Eflornithine Hydrochloride

本研究证实，SCFA生物疗法可重塑1型糖尿病患者肠道粘膜稳态，增加紧密连接蛋白，减少细胞死亡通路，并改变精氨酸、色氨酸等代谢途径。将应答者菌群移植给无菌NOD小鼠后，其丁酸盐产量增加，糖尿病进展延迟，伴随Ahr配体活性升高、IgA产生增加及炎症性B细胞反应减弱。研究表明SCFA疗法通过调控菌群-代谢物-免疫轴发挥保护作用。 题目： SCFA生物疗法通过重塑粘膜稳态和代谢组延缓人源化无菌小鼠的糖尿病 摘要： 1型糖尿病 (Type 1 diabetes, TID) 与肠道微生物群改变有关，其特征是短链脂肪酸 (Short-chain fatty acid, SCFA) 产量减少。在患有TID的成人中，口服一种产SCFA的生物疗法后，观察到SCFA增加、肠道微生物群改变和免疫调节，并在临床前模型中延迟了糖尿病。在此，我们表明人类SCFA生物疗法伴随着肠道蛋白质组和粘膜免疫稳态的重塑。代谢组学显示，精氨酸、谷氨酸、核苷酸和色氨酸代谢在SCFA生物疗法后富集，并发现了与血糖控制相关的代谢物。粪便微生物群移植表明，SCFA应答者的微生物群延缓了人源化无菌小鼠的糖尿病进展。受到保护的小鼠增加了与人类相似的代谢途径，包括产生芳烃受体 (aryl-hydrocarbon receptor, Ahr) 配体、减少炎症性粘膜免疫以及增加肠道中的免疫球蛋白A (Immunoglobulin A, IgA) 产生。这些数据表明，一种有效的SCFA免疫调节剂可促进多种有益途径，并支持以微生物群为靶点对抗TID的方法。 引言： 肠道微生物群是肠道稳态的关键驱动因素和发育中免疫系统的调节者。肠道微生物群的失调被认为是导致自身免疫性疾病（如TID）发展的一个可能因素。TID是由T细胞驱动的对胰岛胰岛素生成β细胞的自身免疫攻击引起的，通常在儿童期被诊断。多项研究报告了TID发病前肠道微生物群组成的改变，包括拟杆菌属 (Bacteroides) 物种增加、厚壁菌门 (Firmicutes) 减少以及β多样性降低。虽然观察到的分类学变化在不同研究中并不总是一致，但在不同疾病阶段，TID存在一个共同的功能缺陷。在小鼠、新诊断儿童和长期患有TID的成人中，产生SCFA、乙酸盐 (acetate)、丙酸盐 (propionate) 和丁酸盐 (butyrate) 的细菌减少与胰岛自身免疫反应相关。因此，微生物SCFA生产的功能缺陷，而非特定物种的缺失，可能与胰岛自身免疫和TID的进展有关。 SCFAs以其对宿主广泛的有益作用而闻名，可作为能源、信号分子和表观遗传调节剂。丁酸盐是结肠上皮的主要能源，通过紧密连接 (tight-junction) 的形成改善肠道稳态、刺激粘液产生并促进屏障功能。在免疫细胞中，丁酸盐促进调节性T细胞 (regulatory T cell, Treg) 分化并抑制抗原呈递细胞产生炎症细胞因子，而乙酸盐调节B细胞活化和IgA产生。SCFAs还能改善胰岛β细胞在应激下的存活。除了SCFAs，其他微生物来源的代谢物，包括精氨酸、色氨酸代谢物、谷氨酸、琥珀酸、鸟氨酸和瓜氨酸，也与未来进展为TID的风险改变有关。我们假设，高产SCFA的干预将重塑肠道微生物群，恢复重新编程胰岛自身免疫进展所需的多种微生物代谢物的下游生产。 先前，我们证明了由一种经过修饰以传递乙酸盐和丁酸盐的多糖生物分子 (HAMSAB) 组成的SCFA生物疗法，在TID的非肥胖糖尿病 (non-obese diabetic, NOD) 小鼠模型中能预防糖尿病发展。其作用机制是减少了胰岛特异性T细胞的活化、扩增了Tregs并减少了过度活跃的B细胞。此外，这种有效的免疫调节剂已被证明在高血压中具有治疗作用，这说明了SCFAs在治疗像TID这样严重或危及生命的疾病方面的有效性。