Eicosapentaenoic acid

摘要：近年来，一次性使用系统变得越来越重要。这尤其适用于它们在基于哺乳动物细胞培养的生物制药产品制造中的使用，例如用于治疗癌症和自身免疫疾病的抗体。如今，这类生物治疗药物的开发者和制造商可以从不同供应商那里选择大量的一次性使用系统产品组合。例如，有存储袋、过滤器、混合器、生物反应器、连接器、收获和转移系统、膜吸附器、冷冻和解冻系统的一次性版本，仅举几个例子。因此，在完全的一次性生产设施中生产临床样本（上游处理到灌装）已经成为现实。基于对一次性使用系统术语的定义和一次性技术发展里程碑的介绍，本章节讨论了当前市场上可用的一次性使用系统最重要的优势和现有限制。随后，基于选定的产品示例，介绍了一次性技术的发展现状。重点放在上游区域和一次性生物反应器上。最后，从一次性系统日益增加的实施中推断出从过程强化到完全连续生产的途径。 1.引言 一次性使用（SU）系统及其组成技术现在已成为许多生物制药生产过程不可或缺的一部分。它们被用于研究与开发、临床前和临床生产以及商业生产的每个不同阶段，用于生产小到中等体积的治疗性蛋白，如单克隆抗体（mAbs）、激素、疫苗、细胞和基因治疗药物或抗体药物偶联物（ADC）。这些系统中使用的宿主细胞可以是昆虫细胞或微生物，但主要是哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢{CHO}细胞）。“一次性使用系统”一词描述的是一种塑料制品或设备，其细胞、培养基或产品接触表面在使用一次后即被丢弃（例如，焚烧）。因此，“一次性使用”一词也常用于SU系统的消耗性部件，这些部件由聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、乙烯醋酸乙烯酯、聚醚砜、聚硅氧烷和氟塑料如聚四氟乙烯或聚偏氟乙烯等材料制成。SU系统中的消耗性部件通常是刚性形状或柔性袋，由多层薄膜组成，通常预组装并灭菌。伽马辐射（25-50 kGy）是首选的灭菌方式，但X射线处理正在兴起。SU系统并不是一个新现象；严格来说，它们已经存在了50年。第一个SU培养系统（空心纤维生物反应器和CellFactories）是在20世纪70年代开发的，并在早期使用贴壁生长的哺乳动物细胞的mAb和疫苗生产过程中使用。自20世纪90年代以来，塑料过滤胶囊、无菌注射器过滤器和SU储存袋（包括输送系统）已经商业化。SU技术发展的一个重要里程碑是在1998年推出了第一个波浪混合SU生物反应器，Wave™ Reactor（见“一次性生物反应器”部分）。Wave™ Reactor不仅为其他可扩展的SU生物反应器类型铺平了道路，还促进了生物制药生产过程中其他SU工艺设备的发展。在21世纪初，首次可以在非无菌环境中使用无菌连接器连接无菌流体路径，2006年，第一个搅拌式SU生物反应器（HyClone™ S.U.B.和Xcellerex™ XDR-Disposable Stirred Tank Bioreactor）被引入市场。这引发了对SU技术应用和发展的新兴趣浪潮，得到了各种组织（例如，生物工艺系统联盟，生物制药运营组{BPOG}，国际制药工程学会，化学工程和生物技术学会{DECHEMA}在美国和欧洲地区）的支持。SU系统的开发商和制造商，以及来自工业界和学术界的用户，开始解决现有SU系统的弱点（见“一次性使用系统的优缺点”部分），并进一步开发和设计使用SU系统的设施。在开发生物制药和生物仿制药的压力下，自2015年以来，人们越来越关注使用SU系统的工艺强化和连续工艺，从而复兴了灌注技术（见“强化和连续设施趋势”部分）。事实上，全球用于生物制药工艺的SU设施数量正在增加。在过去5年中，亚洲地区对SU技术特别感兴趣；细胞和基因治疗药物的开发商和制造商渴望利用SU技术的潜力（见“一次性使用系统的优缺点”部分）；Covid 19大流行推动了SU技术的繁荣，这种繁荣一直持续到今天。 2.一次性使用系统的优缺点 SU系统可以快速安装并投入使用，比可重复使用的同类产品更便宜，并且具有高度的模块化和灵活性。最近的研究表明，它们还支持强化和连续生物制药生产过程的实施（见“强化和连续设施趋势”部分）。由于不需要在现场对SU系统进行灭菌或清洁（无需灭菌设施，无需现场清洁，无需注射用水），设施的占地面积可以减少，微生物污染的风险，特别是交叉污染的风险会降低。通过实施SU系统，可以缩短新产品的开发时间，并增加每年产品批次的数量。各种研究表明，使用SU系统的环境影响也比可重复使用系统更低。然而，SU系统中消耗品的不断更新确实产生了大量的废物。因此，为了进一步提高SU系统的可持续性，许多制造商目前正在研究机械回收使用量最大的SU系统消耗品的可行性，如生物工艺袋。SU系统的劣势包括缺乏标准化，导致依赖某些供应商，有限的可扩展性，可能的泄漏，提取物和可提取物（E&L）的发生以及消耗品的高成本。大多数列出的劣势可以归因于所使用的塑料材料属性及其进一步加工/处理。有趣的是，拒绝在生物制药过程中使用SU系统的主要原因是E&L，它们可能以不可接受的浓度发生。 虽然提取物是在实验室的严苛工艺条件下形成的化学物质，可提取物是在实际工艺条件下形成的。然而，像双(2,4-二叔丁基苯基)磷酸酯或3,5-二硝基双酚A这样的可提取物是提取物的一个子集。已知的E&L的安全信息不断由提取物和可提取物安全信息交换联盟更新，并可在互联网上获取（www.elsiedata.org）。E&L的来源包括塑料加工（添加润滑剂、增塑剂、抗氧化剂、热和紫外线稳定剂）、辐照、储存和运输SU系统的消耗品。事实上，E&L可能来源于工艺系统（例如，生物工艺袋、过滤器），以及一级（例如，注射器、安瓿、小瓶）和二级（例如，包装纸、容器标签）包装组件，可能会对产品质量、数量和稳定性产生负面影响。在最坏的情况下，E&L可能在存在的浓度下具有毒性，危及患者安全。由于患者安全是生物制药产品制造中的首要考虑，与最终药品（DP）最接近的工艺步骤（见图1.1），接触时间最长的步骤被认为是在E&L概况方面风险最大的步骤。这意味着上游加工（USP）在关键E&L浓度方面的风险最低，而用于灌装和完成工艺的SU系统风险最大，下游加工（DSP）步骤则介于两者之间。USP包括从工作细胞库（WCB）培养细胞、接种物生产、细胞扩增、生物反应器中mAb表达和收获（细胞分离和澄清）。在大多数情况下，DSP包括捕获和抛光步骤，提供最终药物物质（DS）。然后是配方，最后是灌装和完成。经过质量控制（QC）后，最终DP被标记、包装和运输。本章未显示USP中的培养基准备和生产过程步骤，以及DSP中的缓冲液生产步骤，但将在本章进一步讨论。 图 1.1 典型生物制药生产过程（以单克隆抗体生产为例）的步骤和阶段。 有趣的是，研究表明，通过过滤步骤或预冲洗过滤系统，可以大幅降低USP和DSP中可提取物的浓度。因此，建议在生产过程的每个步骤尽早确定E&L风险概况，并与专门的毒理学家合作。过去9年发布的建议和标准，如BPOG、美国材料与试验协会和美国药典可用于此目的。值得一提的是，SU设备制造商生成的E&L数据并不免除DP制造商进行与其工艺相关的自己的研究。尽管如此，市场上当前一代SU系统的优势远远超过它们的弱点。然而，一个重要的前提是正确选择和使用SU系统。用户可以从各种不同的产品中选择，甚至可以使用SU系统设计平台工艺。著名的SU系统制造商如Cytiva（ReadyToProcess系列，FlexFactory™系列）、Merck（Mobius®系列）、Pall（Allegro™系列）、Sartorius（Flexact®系列）和Thermo Fisher Scientific（HyPerforma™系列）为USP、DSP、配方和灌装提供平台。基于这些平台的最先进的工艺具有明确定义的工艺序列，这有助于开发高效的工程工作流程，提高供应安全性，并提供工艺优化的潜力。 3.一次性系统：我们今天所处的位置 3.1.一次性上游处理 SU系统在生物制药生产过程的上游加工中无处不在。基于SU系统的完整上游生产线在mAb生产过程中已经成为现实，其中使用了以下SU设备：管道、无菌连接器、采样和转移系统、带有储存袋的生物工艺容器、搅拌器、一次性生物反应器（SUBs）、过滤系统，如深层过滤器、微滤、超滤和透析系统、离心机和分离器。此外，还使用了典型的实验室用具，如小瓶、摇瓶和移液管。然而，这些类型的用具以及管道、采样系统、转移系统和带有储存袋的生物工艺容器不是本章的主题。关于这些主题的详细信息可以在（第2章和第5章）中找到。在过去的16年里，根据Langer的分析，搅拌器和生物反应器是最常实施的SU系统。因此，它们和最常用的用于初级回收（细胞分离/澄清）的SU系统将在本节中更详细地描述。因为SUBs是USP的核心，它们将是本节的重点。 3.1.1.一次性搅拌器 SU搅拌器主要用于USP中的培养基生产。机械驱动系统用于此任务，并且商业上可获得的搅拌器容量高达个位数立方米。它们有一个圆柱形或立方体形的塑料袋，并且大多数是搅拌的，但偶尔也可以是振荡系统（例如，Cytiva ReadyToProcess™搅拌器，最大50升工作体积）或圆盘混合系统（Thermo Fisher Scientific ImPULSE™搅拌器，最大5000升工作体积）。在搅拌的SU搅拌器中，旋转的搅拌元件通常是磁力搅拌器。然而，也有带有密封件（顶部或底部安装）的搅拌SU搅拌器，如Pall的Allegro™ SU搅拌器（最大1000升工作体积，见图1.2）或Thermo Fisher Scientific的HyPerforma™ SU搅拌器。 图 1.2 磁力混合器系统。（图片由 Pall Corporation 提供） HyPerforma™ SU搅拌器有6种尺寸（50-2000升工作体积），并且有一个顶部安装的搅拌器。该系统提供了5:1的混合体积转换比，并且有加热和非加热版本。然而，Pall的Allegro™ SU搅拌器的工作体积可达1000升，并且配备了底部安装的搅拌器。 搅拌式SU搅拌器的容量可达7000升（ABEC的CSR® General Mixer）。目前，这些是市场上最大的SU搅拌器。Werner及其合作者以及de Boulard和Kienle提供了当前SU混合技术的更全面的概述。这两篇出版物讨论了其他机械驱动的SU搅拌器（例如，基于悬浮技术的搅拌系统或翻滚搅拌器）以及特别适合DSP（见“一次性下游处理”部分）和产品配方（见“一次性配方和灌装完成”部分）的水力驱动版本。毫不奇怪，大多数描述的SU搅拌器的工作原理也出现在SU生物反应器中，这些设备的制造商也提供SU混合技术。 3.1.2.一次性生物反应器 SUBs，从毫升规模到立方米规模，用于细胞生产（例如，接种物生产）和产品表达（例如，mAb）目的。根据它们的功率输入（见图1.3），它们可以分为四类：机械驱动、气动和液压驱动以及混合版本。机械驱动的SUBs是最大的群体，包括搅拌式、波浪混合式和轨道摇动的SU版本。机械功率输入是通过搅拌、摆动运动（波浪混合运动）或轨道摇动来实现的。气动系统中的直接曝气产生热量和质量传递，而液压系统中使用泵。 图 1.3 根据功率输入对常见单次使用生物反应器类型的分类。 3.1.3.搅拌式一次性生物反应器 几十年来，在微生物和哺乳动物细胞的可重复使用搅拌生物反应器的开发经验反映在搅拌SUBs的设计中。不同供应商现在提供高达6000升工作体积的SUBs（见表1.2）。这些系统由刚性容器（10毫升至40升工作体积）或柔性袋（4.5-6000升工作体积）组成，高度与直径比（H/D）为1.5:1-2.2:1。最大的8000升SUBs（6000升工作体积）由ABEC在2019年推出。刚性搅拌SUB系统通常是独立的，由聚碳酸酯制成的塑料容器，不需要支撑容器来成型。与基于袋子的系统不同，在使用刚性系统时，折叠应力通常不是问题，因为折叠应力可能导致层断裂，从而导致泄漏。使用培养袋时，重要的是袋子要正确安装并完全适合其固定装置，以实现最佳性能，特别是在热传递方面。在展开袋子和安装过程中可能引起的腔室、口袋和褶皱应该被防止。根据生物反应器的规模，容器的加热和冷却是通过加热块、块冷却器或双夹套来完成的。通常使用气体排放过滤器加热器而不是排气气体冷凝器，即使它们的性能较低。为了降低由于过滤器堵塞或泡沫导致的排气过滤器堵塞的风险，在较大的搅拌SUBs中，几个排气过滤器被并行连接。BioBLU® 0.3c生物反应器（Eppendorf）使用了不同的原理。