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王均
华南理工大学生物医学科学与工程学院院长、教授。国家自然科学基金青年科学基金项目（A 类）获得者，国家重点研发计划项目负责人，中国生物材料学会会士，英国皇家化学学会会士，国际生物材料科学与工程学会联合会会士。研究方向聚焦生物材料与肿瘤免疫治疗交叉领域，提出肿瘤微环境活化、理化性能智能调控的纳米药物递送载体构建新策略，实现纳米载体协同克服体内递送屏障；研发阳离子脂质辅助的高分子纳米粒（CLAN），为核酸类药物体内高效递送提供解决方案；构建通用型抗体固定平台纳米适配子系统，赋予单抗药物的多价性、多特异性和多功能化特性。在 Nat Biomed Eng、Nat Nanotechnol、Sci Transl Med 等国际权威期刊发表研究论文 250 余篇，总被引 23 000 余次；2021—2022 年连续入选科睿唯安 “ 高被引科学家 ” 和爱思唯尔中国高被引学者。科研成果先后获得国家自然科学奖二等奖、教育部自然科学奖一等奖、广东省科学技术奖自然科学一等奖、生物材料学会科学技术二等奖等重要奖项。现任Biomaterials期刊副主编（2019年4月—），《生物材料科学与工程》丛书执行副总主编。
沈松
华南理工大学生物医学科学与工程学院教授。主要研究方向为生物大分子药物递送载体。研究成果发表于 Nat Biomed Eng、Nat Commun、Adv Mater、Nano Today 等国际知名学术期刊，累计发表论文50 余篇，总被引 4 500 余次，其中以第一作者或通信作者身份发表 26 篇。申请中国发明专利、美国发明专利、PCT 专利共 17 项，已授权 8 项；参与撰写 2 部著作的章节。先后主持国家自然科学基金青年科学基金（B 类）、面上项目及广东省自然科学基金杰出青年项目，入选博士后创新人才支持计划，并作为核心骨干参与国家重点研发计划、广州市重点领域研发计划等项目。
双/多特异性抗体研究进展 PPS
赵东坤 1，李倩茹 1，江远兰 1，沈松 1, 2, 3*，王均 1, 2, 3**
（1. 华南理工大学生物医学科学与工程学院，广东 广州，511442；2. 华南理工大学国家人体组织功能重建工程技术研究中心，广东 广州，510006；3. 华南理工大学生物医学材料教育部重点实验室，广东 广州 510006）
[摘要]肿瘤免疫治疗领域中，抗体药物已成为重要治疗手段。然而，单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）因肿瘤异质性、耐药性及免疫抑制性微环境等因素制约，疗效有限。双/多特异性抗体（bispecific antibodies/multispecific antibodies, BsAbs/MsAbs）凭借多靶向性和多价性效应，显著增强抗肿瘤效力并降低毒性和副作用，成为下一代抗体药物的重要发展方向。随着抗体工程技术进步，多种 BsAb/MsAb 制备技术平台不断涌现，但靶点组合筛选、亲和力优化平衡及药物可开发性等问题仍构成主要挑战。系统综述当前 BsAb/MsAb 技术平台的研究进展，重点聚焦纳米技术在 BsAbs/MsAbs 构建中的应用，探讨人工智能（artificial intelligence, AI）技术在该领域的潜在应用价值。MsAbs 在克服 mAbs 局限性方面展现出巨大潜力，纳米技术、AI 等新兴技术有望进一步加速其研发进程，为肿瘤免疫治疗提供新的解决方案。
肿瘤免疫治疗领域涵盖免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗及嵌合抗原受体疗法等多个方向，已成为生物医药研究的热点领域。其中，抗体类药物发展尤为迅速，免疫检查点阻断抗体、免疫细胞激动抗体、T细胞衔接抗体等在临床研究中展现出显著疗效[1]。2024 年全球销售额前 3 位的抗肿瘤药物分别为靶向程序性死亡受体 1（programmed death-1，PD-1）免疫检查点的帕博利珠单抗（pembrolizumab）和纳武利尤单抗（nivolumab），以及靶向肿瘤细胞分化簇38（cluster of differentiation 38，CD38）的达雷妥尤单抗（daratumumab），其中帕博利珠单抗全球销售额高达 294.8 亿美元 [2]，凸显了抗体药物在抗肿瘤免疫治疗中的重要地位。
肿瘤的复杂性与高度异质性限制了靶向单一分子的抗体药物的疗效，这一问题在免疫检查点阻断疗法中尤为突出。随着蛋白质工程技术的进步，能够同时靶向多个分子或同一分子不同表位的双特异性抗体（bispecific antibodies，BsAbs）和多特异性抗体（multispecific antibodies，MsAbs）迅速发展。 以贝林妥欧单抗（blinatumomab）为代表的双特异性 T 细胞衔接器（bispecific T cell engager，BiTE）在临床上的成功应用，标志着 BsAbs/MsAbs 已成为下一代免疫疗法的重要研究方向。尽管如此，BsAbs/MsAbs 的设计与制备仍面临诸多挑战，包括最优靶点组合筛选、抗体链错配控制以提高产率、结构稳定性增强等关键问题。以下将综述肿瘤免疫治疗中代表性 BsAbs/MsAbs 的作用机制与制备策略，探讨机器学习技术和人工智能（artificial intelligence，AI）技术在该领域研发中的应用前景，为相关研究提供参考。
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BsAbs/MsAbs 在肿瘤免疫治疗中的应用
单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）在肿瘤免疫治疗中主要通过 3 种机制发挥作用：其一，通过阻断免疫检查点重塑免疫细胞的抗肿瘤活性，以 PD-1/ 程序性死亡受体配体 1（programmed deathligand1，PD-L1）抗体为代表的检查点抑制剂可有效阻断抑制性信号通路，恢复 T 细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell）活性，在部分患者中实现肿瘤长期抑制甚至完全缓解 [3-4]；其二，免疫激动剂抗体通过靶向 4-1BB（CD137）、CD28、OX40（CD134）等受体“激活”免疫细胞，增强其增殖和杀伤功能 [5]，但强烈的激活作用易导致严重免疫相关副作用甚至致命的细胞因子风暴，显著限制临床应用，疗效与安全性的平衡难题亟待解决 [6]； 其三，mAbs 可直接靶向肿瘤相关或特异性抗原 [ 如人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）]，其可结晶片段（fragment crystallizable，Fc 段）介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（antibodydependent cellular phagocytosis，ADCP）和补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）能精准引导免疫细胞杀伤肿瘤 [7]。
尽管取得显著进展，mAbs 疗法仍面临诸多局限：单一免疫检查点阻断常不足以克服多重抑制通路，而联合疗法 [ 如 PD-1 抗体与细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）抗体联用 ] 伴随 3 ~ 4 级副作用显著增加，且临床获益未必同步提升 [8-9]。单靶点单特异性抗体的局限性及未被满足的临床需求，推动了具备多靶向能力的下一代抗体药物——BsAbs/MsAbs 的发展。BsAb 含有 2 个不同的抗原结合位点，可同时结合 2 种抗原；MsAb 则进一步拓展至 3 个或更多靶点。这种多靶向特性使其能够实现协同功能，如共阻断免疫检查点、增强肿瘤抗原识别、介导效应细胞（如 T 细胞）与肿瘤细胞的特异性交联等 [10]。截至目前，全球已有 17 款 BsAbs 获批上市（见表 1），其中多数应用于肿瘤免疫治疗领域。以下将系统阐述 BsAbs/MsAbs 在肿瘤免疫治疗中的独特作用机制与临床应用优势。
