Teclistamab

Iberdomide联合方案治疗复发/难治多发性骨髓瘤：III期MRD终点阳性，PDUFA日期临近 作者：健幸之目 ⚠️ 免责声明：本文全部医药内容仅作学术科普交流，不构成任何诊疗建议。Iberdomide属于尚未正式获批上市的在研药物，临床用药务必遵从血液科专科医生面诊指导，请勿自行参考本文开展治疗。 2025年9月23日，百时美施贵宝（BMS）公布EXCALIBER‑RRMM（NCT04975997）III期研究的中期分析结果：Iberdomide联合达雷妥尤单抗及地塞米松（IberDd方案）用于复发/难治多发性骨髓瘤（RRMM）患者，微小残留病（MRD）阴性率相较于标准DVd方案实现统计学显著改善。基于该项中期结果，BMS已经向美国FDA提交上市申请，PDUFA目标行动日期为2026年8月17日。 该阳性结果让Iberdomide成为FDA 2026年1月MRD终点指导文件发布之后，首批进入审评流程的CELMoD类药物，具备监管示范价值。国内方面，CDE于2025年12月受理该品种上市申请，并在2026年2月将其纳入优先审评。目前公开信息仅限于MRD终点统计学阳性结论，试验组与对照组MRD阴性率具体数值、客观缓解率、完全缓解率、PFS风险比以及完整安全性数据均未经过期刊或学术大会同行评议正式披露。PFS作为另一项主要终点，数据尚未成熟，试验仍在持续随访。围绕Iberdomide的真实临床价值，仍有六项关键问题有待后续数据解答。 一、EXCALIBER‑RRMM试验设计与入组特征 EXCALIBER‑RRMM是一项国际多中心、随机、开放标签III期注册试验，分为两个阶段。 第一阶段为剂量优化，纳入约200例受试者，对比Iberdomide 1.0 mg、1.3 mg与1.6 mg每日一次给药方案（d1‑21，28天为一个治疗周期）的安全性与初步疗效，最终确定1.0 mg为推荐治疗剂量。 第二阶段为随机对照研究，合计约664例受试者按照1:1比例分组。试验组采用Iberdomide 1.0 mg口服联合达雷妥尤单抗、地塞米松的IberDd方案；对照组使用达雷妥尤单抗联合硼替佐米、地塞米松的DVd标准方案。 入组受试者既往接受1‑2线系统治疗后出现疾病进展，ECOG体能状态0‑2分，既往至少一线治疗能够达到部分缓解及以上疗效。排除既往使用过CELMoD类药物、2级及以上伴随疼痛的周围神经病变，以及对硼替佐米或者抗CD38单抗产生耐药的患者。第二阶段随机队列当中，仅有大约10%受试者既往接受过抗CD38单抗治疗。 分层变量包含既往治疗线数、年龄、ISS疾病分期。 终点设置： 双主要终点：①MRD阴性率，仅评估达到CR/sCR的受试者，采用NGS手段检测，检测灵敏度10⁻⁵–10⁻⁶，遵循IMWG评判标准；②无进展生存期PFS。 次要终点：客观缓解率、完全缓解率、缓解持续时间、总生存期、至下一次治疗时间、安全性以及患者报告结局。 试验采用分层检验策略，MRD阴性率作为支持加速批准的替代终点，PFS用于确证临床生存获益。两个终点均需达到预设统计学标准，方可支撑完整上市批准。现阶段仅MRD中期终点取得阳性结果，PFS数据还在持续积累。 二、监管背景：MRD作为加速批准终点的里程碑意义 EXCALIBER‑RRMM处于多发性骨髓瘤药物监管规则迭代的关键节点。 2024年4月，FDA肿瘤药物咨询委员会ODAC以12:0全票认可，MRD阴性率可以作为多发性骨髓瘤药物加速批准的替代终点。2026年1月20日，FDA正式发布行业指导草案，明确在取得完全缓解的患者群体中，流式或者NGS测得的MRD阴性结果，可作为加速批准的主要终点。 监管思路转变的背景是，当前复发难治骨髓瘤整体客观缓解率普遍达到60%‑70%，新诊断患者缓解率接近90%，单纯依靠缓解率作为主要终点，需要极大样本量才可以观测到组间差异。MRD作为深度缓解指标，可以在更早时间点捕捉疗效信号。基于MRD取得的加速批准属于附条件批准，申办企业后续仍需PFS或者OS数据证实药物真实临床获益。 Iberdomide的NDA申报，正是这份指导文件落地之后首批审评实践案例。FDA在2026年2月17日正式受理申报，同步授予突破性疗法认定以及优先审评资格，并通过Project Orbis项目开展多国同步审评。中国CDE于2025年12月27日受理Iberdomide胶囊上市申请，适应症为既往至少接受过一线治疗的多发性骨髓瘤成人患者，2026年2月纳入优先审评。若审评顺利，该药物有望2026年下半年实现中美同步获批。 三、作用机制：从IMiD到CELMoD的分子进化 Iberdomide（CC‑220）属于Cereblon E3连接酶调节剂（CELMoD），作用靶点为CRBN E3泛素连接酶复合体。理解其定位，需区分传统IMiD与新一代CELMoD的分子差异。 来那度胺、泊马度胺这类传统免疫调节剂同样结合CRBN蛋白。CELMoD和CRBN的结合亲和力更高，能够更加高效诱导蛋白构象改变，招募并且泛素化降解Ikaros（IKZF1）、Aiolos（IKZF3）两种转录因子，二者是骨髓瘤肿瘤细胞存活增殖的关键分子。 体外数据表明，同等摩尔浓度条件下，Iberdomide对于靶蛋白的降解能力优于泊马度胺，同时可以激活CD8⁺T细胞与NK细胞，重塑肿瘤局部免疫微环境。该药物对于一部分IMiD耐药人群，尤其是非CRBN通路依赖的耐药患者，依旧保留一定治疗活性。对于已经出现CRBN表达下调、IKZF3 Q147H突变的患者，CELMoD同样很难起效。 分子胶药物普遍存在底物选择性问题，早期化合物容易造成CK1α等非目标蛋白降解。后续开发的第二代CELMoD，例如mezigdomide，已经将CK1α脱靶降解比例由80%下降至5%以内。Iberdomide属于第一代CELMoD分子，脱靶谱仍需长期随访验证。 给药形式为每日口服，不需要静脉输注，在长期维持治疗中具备给药便利性优势。 四、早期临床数据参考与安全性特征 III期完整数据公布前，I/II期CC‑220‑MM‑001试验（NCT02773030）的结果可供参考。 Iberdomide联合地塞米松用于多线治疗失败的复发难治骨髓瘤，客观缓解率26.2%，临床获益率36.4%，中位PFS 2.4‑3个月，中位总生存期11.2个月。3‑4级不良事件集中在血液毒性：中性粒细胞减少45%，贫血28%，感染发生率27%，血小板减少22%。 Iberdomide联合达雷妥尤单抗、地塞米松方案的早期队列数据显示，客观缓解率约35%‑41%；3‑4级治疗相关不良事件主要为中性粒细胞减少50%，白细胞减少22%，贫血22%。 以上数据提示Iberdomide单药抗肿瘤活性有限，临床价值更多体现在联合CD38单抗、蛋白酶体抑制剂的组合方案中。安全性特征以骨髓抑制为核心，整体毒性谱系和IMiD药物相近，但各类不良反应的发生率、严重程度存在差异。EXCALIBER‑RRMM研究官方披露IberDd方案安全性和既往研究保持一致，但完整的3‑4级不良事件统计、严重感染、周围神经病变发生率以及治疗停药率，仍有待正式文献公布。 