在最近的一项初步研究中，长期患有TID的成人接受SCFA生物疗法6周后，粪便和血浆中的SCFAs增加，肠道微生物群发生改变。这与循环免疫反应的转变相关，其特征是B细胞活化减少以及T细胞亚群中调节性TIGIT和CTLA4表达升高。虽然该研究并非旨在评估β细胞保存或TID延迟，但其研究结果表明，在临床前模型中观察到的SCFA生物疗法对免疫调节的影响适用于人类。 本研究的目的是确定SCFA生物疗法是否改变粘膜免疫、肠道屏障功能和代谢物生产，从而可能减少TID的发病。通过使用粪便蛋白质组学，我们展示了SCFA干预后肠道屏障蛋白和先天免疫的重塑。我们确定了精氨酸、核苷酸和色氨酸代谢物的代谢转变，然后将其与血糖控制相关联。我们通过将SCFA应答者和非应答者人类参与者的粪便微生物群移植到无菌NOD小鼠体内，建立了SCFA修饰的肠道微生物群与其在预防或延迟TID中的作用之间的因果关系。我们发现，来自SCFA应答者的微生物群在移植到NOD小鼠体内后，增加了丁酸盐的产生并延缓了糖尿病进展，这与独特的代谢物谱、烃受体配体产生、重塑的粘膜免疫相关。SCFA生产的恢复对肠道屏障、免疫和代谢具有广泛影响，是针对旨在阻止TID进展的干预措施的一个有前景的方法。结果：SCFA生物疗法后人类粪便蛋白质组的重塑 在NOD小鼠中，施用产乙酸盐和丁酸盐的生物疗法通过增加紧密连接和IL22基因表达改善了肠道稳态。我们假设增加SCFA的递送也会影响人类的粘膜免疫和肠道屏障功能。为了研究这一点，我们使用了在为期6周的SCFA生物疗法干预期间，从长期患有TID的成人收集的粪便样本，研究访视时间点为第0周（基线）、第6周（干预结束）和第12周（随访），如前所述。该研究是一项单臂初步试验，招募了21名参与者，其中18人完成了试验，其粪便和血浆样本用于当前研究（图1A）。研究参与者的特征描述见补充数据1。 为了研究这些个体的肠道屏障稳态，我们对可溶性粪便蛋白进行了非靶向蛋白质组学分析，这些蛋白富含来自肠道上皮和外分泌胰腺的人类蛋白。将检测到的肽段与人类蛋白质组数据库进行比对，过滤后鉴定出738种人类蛋白质。使用偏最小二乘判别分析 (partial least-squares discriminant analyses, PLS-DA) 进行的监督聚类表明，宿主粪便蛋白质组在所有三个时间点都是独特的，这一点通过PERMANOVA得到确认 (p=0.001)，并且随访时间点在干预停止后并未恢复到基线水平（图1B-D）。单变量线性混合模型分析发现159种蛋白质在不同时间点之间存在差异 (p<0.05)，其中53种的错误发现率 (false discovery rate, FDR) <0.05（补充数据2，补充图2）。 对SCFA生物疗法后增加的蛋白质进行基因本体 (Gene Ontology) 通路富集分析，在第6周发现了201个富集的生物过程 (FDR<0.05, 图1E, 补充数据3)。最富集的过程是细胞氧化还原稳态，其中包括抗氧化剂过氧化还原蛋白-6 (peroxiredoxin-6, PRDX6)、硫氧还蛋白 (thioredoxin, TXN) 和硫氧还蛋白还原酶1 (thioredoxin reductase 1, TXNRD1)，它们可防止氧化应激。与此一致的是，与缺氧反应和氧水平降低反应相关的蛋白质富集，表明存在低氧环境。肌动蛋白丝通路、纤维组织和上皮细胞分化增加，这由上皮细胞连接蛋白CAPZB、CAPZA1和埃兹蛋白 (radixin, RDX) 驱动。多个与中性粒细胞和髓系细胞相关的先天免疫过程富集，包括抗炎蛋白酶颗粒体蛋白前体 (progranulin, GRN)、抗菌防御蛋白NOX2以及参与细胞粘附、迁移和血管生成的蛋白质，如颗粒钙蛋白 (grancalcin, GCA)、整合素亚基α M (integrin subunit alpha M, ITGAM 或 CD11b) 和基质金属肽酶-9 (matrix metallopeptidase-9, MMP9)（补充图1，补充数据3）。