1.1 BsAbs/MsAbs 的效应细胞衔接策略
BiTE 是一类可同时靶向 T 细胞与肿瘤细胞的BsAbs，其分子结构通常包含 2 个抗原结合位点：一个靶向 T 细胞表面 CD3 蛋白以激活 T 细胞免疫反应，另一个靶向肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA），从而将激活的 T 细胞与肿瘤细胞直接衔接。这一设计使 T 细胞无需依赖 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）识别即可杀伤肿瘤细胞，且能更高效地形成免疫突触，释放颗粒酶、穿孔素等效应分子，显著提升肿瘤杀伤效能 [11]。目前，基于 T 细胞衔接器原理的 BsAbs/MsAbs 已广泛进入临床研发阶段，例如靶向 CD20×CD3 和 B 细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）×CD3 的 BsAbs，以及靶向 CD38×CD3×CD28 的三特异性抗体（trispecific antibody，TsAb）等，均已实现上市或进入临床试验[12]。
基于 BiTE 的成功经验，类似策略已拓展至其他免疫细胞类型。在 NK 细胞衔接领域，Affimed公司开发的 4 价态 BsAbs 可同时靶向 NK 细胞活化分子 CD16a 与肿瘤抗原 CD30，实现活化 NK 细胞与肿瘤细胞的衔接；其靶向 CD16a×CD30 和CD16a× 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的抗体已进入临床试验阶段 [13]。 Dragonfly Therapeutics 公司研发的三特异性 NK 细胞衔接器可同时靶向 NK 细胞的活化分子 CD16、抑制性分子 NKG2D 及肿瘤抗原 HER2，该设计既激活 NK 细胞，又解除肿瘤介导的免疫抑制，增强抗肿瘤效应 [14]。上述研究显示，BsAbs/MsAbs 通过精准衔接免疫细胞与肿瘤细胞，显著提升了免疫治疗的靶向性与效率。
除 免 疫 细 胞 与 肿 瘤 细 胞 的 衔 接 外，BsAbs/MsAbs 的应用边界正逐步延伸至免疫细胞间相互作用的调控。例如，Shapir Itai 等 [15] 设计的双特异性树突状细胞（dendritic cell，DC）-T 细胞衔接器（bispecific DC-T cell engager，BiCE）通过同时靶向 T 细胞表面 PD-1 蛋白与 DC 表面 C 型凝集素结构域家族 9 成员 A 蛋白，促进 DC 与 CD8+ PD-1+ T细胞的相互作用，进而增强免疫信号转导。与传统PD-1 抑制剂相比，BiCE 对细胞毒性 T 细胞的增殖与激活具有更显著的促进作用。从 T 细胞到 NK 细胞，再到免疫细胞网络的整体调控，BsAbs/MsAbs正通过不断拓展的细胞衔接策略，推动肿瘤免疫治疗向精准化、高效化方向发展。
1.2 BsAbs/MsAbs 的共阻断和共激活策略
BsAbs/MsAbs 的优势同样体现在对免疫检查点的协同阻断上。单一抗体疗法往往疗效有限，多种免疫检查点抗体的联合应用虽可增强抗肿瘤效应，但会显著提升副作用发生率，例如 CTLA-4 抗体与 PD-1 抗体联合使用时，各级毒性发生率较单药治疗提高 3 倍，且 3 ~ 4 级毒性的出现时间显著提前。免疫相关不良事件已成为限制联合疗法临床应用的关键瓶颈。为克服这一局限，靶向 PD-1×CTLA-4 的BsAbs 通过同时阻断两大免疫检查点，并优先结合 PD-1 高表达细胞表面的 CTLA-4 分子，介导蛋白内化与降解，实现协同增效与毒性降低。康方生物的BsAb 卡度尼利单抗（cadonilimab）的临床数据显示，其在肿瘤组织中的富集效率显著高于传统 mAbs，并能优先结合 CTLA-4/PD-1 高表达的细胞，在提升疗效的同时降低毒性和副作用发生率 [16-17]。
协同作用的另一重要实现路径是对肿瘤信号通路的共同抑制。例如，EGFR 信号阻断常伴随间质上皮细胞转化因子（mesenchymal-epithelialtransition factor，MET）通路的代偿性激活，形成“信号旁路”，导致 mAbs 疗效衰减。针对这一获得性耐药难题，杨森制药开发的靶向 EGFR×MET 的 BsAb——埃万妥单抗（amivantamab）通过同时阻断 2 条促癌通路并增强 ADCC 效应，实现协同增效，从机制上降低耐药性发生概率 [18]。
BsAbs/MsAbs 的关键作用机制还包括介导免疫细胞的高效共激活。鉴于活化免疫细胞的抗体（如 CD3、CD28 抗体）及细胞因子因治疗窗狭窄而限制临床应用的现状，研究人员通过 BsAbs/MsAbs 的分子设计优化激活效率。例如，赛诺菲公司开发的靶向 CD38×CD3×CD28 的 TsAb 利用CD3 与 CD28 结合域的空间共定位，显著提高 T 细胞激活效率，体外实验表明只需皮摩尔级浓度即可诱导 T 细胞杀伤肿瘤 [19]。与传统 BiTE 相比，该类抗体可在更低剂量下激活免疫应答，减轻相关毒性和副作用。尤其值得关注的是，赛诺菲另一款靶向HER2×CD3×CD28 的 TsAb 可特异性增强 CD4+ T细胞的抗肿瘤效应，这一功能为传统 BsAbs 所不具备 [20]。在 NK 细胞领域，共激活策略同样展现出多样性，GT Biopharma 开发的三特异性 NK 细胞衔接器通过靶向 CD16 并融合重组人白介素-15，在结合 NK 细胞的同时激活其杀伤功能，其 CD19 靶向域可将活化的 NK 细胞与 B 细胞淋巴瘤精准结合，显著增强肿瘤杀伤作用 [21]。
BsAbs/MsAbs 通过共阻断免疫检查点、共激活免疫细胞及协同抑制肿瘤信号通路等多重机制，相较于传统 mAbs 实现了治疗窗的显著优化。其优势在于通过分子设计精准调控肿瘤微环境或免疫细胞网络，在提升疗效的同时降低系统毒性。从 T 细胞双信号共激活到 NK 细胞功能强化，BsAbs/MsAbs正通过不断创新的细胞调控策略，逐步成为下一代肿瘤免疫治疗的重要研究方向。
1.3 BsAbs/MsAbs 的多价效应
BsAbs/MsAbs 不仅能够携带针对不同靶点的抗原结合域，还可整合同一靶点的多个结合域，从而形成多价结构。相比之下，单特异性抗体通常仅为双价结构，即仅具备 2 个抗原结合位点。多价结构在抗体功能中具有关键作用：一方面，其可增强抗体对抗原的整体结合力，例如天然存在的免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）凭借 10 个相同识别位点，显著提高了对抗原的亲和力；另一方面，多价结构也有助于触发 Fc 段介导的效应功能，如补体杀伤通常需要多个 Fc 区域聚集才能有效激活 [22]。 基于多价结构带来的亲和力与效应功能优势，BsAbs/MsAbs 在识别和清除肿瘤细胞方面展现出显著潜力。例如，IGM Biosciences 公司开发的双特异性多价抗体 IGM-2644 含 10 个 CD38 结合位点和 1 个 CD3 结合位点，对高、低表达 CD38 的肿瘤均有显著杀伤作用；而靶向 CD38 的单特异性双价抗体达雷妥尤单抗（daratumumab）对低表达 CD38 的肿瘤效果有限 [23]。除增强识别能力外，多价设计还可提高抗体对靶细胞的选择性，从而降低对正常细胞的毒性。Slaga 等 [24] 开发的一款靶向 CD3×HER2的双特异性 3 价抗体，引入 2 个低亲和力 HER2 结合域（亲和力为对照单价抗体的 1/100），该设计显著减弱其对低表达 HER2 正常细胞的杀伤作用，而对高表达 HER2 肿瘤细胞维持高效活性，有望提升治疗安全性。