五、横向对比：RRMM治疗格局中的定位 DVd方案基于CASTOR研究数据，采用皮下或者静脉制剂搭配口服药物，注册研究中MRD阴性率约30%‑40%，主要短板来自硼替佐米带来的周围神经毒性，患者需频繁前往医院完成输液。 IberDd组合由口服小分子叠加单抗输注构成，III期中期分析证实MRD阴性率优于DVd方案，但绝对数值待公布，PFS终点尚未读出，完整安全性数据缺失。口服给药是这套方案的便利性优势。 BCMA双特异性抗体（teclistamab、elranatamab）皮下或静脉给药，可实现较高比例MRD转阴，但存在细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征风险，用药需院内监测并执行剂量爬坡。 BCMA CAR‑T细胞治疗可达到最高水平MRD转阴，但费用高昂，制备周期长，国内可开展治疗的中心有限，且存在迟发性感染风险。 对于1‑2线复发骨髓瘤人群，若后续PFS终点阳性，IberDd有望成为DVd方案的替代性选择。口服给药模式能够改善患者就医体验，但骨髓抑制毒性替换硼替佐米的神经毒性，获益风险需结合患者个体情况评估。若PFS未达预期，仅凭MRD替代终点难以支撑广泛临床应用。 血液肿瘤领域已有先例，部分新药可提升MRD转阴比例，却未转化为PFS、OS生存获益。Iberdomide的最终临床定位，完全取决于EXCALIBER‑RRMM后续PFS的读出结果。 六、待揭晓的关键信息 在监管机构做出最终审评结论、临床指南更新之前，还有多项核心问题需要完整试验数据予以解答。需要明确MRD阴性率的绝对数值，试验组与对照组具体百分比，以及t(4;14)、del(17p)等高风险细胞遗传学亚组的分层获益差异；同时需要拿到sCR、CR、VGPR缓解占比分布，以及肿瘤缓解出现的时间动力学特征。 PFS最终分析的风险比HR与中位PFS数值，是评判这款药物临床价值最核心指标。安全性层面，3‑4级中性粒细胞减少、血小板减少、机会性感染、胃肠道不良反应、皮疹以及治疗停药率都需要完整披露。即便总生存期数据尚未成熟，其中期趋势信号依旧具备临床参考意义。而EORTC QLQ‑C30/My20生活质量量表结果，也将帮助业界客观评估口服方案带给患者的实际获益。 综合来看，Iberdomide代表新一代CELMoD药物的重要突破，但是现阶段一切判断都建立在中期MRD替代终点之上，最终临床价值仍要等待硬终点数据落地。 参考文献 1. Bristol Myers Squibb. Phase 3 EXCALIBER‑RRMM study demonstrated statistically significant improvement in MRD negativity rates. News release. September 23, 2025. 2. ClinicalTrials.gov. NCT04975997: A study of iberdomide in combination with daratumumab and dexamethasone in participants with RRMM (EXCALIBER‑RRMM). 3. Lonial S, et al. EXCALIBER‑RRMM: a phase III trial of iberdomide, daratumumab, and dexamethasone in relapsed/refractory multiple myeloma. Future Oncol. 2025;21(14):1761‑1769. 4. Lonial S, Popat R, Hulin C, et al. Iberdomide plus dexamethasone in heavily pretreated late‑line relapsed or refractory multiple myeloma (CC‑220‑MM‑001): a multicentre, multicohort, open‑label, phase 1/2 trial. Lancet Haematol. 2022;9(11):e822‑e832. 5. U.S. Food and Drug Administration. Minimal residual disease and complete response in multiple myeloma: use as endpoints to support accelerated approval. Draft guidance for industry. January 20, 2026. 6. U.S. Food and Drug Administration accepts Bristol Myers Squibb's new drug application for iberdomide in RRMM. News release. BMS. February 17, 2026. 7. Sonneveld P, Chanan‑Khan A, Weisel K, et al. Overall survival with daratumumab, bortezomib, and dexamethasone in previously treated multiple myeloma (CASTOR). J Clin Oncol. 2023;41(8):1600‑1609. 8. Kumar S, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17(8):e328‑e346. 搜索关键词：Iberdomide、CELMoD、复发难治多发性骨髓瘤、EXCALIBER‑RRMM、MRD阴性率、达雷妥尤单抗、微小残留病、BMS、PDUFA 2026 话题标签：#多发性骨髓瘤 #Iberdomide #CELMoD #MRD #血液肿瘤 #新药研发 #健幸之目 本文由「健幸之目」医学编辑团队基于公开文献独立整理，仅供专业读者参考。 作者：健幸之目 ⚠️ 免责声明：本文全部医药内容仅作学术科普交流，不构成任何诊疗建议。Iberdomide属于尚未正式获批上市的在研药物，临床用药务必遵从血液科专科医生面诊指导，请勿自行参考本文开展治疗。 2025年9月23日，百时美施贵宝（BMS）公布EXCALIBER‑RRMM（NCT04975997）III期研究的中期分析结果：Iberdomide联合达雷妥尤单抗及地塞米松（IberDd方案）用于复发/难治多发性骨髓瘤（RRMM）患者，微小残留病（MRD）阴性率相较于标准DVd方案实现统计学显著改善。基于该项中期结果，BMS已经向美国FDA提交上市申请，PDUFA目标行动日期为2026年8月17日。 该阳性结果让Iberdomide成为FDA 2026年1月MRD终点指导文件发布之后，首批进入审评流程的CELMoD类药物，具备监管示范价值。国内方面，CDE于2025年12月受理该品种上市申请，并在2026年2月将其纳入优先审评。