在随访时，上皮、中性粒细胞和髓系细胞通路仍然富集，表明干预结束后存在持续效应（补充数据3）。 使用KEGG进行通路富集分析，发现19条通路在第6周显著富集 (FDR<0.05, 图1F, 补充数据4)。这些包括先天免疫通路，表明中性粒细胞和吞噬体 (phagosomes) 的强烈参与。由TUB1A、RDX和SLC9A3R1驱动的紧密连接通路增加（补充图1），内质网中的蛋白质加工（包括参与抑制错误折叠蛋白质聚集的热休克蛋白 (CRYAB, HSP90B1, PRKCSH)）也增加。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及精氨酸生物合成的富集包括精氨基琥珀酸合成酶-1 (argininosuccinate synthase-1, ASS1)、CAD蛋白 (CAD) 和4-氨基丁酸氨基转移酶 (4-aminobutyrate aminotransferase, ABAT)、一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS2) 和乙醛脱氢酶2 (aldehyde dehydrogenase 2, ALDH2)，这些都在SCFA生物疗法后增加（补充图1）。在随访时，溶酶体 (lysosome) 和吞噬体通路富集，表明存在持久的先天免疫反应（补充数据4）。 SCFA生物疗法后减少的KEGG通路包括铁死亡 (ferroptosis) 和坏死性凋亡 (necroptosis) 细胞死亡通路（图1G，补充数据4）。这些变化由铁储存蛋白铁蛋白轻链 (ferritin light chain) 和铁蛋白重链1 (ferritin heavy chain 1)，以及电压依赖性阴离子选择性通道蛋白 (voltage-dependent anion-selective channel protein)，一种促凋亡蛋白驱动（补充图1）。坏死性凋亡是一种炎症形式的细胞死亡，通常由病原体诱导的细胞损伤引起。铁死亡是一种与铁相关的细胞死亡形式，与抗氧化防御失败有关，并与肠上皮功能障碍和肠道疾病相关。类似的通路在随访时持续存在，坏死性凋亡仍然下调（补充数据4）。总之，这些数据表明，SCFA生物疗法后可能激活了中性粒细胞介导的组织修复过程，同时伴随着紧密连接蛋白的增加和细胞死亡通路的减少。 Figure 1 : SCFA生物疗法后粪便蛋白质组学揭示的肠道屏障蛋白重塑。 A 试验示意图。创建于 BioRender。Hamilton-Williams, E. (2025) https://BioRender.com/h13m098。B 人类粪便蛋白质的多变量 PLS-DA 分析。显著性通过双侧 PERMANOVA 确定。成对比较通过错误发现率进行多重校正调整。椭圆显示 95% 置信区间。C, D PLS-DA 的组分 1 和 2，前 20 个载荷。橙色：基线，蓝色：第 6 周，红色：随访。E 使用从基线到第 6 周增加的蛋白质 (p < 0.05) 富集得到的前 40 个显著富集的基因本体生物过程 (FDR < 0.05)。F 从基线到第 6 周增加的蛋白质或 G 从基线到第 6 周减少的蛋白质的 KEGG 通路富集。显著性通过使用似然比检验 (p < 0.05) 和 Benjamini-Hochberg 多重检验校正的线性混合效应模型确定。富集分析使用 p < 0.05 的蛋白质进行。边的 cut-off 值为 40% 共享蛋白质。边的粗细表示蛋白质重叠的程度。另见补充图 1 和补充数据 2-4。