无液体的Peltier元件控制排气空气中的温度和凝结。Ambr® 250系统（Sartorius）也采用了类似的原理，以减少由于蒸发导致的液体损失。BioBLU® 0.3c和Ambr® 250都是可堆叠的模块化系统，具有多达32个或更多的平行培养容器。生物反应器容器的工作体积为100-250毫升，适用于筛选实验和工艺开发。这两个系统都提供用于哺乳动物或微生物细胞的版本，使用不同类型的搅拌器（斜叶搅拌器与Rushton搅拌器）以满足生产生物体的不同要求。除了使用哺乳动物（主要是CHO）和微生物（主要是大肠杆菌{E. coli}和毕赤酵母{P. pastoris}）细胞的应用外，这些系统还用于处理人类原代细胞（即间充质干细胞{MSCs}、诱导多能干细胞{iPSCs}和CAR-T细胞），因为它们的高度自动化、并行运行培养的能力以及低初始工作体积。另一个流行的搅拌SUB系统，用于筛选研究、培养基优化和克隆选择是Ambr® 15，它提供10至15毫升的工作体积和自动化液体处理。与其他刚性搅拌SUB系统不同，Ambr® 15呈立方体形状，除了用于pH和DO测量的光学传感器点、搅拌器和搅拌器轴之外，没有内部结构。Nienow等人已经证明，Ambr® 15优于通常在早期工艺开发或CHO克隆选择中使用的常规摇瓶。他们证明，在Ambr® 15中表达IgG4的CHO细胞系的性能比摇瓶更接近大规模生物反应器。Lonza的数据也显示了Ambr® 15和更大的SU生物反应器中不同mAbs的产品滴度的可比性（见表1.1）。最近，Ambr® 15也被证明用于原代细胞的工艺开发。然而，由于Ambr® 15系统的技术复杂性更高，与其经典的摇瓶或TubeSpin®生物反应器相比，需要更多的努力来保持其运行。 台式搅拌式SUBs，包括AppiFlex ST (Applikon)、BioBLU® 1c、3c、5c和10c (Eppendorf)、Mobius® CellReady 3 L (Merck Millipore)和UniVessel® SU (Sartorius)，与经典的可重复使用搅拌细胞培养生物反应器的设计非常接近。所有哺乳动物版本都配备了一个或两个顶部安装的船用或分段叶片搅拌器，能够实现50-200 W/m³的特定功率输入，这对于常见的基于哺乳动物的过程来说是足够高的。UniVessel® SU是第一个商业化的刚性搅拌SUB，由两级搅拌器搅拌。分段叶片搅拌器(SBI)的三个元件在形状上类似于BioBLU®的“象耳”搅拌器，但它们的叶片角度较低，为30°（而不是45°），这导致功率输入较低。UniVessel® SU在过去已经被广泛研究，以预测流体流动、特定功率输入(0.4–435 W/m³)、混合时间(3–100 s)、氧质量传递(10–50 h⁻¹)和流体动力学应力。科学文献中报道了无数的应用，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和人类原代细胞。另一个被良好描述的搅拌式SUB是Mobius® CellReady 3 L，它在2009年夏天推出。该系统配备了一个船用搅拌器（顶部驱动）、一个微孔分散器或开放式管道分散器和标准传感器。关于Mobius® CellReady 3 L的生化工程参数的详细信息，包括流体流动和流体动力学应力，可以在几篇研究文章和教科书中找到。不同的作者已经表明，在Mobius® CellReady 3 L和3 L玻璃搅拌生物反应器中可以实现类似的细胞密度和抗体滴度。此外，Cierpka等人、Grein等人和Lawson等人已经表明，Mobius® CellReady 3 L和50 L可以成功地用于处理干细胞。由于3D打印技术的进步和生物相容性打印材料（USP VI级材料）的可用性，Applikon推出了AppliFlex ST生物反应器，其顶板和内部部件（包括搅拌器）都是3D打印的。生物反应器的定制为用户提供了新的程度的灵活性，允许调整尖端管/给液管线的大小和位置，以及搅拌器的类型和几何形状。因此，生物反应器可以根据工艺/应用进行设计，而不是相反。然而，由于3D打印的技术限制，生物反应器的最大尺寸目前限于台式规模（~10 L）。Thermo Fisher Scientific (HyPerforma™ S.U.B)和Cytiva (Xcellerex™)的SU搅拌袋系统可用于高达2000 L的哺乳动物细胞培养，并为不锈钢制成的搅拌生物反应器提供了真正的替代品。这两种生物反应器系统都使用圆柱形袋子，其中预先安装了低剪切搅拌器和通常使用的曝气设备，如微孔分散器和开放式管道分散器。这些袋子生物反应器的相关搅拌器（d/D为1:3–1:2）和反应器几何形状（H/D为1:1–2:1）是从它们的钢制对应物复制而来的。两个系统都拥有一个偏心、角向、轴向流动的搅拌器。偏心位置的搅拌器消除了表面的流体涡旋，消除了挡板的需要。XDR生物反应器使用磁力耦合、底部驱动的船用搅拌器运行，S.U.B是顶部驱动的，并包含了一个密封件。XDR和S.U.B系统目前被用于许多使用哺乳动物（例如，CHO、杂交瘤、Vero、婴儿仓鼠肾{BHK}）和昆虫细胞的mAb和疫苗生产过程中。Lonza实现了类似的产品数量（中到高细胞密度和滴度在g/L范围内），此外，对SUBs的微生物版本的的兴趣导致了S.U.F 300和XDR 200 MO的设计。Sartorius的BIOSTAT® STR高达2000 L，尽可能接近现代可重复使用细胞培养生物反应器的经典配置。袋子可以配备一个环状分散器或微孔分散器和两个轴向流动的SBIs，或一个轴向流动的SBI和一个径向流动的圆盘搅拌器的组合。生物反应器中的均匀混合是通过中心搅拌系统实现的。Löffelholz等人进行的实验和数值研究表明，由于其几何相似性导致的可比流体动力学特性，BIOSTAT® STR生物反应器具有可扩展性。他们报告了BIOSTAT® STR 50 L、200 L和1000 L（2 × SBI）的特定功率输入在29–86 W/m³（utip ~ 1.8 m/s）和混合时间在10到200 s之间。Lonza在其位于瑞士Visp的IBEX一次性生产设施中使用BIOSTAT® STR生物反应器。图1.4显示了当使用Lonza的GS Xceed® CHO平台技术时，BIOSTAT® STR生物反应器中的过程可扩展性的一个例子。 图 1.4 不同规模（200 L 中试规模，1000 L 和 2000 L 生产规模）的 BIOSTAT® STR 生物反应器中归一化活细胞密度（VCD）的时间依赖性曲线。数据代表基于 GS Xceed® CHO 平台技术的 Lonza 补料批处理生产过程。 Pall Life Sciences在2018年推出了Allegro™ STR系统，这是一个与经典生物反应器设计不同的生物反应器。Allegro™ STR的培养容器由一个方形袋子组成，有五种不同的规模（Allegro™ 50、200、500、1000、2000 L）。与经典的圆柱形搅拌SUBs不同，Allegro™ STR的支撑容器在袋子的侧面集成了凹槽，充当挡板。底部安装的变桨搅拌器提供了<30 s的混合时间和高达40 h⁻¹的kLa值，搅拌器速度高达105 rpm。Schirmer等人使用IgG产生的CHO细胞系进行的培养研究表明，Allegro™ STR 200 L生物反应器提供了与类似规模的经典搅拌SUB相当的细胞密度（21.5 × 10⁶细胞/mL）和mAb滴度（1.9 g/L）。Thermo Fisher Scientific最近引入了一个基于长方体容器的类似生物反应器概念：HyPerforma™ DynaDrive™ S.U.B系列（50、500、3000、5000 L），它专门设计用于强化过程。由于长方体容器形状和由此产生的H/D比率（2.5:1–2.9:1），高转换比高达10:1和20:1是可能的。与其他具有刚性搅拌器轴的搅拌SUBs不同，DynaDrive™的搅拌器安装在柔性传动系统上。根据生物反应器的大小，使用两个到四个直径为110-490 mm的船用搅拌器，这些搅拌器战略性地扩展了一个柔性绳梯，并在梯子底部使用扫掠搅拌器。关于DynaDrive™系统的生化工程参数和由此产生的流体流动模式的详细信息可以在中找到。总之，DynaDrive™提供了高达80 W/m³的P/V，kLa值在40到>50 h⁻¹之间，混合时间<60 s。Cobia等人证明了DynaDrive™系统（50、500、5000 L）在14天的标准补料批处理中的可扩展性。他们在不同的生物反应器规模上报告了可比的VCDs（~20 × 10⁶细胞/mL）和产品滴度（~3 g/L）（图1.5）。 图 1.5 Thermo Fisher Scientific 的 HyPerforma™ DynaDrive™ 生物反应器。（照片由 Thermo Fisher Scientific 提供） 美国食品药品监督管理局（FDA）的过程分析技术（PAT）倡议要求监测各种过程参数以确保生物制药产品的质量。因此，SUBs必须配备适当的传感器技术。如今，大多数SUBs只配备了基本的仪器（即pH、DO和温度传感器，见表1.2）。这些系统要么直接配备了SU传感器，要么可以使用无菌连接配备传统传感器。一些SUBs还包括内置的电容传感器，允许非侵入性在线测量活细胞体积（VCV）。关于SU传感器及其测量原理的当前状态的更多信息可以在中找到。 当前的趋势集中在引入非侵入性光谱测量技术（例如，紫外/可见光、红外、荧光、拉曼光谱），其中最有趣的是拉曼光谱。包括葡萄糖、乳酸、醋酸、甲酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨在内的几种与生物学相关的分子都是拉曼活性的，如果能够基于适当的过程训练集构建良好的模型，这项技术有潜力测量活细胞密度、总细胞密度和产品浓度。 3.1.4.波浪混合式一次性生物反应器 所有波浪混合生物反应器都使用由多层薄膜制成的2D或3D袋子。袋子通常由聚乙烯制成，接触层通常由乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)制成。袋子内的混合是通过由摇摆平台的摆动运动产生的波诱导混合过程实现的。袋子内部的波特性取决于袋子的几何形状、摇摆角度、摇摆速率、袋子的平移、填充体积和流体特性（即，流体密度和粘度）。过去的各种研究表明，波诱导混合对剪切敏感的悬浮细胞特别有益。Werner等人使用计算流体动力学(CFD)模拟发现，与配备Rushton涡轮和桨叶搅拌器的搅拌细胞培养生物反应器相比，能量耗散和剪切模式更加均匀。由于波动运动，氧气通过袋子内头顶空间的无泡表面曝气进入流体，培养基表面不断更新。大多数可用的波浪混合生物反应器系统的氧气传递速率（由体积氧传递系数kLa描述）及其对培养结果的影响已经进行了研究。波浪混合系统在袋子设计（即，材料、几何形状）、控制机制、安装的传感器类型和平台运动方面有所不同，可以是1D、2D或3D。质量和能量传递的强度，因此细胞生长和产品表达可以直接通过波的产生和传播来控制。然而，要适当控制各种影响参数，需要很好地理解系统。因此，在部署系统之前，使用生化工程方法对系统进行技术表征是有用的。关于波浪混合生物反应器的技术表征的详细信息，包括使用的方法的指南（例如，DECHEMA，BPOG），可以在科学文献中找到。 1D摆动混合概念在生物制药行业中使用最为广泛。1D运动袋子内的流体流动可以通过修改的雷诺数(Remod)来表征，这是Eibl等人在2009年引入的。他们发现，在1D运动袋子中，当Remod > 1000时会发生湍流条件，Remod取决于工作体积、培养袋的长度、液位、摇摆速率、流体的运动粘度和一个经验的袋子依赖常数。与Remod概念相反，Oncül等人引入了无量纲的Womersley数与参数β相结合，以量化流动的非稳态特性。他们发现，在β > 700和Womersley数>8.5时，振荡波浪混合生物反应器中会发生湍流条件。报道的混合时间（4–800 s）和kLa值（5–50 h⁻¹）使1D运动的波浪混合生物反应器适合大多数细胞培养（例如，CHO和BHK细胞），特别是那些对氧气需求低和中等且具有牛顿流体流动特性的。对于1D运动袋子，已经证明增加摇摆角度和摇摆速率比增加曝气速率更有效地增加kLa。当培养好氧微生物时，已经报道了1D运动袋子的氧气传递条件的限制。