目前公开信息仅限于MRD终点统计学阳性结论，试验组与对照组MRD阴性率具体数值、客观缓解率、完全缓解率、PFS风险比以及完整安全性数据均未经过期刊或学术大会同行评议正式披露。PFS作为另一项主要终点，数据尚未成熟，试验仍在持续随访。围绕Iberdomide的真实临床价值，仍有六项关键问题有待后续数据解答。 一、EXCALIBER‑RRMM试验设计与入组特征 EXCALIBER‑RRMM是一项国际多中心、随机、开放标签III期注册试验，分为两个阶段。 第一阶段为剂量优化，纳入约200例受试者，对比Iberdomide 1.0 mg、1.3 mg与1.6 mg每日一次给药方案（d1‑21，28天为一个治疗周期）的安全性与初步疗效，最终确定1.0 mg为推荐治疗剂量。 第二阶段为随机对照研究，合计约664例受试者按照1:1比例分组。试验组采用Iberdomide 1.0 mg口服联合达雷妥尤单抗、地塞米松的IberDd方案；对照组使用达雷妥尤单抗联合硼替佐米、地塞米松的DVd标准方案。 入组受试者既往接受1‑2线系统治疗后出现疾病进展，ECOG体能状态0‑2分，既往至少一线治疗能够达到部分缓解及以上疗效。排除既往使用过CELMoD类药物、2级及以上伴随疼痛的周围神经病变，以及对硼替佐米或者抗CD38单抗产生耐药的患者。第二阶段随机队列当中，仅有大约10%受试者既往接受过抗CD38单抗治疗。 分层变量包含既往治疗线数、年龄、ISS疾病分期。 终点设置： 双主要终点：①MRD阴性率，仅评估达到CR/sCR的受试者，采用NGS手段检测，检测灵敏度10⁻⁵–10⁻⁶，遵循IMWG评判标准；②无进展生存期PFS。 次要终点：客观缓解率、完全缓解率、缓解持续时间、总生存期、至下一次治疗时间、安全性以及患者报告结局。 试验采用分层检验策略，MRD阴性率作为支持加速批准的替代终点，PFS用于确证临床生存获益。两个终点均需达到预设统计学标准，方可支撑完整上市批准。现阶段仅MRD中期终点取得阳性结果，PFS数据还在持续积累。 二、监管背景：MRD作为加速批准终点的里程碑意义 EXCALIBER‑RRMM处于多发性骨髓瘤药物监管规则迭代的关键节点。 2024年4月，FDA肿瘤药物咨询委员会ODAC以12:0全票认可，MRD阴性率可以作为多发性骨髓瘤药物加速批准的替代终点。2026年1月20日，FDA正式发布行业指导草案，明确在取得完全缓解的患者群体中，流式或者NGS测得的MRD阴性结果，可作为加速批准的主要终点。 监管思路转变的背景是，当前复发难治骨髓瘤整体客观缓解率普遍达到60%‑70%，新诊断患者缓解率接近90%，单纯依靠缓解率作为主要终点，需要极大样本量才可以观测到组间差异。MRD作为深度缓解指标，可以在更早时间点捕捉疗效信号。基于MRD取得的加速批准属于附条件批准，申办企业后续仍需PFS或者OS数据证实药物真实临床获益。 Iberdomide的NDA申报，正是这份指导文件落地之后首批审评实践案例。FDA在2026年2月17日正式受理申报，同步授予突破性疗法认定以及优先审评资格，并通过Project Orbis项目开展多国同步审评。中国CDE于2025年12月27日受理Iberdomide胶囊上市申请，适应症为既往至少接受过一线治疗的多发性骨髓瘤成人患者，2026年2月纳入优先审评。若审评顺利，该药物有望2026年下半年实现中美同步获批。 三、作用机制：从IMiD到CELMoD的分子进化 Iberdomide（CC‑220）属于Cereblon E3连接酶调节剂（CELMoD），作用靶点为CRBN E3泛素连接酶复合体。理解其定位，需区分传统IMiD与新一代CELMoD的分子差异。 来那度胺、泊马度胺这类传统免疫调节剂同样结合CRBN蛋白。CELMoD和CRBN的结合亲和力更高，能够更加高效诱导蛋白构象改变，招募并且泛素化降解Ikaros（IKZF1）、Aiolos（IKZF3）两种转录因子，二者是骨髓瘤肿瘤细胞存活增殖的关键分子。 体外数据表明，同等摩尔浓度条件下，Iberdomide对于靶蛋白的降解能力优于泊马度胺，同时可以激活CD8⁺T细胞与NK细胞，重塑肿瘤局部免疫微环境。该药物对于一部分IMiD耐药人群，尤其是非CRBN通路依赖的耐药患者，依旧保留一定治疗活性。对于已经出现CRBN表达下调、IKZF3 Q147H突变的患者，CELMoD同样很难起效。 分子胶药物普遍存在底物选择性问题，早期化合物容易造成CK1α等非目标蛋白降解。后续开发的第二代CELMoD，例如mezigdomide，已经将CK1α脱靶降解比例由80%下降至5%以内。Iberdomide属于第一代CELMoD分子，脱靶谱仍需长期随访验证。 给药形式为每日口服，不需要静脉输注，在长期维持治疗中具备给药便利性优势。 四、早期临床数据参考与安全性特征 III期完整数据公布前，I/II期CC‑220‑MM‑001试验（NCT02773030）的结果可供参考。 Iberdomide联合地塞米松用于多线治疗失败的复发难治骨髓瘤，客观缓解率26.2%，临床获益率36.4%，中位PFS 2.4‑3个月，中位总生存期11.2个月。3‑4级不良事件集中在血液毒性：中性粒细胞减少45%，贫血28%，感染发生率27%，血小板减少22%。 Iberdomide联合达雷妥尤单抗、地塞米松方案的早期队列数据显示，客观缓解率约35%‑41%；3‑4级治疗相关不良事件主要为中性粒细胞减少50%，白细胞减少22%，贫血22%。 以上数据提示Iberdomide单药抗肿瘤活性有限，临床价值更多体现在联合CD38单抗、蛋白酶体抑制剂的组合方案中。安全性特征以骨髓抑制为核心，整体毒性谱系和IMiD药物相近，但各类不良反应的发生率、严重程度存在差异。EXCALIBER‑RRMM研究官方披露IberDd方案安全性和既往研究保持一致，但完整的3‑4级不良事件统计、严重感染、周围神经病变发生率以及治疗停药率，仍有待正式文献公布。 五、横向对比：RRMM治疗格局中的定位 DVd方案基于CASTOR研究数据，采用皮下或者静脉制剂搭配口服药物，注册研究中MRD阴性率约30%‑40%，主要短板来自硼替佐米带来的周围神经毒性，患者需频繁前往医院完成输液。 IberDd组合由口服小分子叠加单抗输注构成，III期中期分析证实MRD阴性率优于DVd方案，但绝对数值待公布，PFS终点尚未读出，完整安全性数据缺失。口服给药是这套方案的便利性优势。 BCMA双特异性抗体（teclistamab、elranatamab）皮下或静脉给药，可实现较高比例MRD转阴，但存在细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征风险，用药需院内监测并执行剂量爬坡。 BCMA CAR‑T细胞治疗可达到最高水平MRD转阴，但费用高昂，制备周期长，国内可开展治疗的中心有限，且存在迟发性感染风险。 对于1‑2线复发骨髓瘤人群，若后续PFS终点阳性，IberDd有望成为DVd方案的替代性选择。口服给药模式能够改善患者就医体验，但骨髓抑制毒性替换硼替佐米的神经毒性，获益风险需结合患者个体情况评估。