SCFA生物疗法后肠道代谢物产生显著改变 由于肠道微生物群产生的代谢物可能是SCFA生物疗法对肠道上皮任何影响的介质，我们使用非靶向代谢组学广泛分析了粪便代谢物，包括微生物群和宿主产生的代谢物。LC/MS分析检测到603种推定注释的代谢物。监督多变量分析表明，第6周的粪便代谢组与其他两个时间点不同 (PERMANOVAp=0.006, 图2A, 补充图2A)。单变量分析发现101种代谢物具有 p<0.05，其中8种FDR < 0.05（图2B, 补充图2B, 补充数据5）。MetOrigin通路分析确定了多个通路的富集，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，丁酸盐代谢，精氨酸生物合成，TCA循环 (TCA cycle)，以及嘌呤代谢 (purine metabolism)，这些在第6周和随访时均出现，大多数通路由宿主和微生物群共享（图2C, D, 补充数据6）。由部分微生物群特异性通路驱动的嘧啶代谢 (pyrimidine metabolism) 在随访时富集（图2C, D, 补充数据6）。在这些通路中，琥珀酸 (succinic acid, succinate) 和丁酸 (butyric acid, butyrate) 在第6周和第12周的增加促进了丁酸盐通路的富集（补充图2C）。丁酸盐是通过TCA循环（包括琥珀酸）为结肠细胞提供能量的主要来源。精氨酸通路的富集是由第6周增加的1-吡咯啉-5-羧酸 (1-pyrroline-5-carboxylic acid) 和第12周增加的肌酸 (creatine) 以及鸟氨酸 (ornithine)、谷氨酰胺 (glutamine) 和2-氧代精氨酸 (2-oxoarginine) 的减少驱动的（补充图2C，补充数据6）。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸通路的富集是由丙氨酸 (alanine)、氧代戊二酸 (oxoglutaric acid) 和谷氨酰胺的减少，但琥珀酸增加驱动的（补充图2C，补充数据6）。嘌呤和嘧啶核苷酸代谢通路包括脱氧肌苷 (deoxyinosine)、脱氧尿苷 (deoxyuridine) 和假尿苷 (pseudouridine)，它们在第6周均呈增加趋势，并在第12周显著下降（补充图2B, C，补充数据6）。脱氧肌苷和脱氧尿苷，以及含有谷氨酸和两个缬氨酸的三肽 (Glu/Val/Val)、4-羟基-2-氧代庚二酸 (4-hydroxy-2-oxo-heptanedioic acid) 和γ-谷氨酰丙氨酸 (gamma-glutamylalanine) 与HbA1c负相关，与估算的C肽正相关（图2E）。 对粪便代谢物、通路和粪便蛋白质的综合分析支持了SCFA生物疗法驱动TCA循环以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，导致谷氨酸和谷氨酰胺转化为嘌呤和嘧啶核苷酸，同时驱动尿素循环和精氨酸代谢的假设（通路示意图见图2F）。从基线到第6周的大多数变化是涉及精氨酸生物合成的 precursor 代谢物，例如粪便代谢物N-乙酰谷氨酸 (N-acetyl-glutamic acid)、谷氨酰胺和谷氨酸。而从基线到随访的变化是涉及精氨酸利用的代谢物，例如粪便代谢物肌酸、肌酐 (creatinine) 和2-氧代精氨酸（图2F）。 Figure 2 : SCFA生物疗法后肠道代谢物产生发生显著变化。A 人类粪便代谢物的多变量 PLS-DA 分析。显著性通过双侧 PERMANOVA 确定。成对比较通过错误发现率进行多重校正调整。椭圆显示 95% 置信区间。B 通过线性混合效应模型使用似然比检验 (p < 0.05) 和 Benjamini-Hochberg 多重检验校正确定 FDR < 0.1 的粪便代谢物丰度热图。