综上，BsAbs/MsAbs 不仅能够模拟多种抗体联合应用的协同阻断效应，还可借助多靶向、多价等结构特点，实现免疫细胞衔接、时空同步靶向、强化靶细胞识别及减少脱靶毒性等多种功能。这些功能优势主要源于其多靶向能力与多价效应的有机结合，也由此奠定了 BsAbs/MsAbs 在肿瘤免疫治疗中不可或缺的地位。
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BsAbs/MsAbs 的制备技术研究进展
自首款 BsAb 卡妥索单抗（catumaxomab）获批以来，该领域经历了快速的技术革新与临床转化，BsAbs/MsAbs 的工程化平台蓬勃发展，如 Knobsinto-Holes、CrossMAb、DVD-Ig、Nanobody-based等，极大优化了BsAbs/MsAbs 的稳定性、表达产量、药代动力学特性和功能活性。近年来，更多候选分子处于活跃的临床前和临床试验阶段，靶点组合日益丰富，结构形式不断创新。基于结构通常可将 BsAbs 分为带有 Fc 段的 IgG 样抗体和非 IgG 类型抗体，MsAbs 的制备平台通常在 BsAbs 的基础上通过基因工程技术共表达功能元件，其中功能元件涵盖细胞因子、纳米抗体、单链片段抗体等具有功能性的蛋白分子，以实现多特异性 [25-26]。
2.1 IgG 类型的 BsAbs/MsAbs 制备方法
IgG 抗体由 2 条同源轻链和 2 条同源重链自组装形成，结构包含抗原结合片段（fragment antigenbinding，Fab段）和 Fc 段， 其 中 Fc 段具有重要的生物学功能：不仅能与 Fc 受体（Fc receptor，FcR）结合介导 ADCC、ADCP、CDC，还能通过与 FcR 的相互作用延长抗体的体内半衰期，是抗体发挥功能的核心单元之一 [27]。鉴于此，在 BsAbs和 MsAbs 的构建过程中，部分策略需保留 Fc 段功能，由此衍生出一系列基于 IgG 的 BsAb/MsAb 平台技术。
在早期探索中，BsAbs 的传统构建方法是利用遗传学手段将产生 2 种不同抗体的杂交瘤细胞进行融合，使其自发形成轻链与重链的交叉配对。然而，该过程会生成复杂混合物，其中包含多达 10 种错配产物（如同源二聚体、聚集体或半抗体），且其生化性质与目标 BsAbs 高度相似，导致纯化极为困难 [28]。因此，基于 IgG 的 BsAbs 构建技术的关键在于解决重链与轻链的错配问题，其中重链错配的调控是早期研究的重点方向。
针对重链错配难题，研究人员开发了多种定向异源二聚化策略。Ridgway 等 [29] 提出的“锁钥策略”（knobs-into-hole，KiH）通过改造一条重链 Fc 区形成“凸起”（knob）结构，另一条形成“凹陷”（hole）结构，利用空间构象互补性促进重链的正确配对，优先形成异源二聚体，有效抑制同源二聚体的形成。
除空间互补策略外，电荷调控机制也被成功应用于重链配对调控。Wei 等 [30] 开发的电荷排斥诱导双特异性技术，通过在同源重链的 CH3 区引入相同电荷基团，利用静电排斥作用减少同源配对，从而提高异源二聚体的形成效率。Krah 等 [31] 则基于天然抗体的重链交换机制，在 2 种 IgG1 抗体的重链中分别引入 K409R 和 F405L 突变，使抗体在还原条件下可高效发生重链交换，异源二聚体产率超过 90%，为规模化制备提供了新路径。
随着重链错配问题的逐步解决，轻链错配成为制约当前 BsAbs 平台技术开发的重要挑战，一系列针对性解决方案应运而生。药明生物开发的 WuXiBody平台在采用 KiH 策略解决重链错配的基础上，创新性地引入 TCR 恒定区替代抗体的轻链与重链恒定区，通过结构改造使工程化轻链无法与普通抗体重链形成有效配对，从分子机制上避免轻链错配 [32]。罗氏公司的CrossMAb技术是目前临床广泛应用的轻链错配解决方案，该技术通过对轻链与重链的结构域进行定向互换（包括恒定区/可变区互换、可变区单独互换或恒定区单独互换），使普通轻链与改造后的重链因结构不兼容而无法形成错配复合物 [33]。 此外，共同轻链技术也是常用策略之一，该技术通过基因工程手段将小鼠抗体的轻链可变区固定为共同序列，筛选获得的抗体天然具备相同轻链，结合 KiH 重链改造技术即可实现重链异源配对，大幅简化 BsAbs 的构建流程 [34]。
在成熟 BsAbs 构建平台的基础上，MsAbs 的开发主要通过在抗体分子中引入额外功能元件实现，这些元件可融合于 Fc 段或 Fab 段，包括单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）、Fab、细胞因子及单域抗体等。例如，Hu 等 [35] 基于 CrossMAb 技术构建了靶向 EGFR×HER3 的 BsAb，并在其轻链与重链可变区融合新的 Fab 段，成功获得靶向 EGFR×HER2×HER3× 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的 4 价四 特 异 性 抗 体（tetraspecific antibody，TetraAb）；Castoldi 等 [36] 则在轻链融合 scFv、在 Fc 段融合单链 Fab（scFab），构建了靶向 HER1× 胰岛素样生长因子-1 受体 ×HER3×c-Met 的 4 价 TetraAb；康方生物进一步展示了该策略的临床转化潜力，其通过在抗体 Fc 段直接融合 scFv 的方式，开发出靶向 PD-1×VEGF 的 4 价 BsAb 依沃西单抗（ivonescimab），该药物目前已成功获批上市，为BsAbs 的产业化发展提供了重要参考 [37]。
2.2 基于抗原结合域的 BsAbs/MsAbs 制备方法
基于 Fc 段的 BsAbs 构建技术虽保留了抗体天然结构和 Fc 段功能，但轻链或重链的错配问题仍未得到彻底解决。对于无需 Fc 段介导功能的 MsAbs设计，仅需考虑功能元件的连接与组装，目前广泛应用的策略是通过重组蛋白技术连接 scFv、Fab、重链抗体的重链可变区（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH，即纳米抗体核心功能单元）等功能元件。其中，化学试剂共价交联 2 个抗体片段或完整抗体以制备双功能抗体片段的方法并不常用，原因在于其在制备过程中出现抗体多聚、免疫原性升高及产物活性丧失等问题。近年来，Doppalapudi 等 [38] 开发了基于靶向肽的精准化学修饰技术，构建出偶联反应肽修饰的 BsAbs（CovX-Bodies），尽管该技术中靶向肽的选择范围相对有限，但仍为 BsAbs/MsAbs 的制备提供了新的技术思路。
采用重组蛋白技术串联 scFv 是目前应用最广泛的方法之一。该策略通过连接肽将 2 个或多个靶向不同抗原的 scFv、VHH 等功能元件串联，形成重组融合蛋白。临床获批药物 BsAb 贝林妥欧单抗（blinatumomab）便是典型代表，其通过柔性GGGGS 连接肽，将靶向 CD3 的 scFv 与靶向 CD19的 scFv 串联为单一多肽链，经重组表达后可同时结合 CD3 与 CD19，在复发/难治性急性 B 细胞淋巴瘤治疗中实现了 34% 的完全缓解率 [39]。将该串联策略延伸至三特异性或四特异性分子构建时，只需通过相同连接肽引入更多抗体片段即可。例如，Felices等 [40] 采用 (G4S)4 连接肽，串联靶向 CD16（NK 细胞表面）、CD19（肿瘤细胞表面）及 CD22（肿瘤细胞表面）的抗体片段，构建的 MsAbs 可同时衔接 NK 细胞与 B 淋巴瘤细胞，在混合谱系表达的 B 淋巴瘤模型中展现出良好治疗效果；基石药业则通过串联 scFv，构建了靶向 PD-L1×4-1BB×人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的 TsAb，其中HSA 靶向域可延长分子体内半衰期，解决了无 Fc段 MsAbs 的药代动力学缺陷 [41]。