若PFS未达预期，仅凭MRD替代终点难以支撑广泛临床应用。 血液肿瘤领域已有先例，部分新药可提升MRD转阴比例，却未转化为PFS、OS生存获益。Iberdomide的最终临床定位，完全取决于EXCALIBER‑RRMM后续PFS的读出结果。 六、待揭晓的关键信息 在监管机构做出最终审评结论、临床指南更新之前，还有多项核心问题需要完整试验数据予以解答。需要明确MRD阴性率的绝对数值，试验组与对照组具体百分比，以及t(4;14)、del(17p)等高风险细胞遗传学亚组的分层获益差异；同时需要拿到sCR、CR、VGPR缓解占比分布，以及肿瘤缓解出现的时间动力学特征。 PFS最终分析的风险比HR与中位PFS数值，是评判这款药物临床价值最核心指标。安全性层面，3‑4级中性粒细胞减少、血小板减少、机会性感染、胃肠道不良反应、皮疹以及治疗停药率都需要完整披露。即便总生存期数据尚未成熟，其中期趋势信号依旧具备临床参考意义。而EORTC QLQ‑C30/My20生活质量量表结果，也将帮助业界客观评估口服方案带给患者的实际获益。 综合来看，Iberdomide代表新一代CELMoD药物的重要突破，但是现阶段一切判断都建立在中期MRD替代终点之上，最终临床价值仍要等待硬终点数据落地。 参考文献 1. Bristol Myers Squibb. Phase 3 EXCALIBER‑RRMM study demonstrated statistically significant improvement in MRD negativity rates. News release. September 23, 2025. 2. ClinicalTrials.gov. NCT04975997: A study of iberdomide in combination with daratumumab and dexamethasone in participants with RRMM (EXCALIBER‑RRMM). 3. Lonial S, et al. EXCALIBER‑RRMM: a phase III trial of iberdomide, daratumumab, and dexamethasone in relapsed/refractory multiple myeloma. Future Oncol. 2025;21(14):1761‑1769. 4. Lonial S, Popat R, Hulin C, et al. Iberdomide plus dexamethasone in heavily pretreated late‑line relapsed or refractory multiple myeloma (CC‑220‑MM‑001): a multicentre, multicohort, open‑label, phase 1/2 trial. Lancet Haematol. 2022;9(11):e822‑e832. 5. U.S. Food and Drug Administration. Minimal residual disease and complete response in multiple myeloma: use as endpoints to support accelerated approval. Draft guidance for industry. January 20, 2026. 6. U.S. Food and Drug Administration accepts Bristol Myers Squibb's new drug application for iberdomide in RRMM. News release. BMS. February 17, 2026. 7. Sonneveld P, Chanan‑Khan A, Weisel K, et al. Overall survival with daratumumab, bortezomib, and dexamethasone in previously treated multiple myeloma (CASTOR). J Clin Oncol. 2023;41(8):1600‑1609. 8. Kumar S, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17(8):e328‑e346. 搜索关键词：Iberdomide、CELMoD、复发难治多发性骨髓瘤、EXCALIBER‑RRMM、MRD阴性率、达雷妥尤单抗、微小残留病、BMS、PDUFA 2026 话题标签：#多发性骨髓瘤 #Iberdomide #CELMoD #MRD #血液肿瘤 #新药研发 #健幸之目 本文由「健幸之目」医学编辑团队基于公开文献独立整理，仅供专业读者参考。

单抗的成功促进了双特异性（bsAb）和多特异性抗体（msAb）的发展，这些分子可同时结合多个靶点，解锁传统mAb无法实现的新机制（如T细胞重定向、克服耐药等）。目前已有多款双抗上市，比如CD3 TCE（blinatumomab、teclistamab等）通过同时结合免疫细胞与肿瘤细胞激活免疫杀伤；amivantamab（EGFR×MET）克服EGFR exon20插入突变耐药。Emicizumab（FIXa×FX）治疗血友病。多抗虽然尚无产品上市，但已有产品处于临床研究阶段。双抗/多抗的成药性比单抗更具挑战，前者结构更为复杂、免疫原性风险更高、稳定性可能不如单抗、制造难度大（如需要多链组装、纯化工艺复杂）等。所以，bsAb/msAb的开发需进行系统性的可开发性评估，结合分子设计、免疫原性预测、稳定性测试和制造可行性分析，以最大化临床转化成功率。 抗体架构——结构角度 BsAb/msAb架构分为IgG样格式和片段化格式。IgG样格式保留Fc，分为对称（如knob-into-hole）和非对称（如CrossMab）结构，需进行抗体工程化突变（如电荷突变）减少错配。缺点是可能改变Fc效应功能或半衰期。片段化格式如单链可变片段（scFv）或纳米抗体（VHH），无Fc区，通过linker串联不同结合域，优势在于组织渗透性和高活性，缺点是易聚集、稳定性差，需优化linker长度和序列。 不同架构对应的成药性风险不同。免疫原性方面，非天然结构（如人工linker、突变位点）可能触发抗药抗体（ADA）反应，需通过表位预测和体外T细胞实验评估。稳定性方面，scFv等片段化分子因缺乏Fc保护，易形成多聚体，需通过热力学稳定性（Tm值）和动态光散射（DLS）监测。高疏水性linker或突变可能导致沉淀，需优化缓冲体系或引入溶解度增强突变（如极性氨基酸替换）。PK/PD方面，无Fc的片段化分子需通过PEG化或白蛋白融合延长半衰期，且需权衡肿瘤穿透与全身暴露。工艺制造方面，非Fc架构需放弃Protein A亲和层析，改用混合模式层析（如疏水相互作用+离子交换）或标签纯化（如His-tag）。