Hitchcock展示了通过增加薄膜层的形成来增加好氧微生物培养的氧气质量传递，对于涉及高光学细胞密度的细菌人乳头瘤病毒疫苗生产。为此，Hitchcock使用了一个BIOSTAT® RM 50 L袋子，工作体积为5 L。相反，Dreher等人展示了通过使用基于氧气消耗模型的线性进料策略，可以在BIOSTAT® RM 10 L（带5 L工作体积，10°和42 rpm）中实现E. coli BL21的OD600为130。 2D和3D运动袋子系统（例如，CELL-tainer®或Allegro™ XRS，见表1.2）提供了高达73和450 h⁻¹的kLa值。适应的袋子运动增加了湍流和表面更新。因此，这些系统适合对氧气需求高或具有特殊混合要求的培养，例如非牛顿培养基。CELL-tainer®结合了垂直摇摆运动和水平平移，而Allegro™ XRS有一个3D袋子，使用同时的双轴摇摆运动，使流动具有翻滚特性。关于CELL-tainer®生物反应器运动的详细信息，包括生化工程和CFD模拟数据，可以在中找到。Westbrook等人成功地使用CELL-tainer®生物反应器系统培养E. coli BL21并生产重组谷胱甘肽S-转移酶-hCD83ext融合蛋白，取得了与搅拌生物反应器相当的结果。Junne等人通过保持主要的几何特征（角度和板宽之间的比例）展示了CELL-tainer®系统的线性可扩展性，并能够在各个不同的规模（12–120 L）上产生可比的流体特性和剪切应力。 无可争议的是，1D运动的波浪混合生物反应器比2D和3D运动系统得到了更深入的研究，并且在生物制药行业中得到了更广泛的应用。实际上，CFD模拟揭示了层流条件的存在和远低于搅拌细胞培养生物反应器报道的剪切应力水平。这一事实也鼓励了不同的用户使用1D运动袋子进行细胞治疗制造，例如扩展人类间充质干细胞和人类免疫细胞（例如CAR-T或NK细胞）。鉴于此，Sartorius和Cytiva推出了波浪混合生物反应器系统（BIOSTAT® RM TX和Xuri™ Cell Expansion System），这些系统具有特殊袋子设计，用于原代细胞处理。除了这些应用外，1D运动袋子也已证明在基于动物细胞的病毒生产基因治疗、疫苗和病毒样颗粒疫苗的生产过程中是有效的。 3.1.5.轨道摇动式一次性生物反应器 对于静止的、搅拌的、直接曝气的SU生物反应器，工程参数和放大标准通常可以没有任何重大问题地建立，但轨道摇动生物反应器的自由液面使得这一点更加困难。摇瓶（例如Erlenmeyer flasks）可用的不同流动模式工程值无法转移到轨道摇动管（例如TubeSpin®生物反应器15, 50, 450和600）和基于袋子的系统（例如OrbShake™生物反应器）。最被广泛研究的一次性轨道摇动生物反应器系统是OrbShake™生物反应器（Kühner AG），它由一个3D圆柱形SU袋子、一个支撑不锈钢容器和一个外围测量和控制单元组成。OrbShake™系统在台式（Vw 12 L）和生产（Vw 2500 L）规模上都有提供，中间还有两个额外的系统规模（SB50-X和SB200-X）。流体的混合是通过摇动平台的轨道运动实现的。流体动力学受到选定操作条件的高度影响，因为不同的反应器直径、轨道直径、流体高度、旋转摇动速度和流体运动粘度的不同组合创造了不同的流动/涡旋结构，最终控制剪切应力、湍流、曝气、对流、混合和悬浮过程。关于OrbShake™生物反应器的生化工程数据和流体流动动力学的详细信息可以在中找到。Dittler等人报告了SB10-X系统在建立无滴度感染细胞保存和放大（TIPS）过程的成功使用，使用Sf-9细胞和重组杆状病毒Autographa californica multicapsid核多角体病毒，该病毒产生分泌型碱性磷酸酶（rSEAP）。通过使用SB10-X系统和TIPS方法，他们在感染后4天实现了144-158 U/mL的rSEAP活性，与传统的两阶段过程相比节省了2-3天。最近，Coronel等人为SB10-X配备了切向流过滤（TFF）和交替切向流过滤（ATF）设备，以在灌注模式下运行系统（另见“强化和连续设施趋势”部分）并生产人类影响A病毒疫苗。作者证明了在轨道摇动生物反应器中可以实现高达50 × 10⁶细胞/mL的活细胞密度。Anderlei等人报告了SB200-X在100 L工作体积下的kLa值高达45 h⁻¹，并且根据摇动频率（50–70 rpm），混合时间在25到70秒之间。对于SB2500-X，报道了较低的kLa值，范围从~2到25 h⁻¹，取决于工作体积（500–2500 L）和摇动频率（35–55 rpm）。 3.1.6.用于初级回收/澄清的系统 大多数生物制药产品（特别是mAbs）分泌到细胞培养基中。因此，需要一个初级澄清步骤来分离细胞和大的污染物。为此，最常见的分离策略要么是基于过滤，要么是基于离心。在初级澄清之后，执行二次和/或三次澄清，以去除更细小的颗粒和生物负荷。这些步骤可以由一个或多个级别的深层过滤器组成，然后是一个无菌级膜过滤器。Merck Millipore（Millistak+® Pod系统）、3M™（Zeta Plus™）、Sartorius（Sartoclear® L-Drum技术）和Pall（Stax™技术）提供了适用于不同澄清范围的SU过滤器。过滤器由硅藻土、纤维素或全合成纤维（例如聚丙烯腈纤维）、无机过滤助剂组成，在某些情况下，还有带电基团。全合成过滤器（例如Millistak+® HC Pro）在工艺一致性方面提供了优势，并且在使用前需要的冲洗量显著减少。一些过滤器的过滤表面带正电荷，以通过电动力学吸附减少带负电的污染物。吸附性能允许过滤适应范围广泛的细胞培养液。例如，3M™ Emphaze™和Harvest RC是基于AEX的吸附性过滤器，可以大大减少HCCF中的rDNA。总的来说，SU深层过滤器由于其直接放大、模块化设计和完全封闭的过滤片/胶囊的可用性，便于轻松和安全地处理，提供了优势。 SU离心机是整个初级澄清和二次澄清步骤的SU过滤器的替代品，特别是当需要分离大量生物量时（例如，强化的补料批处理或灌注过程）。近年来，新的SU离心机（GEA kytero®, Alfa Laval CultureOne™）已经上市，补充了已经可用的离心机（CARR UniFuge和U2k, Sartorius Ksep®）。Sartorius的Ksep®系统使用具有流化床技术的逆流离心分离细胞和上清液[122]。分离过程包括加载、洗涤和卸缓冲液和细胞的重复周期。该系统有两种不同的尺寸，允许最大流量为114 L/h（Ksep® 400；处理体积10-200 L）和720 L/h（Ksep®6000 s；处理体积50–2000 L）。Saballus等人最近证明了Ksep®系统适用于澄清高细胞密度CHO过程（100 × 10⁶细胞/mL）。通过使用离心后过滤步骤，他们能够将浑浊度从8000降至<5 NTU，同时保持>90%的mAb回收率。其他SU离心机，如CultureOne™或kytero®（见图1.6），基于经典的盘片堆叠技术。在这些系统中，具有更高细胞密度的悬浮液集中在分离碗的外围，而纯化的上清液从中心上部移除。因此，实现了高浓度细胞和清澈上清液的连续排放。这两种SU离心机系统都有两个尺寸；CultureOne™ Primo和kytero® 500建议用于从高达500 L的生物反应器中收集细胞（处理能力高达200 L/h），因此用于中试规模。相比之下，CultureOne™ Maxi和kytero® 2000是为生产规模设计的，可以处理高达2000 L的细胞悬浮液体积（处理能力高达600 L/h）。kytero®系统完全无轴、机械轴承和密封件驱动。旋转的分离碗由磁力技术（breezeDrive®）悬浮。在CultureOne™系统中，过程室由机械密封件与环境隔离。Ott等人最近证明了kytero® 500 SU离心机适用于澄清CHO细胞培养悬浮液（补料批处理，VCDmax = 16.8 × 10⁶细胞/mL）。他们能够在不到2小时内完全分离出200 L SUB中的细胞悬浮液，实现98-99%的mAb回收率和10-15 NTU的浑浊度。 图 1.6 kytero® SU 离心机。（版权所有 GEA AG） 细胞分离的进一步选择包括利用SU声学室的声学分离技术，这些技术可以有效地减少高达2000 L生物反应器规模的浑浊度、颗粒和细胞。宏观尺度的声学分离器使用多维驻波从悬浮液中移除细胞和颗粒。为此，细胞悬浮液通过一个声场移动，在该声场中，物理力保持细胞并将它们聚集在声波的交叉点或节点处形成紧密堆积的群体。一旦达到临界细胞群大小，细胞群就会因重力而开始沉降。Pall的Cadence™ Acoustic Separator就是这样一个系统的示例。 3.2.一次性下游处理 最初主要用于USP的SU系统（见“一次性上游处理”部分），近年来在DSP中也越来越受欢迎。如今，可以使用SU系统执行复杂的步骤，如色谱、离心和TFF。然而，由于过去二十年细胞密度和产品滴度逐渐增加，过程强化已成为DSP中的一个重要方面（见“强化和连续设施趋势”部分）。在DSP中使用SU技术提供了更大的设计灵活性，并在过程变化变得必要时更快地适应。此外，合格和投产过程的准备时间更短，从而减少了变更控制文件的成本和工作量。因此，这对新生物制药产品的上市时间有重大影响。然而，DSP中的SU技术在可扩展性方面仍然有限，因此不支持超过4000 L的生产规模。因此，有一种趋势是向更大的一次性模块发展，这些模块支持更大的生产量或进一步的过程强化。 色谱是生物制药纯化中使用的关键技术。例如，通常进行三个色谱步骤来纯化mAb。第一步，称为捕获色谱，用于从澄清的细胞上清液中分离、浓缩和稳定产品。然后是两个抛光步骤，以进一步耗尽宿主细胞蛋白（HCP）、脱氧核糖核酸（DNA）和高分子重量物质（例如，聚集的产品）。使用一次性柱和SU色谱平台可以实现更快的周转时间，并通过消除清洁过程和验证来提高设施生产率。Cytiva（ÄKTA™ ready SU系统）和Pall（Allegro™ SU色谱系统）提供了SU色谱系统。两个系统都使用完全一次性的流路、预装的传统或SU柱和基于膜的色谱产品。这为多产品设施提供了相当大的灵活性，并从长远来看降低了处理成本。使用预装的一次性柱允许将劳动密集型和技术性很高的装填过程外包。这消除了装柱系统和装柱和清洁所需的缓冲液的需要。然而，预装柱的大小是有限的。Cytiva和Repligen提供了不同树脂和格式的GMP兼容柱。SU膜吸附剂（例如，Sartorius的Sartobind®，Pall的Mustang®）代表了基于柱的色谱的替代品，对于DSP过程强化特别感兴趣（见“强化和连续设施趋势”部分）。 病毒清除至少基于两个正交步骤，如国际人用药品注册技术要求协调会（ICH Q5A指南）所要求。通常，这是通过结合使用低pH病毒灭活步骤和过滤和色谱病毒清除步骤来实现的。为病毒灭活步骤提供了特别设计的SU混合系统。病毒过滤步骤通常使用具有15-20 nm膜截止的过滤胶囊（例如，Planova™，Viresolve®，Virosart®）在专用的SU处理平台上运行（例如，Agilitech、Sartorius、Cytiva、Merck Millipore的SU病毒过滤系统）。 3.3.一次性配方和灌装完成 配方步骤的目的是浓缩并交换产品溶液中的缓冲液，以实现适当的体积减少和缓冲条件。通常使用TFF来实现这一目的。使用TFF，溶液可以预浓缩至理想的浓度进行透析过滤。可以通过透析过滤完成缓冲液交换，并将产品浓缩至最终浓度以进行进一步处理。通常使用5-7的透析过滤体积以实现高达99.9%的缓冲液交换。如今，市场上有各种TFF系统（例如，Pall、Repligen、Merck Millipore、Parker）提供SU流路和带有高膜面积（高达10 m²）的SU卡带。一旦最终配方均匀，就应该对其进行无菌处理和灌装，不影响DP的稳定性或功能性，并尽量减少产品损失。为了满足所有这些要求，需要以下设备：解冻单元、合并或结合单元（例如，疫苗）、混合单元、自动化配方控制和计量单元、过滤单元和最终灌装机。如今，不同的制造商（例如，Meissner、Parker、Pall、Sartorius、Single-Use Support）提供了SU冷冻（例如，Cellsius® Pak, RoSSpFTU）和灌装系统（例如，SciLog® FD, Linkit® AX, Allegro™ SU灌装, RoSS.FILL）。