除 scFv 外，抗体 Fab 段因结构稳定性高、抗原结合活性可靠，成为 MsAbs 构建的理想模块。为提升产物均一性，Lewis 等 [42] 通过连接肽介导 2 种 Fab 重链共表达，引导轻链自发配对形成异二聚体，构建出靶向 EGFR×CD3 的 BsAbs，其研究证实，基于完整 Fab 结构的 BsAbs 相较 scFv 片段构建体具有更优的结构稳定性。
利用纳米抗体构建多特异性分子是 MsAbs 研发的另一重要途径，其核心模块包括羊驼抗体抗原结合域和鲨鱼抗体抗原结合域等。Conrath 等 [43] 利用骆驼源单域抗体片段，先构建靶向成纤维细胞激活蛋白和 CD3 的 BsAbs，再通过融合靶向 PD-1 的 VHH 片段，成功构建了 MsAbs 分子。鉴于纳米抗体分子量显著低于传统抗体，该方法构建的 MsAbs在肿瘤组织渗透方面展现出独特优势。
近年来，蛋白质工程技术的突破性进展推动了异二聚化及多聚化平台的兴起，这类平台通过定向组装不同功能单元构建 MsAbs，为传统串联策略提供了替代方案。由于 IgG 分子重链 CH1 结构域和轻链 CL 结构域具有天然的配对组合特性，并可形成稳定的链间二硫键，该结构可作为高效异二聚化框架平台。Müller 等 [44] 分别在抗 EGFR 的 scFv 和抗CD2 的 scFv 末端融合 CH1 和 CL 结构域，实验结果显示 CH1 和 CL 可自发配对并形成稳固二硫键，成功将 2 个异源 scFv 组装为功能性 BsAbs 分子。除利用 IgG 片段作为组装支架外，部分异二聚化多抗构建策略还采用非 IgG 分子作为基础支架，其中“dockand-lock”（锚定-锁定）策略最具代表性。Rossi等 [45] 以蛋白激酶 A 的 Ⅱ 型调节亚基作为“锚”，蛋白激酶 A 锚定蛋白的锚定结构域作为“锚点”，并在“锚”和“锚点”末端引入半胱氨酸残基；通过蛋白重组技术将“锚”和“锚点”分别融合至 Fab 重链 CH1 结构域的 C 端，引导 2 个 Fab 重链二聚化形成 BsAbs；若进一步加入带有“锚点”的 Fab 段，可与二聚化的 BsAbs 结合形成 MsAbs 分子。与直接串联策略相比，二聚化或多聚化组装方式在分子设计上更具挑战性，而功能元件串联法则因操作简便、通用性强，在 MsAbs 设计中仍占据主导地位。
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BsAbs/MsAbs 面临的挑战与新策略
相较于传统 mAbs，具备多靶点靶向功能的BsAbs/MsAbs 在分子结构上更为复杂，显著提高了生产工艺控制难度。同时，多靶点间潜在的协同激活或相互拮抗效应使其作用机制呈现多样性，对耐药性及安全性的研究提出更高要求。随着全球范围内多款 BsAbs 相继进入临床及上市阶段，中美药品监管机构已针对性发布专项技术指南，为该类药物的研发提供明确规范。
美国食品药品监督管理局于 2021 年 5 月 24日发布的《双特异性抗体研发项目行业指南》 (Bispecific Antibody Development Programs: Guidance for Industry)，从药学研究、非临床评价及临床研究三大维度，明确了 BsAbs 的开发技术要求与监管原则：其一，按功能机制将 BsAbs 分为双靶点协同依赖型与桥接功能型，强调研发过程中需清晰阐明靶点间的协同作用机制，量化分析各靶点结合结构域差异化亲和力 / 解离速率对药效的影响，并通过对比研究证实其相较于对应靶点的 2 种单抗联合用药的显著临床优势（包括疗效提升或安全性改善）；其二，药学研究中需重点关注聚集体形成、错配杂质控制及免疫原性风险评估等关键问题；其三，非临床研究需通过体内外实验验证靶点协同或效应叠加的科学合理性；其四，临床研究中需建立量化方法表征双靶点结合状态，若靶点之一已有获批单抗，则需开展头对头临床试验以明确 BsAbs 与单抗的疗效及安全性差异。
我国国家药品监督管理局药品审评中心发布的《双特异性抗体抗肿瘤药物临床研发技术指导原则》则基于分子结构特征将 BsAbs 分为 IgG 样与非 IgG样两大类，同样强调靶点组合需具备明确的协同作用机制或能够解决临床未被满足的需求，而非简单叠加 2 种抗体的靶向功能。该指南将监管聚焦于首次人体试验风险控制策略、免疫原性的系统评价及给药方案优化，同时明确规定，若 BsAbs 所靶向的某一靶点已存在上市单抗，需将该单抗的标准治疗方案纳入临床试验对照组，以科学评估 BsAbs 的临床价值。
综上，尽管 BsAbs 的技术平台日趋多元化，但其固有的结构复杂性仍制约研发进程；而 MsAbs 因靶点数量进一步增加，目前尚未建立起通用化的构建与生产平台。与此同时，日益细化的监管要求使BsAbs/MsAbs 的研发面临靶点组合合理性论证、分子结构稳定性保障及开发成本有效控制等多重持续挑战。近年来，纳米技术与 AI 技术等新兴策略为BsAbs/MsAbs 研发注入新动能。纳米颗粒凭借可定制的结构与表面功能基团，已广泛应用于肿瘤靶向递送系统 [46-49]，其经抗体修饰后呈现的多价结合能力与多特异性靶向效应，正成为新型 MsAbs 构建的重要路径。AI 技术则通过高效推进蛋白质分子的理性设计及亲和力优化，显著提升了 BsAbs/MsAbs 的开发效率与成功率。下文将详细阐述纳米技术和 AI 技术在 BsAbs/MsAbs 构建及优化中的具体应用。
3.1 纳米技术在 BsAbs/MsAbs 研究中的应用
纳米材料可通过静电相互作用、疏水相互作用、范德华力等分子间作用力与蛋白质发生特异性或非特异性结合。在体内生物环境中，纳米颗粒进入血液循环后常与血浆蛋白发生物理吸附，形成“蛋白冠”结构。尽管蛋白冠的形成可能影响部分纳米颗粒的性能，但这一特性可被反向应用于体外抗体蛋白的定向吸附，为构建具有抗体功能的纳米颗粒提供了技术基础 [50]。
多项研究证实了纳米颗粒介导的抗体吸附策略的可行性。Roque 等 [51] 早在 2009 年就进行了抗体与氧化铁纳米颗粒在磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）中混合的实验，结果证实氧化铁纳米颗粒能够吸附抗体；Tonigold 等 [52] 则利用表面带有负电荷的纳米颗粒，通过静电相互作用将靶向 CD63 的抗体固定于纳米颗粒表面，实验表明，该抗体修饰纳米颗粒对高表达 CD63 的 DC 的结合能力较未修饰纳米颗粒显著提升；后续研究中，研究者将靶向 CD63 的抗体替换为靶向 CD3 的抗体后，仍成功实现抗体在纳米颗粒表面的吸附，提示该纳米吸附策略具有良好的普适性，可支持多种抗体分子的固定。
除静电相互作用外，疏水相互作用也被用于构建抗体功能化纳米颗粒。Du 等 [53] 设计了一种自组装聚丙烯砜 [poly(propylene sulfone)，PPSU] 纳米颗粒，该纳米颗粒可通过疏水作用力吸附蛋白。该团队将靶向 Siglec-6 的抗体和靶向 FcεRIα 的抗体与PPSU 在 PBS 中混合，成功制备出具有 BsAbs 功能的纳米颗粒。
然而，纳米颗粒介导的抗体物理吸附策略存在诸多局限性，限制了该技术的进一步应用。其一，抗体与纳米颗粒的物理吸附作用具有可逆性，在体内复杂环境中，血浆 Ig 的竞争性结合、pH 变化及疏水作用强度改变等因素，均可能导致抗体从纳米颗粒表面脱落，影响功能稳定性；其二，基于物理吸附的 MsAbs 纳米颗粒面临质量控制挑战，非特异性吸附现象的存在不仅导致纳米颗粒表面功能性抗体分子的准确定量难以实现，还会造成不同制备批次间产品质量的显著差异。