非对称IgG样格式需通过双表达载体或共转染优化重轻链比例，减少副产物（如同源二聚体）。 从抗体架构层面给出的成药性评价的建议是：1）早期筛选：利用高通量表达平台（如CHO瞬转）快速评估产量、纯度和稳定性，淘汰高风险候选分子；2）引入二硫键（如链间二硫键）或糖基化修饰（如Fc糖型优化）增强稳定性；3）去除潜在T细胞表位（如去免疫化设计）或使用人源化框架以降低免疫原性；4）针对特定架构定制纯化流程，如scFv格式需结合尺寸排阻层析（SEC）去除聚集体。 架构考量——功能角度 BsAb/msAb的分子架构还可以从另外一个维度分为两类。一是结合价态（Valency）：结合靶点的抗原结合域数量（如1价、2价或更高）。二是结合几何构型（Geometry）：抗原结合域在分子中的空间排列（如scFv的柔性连接vs. IgG的刚性结构）。比如Zanidatamab是一款HER2双表位bsAb（scFv+Fab），通过增强受体聚集提升补体依赖的细胞毒性（CDC）。BiTE®是首个获批的TCE架构（双scFv融合），虽易聚集，但缩短T细胞与肿瘤细胞的距离，显著提升细胞毒性。DART®架构则通过工程化二硫键稳定VH-VL交叉融合，平衡活性与稳定性。 当然，架构优化需同步评估功能与开发性风险。比如8种HER2×CD3 Fc 双抗中，增加scFv数量未影响表达/热稳定性，但导致异质性升高和聚集倾向加剧。又如PD-L1×HER2 双抗的单域抗体融合至IgG N/C端可提升产量，但高阶多价分子出现胶体稳定性问题（如聚集、低溶解度）。 BsAb/msAb的常用元件 多肽连接子（Polypeptide Linkers）、纳米抗体（VHH/Nanobodies®）是bsAb/msAb中的常用配件。 多肽连接子通常分为三类：刚性连接子、柔性连接子、可裂解连接子。刚性连接子维持结构刚性，适用于需固定空间构型的分子（如双表位结合）。柔性连接子提供构象灵活性，常用于scFv或串联结构，平衡活性与稳定性。可裂解连接子在体内特定环境（如肿瘤微酸环境）释放活性片段，提升靶向性。连接子在bsAb/msAb成药性中伴随着重要角色，可以连接不同功能域（如scFv-Fc融合），还可以调节药代动力学（如延长半衰期的Fc/白蛋白融合需优化连接子），也可能影响分子聚集倾向（如(G4S)n连接子长度优化可显著降低聚集）。比如CD19×CD3串联双抗中，连接子长度变化直接影响折叠效率、稳定性和活性。连接子通常的优化策略包括引入二硫键或极性氨基酸（Glu/Lys）提升稳定性。通过突变减少蛋白酶敏感位点，延长体内半衰期。 纳米抗体属于单域抗体（15 kDa），无轻链配对需求，避免链配对复杂性。而且，纳米抗体具备高溶解性与热稳定性，部分VHH可耐受高温后复性（优于传统scFv）。长CDR3环结构增强抗原结合亲和力，并屏蔽疏水残基减少聚集。以上优势，使纳米抗体在bsAb/msAb设计中大受欢迎。首个获批VHH药物caplacizumab（Cablivi®）用于血栓性血小板减少性紫癜。VHH也有局限性，如部分VHH可能因长CDR3环导致免疫原性，需人源化改造。VHH组织穿透性虽强，但肾脏清除快，需通过融合Fc或白蛋白延长循环时间。 免疫原性 相比传统单抗，bsAb/msAb的临床免疫原性数据较少，但已获批/在研分子显示不同分子的ADA发生率差异大，TCE（如CD3靶向）因激活T细胞可能更易引发ADA。双免疫检查点抑制剂（如PD-1×CTLA-4）可能因协同作用降低免疫原性。部分ADA无临床影响，部分则导致治疗中断。引发ADA的因素很多，包括非人源序列、结构复杂性、聚集体，还有来自患者和疾病相关的因素。目前已经有些工具可以进行免疫原性预测和风险评估，比如T细胞表位预测（如NetMHCpan分析潜在HLA结合肽段）、分子模拟、体外实验（如PBMC共培养检测ADA产生及细胞因子释放）、动物模型（如表达人HLA转基因小鼠评估ADA动力学）。 序列风险 BsAbs/msAbs免疫原性风险主要源于其一级氨基酸序列（如非天然结构域连接、人源化改造、Fc效应功能修饰等）。这类抗体通常包含大量经工程化改造的序列，可能引入新抗原或暴露隐蔽表位，从而被抗原呈递细胞（APC）处理并激活T细胞应答。所以，在早期抗体发现阶段，最好就利用in silico表位预测工具筛选低风险序列，并通过体外/离体实验（如T细胞活化试验）确认潜在免疫原性。 In silico预测 In silico计算模拟T细胞表位预测工具，已经有多种商业、公共及学术平台（如NetMHCpan、IEDB等），用于筛选抗体序列中的潜在T细胞表位（通常为9-15个氨基酸片段），预测其与HLA分子的结合能力。这些工具仅基于一级序列进行分析。高级结构的免疫原性风险，可以通过如同源建模、分子动力学模拟等方法，构建抗体三维结构，评估影响免疫原性的结构特征（如溶剂暴露环、翻译后修饰、构象灵活性）。这类方法的优点是高通量、低成本，可早期识别高风险区域，指导候选分子筛选或工程化改造（如去免疫化）。缺点是可能高估免疫原性风险，过度预测，且HLA多态性不足，未完全反映人群HLA-II类分子多样性，需结合体外实验进一步确认。 体外HLA结合实验 体外HLA结合实验通过检测肽段与不同HLA等位基因的亲和力，补充计算模拟预测结果。实验通常采用15-mer重叠肽段，与单体HLA-II分子孵育后，通过荧光光谱、ELISA或表面等离子共振（SPR）等方法考察亲和力。该实验可高通量筛选大量肽库，但也存在一些问题。比如HLA多态性覆盖不足，全球HLA-II等位基因分布复杂，实验常采用超型等位基因（supertype alleles）（共享结合基序的HLA-DR亚型），覆盖>95%人群。而HLA-I实验因高度多态性及结构影响，应用较少，常用方法包括FACS-MHC稳定化实验、竞争实验或HLA分型B细胞系检测。另外，体外HLA结合存在假阴性风险，该实验依赖肽段纯度和设计，若肽段未正确折叠或与HLA结合不稳定，可能低估真实结合能力。而且，这个实验仅反映肽段与HLA的体外结合，无法验证APC加工递呈能力（如蛋白酶切割、胞内运输等关键步骤）。所以，体外HLA结合实验主要用于快速排除高风险肽段，优先选择低亲和力候选分子。后续需通过APC递呈实验（如树突细胞共培养）验证肽段能否被有效加工并激活T细胞，以弥补体外结合实验的不足。 MHC相关肽组学 MHC相关肽组学（MAPPs）方法是评估免疫原性功能的关键实验之一。MAPPs（MHC-associated peptide proteomics）通过液相色谱-质谱联用（LC/MS）技术，直接鉴定APC细胞表面HLA分子递呈的加工后肽段。大致步骤是，将完整bsAb/msAb加载至体外诱导成熟的单核细胞来源DC中，使其被摄取并加工。裂解细胞后分离肽-MHC复合物，解离肽段并通过质谱测序。鉴定优势抗原肽序列，指导后续工程改造以降低免疫原性。MAPPs直接反映体内加工与递呈过程，弥补HLA结合实验的功能缺失。该实验的局限性体现在，DC制备耗时且成本高，通常用于临床前后期、候选分子数量有限的阶段。另外，如果bsAb/msAb靶向DC表面分子（如CD40×CD11c、LAG-3×PD-L1），可能导致假阴性或偏差。