为工程化的T细胞识别表面表达的肿瘤抗原，而不依赖于抗原处理或MHC呈递，使用CARs避免了TCR激活的T细胞所面临的限制。 4.不同OVV的临床试验最新结果 近年来，许多不同的OVV在临床试验中显示出良好的结果，如JX-929、GL-ONC1、JX-594等（表1）。JX929基于Western Reserve痘苗病毒菌株，经过工程设计以选择性地在肿瘤细胞中复制，通过修改VGK和TK基因。该OVV首先在不同类型的实体肿瘤中进行了瘤内注射和随后的人体静脉注射的I期临床试验。结果显示，该OV可以安全施用，没有观察到剂量限制性毒性，病毒在肿瘤组织中选择性复制。然而，目前尚无法确认该病毒的临床益处，需要进一步实验。GL-ONC1是Lister菌株的OVV，包含多个基因修饰，如TK和血凝素基因。该OVV已被测试用于腹腔内和静脉注射，单独或与其他治疗结合使用。当单独测试或与化疗或放疗结合时，未观察到剂量限制性毒性和少量不良反应。目前进入III期临床试验，GL-ONC1与化疗结合的初步结果表明，在肿瘤细胞感染后显示出抗肿瘤活性，但尚无法确认提高的效率是由OV引起的，需要进一步分析以验证GL-ONC1的影响。 双重组病毒“VV-GMCSF-Lact”，基于Lister菌株的VV，目前处于I期临床试验阶段。这种OVV表达lactaptin蛋白和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。初步结果表明，这种OV可能是治疗耐药肿瘤的潜在疗法。还有删除了TK和VGF基因的重组人IL-21溶瘤痘苗病毒（hV01），目前处于I期临床试验阶段。初步结果显示，瘤内表达IL-21对肿瘤微环境（TME）有潜在益处。最后，经过最多次测试的OVV之一是JX-594，也称为PexaVec。它基于Wyeth疫苗株的VV，经过工程改造以表达GM-CSF，并通过删除TK基因选择性地在肿瘤细胞中复制。这种OV已经通过瘤内注射或静脉输注，单独或与其他治疗结合使用，针对多种实体瘤进行了测试。作为单一疗法，有多个临床试验，无论是I期还是II期。结果表明，OV除了安全施用于患者外，还提供了潜在的抗肿瘤活性，给药被良好耐受。一些研究小组现在正在测试这种OV与伊立替康、Durvalumab和Tremelimumab等药物的结合使用。前者是化疗药物，后两者是针对不同免疫检查点调节剂相互作用的抗体。到目前为止，PexaVec与免疫检查点治疗的结合表明没有观察到额外的毒性，并且似乎被良好耐受。此外，治疗的结合显示有证据表明它可以在TME中引起免疫变化。总的来说，已经完成或正在进行的各种临床试验表明，还有许多工作要做，以验证OVV的好处，并优化这些治疗，以增加持久影响及其效果和安全性。即使没有观察到剂量限制性毒性，也有少数不良反应的报告，看看这些OVV是否可以优化以获得更低的不良反应将很有趣。 5.结论和展望 目前，溶瘤病毒是癌症免疫治疗研究的一个有前景的领域。基因编辑技术允许研究人员修改病毒，使它们只能在癌细胞中复制，同时不伤害健康细胞。这些病毒可以释放肿瘤抗原以刺激患者的免疫反应，并同时输送治疗有效载荷。虽然溶瘤病毒显示出有希望的抗癌潜力，但作为单一疗法使用时存在某些限制。一个值得注意的限制是患者之间的治疗反应的变异性，这受到个体肿瘤的不同免疫学特征和遗传特征的影响。此外，肿瘤细胞可能随着时间的推移对溶瘤病毒产生耐药性，从而损害单一疗法方法的持续有效性。认识到肿瘤血管的双重作用，一些策略旨在使其崩溃以产生抗癌效果，而其他策略则专注于使其正常化以增强OV传播。此外，宿主免疫系统可能对溶瘤病毒产生强烈反应，导致其在实现最佳抗肿瘤效果之前就被清除。因此，解决溶瘤病毒单一疗法所面临的这些固有挑战对于为患者创建成功的治疗策略变得至关重要。将OV与传统疗法（如化疗或放疗）结合使用可以产生协同效应，利用每种方法的优势来克服各自的限制。此外，将溶瘤病毒与免疫调节剂（包括免疫检查点抑制剂）结合使用，可以增强对癌细胞的免疫反应，促进更持久和有效的抗肿瘤效果。这些组合策略为癌症治疗提供了一种全面和个性化的方法，提高了效果和更广泛的适用性。组合OV治疗尚未获得批准，但有多种正在进行临床和临床前试验，旨在通过治疗之间的加性或协同作用增加反应率。本综述总结了目前正在研究的主要溶瘤痘苗病毒组合及其背后潜在的协同作用机制。尽管结果令人鼓舞，但需要进一步的研究来证明这些治疗的有效性并确保其获得临床使用的批准。应该进行关于OV与其他二线治疗（如化疗药物和免疫疗法）结合使用的研究，以进一步优化治疗结果。此外，必须优化溶瘤病毒的传递方法，以最大限度地提高反应率，同时最小化脱靶副作用和毒性。对OVV与其他类型的化疗药物和免疫疗法（如细胞因子）的组合效果进行研究，以及对传递方法的进一步研究也必须进行，以实现最大的反应率，同时最小化脱靶副作用和毒性，以及研究OV对其他类型癌症的治疗效果。有希望的组合研究为继续OV研究提供了必要的证据，希望实现高反应率并成为患者的更主流的治疗选择。总之，溶瘤病毒治疗癌症的领域正在迅速发展，组合治疗对于提高反应率和患者总体结果具有很大的希望。基因编辑技术的使用使得可以开发出专门针对癌细胞的病毒，从而避免伤害健康细胞。本综述强调了目前正在研究的溶瘤痘苗病毒组合治疗的现状，以及观察到的协同作用背后的潜在机制。尽管结果令人鼓舞，但需要进一步的研究来证明这些治疗的有效性并确保其获得临床使用的批准。应该进行关于OV与其他二线治疗（如化疗药物和免疫疗法）结合使用的研究，以进一步优化治疗结果。此外，必须优化溶瘤病毒的传递方法，以最大限度地提高反应率，同时最小化脱靶副作用和毒性。溶瘤病毒免疫治疗在癌症治疗方面的前景是光明的，它有潜力成为患者的主流治疗选择。随着该领域的不断发展，我们可以期待新的发现和进步，这将进一步增加反应率并改善患者结果。进一步的研究和投资对于实现溶瘤病毒治疗癌症的全部潜力至关重要。鉴于上述情况，可以得出结论，溶瘤病毒治疗作为一种癌症治疗选择具有很大的前景，组合治疗为未来研究提供了特别有希望的途径。下一步应该集中于证明这些治疗的有效性，并优化传递方法，以将这些治疗推向癌症治疗的前沿。 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