与物理吸附相比，化学偶联技术能使抗体与纳米颗粒表面的结合更为稳定。例如，Mi 等 [54]采用巯基-马来酰亚胺化学偶联法，将 PD-1 抗体与 OX40 抗体共修饰于聚乙二醇-聚丙交酯-乙交 酯共聚物 [（polyethylene glycol-poly(lactic-co-glycolic acid)，PEG-PLGA）] 纳米颗粒表面，制备出平均粒径为 100.1 nm 的双特异性纳米颗粒，负载量分别达49.1 µg · mg-1（PD-1 抗体）和 44 µg · mg-1（OX40 抗体）；该策略不仅能同时靶向 T 细胞上的 PD-1 和 OX40，实现 BsAbs 功能，还可简便地通过控制抗体投入量调控 2 种不同抗体在颗粒表面的价态，研究者通过构建 PD-1 抗体与 OX40 抗体比例为 2 : 1 的双特异性纳米颗粒，验证了该调控机制的可行性。Kosmides 等 [55] 同样利用马来酰亚胺介导的化学偶联技术，将 PD-L1 抗体和 4-1BB 抗体共修饰于纳米颗粒表面，构建了具有“免疫开关（immunoswitch）”功能的双特异性纳米平台，该纳米颗粒可通过双靶向作用实现桥连表达 4-1BB 的 T 细胞和表达 PD-L1 的肿瘤细胞的独特效应。Yuan 等 [56] 使用羧基修饰的纳米颗粒，通过羧基与氨基的反应将抗体共价结合于纳米颗粒表面，构建了带有靶向 HER2 抗体和靶向巨噬细胞钙网蛋白的双功能纳米颗粒，显著增强了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性；Chiang 等 [57]利用还原胺反应将抗体固定在氧化铁纳米颗粒表面，构建了靶向 PD-1×CD3×CD28 的三特异性纳米颗粒。该纳米颗粒不仅能有效激活 T 细胞，还可靶向肿瘤细胞 PD-L1，在阻断 PD-L1 免疫检查点通路的同时，增强 T 细胞对肿瘤细胞的重定向作用，完美实现了 TsAbs 的功能。
尽管化学偶联策略在 MsAbs 纳米体系构建中展现出结合稳定、不可逆的优势，但其技术瓶颈仍不容忽视。一方面，化学修饰过程可能会降低抗体活性，如非特异性羧基-氨基反应可能导致抗体抗原结合域的氨基与纳米颗粒表面非靶向结合，进而降低抗体亲和力；另一方面，修饰过程中使用的化学试剂（如二苯并环辛炔）或有机溶剂（如氯仿）可能残留于纳米颗粒表面，这类物质具有潜在的生物毒性或免疫原性。此外，纳米颗粒表面未完全反应的化学修饰基团可能在体内引发非特异性生物反应，增加了临床应用的安全隐患。
生物亲和策略具有高亲和力和生物安全性的优势。Alhallak 等 [58] 基于链霉素 - 亲和素生物系统开发了一种可实现多特异性、多价态调控的抗体平台（nanoMuTEs）。该平台的构建原理为：将靶向不同抗原的抗体（如抗 CD3 抗体、抗 HER2 抗体、抗 CD20 抗体等）对亲和素进行修饰后，再与链霉素标记的纳米颗粒共孵育，即可制备得到nanoMuTEs。基于该平台，研究团队进一步开发了靶 向 CD3×CD20 的双特异性 nanoMuTEs、靶向CD3×CD38×BCMA 的三特异性 nanoMuTEs 和靶向 CD3×CD38×BCMA× 细胞表面抗原 1 的四特异性 nanoMuTEs，充分展现了其在构建 MsAbs 纳米颗粒方面的巨大潜力。
SpyTag-SpyCatcher 系统是另一种独特的生物亲和体系，其特征为：SpyTag 与 SpyCatcher 通过亲和作用结合后，会在 2 种蛋白分子之间形成稳定的共价键，从而实现二者的不可逆牢固结合。Wang 等 [59] 利用这一亲和系统，构建了表面展示 SpyCatcher 的自组装纳米颗粒，表征结果显示该纳米颗粒平均粒径约为 40 nm，且表面含有 60 个 SpyCatcher 位点供 SpyTag 修饰分子结合。研究人员将 SpyTag 修饰的抗体与该纳米颗粒共孵育，制备出多价态、多特异性的 MsAbs 纳米颗粒。在该研究中，团队选用针对新型冠状病毒 [ 严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）] 不同抗原位点的 3 种抗体，成功构建了能强力中和 SARS-CoV-2 的 TsAbs 纳米颗粒。此外，Krishnan 等 [60] 将表达 SpyCatcher 的细胞膜包裹在 PLGA 聚合物纳米颗粒表面，并与表达 SpyTag的靶向抗体（如抗 EGFR 抗体、抗 HER2 抗体等）高效结合，构建成具有多价抗体功能的细胞膜包裹纳米颗粒。
除上述体系外，利用抗 Fc 抗体或 FcR 介导的特异性结合作用，也是构建多价态纳米颗粒的有效策略。该方法的优势在于无需对目标抗体进行修饰，从而降低了制备流程的复杂性，并减少了对抗体天然功能的干扰。Wiklander等[61]以细胞外囊泡为载体，采用相似的策略构建了一种表达抗体 Fc 段结合位点的细胞外囊泡，利用该囊泡与抗体 Fc 段的特异性相互作用，可将抗体直接固定于囊泡表面，形成多价态结构。Jiang 等 [62] 则采用“纳米适配子”构建策略，将抗 Fc 抗体锚定在聚苯乙烯颗粒表面，随后与治疗性抗体混合，成功制备出可同时靶向 PD-1 和 PD-L1 的多价态双特异性纳米颗粒。在此基础上，Ye 等 [63]进行了载体材料的优化，采用白蛋白-聚乳酸自组装纳米颗粒替代聚苯乙烯颗粒，构建得到生物安全性更优、临床转化前景更广阔的“纳米适配子”。此外，Fan 及其团队 [64] 设计了 FcR-白蛋白融合蛋白，并将其与聚乳酸直接进行自组装，构建成可高效结合治疗性抗体 Fc 段的纳米颗粒。体内实验结果表明，该纳米颗粒能够显著提升治疗性抗体在肿瘤部位的富集效率，同时借助多价态效应进一步增强抗体的靶向治疗效果，为抗体药物的增效递送提供了新的技术路径。
值得注意的是，生物分子的精确自组装技术已成为 MsAbs 制备的另一重要技术方向。例如，Wagenbauer 等 [65] 报道了一种基于 DNA 折纸术的MsAbs 构建方法，其团队通过精准设计 DNA 折纸纳米框架，使框架表面暴露未配对 DNA 链，这些单链的数量和空间位置可根据靶向需求进行调整，随后将带有互补配对 DNA 链修饰的抗体与该纳米框架孵育，通过碱基互补配对作用即可形成 MsAbs DNA 折纸产物。此外，Zhang 等 [66] 基于多价 IgM蛋白的自组装特性，构建了可精确自组装形成 6 价态抗体的多价态抗体平台。综上，基于纳米载体的BsAbs/MsAbs 构建技术近年来发展迅速，其具有构建流程简便、靶点组合筛选快捷的特点，为 MsAbs药物的研发提供了有力支撑。
3.2 AI 技术在 BsAbs/MsAbs 研究中的应用
尽管 BsAbs/MsAbs 的构建策略丰富多样，但在药物设计与制备环节仍面临诸多严峻挑战。以基于 IgG 的 MsAbs 为例，其制备过程中需针对不同抗原靶点开展大量亲和力筛选实验，不仅消耗海量资源，还需投入重复性人工劳动。赛诺菲研发的CD3×CD28×CD38 TsAb 中， 其 分 别 靶 向 CD3、CD28 的抗原结合域与靶向肿瘤细胞表面 CD38 抗原的抗原结合域的比例难以灵活调控。研究人员指出，该 TsAb 在临床试验中引发严重毒性和副作用，其诱因可能是细胞活化效应过强——在药物剂量尚未达到治疗有效浓度时，CD3 和 CD28 抗体介导的激活作用已超出机体安全耐受阈值。由此可见，通过平衡不同靶点间的亲和力以控制抗体副作用，需付出极高的研发成本。与此同时，MsAbs 制备中的结构稳定性问题，同样需要通过大量实验加以解决；而在抗体进入生产阶段前，目前尚无标准化模型可从氨基酸序列层面精准预测 BsAbs 的表达稳定性及聚集、错配等潜在风险。