MAPPs仅证明肽段被递呈，不等于会产生T细胞应答，需结合DC功能实验（如细胞活化、细胞因子检测）及离体T细胞活化/增殖实验验证。 离体T细胞实验 离体T细胞实验通过模拟体内抗原递呈与T细胞激活过程，成为评估治疗性抗体（尤其bsAbs/msAbs）免疫原性的关键方法。最常用的体系是PBMC共培养体系。使用健康/患者来源的新鲜或冻存PBMC（或CD8+耗竭PBMC、纯化CD4+T细胞），与单核细胞来源的DC共培养。之后加入待测抗体刺激，使APC摄取、加工并递呈抗原肽，激活初始T细胞。可以采用流式检测T细胞增殖、活化，也可以检测细胞因子分泌。需要注意的是，如果bsAbs/msAbs靶向免疫细胞表面受体（如T细胞、DC），可能会直接结合细胞而非抗原递呈激活T细胞，导致假阳性结果。另外，bsAbs/msAbs易因错配产生非目标分子，污染实验样本并干扰结果，所以必须使用高纯度（>95%）抗体制剂，并通过质控（如SEC-HPLC、CE-SDS）排除杂质影响。该实验也有自身的局限性，比如灵敏度受限，初始T细胞含量低，需优化DC:T细胞比例、延长培养时间或添加共刺激因子（如CD28抗体）提升信号。又如健康供者PBMC可能无法完全模拟患者免疫状态，建议补充患者样本验证。所以，通常的免疫原性风险评估策略是多层级风险控制，大致流程是先用计算模拟（HLA结合预测）→MAPPs确认提呈肽段→PBMC/DC-T细胞实验验证功能。 B细胞风险 当然除了APC-T细胞这对组合，B细胞在ADA生成中也有贡献。B细胞可以通过BCR结合bsAbs/msAbs的表位，内化、加工后递呈给辅助型T细胞，促进自身分化为浆细胞并分泌高亲和力IgG型ADA。另外，记忆型B细胞可以快速响应抗原刺激，是长期免疫记忆的关键。不过，体外B细胞实验存在一定的技术挑战，现有ELISpot仅能检测记忆B细胞的IgG/IgM分泌，无法模拟初始B细胞的类别转换（IgM→IgG）过程。另外，缺乏标准化体外体系诱导完整B细胞应答（如生发中心反应、体细胞高频突变）。B细胞表位也有一些预测工具，如IEDB、SEPIa等，但预测准确性显著低于T细胞表位工具（因B细胞表位依赖构象识别，且缺乏高分辨率晶体结构数据）。还需要注意的是，如果抗体靶向B细胞表面分子（如CD20、CD19），需警惕直接激活B细胞导致假阳性。杂质（如聚集体、降解片段）可能非特异性激活B细胞，需严格质控。 关键质量属性风险 CQA（关键质量属性）是指影响产品安全性和有效性的物理、化学、生物学或微生物学特性。对于bsAbs/msAbs，其复杂的分子设计常导致以下挑战，进而增加免疫原性风险。BsAbs/msAbs聚集倾向升高，非天然结构域连接易引发蛋白聚集，激活先天免疫细胞（如巨噬细胞）的模式识别受体（PRR）。BsAbs/msAbs稳定性下降，结构复杂性降低构象稳定性，暴露隐蔽表位或促进降解产物形成。BsAbs/msAbs杂质风险高，错配副产物（如半抗体、同源二聚体）作为非预期抗原，可能打破免疫耐受并产生佐剂效应。如果出现这些情况，建议进行工艺优化，通过上游设计（如稳定铰链区、优化Fc）和下游纯化（如亲和层析去除错配体）降低CQA风险。建立高灵敏度SEC-HPLC、CE-SDS方法监测聚集体与片段，以控制杂质。另外，可以结合产品作用机制、PBMC/DC-T细胞功能实验综合评估免疫原性。 患者来源的风险 患者预存免疫反应（患者体内预先存在的抗药物抗体）也是ADA产生的风险之一。随着bsAbs/msAbs研发加速，临床开发阶段需系统性筛查和表征药物初治患者的预存免疫反应，以规避潜在风险。许多bsAbs/msAbs靶向既往已用于单抗或ADC的靶点（如TNF-α、TIM-3），或直接使用已上市抗体的骨架（如JNJ-61178104基于阿达木单抗）。患者若曾接受相关生物治疗，可能因记忆B细胞快速回忆应答产生针对bsAb/msAb的高强度ADA。比如JNJ-61178104，临床ADA反应与患者既往接受TNF-α抑制剂治疗史显著相关。所以，对于bsAbs/msAbs，建议在筛选期或治疗前采集患者样本，检测预存ADA。若预存ADA阳性率>5%，需考虑排除高风险患者或设计分层给药方案。 治疗相关因素带来的风险 治疗相关风险因素如给药方式、剂量及联合用药对bsAbs/msAbs免疫原性也会产生影响。首先看下给药途径，传统观点认为SC给药免疫原性更高，但已上市单抗临床数据未完全支持。但bsAbs/msAbs可能与单抗相比，有一定特殊性。SC需高浓度制剂，易加剧蛋白聚集、片段化等CQA问题，可能通过皮下组织PRR激活增强免疫应答。比如PSMA×CD3 bsAb TCE（pasotuxizumab），IV组无ADA，SC组100%患者产生ADA，93%为中和抗体。JNJ-63898081（同类PSMA×CD3 bsAb），SC组同样出现高ADA发生率。 再看剂量与给药方案。BsAbs/msAbs因毒性（如CRS）常采用低于单抗的剂量，可能增加ADA介导的加速清除风险，导致PK/PD不达标。不过，bsAbs/msAbs给药频率和周期可能并未增加ADA产生风险，比如在肿瘤领域通常短期治疗（数周期）可能不足以引发强免疫记忆，当然高免疫原性分子除外。另外，对于自身免疫病，虽然是长期治疗，但很多药物如CD20×CD3 bsAb可能通过清除B细胞发挥药理作用，反而降低自身ADA产生风险。 联合用药方面，免疫调节剂如糖皮质激素、甲氨蝶呤等可能抑制ADA生成，但可能掩盖真实免疫原性风险。化疗药物（如氟达拉滨）可能通过淋巴细胞耗竭降低免疫应答，但需警惕免疫重建后的延迟ADA反应。免疫增强剂如PD-1抑制剂联合bsAb，可能增强T细胞活化，加剧细胞因子风暴与免疫原性。 作用机制相关免疫原性风险 前文其实已有介绍，bsAbs/msAbs的MOA显著影响其临床免疫原性，表现为免疫原性增强或抑制，需纳入综合风险评估。对于B细胞耗竭型MOA，如CD19×CD3（blinatumomab）、BCMA×CD3（teclistamab），ADA发生率<2%。对于B细胞共刺激型MOA，如CD40激动剂（ABBV-428，靶向mesothelin×CD40），CD40激活促进B细胞增殖、类别转换，ADA发生率63%，且中和抗体导致PK暴露量下降。对于非耗竭型T细胞激活MOA，如CEA×CD3（AMG 211），导致广泛T细胞激活，高剂量组100%患者产生ADA，导致暴露量降低，治疗中断。对于免疫检查点调节型MOA，如CTLA-4×PD-1双抗、TIM-3×PD-L1（LY3415244），通过解除T细胞抑制，也会增加ADA产生风险。 特异性 在bsAbs/msAbs的开发过程中，多特异性（在蛋白质组中的非靶点结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的特性。这些特性可能会改变抗体的疗效、清除率和组织分布，进而导致脱靶毒性、免疫原性以及CMC过程中的挑战。 In silico预测 已开发出多种计算机辅助计算工具，用于评估抗体特征以预测多反应性。