SU灌装线设置的案例研究可以在以下参考文献中找到。 4.趋势加强和持续设施 Konstantinov 和 Cooney 定义了连续单元操作作为流程的一个子单元，在其中存在持续一段时间的连续流动输入和最小的内部保持体积。输出可以是连续的，或者被离散成小批量，然后以循环方式生产。基于这个定义，可以定义两种不同类型的连续过程：(1) 混合连续过程，其中批处理和连续单元操作被结合，以及 (2) 完全集成的单元操作或端到端过程。如今，混合连续过程已经是生物制药生产中的现实，其中可以区分出三种不同的类型：(1) 连续上游后跟批处理下游，(2) 连续上游和捕获与批处理下游，以及 (3) 批处理上游后跟连续下游。第一种类型并不新鲜，几十年来一直用于生产治疗性酶、血液因子和某些单克隆抗体。将这种方法发展到连续捕获步骤代表了重要的改进，解决了与下游过程相关的高成本问题，其中捕获步骤单独占成本的大约 25%。连续捕获方法意味着在澄清步骤之后不再需要大型保持罐，并且理论上可以将 Protein A 柱的尺寸减少两个数量级，这也导致缓冲液使用显著减少。在第三种方法中，细胞培养通常以传统的补料批处理模式进行，而一个或两个下游过程（例如，捕获，抛光）连续运行，这导致更小的连续色谱柱（=成本降低）。 无可争议的是，近年来大量使用单元操作（SU）系统的可用性推动了更加强和连续的单克隆抗体生产过程的发展。这一事实并不令人惊讶，因为现有的 SU 技术促进了加强单元操作的执行。然而，必须区分上游过程（USP）和下游过程（DSP）的加强。上游加强通常需要使用灌注技术，在这种技术中，细胞被保留在生物反应器中，而部分细胞培养基被连续交换。科学文献中报道的灌注过程中最高的细胞密度（VCD）高达 200 × 10^6 细胞/mL。为了以最小的培养基消耗实现如此高的 VCD，Ozturk 提出了使用细胞特异性灌注率（CSPR）来控制灌注过程。CSPR 描述了每天每细胞供应到生物反应器的细胞培养基量，是每细胞营养供应的良好指标。由于在灌注过程中细胞被保留在生物反应器中，因此生物反应器必须配备内部或外部灌注设备以保留细胞（见表 1.3）。选择合适的细胞保留设备是开发灌注过程的重要考虑因素，任何 SU 细胞保留设备都应满足以下特征：(1) 高鲁棒性，(2) 高细胞保留效率且不损伤细胞，(3) 高产品产量，(4) 可扩展性，(5) 低运行成本，以及 (6) 连续收获。细胞保留设备包括内部灌注膜过滤器、TFF 系统、ATF 系统、声波分离器和离心机。除了带有内部灌注膜过滤器的波混生物反应器系统外，所有其他系统均可用于生产规模。波混系统易于使用，因此通常应用于 N-1（即种子阶段）灌注过程。SU 灌注系统的可用性在过去几年中促进了高种子补料批处理生产和浓缩补料批处理过程的发展。除了前面提到的加强过程外，完全连续的灌注过程也非常有趣。这样的过程的目标是实现一个稳态，在这种状态下，生产力和产品质量可以在长时间内仅以最小的偏差维持，同时连续排出废细胞培养基和产品。与 N-1 灌注过程不同，必须定期进行细胞出血以保持必要的恒定 VCD 和高细胞活性。目前，这类过程的目标运行时间范围为 30 至 90 天；过程在稳定条件下运行的时间越长，生物反应器的空间-时间产量就越高。通过使用连续 USP 过程，已报道了 1 g/L/d 的特定生产力 。长时间的运行清楚地表明了对 SU 生物反应器及其内部和外部外围设备在抗性和无菌性方面的高要求。专门设计用于连续灌注过程和加强补料批处理操作的搅拌 SU 生物反应器的一个例子是 Thermo Fisher Scientific 的 HyPerforma™ DynaDrive™ 系列，已在“单次使用生物反应器”部分展示。因为加强 USP 可能导致更高浓度的固体和细胞污染物（例如，HCP，DNA）以及蛋白质聚集体，收获和随后的处理比传统补料批处理过程更加困难。然而，有两种主要的 DSP 加强方法：(1) 增加色谱柱的结合能力或更有效地使用它们，和/或 (2) 通过连续运行每个过程步骤来增加生产力。在单克隆抗体生产的捕获步骤中，通常使用 Protein A，自发现以来已经优化了几次（例如，增加结合能力，提高稳定性）。加强捕获步骤的替代方法是基于执行几个更便宜的色谱步骤而不是使用亲和色谱，或者专门使用阳离子交换色谱进行捕获步骤。其他纯化选项包括沉淀 、目标产品的结晶和两相萃取。捕获和抛光步骤也可以使用膜色谱而不是传统的填充床柱进行。膜色谱允许比填充床柱更高的流速（高达 50 倍）和更低的操作压力。各种制造商（例如，Natrix Separations，Pall，Sartorius）提供 SU 膜胶囊，也可以在结合-洗脱或流过模式下使用。根据 Lim 等人的研究，膜技术比传统填充床柱便宜得多，并且可以节省高达 65% 的成本。然而，膜色谱的缺点是其结合能力低于填充床柱。因此，膜技术目前不广泛用于 DSP 的捕获步骤。Casey 等人提出了在捕获步骤中添加五倍单次通过 TFF（=SPTFF）以减小捕获柱的尺寸。这种方法减少了高达 80% 的树脂和缓冲液使用量，从而显著降低了成本。加强 DSP 的另一种方法是在抛光步骤中使用混合模式色谱。不是依次执行几个色谱步骤，而是使用具有不同亲和力的几个组分作为色谱柱的固定相。 如上所述，过程加强的最终目标是创建一个端到端的过程。这包括使用多柱或逆流色谱的连续捕获步骤。在多柱技术中，几个柱子并行连接并循环操作。因此，只需较小的柱子尺寸。此外，这种方法消除了生产生物反应器后的保持步骤，并减少了使用的树脂和缓冲液量。目前，Merck Millipore（Mobius® Multi Column Capture System）和 Sartorius（Resolute® BIOSMB platform）提供了符合良好生产规范（GMP）的多柱色谱系统，具有完整的单次使用（SU）流路。这两个系统都可以用于捕获步骤的结合-洗脱模式，以及抛光的流过模式（例如，离子交换、疏水或混合模式色谱）。通过结合杂质而不是目标产品，实现了连续操作。一旦柱子完全被杂质加载，杂质突破发生，必须更换柱子。然而，这并不代表真正的连续操作模式，因此被称为伪连续。如前所述，在DSP期间需要执行病毒灭活和病毒过滤步骤。连续病毒灭活有两种方法：(1) 适应经典方法，使用两个交替操作的SU混合器（例如，Pall的Cadence™ Virus Inactivation system）和 (2) 实施一个 plug-flow 反应器，在反应器入口处向产品流中添加酸。在后一种情况下，产品在 plug-flow 反应器中的停留时间保持低pH值，然后在出口处通过添加碱进行中和。连续病毒过滤是使用多过滤器概念进行的，其中两个单独的过滤器并行连接。一旦一个过滤器达到其容量（例如，由于压力限制），系统自动切换到另一个过滤器，以便第一个过滤器可以无菌更换。单克隆抗体的配方通常需要几个TFF步骤，在这些步骤中，产品首先通过超滤浓缩，通过透析转移到适当的缓冲系统，并在第二步超滤中达到最终浓度。因此，这些过程通常不是连续步骤。SPTFF可以用于蛋白质浓缩和透析的连续处理。为此，可以通过增加膜面积和降低流速来增加过滤时间，以至于一个连续的过滤步骤就足够了。 5.总结和结论 SU系统已成为生物制药生产过程中不可或缺的一部分。大多数（约80%）用于研发以及临床前和临床样本生产。它们的特点是高度模块化、灵活性和安全性，以及节省成本的潜力。SU系统已变得重要，特别是对于合同制造组织生产治疗性蛋白如单克隆抗体及其生物仿制药，以及在Covid 19大流行中活跃的疫苗制造商。它们可以在整个生产过程中找到，从上游到填充和完成。尽管与大流行相关的SU系统耗材供应短缺，但预计SU系统的增长将继续。事实上，预计到2030年，全球SU过程市场将以每年16.6%的复合增长率增长。已经批准和正在开发中的细胞和基因治疗产品将有助于这一增长。当前的趋势是基于SU技术的加强和连续过程，其中实施了灌注，并在更短的时间内或更小的设施中实现了目标产品滴度和数量。SU系统制造商近年来开发的改进（例如，新的膜材料，系统更易于操作）和创新（例如，用于超高细胞密度过程的混合器和生物反应器，特殊灌注系统）为这一趋势做出了决定性贡献。然而，目前市场上许多现有系统并未完全适合此目的。需要更均匀的改进聚合物，允许更具创新性的设计；SU传感器需要提供更好的长期稳定性；需要在管道和连接器技术方面进行进一步创新；最终，SU产品需要更具成本效益。然而，后者也可能是SU系统新生产商的机会，可以促进这些系统在生物制药行业之外（例如，化妆品和食品工业）的日益实施。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

-- Strong Cash Position of $306 Million; 9th Consecutive Quarter of Positive or Neutral Cash Balance ---- Total Net Revenue of $42 Million Represents Continued Source of Cash from the U.S., RoW Partnerships and Early Phases of European Launches ---- Positive European Momentum Continues with Progress from Pricing & Reimbursement Efforts and Incremental Revenue Growth Driven Primarily by Spain and the UK ---- Company to Host Virtual Analyst & Investor Day November 14 ---- Company Remains Committed to Maintaining Public Listing – DUBLIN and BRIDGEWATER, N.J., Oct. 30, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Amarin Corporation plc (NASDAQ: AMRN), today reported financial results for the third quarter ended September 30, 2024, and provided a business update. At Amarin, the company’s product -- VASCEPA®/VAZKEPA® (icosapent ethyl) -- has significant growth and value potential globally. This continues to be validated by progress around the world. During the quarter, VAZKEPA sales grew 19% sequentially in Europe, driven primarily by Spain and the UK. Notably, in Italy, the Company has taken additional steps with the Italian authorities and hopes to be in a position to share news soon. In the U.S., the Company has maintained +50% share of the IPE market through the third quarter. As a result, the U.S. business has continued to generate significant cash representing +$300M consistently over the last nine quarters, all in the face of ongoing generic competition. Additionally, the Company continues to assess the potential optimal timing