传统的 BsAbs/MsAbs 发现模式具有劳动密集型特征，不仅研发成本高昂、周期漫长，还受限于筛选通量——仅能对有限的靶点组合、亲和力配比、价态组合及成药性特征进行探究，极易错失最优候选抗体。近年来，AI 技术正推动抗体药物研发模式发生转变，其在蛋白结构预测方面取得重要进展：ImmuneBuilder 基于蛋白质数据库中的免疫蛋白及复合物结构数据、大规模免疫组库序列，结合分阶段训练、领域自适应微调算法与注意力模块技术，设计了免疫蛋白专用深度学习结构预测模型，对抗体-抗原复合物界面主链的预测精度达 0.9 Å（界面均方根偏差为 0.9 Å，1 Å = 0.1 nm），为 BsAbs 的精准设计提供原子级参考依据 [67]；He 等 [68] 基于大语言模型开发了 PALM-H3，该模型利用超过 12 亿条抗体重链序列完成预训练，可从头生成具有特定抗原结合活性的人工抗体重链互补决定区 3（heavy chain complementarity-determining region 3，CDRH3），体外实验证实，PALM-H3 所生成的抗体对 SARSCoV-2野生型及 Alpha、Delta 和 XBB 等重要变异株均表现出高亲和力，为解析抗体设计的内在机制提供了关键见解；Watson 等 [69] 则利用 RFdiffusion 和ProteinMPNN 等 AI 模型，直接预测能够与靶蛋白特定表位结合的单域抗体序列，并借助 ProteinMPNN优化抗体 CDR 区域，实现了靶向流感病毒、SARSCoV-2等抗原的单域抗体快速发现。AI 技术在抗体发现中展现的快速、高效优势，有望加速 BsAbs/MsAbs 的设计与研发进程，在该领域具有广阔的应用前景。
在 BsAbs/MsAbs 的靶点组合筛选方面，AI 技术基于海量数据分析，有望更迅速地发现高效靶点组合。Zhang 等 [70] 将 XGboost 模型与 GPT 模型相结合，提出一种名为 BiSpec Pairwise AI（BSPAI）的靶点组合预测策略。该模型以不同细胞的基因表达谱数据及已获批 BsAbs 的临床信息为输入特征，综合考量靶点对的安全性、双阳性表达比例及作用机制协同性等关键因素，实现对最优 BsAbs 靶点组合的精准预测。前期研究结果表明，CTLA-4 与 PD-L1 的靶点组合具有极强的 BsAbs 开发潜力。
构建不同亲和力的抗体组合是 BsAbs/MsAbs 研发中另一项重复性强的工作。尽管定向进化和噬菌体展示等技术能够高通量筛选不同亲和力的抗体，但仍存在成本高、耗时长的问题。而基于预训练模型的 AI 技术能够快速优化已知抗体的亲和力，生成优化后的高亲和力抗体序列。因此，针对既定的抗体组合，利用 AI 技术能够快速构建一系列对不同靶点具有不同亲和力的 BsAbs/MsAbs，为阐明靶点亲和力与治疗效果的关系提供重要工具。
结构稳定性是 BsAbs/MsAbs 研发面临的另一重大挑战。尽管锁钥结构设计、链交换等技术已在较大程度上降低了轻链和重链的错配风险，但随着抗体特异性和结构复杂程度的提升，链错配和热稳定性问题依然突出。生产前实现抗体稳定性优化，是决定其成药潜力的关键环节。AI 技术可依据抗体序列特征预测其中可能导致聚集的部分，例如根据疏水性和电荷性质预测易引发抗体聚集的区域，从而在设计阶段尽量规避；AbMelt 模型将机器学习与分子动力学模拟相结合，可精准预测抗体的热稳定性指标（包括聚集温度、熔化温度等），助力在设计阶段高效排除成药性差的候选分子 [71]。
综上所述，AI 技术在 BsAbs/MsAbs 靶点组合筛选、亲和力优化以及稳定性预测等方面，有望提供高效、低成本的解决方案，助力降低 BsAbs/MsAbs的研发成本，为 BsAbs/MsAbs 设计提供更优方案。
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结语与展望
BsAbs/MsAbs 凭借其独特的多靶向识别能力和多价效应，在肿瘤免疫治疗领域展现出巨大的发展潜力。这类抗体可同时靶向多个 TAA 或免疫调节分子，有效突破肿瘤异质性、耐药性及免疫抑制微环境等治疗瓶颈，已成为当前肿瘤治疗领域最具前景的研发方向之一。目前，全球范围内已有 10 余款 BsAbs 药物获批上市，众多候选分子也已进入临床试验阶段，这些成果充分验证了 BsAbs/MsAbs 的临床治疗价值。例如，靶向 CD3×CD20 的 BsAbs 在 B 细胞淋巴瘤治疗中表现出良好的疗效，能够有效激活 T 细胞，精准杀伤肿瘤细胞。然而，在 BsAbs/MsAbs 领域蓬勃发展的同时，仍面临着诸多挑战，如靶点组合筛选的盲目性、分子设计的复杂性、制备工艺的可控性以及临床毒性和副作用的管理等。传统研发模式依赖大量重复性实验，存在研发周期长、成本高的固有缺陷。
AI 技术的迅猛发展为破解上述难题提供了新的思路和技术路径。AI 驱动的系统生物学模型和基于蛋白质序列的抗体预测模型具有强大的数据整合和分析能力，可有效整合基因表达谱、蛋白质组学、分子互作网络及蛋白稳定性等海量生物医学数据。通过对这些数据的挖掘与建模，AI 能够实现最优靶点组合的精准预测，例如提出 PD-1/T 细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif domain，TIGIT）/淋巴细胞活化基因-3 编码蛋白（lymphocyte activation gene-3 encoded protein，LAG-3）共阻断、CD28/4-1BB/ 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白共激活等协同策略。以PD-1/TIGIT/LAG-3 共阻断策略为例，AI 模型通过解析三者的功能协同机制——PD-1 主要通过抑制 T 细胞活性介导肿瘤免疫逃逸，TIGIT 可同时抑制 NK 细胞和 T 细胞功能，LAG-3 则通过调控 T 细胞增殖与活化参与免疫抑制——结合不同肿瘤中三者的表达特征及互作网络，证实同时阻断这 3 个靶点可全方位解除肿瘤免疫抑制，从而显著增强免疫细胞的抗肿瘤杀伤效能。
更为重要的是，AI 模型能够精准评估靶点组合的时空协同逻辑，判断是否需要同步阻断抑制信号与提供激活信号，这对 BsAbs/MsAbs 的功能优化至关重要。例如，在阻断 PD-1 等抑制性信号的同时，激活 CD28 等共刺激分子，可在解除免疫抑制的基础上为 T 细胞提供有效的激活信号，使其更好地发挥抗肿瘤作用。AI 模型通过模拟不同信号通路的激活和抑制过程，能够确定最佳的靶点组合和作用时机，从而实现更精准的免疫调节。
在成药性筛选与分子设计层面，AI 技术同样展现出显著优势。在抗体设计阶段，AI 模型可基于蛋白质序列和结构信息，预测抗体的稳定性、亲和力、免疫原性等关键成药性指标。例如，通过分析抗体的氨基酸序列，预测其是否容易形成聚集结构，评估其在生产和储存过程中的稳定性，从而在研发早期排除成药性差的候选分子，降低后续研发风险与成本。在分子结构优化方面，AlphaFold2 等 AI 模型可实现蛋白质三维结构高精度预测，为抗体的设计提供结构参考，大幅缩短传统实验优化周期。
然而，AI 在 BsAbs/MsAbs 研发中的应用仍面临挑战：一方面，AI 模型的准确性高度依赖高质量训练数据，而当前生物医学数据普遍存在噪声干扰、标注不完整等问题；另一方面，AI 模型的可解释性不足，特别是在涉及关键的治疗决策时，需要明确 AI 模型的预测依据和原理。为了充分发挥 AI 在 BsAbs/MsAbs 研发中的作用，需从两方面突破：一是加强生物医学数据基础设施建设，提高数据质量和共享水平；二是不断改进 AI 算法，提高模型的准确性和可解释性。
随着 AI 技术的不断发展和完善，其在 BsAbs/MsAbs 研发中的应用将更加深入广泛。AI 有望推动BsAbs/MsAbs 研发从“经验驱动”迈向“数据驱动”的理性设计阶段，显著加速候选分子的发现与优化进程，为肿瘤免疫治疗带来新的突破。
参考文献：
[1] Paul S, Konig M F, Pardoll D M, et al. Cancer therapy with antibodies[J]. Nat Rev Cancer, 2024, 24(6): 399-426.