这些工具利用从同源模型中获得的抗体特性，如序列组成、CDR长度和表面特性（即电荷和疏水性），来创建多反应性的预测模型。不过，计算机辅助工具在单抗可开发性方面的应用比较成熟，对bsAbs/msAbs尚未得到充分探索。 一般来讲，具有显著CDR正电荷或高疏水性的抗体清除率可能会更高，从而对其治疗效果产生负面影响。这种加速清除是由于抗体表面的正电荷可能与带负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致组织摄取增加和血液清除加快。所以，正电荷对多特异性不利，而较大的负电荷团似乎有益。 其它检测 ICH S6和FDA的抗体开发相关指导原则均提及采用组织交叉反应研究（TCR）试验评估抗体的特异性，既可以看脱靶结合，也可以看在靶但结合部位非预期的组织。常用免疫组化方法进行检测。关于TCR的介绍及局限性，之前已经发过一文，不再细表。 除了组织层面的技术，细胞在特异性方面的应用更为广泛。通常是将各种蛋白靶点的质粒转染至活细胞中。这种形式可以保留蛋白的天然构象，包括翻译后修饰、糖基化、多聚等。而且，基于活细胞的特异性通常采用高通量流式细胞术检测，不需要对细胞进行固定。固定这一步骤通常会改变膜蛋白的构象，如下图所示，固定使CD19抗体的脱靶结合丢失。TCR技术需要对组织进行冰冻及固定，这些处理改变蛋白构象的风险比较高，保留靶点蛋白的天然构象是细胞阵列技术的主要优势。 稳定性 抗体的稳定性主要指的是热稳定性、胶体稳定性、抗蛋白水解能力和在血液中的化学稳定性。稳定性方面的缺陷可能导致制造过程遇到困难、对货架期的影响以及抗体免疫原性和活性的改变。 热稳定性 热稳定性是指在加热时能够抵抗蛋白质展开和降解的能力。对于单抗，热稳定性很大程度上由Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不是那么明显。每个抗体Fv结构域的一级序列不同，热稳定性具有最高的变异性。 热稳定性太低会使抗体更容易聚集。衡量抗体热稳定性的一个常用指标是其熔解温度（Tm）。比如，IgG1的CH2结构域的Tm约为70℃，CH3结构域的Tm约为82℃。有研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，产生的抗体在CH3热稳定性上有显著降低，K409的突变与Tm降低约12℃相关。 差示扫描量热法（DSC）用于确定不同结构域的热稳定性和热力学性质。DSC特别适合bsAbs/msAbs，因为它可以通过额外的信息，如展开焓，来区分不同结构域的展开情况，但由于仪器限制和样品需求，通常通量相对较低。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热位移分析，通常是高通量的，用于识别低稳定性抗体以进行去优先级排序。许多DSF仪器还能够检测由热不稳定诱导的聚集体的形成，这会导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 BsAbs/msAbs的结构对热稳定性有很重要的影响。一般来说，在单抗基础上设计的多抗，很少出现较亲本单抗热稳定性更好的情况。建议先评估亲本单抗的热稳定性，排除低热稳定性的单抗。当然，也有一些抗体工程手段可用于提高bsAbs/msAbs的热稳定性，比如在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面之间、scFvs的可变结构域之间或scFvs的连接体和可变结构域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10℃。 化学稳定性 化学稳定性是指抗体一级序列中以及重链-重链或重链-轻链之间的共价键的完整性。抗体治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同降解途径的影响，包括脱酰胺、异构化、氧化、二硫键交换、N端焦谷氨酸形成、C端赖氨酸的剪切、断裂和糖化。这些降解可能会影响抗体的活性或半衰期。比较知名的例子是曲妥珠单抗，其LC-Asn30的脱酰胺对其活性影响较小，而HC-Asp102的异构化则显著降低了其活性。又比如小鼠单克隆抗体OKT3，Fc区的M428/M252处的甲硫氨酸氧化可以影响与FcRn的结合，从而影响抗体的循环，降低抗体的半衰期。虽然抗体降解可以通过优化制剂配方进行缓解，但强大的化学稳定性对于给药后在体内的稳定性很重要，通常工程方法比配方筛选更受青睐，即从根源降低风险。 导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺、异构化和断裂。脱酰胺是抗体中普遍存在的修饰，发生在生产、储存或体内过程中，天冬酰胺最容易受影响，谷氨酰胺残基次之。脱酰胺通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击以及随后的氨的丢失而发生，导致通过天冬氨酸-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，并且在中性或碱性pH下通常会加速脱酰胺过程。 相反，通过Asu中间体的水解，天冬氨酸的异构化通常在酸性pH下加速，并导致形成异天冬氨酸或天冬氨酸（在中性条件下比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能在冻干的抗体配方中发生。 一级氨基酸序列可用于化学降解风险的的初步评估，再结合结构因素如外部溶剂可及性和二级结构，以及外部因素如pH、温度和辅料等进行进一步确认。可以基于结构和同源模型的方法评估降解风险，尤其是可变区的降解。化学稳定性问题也可以通过强制降解研究来鉴别，包括长时间暴露于高温、低/高pH、冻融循环、搅拌、糖化、光照以及生理或氧化应激等条件。不过这些研究对人力、时间和费用都有要求，通常在细胞系开发之前开展。 抗体治疗药物中化学稳定性受损的另一个表现是断裂，分为非酶促和酶促断裂。非酶促断裂经常在抗体中观察到，主要在恒定区的上铰链区的动态环结构。上铰链区的非酶促断裂通过化学反应如β-消除、直接水解、铜介导的裂解或自由基催化发生，并且依赖于溶剂条件，如碱性或酸性pH、温度以及自由基或金属的存在。非酶促断裂事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上。酶促断裂大多由mAbs和bsAbs/msAbs生产和纯化过程中发生的蛋白酶裂解介导，铰链区是酶促裂解最常见的位点。BsAbs/msAbs可能会经历更严格和复杂的纯化过程，出现酶促断裂的风险更高。 焦谷氨酸形成经常在抗体重链和轻链的N端观察到，特别是N端残基是谷氨酰胺时。焦谷氨酸形成可以通过非酶促的、自发的环化在体外通过N端主链酰胺的氮对侧链酰胺的亲核攻击发生，形成一个稳定的五元环，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化而成。如果控制不当，焦谷氨酸形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中CQA的维护。