for an authorized generic launch. Commenting on the Company and its third quarter results, Aaron Berg, Amarin’s President and CEO stated, “While we and our global partners continue to execute on our multipronged global strategy focused on getting VASCEPA/VAZKEPA into the hands of as many patients as possible, the senior leadership team and I, as well as the Board of Directors, remain committed to evaluating all opportunities to maximize the value and impact of this highly impactful product. To that end, we look forward to highlighting the global opportunity for VASCEPA/VAZKEPA and to hear directly from both prescribers and select partners from around the world on the impact of VASCEPA/VAZKEPA during our upcoming virtual Analyst and Investor Day on November 14.” Continuing, Berg said, “We remain fully committed to our public listing – it is very important for us as well as our shareholders. In addition to continuing to drive the business, there are a number of paths available to us to resolve the issue.” Third Quarter Operational Highlights Amarin continued to advance pricing and reimbursement efforts across additional European and Rest of World (RoW) markets, including: In Italy, realized further progress with the pricing and reimbursement authorities, and the Company hopes to be able to share further updates soon.In Portugal, secured national reimbursement for VAZKEPA.In Australia, in collaboration with our partner CSL Seqirus, secured national reimbursement for VAZKEPA in Australia, where CSL is now launching the product. Investigators presented new subgroup data from the landmark REDUCE-IT® cardiovascular outcomes trial with VASCEPA/VAZKEPA, as well as abstracts showcasing the mechanistic activity of eicosapentaenoic acid (EPA) at the European Society of Cardiology (ESC) Congress.Investigators presented new research on the clinical impact of VASCEPA/VAZKEPA in patients with diabetes and high cardiovascular risk and the anti-Lp(a) oxidation mechanistic effects of eicosapentaenoic acid (EPA) at the 60th Annual European Association for the Study of Diabetes (EASD) Meeting. Financial Update Financial Highlights ($ in millions)Three months ended September 30, 2024Three months ended September 30, 2023% ChangeTotal Net Revenue$42.3$66.1-36%Operating Expenses1$41.4$50.5-18%Cash$305.7$320.7-5% 1 – Excludes restructuring expense of $0.7 million in the 3 months ended September 30, 2023 Total net revenue for the three months ended September 30, 2024 was $42.3 million, compared to $66.1 million in the corresponding period of 2023, a decrease of 36%. Net product revenue for the three months ended September 30, 2024 was $41.9 million, compared to $64.9 million in the corresponding period of 2023, a decrease of 36%. This decrease was driven primarily by an impact in net selling price due to US generic competition as well as a decrease in volume primarily related to CVS moving from an exclusive account to no longer covering VASCEPA. U.S. net product revenue was $30.6 million for the three months ended September 30, 2024 compared to $62.4 million in the corresponding period of 2023. For the three months ended September 30, 2024, European net product revenue was $4.3 million and Rest of World (RoW) net product revenue was $6.9 million, compared to $0.8 million and $1.8 million, respectively in the corresponding period in 2023. Cost of goods sold for the three months ended September 30, 2024 was $26.0 million, compared to $36.2 million in the corresponding period of 2023. Overall gross margin on net product revenue for the three months ended September 30, 2024 and 2023 was 38% and 44%, respectively. Excluding the inventory restructuring charge in Q3 2023 gross margin was 64%. Selling, general and administrative expenses for the three months ended September 30, 2024 was $36.9 million, compared to $45.5 million in the corresponding period of 2023. This decrease was primarily due to cost optimization efforts across the business. Research and development expenses for the three months ended September 30, 2024 were $4.5 million, compared to $5.1 million in the corresponding period of 2023. Under U.S. GAAP, the Company reported net loss of $25.1 million for the three months ended September 30, 2024, or basic and diluted loss per share of $0.06. This net loss includes $4.7 million in non-cash stock-based compensation. For the three months ended September 30, 2023, the Company reported net loss of $19.3 million, or basic and diluted loss per share of $0.05. This net loss included $4.6 million in non-cash stock-based compensation expense. Excluding non-cash stock-based compensation expense and restructuring expense, non-GAAP adjusted net loss was $20.4 million for the three months ended September 30, 2024 or non-GAAP adjusted basic and diluted loss per share of $0.05, compared with non-GAAP adjusted net loss of $1.3 million for the three months ended September 30, 2023 or non-GAAP adjusted basic and diluted loss per share of $0.00. As of September 30, 2024, the Company reported aggregate cash and investments of $305.7 million, which includes receipt of the $15 million EDDING CVRR milestone payment in the quarter, compared to aggregate cash and investment of $306.7 million as of June 30, 2024. 