[2] Verdin P. Top companies and drugs by sales in 2024[J]. Nat Rev Drug Discov, 2025, 24(4): 240.
[3] Huang A C, Zappasodi R. A decade of checkpoint blockade immunotherapy in melanoma: understanding the molecular basis for immune sensitivity and resistance[J]. Nat Immunol, 2022, 23(5): 660-670.
[4] Chamoto K, Yaguchi T, Tajima M, et al. Insights from a 30-year journey: function, regulation and therapeutic modulation of PD1[J]. Nat Rev Immunol, 2023, 23(10): 682-695.
[5] Lotze M T, Olejniczak S H, Skokos D. CD28 co-stimulation: novel insights and applications in cancer immunotherapy[J]. Nat Rev Immunol, 2024, 24(12): 878-895.
[6] Shah D, Soper B, Shopland L. Cytokine release syndrome and cancer immunotherapies-historical challenges and promising futures[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1190379.
[7] Daniel Lagassé H A, Hengel H, Golding B, et al. Fc-fusion drugs have FcγR/C1q binding and signaling properties that may affect their immunogenicity[J]. AAPS J, 2019, 21(4): 62.
[8] Jin Z, Zhou Q, Cheng J N, et al. Heterogeneity of the tumor immune microenvironment and clinical interventions[J]. Front Med, 2023, 17(4): 617-648.
[9] Hu-Lieskovan S, Malouf G G, Jacobs I, et al. Addressing resistance to immune checkpoint inhibitor therapy: an urgent unmet need[J]. Future Oncol, 2021, 17(11): 1401-1439.
[10] Yao Y, Hu Y, Wang F. Trispecific antibodies for cancer immunotherapy[J]. Immunology, 2023, 169(4): 389-399.
[11] Ellerman D. Bispecific T-cell engagers: towards understanding variables influencing the in vitro potency and tumor selectivity and their modulation to enhance their efficacy and safety[J]. Methods, 2019, 154: 102-117.
[12] Liu X, Zhao J, Guo X, et al. CD20 × CD3 bispecific antibodies for lymphoma therapy: latest updates from ASCO 2023 annual meeting[J]. J Hematol Oncol, 2023, 16(1): 90.
[13] Phung S K, Miller J S, Felices M. Bi-specific and tri-specific NK cell engagers: the new avenue of targeted NK cell immunotherapy[J]. Mol Diagn Ther, 2021, 25(5): 577-592.
[14] Safran H, Cassier P A, Vicier C, et al. Phase 1/2 study of DF1001, a novel tri-specific, NK cell engager therapy targeting HER2, in patients with advanced solid tumors: phase 1 DF1001 monotherapy dose-escalation results[J]. J Clin Oncol, 2023, 41(16_suppl): 2508.
[15] Shapir Itai Y, Barboy O, Salomon R, et al. Bispecific dendritic-T cell engager potentiates anti-tumor immunity[J]. Cell, 2024, 187(2): 375-389.e18.
[16] Dovedi S J, Elder M J, Yang C, et al. Design and efficacy of a monovalent bispecific PD-1/CTLA4 antibody that enhances CTLA4 blockade on PD-1+ activated T cells[J]. Cancer Discov, 2021, 11(5): 1100-1117.
[17] Keam S J. Cadonilimab: first approval[J]. Drugs, 2022, 82(12): 1333-1339.
[18] Neijssen J, Cardoso R M F, Chevalier K M, et al. Discovery of amivantamab (JNJ-61186372), a bispecific antibody targeting EGFR and MET[J]. J Biol Chem, 2021, 296: 100641.
[19] Wu L, Seung E, Xu L, et al. Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation[J]. Nat Cancer, 2020, 1(1): 86-98.
[20] Seung E, Xing Z, Wu L, et al. A trispecific antibody targeting HER2 and T cells inhibits breast cancer growth via CD4 cells[J]. Nature, 2022, 603(7900): 328-334.
[21] Cheng Y, Zheng X, Wang X, et al. Trispecific killer engager 161519 enhances natural killer cell function and provides anti-tumor activity against CD19-positive cancers[J]. Cancer Biol Med, 2020, 17(4): 1026-1038.
[22] Oostindie S C, Lazar G A, Schuurman J, et al. Avidity in antibody effector functions and biotherapeutic drug design[J]. Nat Rev Drug Discov, 2022, 21(10): 715-735.
[23] Hart K C, Santos D, Li K, et al. Abstract 1237: IGM-2644, a CD38×CD3 bispecific IgM T cell engager, shows enhanced antitumor activity compared to daratumumab in preclinical models of multiple myeloma[J]. Cancer Res, 2024, 84(6_Supplement): 1237.
[24] Slaga D, Ellerman D, Lombana T N, et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3[J]. Sci Transl Med, 2018, 10(463): eaat5775.
[25] Klein C, Brinkmann U, Reichert J M, et al. The present and future of bispecific antibodies for cancer therapy[J]. Nat Rev Drug Discov, 2024, 23(4): 301-319.
[26] Giese G, Williams A, Rodriguez M, et al. Bispecific antibody processdevelopment: assembly and purification of knob and hole bispecific antibodies[J]. Biotechnol Prog, 2018, 34(2): 397-404.
[27] 吴亚辉 , 罗龙龙 , 张冉 . 治疗性抗体半衰期研究进展 [J] . 药学进展, 2024, 48(1): 70- 附页 2.
[28] Chen S W, Zhang W. Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies [J]. Antibody Therapeutics, 2021, 4(2): 73-88.
[29] Ridgway J B, Presta L G, Carter P. ‘Knobs-into-holes’ engineering of antibody CH3 domain for heavy chain heterodimerization[J]. Protein Eng, 1996, 9(7):617-621.
[30] Wei H, Cai H, Jin Y, et al. Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production[J]. Oncotarget, 2017, 8(31): 51037-51049.
[31] Krah S, Sellmann C, Rhiel L, et al. Engineering bispecific antibodies with defined chain pairing[J]. N Biotechnol, 2017, 39(Pt B): 167-173.
[32] Dong W, Li Y. Complementary methods for monitoring hole-hole homodimer associated with a WuXiBody-based asymmetric bispecific antibody[J]. Protein Expr Purif, 2023, 210: 106316.
[33] Klein C, Schaefer W, Regula J T. The use of CrossMAb technology for the generation of bi- and multispecific antibodies[J]. MAbs, 2016, 8(6): 1010-1020.