这在bsAbs中也观察到，由于在某些双特异性格式中所有链的N端可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加。 糖化主要发生在赖氨酸侧链胺上，其次发生在N端胺和精氨酸上，这是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。糖化通常在发酵过程中或在储存期间发生。需要通过合适的生产和制剂处方条件严格控制抗体制备过程。糖化可以通过硼酸或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色测定来检测。 胶体稳定性和粘度 胶体稳定性是指蛋白通过自缔合在溶液中沉淀的趋势，受到电荷、疏水作用、与离子的相互作用等因素的影响。粘度是描述流动阻力的相关属性，由分子间蛋白-蛋白相互作用引起。对于高浓度治疗性bsAbs/msAbs的制剂配方，胶体稳定性和粘度是需要考虑的重要属性。胶体稳定性通常通过盐或PEG诱导的沉淀、静态光散射、多角度光散射和DLS来评估。由于VH-VL界面处灵活性增加，含有scFv结构域的bsAbs/msAbs的胶体稳定性通常受损。不过，研究显示在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中，一个易于聚集的scFv-bsAb的胶体稳定性得到改善，展示了配方改善胶体稳定性的潜力。 如果抗体给药浓度过高（>100 mg/mL），自相互作用也会成为bsAbs/msAbs胶体稳定性风险之一。虽然较单抗会有所减弱，但不太可能完全消失。此外，任何以强制正确组装重-重和重-轻链的bsAbs/msAbs突变，例如引入电荷对和工程化改造疏水界面，如果突变部分或完全暴露或导致影响抗体表面属性的构象变化，可能会带来自缔合风险。评估自相互作用的方法包括DLS、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。 抗体的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于样本需求量大，特别是对于高浓度配方，这个实验通常在开发过程的后期进行。将单抗重新改构为bsAbs/msAbs，由于两个靶向模块的存在，产生新的相互作用，可能导致更高的粘度，特别是如果这些模块具有相反的静电属性。 体内稳定性 治疗性抗体在体内的物理化学稳定性在用药后的几天和几周内可能对药物疗效、清除和免疫原性产生影响。与单抗一样，人们希望IgG样bsAbs/msAbs具有长半衰期的PK特性。不过，识别和定量抗体药物在体内的生物转化事件是一个相对较新的领域，具备一定的挑战。 血清是血液的一部分，是一个富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小分子硫醇的异质性环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG2和IgG4。 在啮齿动物和非人灵长类动物中的血清稳定性研究和PK评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，可在开发性评估的早期进行。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的候选物。例如，体内的脱酰胺可能导致抗原结合的丧失并影响效力，并可能带来潜在的免疫原性问题。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和来自化脓性链球菌的免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或在循环中裂解，而IgG2则不太容易受到裂解。IgG1的两个重链的下铰链处的裂解可能会负面影响Fc效应功能，如ADCC和CDC，因为裂解位点靠近Fcγ受体和C1q的结合位点。IgG类型的bsAbs/msAbs的铰链区域同样可能受到蛋白酶裂解，应在临床前开发阶段进行监测。许多bsAb使用G-S linker来增加价态，可能在体内容易受到蛋白水解。 生产 蛋白不仅能设计出来，还要具备不错的可制造性方可。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造工艺和控制策略。 上游工艺考虑 开发bsAb/msAb稳定细胞株时，上游工艺考虑不仅要评估一些单抗常用的经典指标，如蛋白滴度、细胞株稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预期设备、材料、培养基和补料背景下的可制造性，还要额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 载体和序列设计、正确组装分子的克隆性和产量的选择过程，以及细胞培养和蛋白表达的参数，都是关键考虑因素。使用氨基酸点突变，如knob-into-hole突变，可以优化bsAb/msAb中正确配对目标分子的浓度。不过，即使进行工程改造和工艺优化，bsAb/msAb的错配并不罕见，还是要依赖下游工艺去除相关杂质。 下游工艺考虑 BsAb/msAb上游制备过程中产生的错配产物作为工艺杂质存在，给纯化过程带来额外负担。这为bsAbs/msAbs的可制造性带来了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如一些四链bsAb分子，难以使用药学常用的分离方法区分。在开发bsAb/msAb时建议尽早评估可制造性，以确定由于链错配而产生的结构变异体之间的分子特性差异是否提供了足够的分辨率，以实现成功的规模化纯化。其中，变异体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用pH和/或电导率依赖的色谱工艺。其他纯化方法也可以利用，包括使用疏水相互作用色谱针对变异体之间的疏水性差异，或依赖于独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。 分析方法开发 在bsAb/msAb的制造中，使用适当的分析方法对于其表征非常重要。除了典型的产品相关、宿主细胞相关和其他工艺相关杂质外，建立足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品也很重要。LC/MS方法，包括去糖基化完整MS，通常能够区分错配变异体，识别包含错配HC和/或LC组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。BsAb/msAb分析方法的挑战还来自生物活性检测。BsAb/msAb的生物学测定必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将两种机制结合到单一实验中有时会是一项挑战，需要评估是否要开发两个独立的生物学测定方法。