2024 Financial Outlook The Company is committed to executing against the significant opportunity in Europe. The Company is focused on maintaining market share in the U.S. and maximizing cash generation from the attractive and growing Rest of World (RoW) income stream. The Company continues to make progress on reducing operating expenses and managing its cash position, including $10 million of operating expense savings in the third quarter of 2024 compared to the third quarter of 2023. The Company reaffirms its belief that current cash and investments and other assets are adequate to support continuing operations for the foreseeable future. Virtual Analyst & Investor Day 2024 – November 14 Amarin will host a virtual analyst and investor day on Thursday, November 14, 2024, from 8:00 AM EST to 10:00 AM EST. The event will be hosted by members of the Amarin senior management team and will focus on updating the investment community on the current state of the VASCEPA/VAZKEPA franchise, with particular attention given to discussions on the dynamics of key geographies that represent the future value of the franchise, including Europe. In addition, a dedicated question and answer session will be held during which the Amarin senior management team will entertain questions submitted in advance to investor.relations@amarincorp.com. As a virtual event, the program will be webcast and archived for future reference and will be open to all participants; participation will require a simple registration step before joining, which will be available through the Company website prior to this event. Throughout the event, there will be no live interaction with audience participants. Q3 2024 Earnings Conference Call and Webcast Information Amarin will host a conference call on October 30, 2024, at 5:00 p.m. ET to discuss this information. The conference call can be accessed on the investor relations section of the company's website at www.amarincorp.com, or via telephone by dialing 888-506-0062 within the United States, 973-528-0011 from outside the United States, and referencing conference ID 732244. A replay of the call will be made available for a period of two weeks following the conference call. To listen to a replay of the call, dial 877-481-4010 from within the United States and 919-882-2331 from outside of the United States, and reference conference ID 51361. A replay of the call will also be available through the company's website shortly after the call. About AmarinAmarin is an innovative pharmaceutical company leading a new paradigm in cardiovascular disease management. We are committed to increasing the scientific understanding of the cardiovascular risk that persists beyond traditional therapies and advancing the treatment of that risk for patients worldwide. Amarin has offices in Bridgewater, New Jersey in the United States, Dublin in Ireland, Zug in Switzerland, and other countries in Europe as well as commercial partners and suppliers around the world. About VASCEPA®/VAZKEPA® (icosapent ethyl) Capsules VASCEPA (icosapent ethyl) capsules are the first prescription treatment approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) comprised solely of the active ingredient, icosapent ethyl (IPE), a unique form of eicosapentaenoic acid. VASCEPA was launched in the United States in January 2020 as the first drug approved by the U.S. FDA for the treatment of high-risk patients with persistent cardiovascular risk despite being on statin therapy. VASCEPA was initially launched in the United States in 2013 based on the drug’s initial FDA approved indication for use as an adjunct therapy to diet to reduce triglyceride levels in adult patients with severe (≥500 mg/dL) hypertriglyceridemia. Since launch, VASCEPA has been prescribed more than twenty-five million times. VASCEPA is covered by most major medical insurance plans. In addition to the United States, VASCEPA is approved and sold in Canada, China, Australia, Lebanon, the United Arab Emirates, Kuwait, Saudi Arabia, Qatar and Bahrain. In Europe, in March 2021 marketing authorization was granted via a centralized procedure for icosapent ethyl in the European Union for the reduction of risk of cardiovascular events in patients at high cardiovascular risk, under the brand name VAZKEPA. VAZKEPA (icosapent ethyl) is currently sold in Europe in Sweden, Finland, Austria, the UK (including England, Wales & Scotland and Northern Ireland), Spain, Portugal, Greece and the Netherlands. In April 2021 marketing authorization for VAZKEPA (icosapent ethyl) was granted in Great Britain (applying to England, Scotland, Wales and Northern Ireland). United States Indications and Limitation of Use VASCEPA is indicated: As an adjunct to maximally tolerated statin therapy to reduce the risk of myocardial infarction, stroke, coronary revascularization and unstable angina requiring hospitalization in adult patients with elevated triglyceride (TG) levels (≥ 150 mg/dL) and established cardiovascular disease or diabetes mellitus and two or more additional risk factors for cardiovascular disease. As an adjunct to diet to reduce TG levels in adult patients with severe (≥ 500 mg/dL) hypertriglyceridemia. The effect of VASCEPA on the risk for pancreatitis in