[34] Rong Y, Chen I L, Larrabee L, et al. An engineered mouse model that generates a diverse repertoire of endogenous, high-affinity common light chain antibodies [J]. Antibodies, 2024, 13(1): 14.
[35] Hu S, Fu W, Xu W, et al. Four-in-one antibodies have superior cancer inhibitory activity against EGFR, HER2, HER3, and VEGF through disruption of HER/MET crosstalk[J]. Cancer Res, 2015, 75(1): 159-170.
[36] Castoldi R, Schanzer J, Panke C, et al. TetraMabs: simultaneous targeting of four oncogenic receptor tyrosine kinases for tumor growth inhibition in heterogeneous tumor cell populations[J]. Protein Eng Des Sel, 2016, 29(10): 467-475.
[37] Zhao Y, Chen G, Chen J, et al. AK112, a novel PD-1/VEGF bispecific antibody, in combination with chemotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): an open-label, multicenter, phase II trial[J]. EClinicalMedicine, 2023, 62: 102106.
[38] Doppalapudi V R, Tryder N, Li L, et al. Chemically programmed antibodies: endothelin receptor targeting CovX-Bodies[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2007, 17(2): 501-506.
[39] Goebeler M E, Bargou R C. T cell-engaging therapies: BiTEs and beyond[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2020, 17(7): 418-434.
[40] Felices M, Lenvik T R, Davis Z B, et al. Generation of BiKEs and TriKEs to improve NK cell-mediated targeting of tumor cells[J]. Methods Mol Biol, 2016, 1441: 333-46.
[41] Warmuth S, Gunde T, Snell D, et al. Engineering of a trispecific tumor-targeted immunotherapy incorporating 4-1BB co-stimulation and PD-L1 blockade[J]. Oncoimmunology, 2021, 10(1): 2004661.
[42] Lewis S M, Wu X, Pustilnik A, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(2): 191-198.
[43] Conrath K E, Lauwereys M, Wyns L, et al. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs[J]. J Biol Chem, 2001, 276(10): 7346-7350.
[44] Müller K M, Arndt K M, Strittmatter W, et al. The first constant domain (CH1 and CL) of an antibody used as heterodimerization domain for bispecific miniantibodies[J]. FEBS Lett, 1998, 422(2): 259-264.
[45] Rossi E A, Goldenberg D M, Chang C H. Complex and defined biostructures with the dock-and-lock method[J]. Trends Pharmacol Sci, 2012, 33(9): 474-481.
[46] Francis D M, Manspeaker M P, Archer P A, et al. Drug-eluting immune checkpoint blockade antibody-nanoparticle conjugate enhances locoregional and systemic combination cancer immunotherapy through T lymphocyte targeting[J]. Biomaterials, 2021, 279: 121184.
[47] Escriche-Navarro B, Garrido E, Escudero A, et al. Targeting the senescent surfaceome through DPP4 antibody-functionalized nanoparticles. An application to cancer therapy[J]. Biomaterials, 2026, 324: 123461.
[48] Pham L M, Kim E C, Ou W, et al. Targeting and clearance of senescent foamy macrophages and senescent endothelial cells by antibody-functionalized mesoporous silica nanoparticles for alleviating aorta atherosclerosis[J]. Biomaterials, 2021, 269: 120677.
[49] Fan Z, Liu Y, Ye Y, et al. Functional probes for the diagnosis and treatment of infectious diseases[J]. Aggregate, 2024, 5(6): e620.
[50] Casals E, Vitali M, Puntes V. The nanoparticle-Protein Corona untold history (1907–2007)[J]. Nano Today, 2024, 58: 102435.
[51] Roque A C, Bispo S, Ferreira H A, et al. Antibody immobilization on magnetic particles[J]. J Mol Recognit, 2009, 22(2): 77-82.
[52] Tonigold M, Simon J, Estupiñán D, et al. Pre-adsorption of antibodies enables targeting of nanocarriers despite a biomolecular corona[J]. Nat Nanotechnol, 2018, 13(9): 862-869.
[53] Du F, Rische C H, Li Y, et al. Controlled adsorption of multiple bioactive proteins enables targeted mast cell nanotherapy[J]. Nat Nanotechnol, 2024, 19(5): 698-704.
[54] Mi Y, Smith C C, Yang F, et al. A dual immunotherapy nanoparticle improves T-cell activation and cancer immunotherapy[J]. Adv Mater, 2018, 30(25): e1706098.
[55] Kosmides A K, Sidhom J W, Fraser A, et al. Dual targeting nanoparticle stimulates the immune system to inhibit tumor growth[J]. ACS Nano, 2017, 11(6): 5417-5429.
[56] Yuan H, Jiang W, von Roemeling C A, et al. Multivalent bi-specific nanobioconjugate engager for targeted cancer immunotherapy[J]. Nat Nanotechnol, 2017, 12(8): 763-769.
[57] Chiang C S, Lin Y J, Lee R, et al. Combination of fucoidan-based magnetic nanoparticles and immunomodulators enhances tumourlocalized immunotherapy[J]. Nat Nanotechnol, 2018, 13(8): 746-754.
[58] Alhallak K, Sun J, Azab A K, et al. Nanoparticle T-cell engagers as a modular platform for cancer immunotherapy [J]. Leukemia, 2021, 35(8): 2346-2357.
[59] Wang Y, Song F, Wang S, et al. Nanoparticle-based multivalent human antibodies offer potent and broad neutralization against Omicron sublineages[J]. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8(1): 284.
[60] Krishnan N, Jiang Y, Zhou J, et al. A modular approach to enhancing cell membrane-coated nanoparticle functionality using genetic engineering[J]. Nat Nanotechnol, 2024, 19(3): 345-353.
[61] Wiklander O P B, Mamand D R, Mohammad D K, et al. Antibodydisplaying extracellular vesicles for targeted cancer therapy[J]. Nat Biomed Eng, 2024, 8(11): 1453-1468.
[62] Jiang C T, Chen K G, Liu A, et al. Immunomodulating nano-adaptors potentiate antibody-based cancer immunotherapy[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 1359.
[63] Ye Q N, Zhu L, Liang J, et al. Orchestrating NK and T cells via trispecific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity[J]. Nat Commun, 2024, 15(1): 6211.
[64] Fan Y N, Zhu L, Qing Y X, et al. Engineering multi-specific nanoantibodies for cancer immunotherapy[J]. Nat Biomed Eng, 2025, 9(12): 2124-2140.
[65] Wagenbauer K F, Pham N, Gottschlich A, et al. Programmable multispecific DNA-origami-based T-cell engagers[J]. Nat Nanotechnol, 2023, 18(11): 1319-1326.
[66] Zhang Y, Zhao G, Chen Y F, et al. Engineering nano-clustered multivalent agonists to cross-link TNF receptors for cancer therapy[J]. Aggregate, 2023, 4(6): e393.
[67] Abanades B, Wong W K, Boyles F, et al. ImmuneBuilder: deeplearning models for predicting the structures of immune proteins[J]. Commun Biol, 2023, 6(1): 575.
[68] He H, He B, Guan L, et al. De novo generation of SARS-CoV-2 antibody CDRH3 with a pre-trained generative large language model[J]. Nat Commun, 2024, 15(1): 6867.
[69] Watson J L, Juergens D, Bennett N R, et al. De novo design of protein structure and function with RFdiffusion[J]. Nature, 2023, 620(7976): 1089-1100.
[70] Zhang X, Wang H, Sun C. BiSpec Pairwise AI: guiding the selection of bispecific antibody target combinations with pairwise learning and GPT augmentation[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2024, 150(5): 237.
[71] Rollins Z A, Widatalla T, Cheng A C, et al. AbMelt: learning antibody thermostability from molecular dynamics[J]. Biophys J, 2024, 123(17): 2921-2933.
本文引文格式：
赵东坤, 李倩茹, 江远兰, 等. 双/多特异性抗体研究进展[J]. 药学进展, 2025, 49(12): 1076-1087.
美编排版：朱玲欣
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