patients with severe hypertriglyceridemia has not been determined. Important Safety Information VASCEPA is contraindicated in patients with known hypersensitivity (e.g., anaphylactic reaction) to VASCEPA or any of its components. VASCEPA was associated with an increased risk (3% vs 2%) of atrial fibrillation or atrial flutter requiring hospitalization in a double-blind, placebo-controlled trial. The incidence of atrial fibrillation was greater in patients with a previous history of atrial fibrillation or atrial flutter. It is not known whether patients with allergies to fish and/or shellfish are at an increased risk of an allergic reaction to VASCEPA. Patients with such allergies should discontinue VASCEPA if any reactions occur. VASCEPA was associated with an increased risk (12% vs 10%) of bleeding in a double-blind, placebo-controlled trial. The incidence of bleeding was greater in patients receiving concomitant antithrombotic medications, such as aspirin, clopidogrel or warfarin. Common adverse reactions in the cardiovascular outcomes trial (incidence ≥3% and ≥1% more frequent than placebo): musculoskeletal pain (4% vs 3%), peripheral edema (7% vs 5%), constipation (5% vs 4%), gout (4% vs 3%), and atrial fibrillation (5% vs 4%). Common adverse reactions in the hypertriglyceridemia trials (incidence >1% more frequent than placebo): arthralgia (2% vs 1%) and oropharyngeal pain (1% vs 0.3%). Adverse events may be reported by calling 1-855-VASCEPA or the FDA at 1-800-FDA-1088. Patients receiving VASCEPA and concomitant anticoagulants and/or anti-platelet agents should be monitored for bleeding. FULL U.S. FDA-APPROVED VASCEPA PRESCRIBING INFORMATION CAN BE FOUND AT WWW.VASCEPA.COM. Europe For further information about the Summary of Product Characteristics (SmPC) for VAZKEPA® in Europe, please visit: https://www.medicines.org.uk/emc/product/12964/smpc. Globally, prescribing information varies; refer to the individual country product label for complete information. Use of Non-GAAP Adjusted Financial Information Included in this press release are non-GAAP adjusted financial information as defined by U.S. Securities and Exchange Commission Regulation G. The GAAP financial measure most directly comparable to each non-GAAP adjusted financial measure used or discussed, and a reconciliation of the differences between each non-GAAP adjusted financial measure and the comparable GAAP financial measure, is included in this press release after the condensed consolidated financial statements. Non-GAAP adjusted net (loss) income was derived by taking GAAP net loss and adjusting it for non-cash stock-based compensation expense, restructuring expense and other one-time expenses. Management uses these non-GAAP adjusted financial measures for internal reporting and forecasting purposes, when publicly providing its business outlook, to evaluate the company’s performance and to evaluate and compensate the company’s executives. The company has provided these non-GAAP financial measures in addition to GAAP financial results because it believes that these non-GAAP adjusted financial measures provide investors with a better understanding of the company’s historical results from its core business operations. While management believes that these non-GAAP adjusted financial measures provide useful supplemental information to investors regarding the underlying performance of the company’s business operations, investors are reminded to consider these non-GAAP measures in addition to, and not as a substitute for, financial performance measures prepared in accordance with GAAP. Non-GAAP measures have limitations in that they do not reflect all of the amounts associated with the company’s results of operations as determined in accordance with GAAP. In addition, it should be noted that these non-GAAP financial measures may be different from non-GAAP measures used by other companies, and management may utilize other measures to illustrate performance in the future. Forward-Looking StatementsThis press release contains forward-looking statements which are made pursuant to the safe harbor provisions of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995, including beliefs about Amarin’s key achievements in 2023 and the potential impact and outlook for achievements in 2024 and beyond; Amarin’s 2024 financial outlook and cash position; Amarin’s overall efforts to expand access and reimbursement to VAZKEPA across global markets; and the overall potential and future success of VASCEPA/VAZKEPA and Amarin generally. These forward-looking statements are not promises or guarantees and involve substantial risks and uncertainties. A further list and description of these risks, uncertainties and other risks associated with an investment in Amarin can be found in Amarin's filings with the U.S. Securities and Exchange Commission, including Amarin’s quarterly report on Form 10-Q for the period ending September 30, 2024 and annual report on Form 10-K for the full year ended 2023. Existing and prospective investors are cautioned not to place undue reliance on these forward-looking statements, which speak only as of the date they are made. Amarin undertakes no obligation to update or revise the information contained in its forward-looking statements, whether as a result of new information, future events or circumstances or otherwise. Amarin’s forward-looking statements do not reflect the potential impact of significant transactions the company may enter into, such as mergers, acquisitions, dispositions, joint ventures or any material agreements that Amarin may enter into, amend or terminate. Availability of Other Information About AmarinInvestors and others should note that Amarin communicates with its investors and the public using the company website (www.amarincorp.com), the investor relations website (www.amarincorp.com/investor-relations), including but not limited to investor presentations and investor FAQs, U.S. Securities and Exchange Commission filings, press releases, public conference calls and webcasts. The information that Amarin posts on these channels and websites could be deemed to be material information. As a result, Amarin encourages investors, the media, and others interested in Amarin to review the information that is posted on these channels, including the investor relations website, on a regular basis. This list of channels may be updated from time to time on Amarin’s investor relations website and may include social media channels. The contents of Amarin’s website or these channels, or any other website that may be accessed from its website or these channels, shall not be deemed incorporated by reference in any filing under the Securities Act of 1933. Amarin Contact InformationInvestor & Media Inquiries: Mark Marmur Amarin Corporation plc PR@amarincorp.com -Tables to Follow- CONSOLIDATED BALANCE SHEET DATA (U.S. GAAP) Unaudited September 30, 2024 December 31, 2023 (in thousands) ASSETS Current Assets: Cash and cash equivalents $156,944 $199,252 Restricted cash 526 525 Short-term investments 148,788 121,407 Accounts receivable, net 112,642 133,563 Inventory 224,000 258,616 Prepaid and other current assets 7,316 11,618 Total current assets 650,216 724,981 Property, plant and equipment, net 24 114 Long-term inventory 74,023 77,615 Operating lease right-of-use asset 7,984 8,310 Other long-term assets 1,250 1,360 Intangible asset, net 17,118 19,304 TOTAL ASSETS $750,615 $831,684 LIABILITIES AND STOCKHOLDERS’ EQUITY Current Liabilities: Accounts payable $40,507 $52,762 Accrued expenses and other current liabilities 161,047 204,174 Current deferred revenue — 2,341 Total current liabilities 201,554 259,277 Long-Term Liabilities: Long-term deferred revenue — 2,509 Long-term operating lease liability 8,215 8,737 Other long-term liabilities 9,471 9,064 Total liabilities 219,240 279,587 Stockholders’ Equity: Common stock 305,202 302,756 Additional paid-in capital 1,911,445 1,899,456 Treasury stock (65,344) (63,752) Accumulated deficit (1,619,928) (1,586,363) Total stockholders’ equity 531,375 552,097 TOTAL LIABILITIES AND STOCKHOLDERS’ EQUITY $750,615 $831,684 CONSOLIDATED STATEMENTS OF OPERATIONS DATA (U.S. GAAP) Unaudited Three months ended September 30, Nine months ended September 30, (in thousands, except per share amounts) (in thousands, except per share amounts) 2024 2023 2024 2023 Product revenue, net$41,852 $64,903 $144,522 $214,744 Licensing and royalty revenue 446 1,153 21,786 17,454 Total revenue, net 42,298 66,056 166,308 232,198 Less: Cost of goods sold 26,022 23,560 75,359 72,553 Less: Cost of goods sold - restructuring inventory — 12,674 — 39,228 Gross margin 16,276 29,822 90,949 120,417 Operating expenses: Selling, general and administrative (1) 36,904 45,457 115,340 155,997 Research and development (1) 4,540 5,105 14,884 16,428 Restructuring — 711 — 10,743 Total operating expenses 41,444 51,273 130,224 183,168 Operating loss (25,168) (21,451) (39,275) (62,751) Interest income, net 3,374 3,216 10,028 8,438 Other income (expense), net 265 (575) 1,954 3,092 Loss from operations before taxes (21,529) (18,810) (27,293) (51,221) Provision for income taxes (3,605) (501) (6,272) (2,110) Net loss$(25,134) $(19,311) $(33,565) $(53,331) Loss per share: Basic$(0.06) $(0.05) $(0.08) $(0.13) Diluted$(0.06) $(0.05) $(0.08) $(0.13) Weighted average shares: Basic 411,150 408,417 410,786 407,489 Diluted 411,150 408,417 410,786 407,489 (1) - Excluding non-cash stock-based compensation, selling, general and administrative expenses were $33,075 and $41,807 for the three months ended September 30, 2024 and 2023, respectively, and research and development expenses were $3,671 and $4,113, respectively, for the same periods. RECONCILIATION OF NON-GAAP NET INCOME (LOSS) Unaudited Three months ended September 30, Nine months ended September 30, (in thousands, except per share amounts) (in thousands, except per share amounts) 2024 2023 2024 2023 Net loss for EPS1 - GAAP (25,134) (19,311) (33,565) (53,331) Stock-based compensation expense 4,698 4,643 14,303 12,034 Restructuring inventory — 12,674 — 39,228 Restructuring expense — 711 — 10,743 Advisor fees — — — 6,270 Net (loss) income for EPS1 - non-GAAP $(20,436) $(1,283) $(19,262) $14,944 1basic and diluted (Loss) earnings per share: Basic - non-GAAP $(0.05) $(0.00) $(0.05) $0.04 Diluted - non-GAAP $(0.05) $(0.00) $(0.05) $0.04 Weighted average shares: Basic 411,150 408,417 410,786 407,489 Diluted 411,150 408,417 410,786 417,117