粗体代谢物为级别 1（使用参考标准品鉴定）。C 从基线到第六周显著富集的 KEGG 通路和 D 从基线到随访显著富集的 KEGG 通路。富集分析在 MetOrigin 中使用 p < 0.05 的代谢物进行。差异使用配对双尾 t 检验对单个代谢物进行确定，cut-off 值为 p < 0.05。绿色条：微生物通路，黑色条：宿主和微生物共享（共代谢）通路。E FDR < 0.1 的代谢物与血糖变量的重复测量相关性。* 表示 FDR 校正后 p 值 > 0.01 且 < 0.05，· 表示 p 值 > 0.05 且 < 0.1。F 显示干预后改变的关键人类粪便蛋白质、粪便代谢物和代谢通路示意图。实线箭头表示第 6 周的变化，虚线箭头表示随访时的变化。TCA 循环：三羧酸循环，NO：一氧化氮。创建于 BioRender。Hamilton-Williams, E. (2025) https://BioRender.com/l00t262。另见补充图 2 和补充数据 2, 5, 6。血浆代谢组学揭示SCFA生物疗法后的全身代谢效应 为了进一步了解患有TID的成人进行6周SCFA生物疗法，以及相关的微生物组和代谢组变化如何系统性影响宿主，我们研究了血浆中的循环代谢物。血浆的非靶向LC/MS分析鉴定出619种推定注释的代谢物。多变量PLS-DA显示在随访时对血浆代谢物的影响最大，且PERMANOVA显示显著 (p=0.022, 图3A, B)。单变量分析使用线性混合模型发现92种代谢物具有 p<0.05（补充数据7）。与第6周相比，随访时琥珀酸增加，第12周时2-氧代精氨酸减少，这与粪便代谢组相似（补充数据7）。探索性富集分析发现，色氨酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成是第12周受影响最严重的通路（图3C，补充数据8），这归因于色氨酸 (tryptophan)、犬尿氨酸 (kynurenine) 和吲哚丙酮酸 (indolepyruvate)（补充数据8）。缬氨酸 (valine)、亮氨酸 (leucine) 和异亮氨酸 (isoleucine) 的生物合成和降解也富集。这些数据表明，SCFA生物疗法后对代谢通路存在持续的全身性影响。 Figure 3 : 随访时血浆代谢物发生显著改变。A 血浆代谢物的 PLS-DA 分析和 B PLS-DA 组分 1 的载荷图。显著性通过双侧 PERMANOVA 确定。成对比较通过错误发现率进行多重校正调整。椭圆表示 95% 置信区间。橙色：基线，蓝色：第 6 周，红色：随访。粗体代谢物为级别 1（使用参考标准品鉴定）。C 从第 6 周到随访以及从基线到随访发生变化的血浆代谢物的 MetaboAnalyst 通路富集分析。富集使用双侧线性混合模型分析 p < 0.05 的代谢物。红色虚线表示通路显著性。颜色代表显著性。点大小代表影响值。提供了 P 值。另见补充数据 7 和 8。人-鼠微生物群移植模型证明SCFA生物疗法修饰的微生物群具有疾病修饰作用 我们接下来使用人-鼠粪便微生物群移植模型来研究SCFA生物疗法后人类微生物群中存在的功能变化是否可以改变疾病进展（图4A）。鉴于HAMSAB显著增加了小鼠和人类粪便和循环中的乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐浓度，我们根据试验参与者在第6周时粪便SCFAs的增加情况对其进行分类，将倍数变化≥2的称为“应答者”，<2的称为“非应答者”（图4B）。我们选择了n=2名SCFA非应答者（供体A和B）和n=2名应答者（供体C和D），他们也具有较高的活菌计数。虽然应答者和非应答者受试者在生物疗法后同样改变了他们的α和β多样性（补充图3），但应答者个体往往具有更高的α多样性。将个体人类供体粪便样本的重悬液在交配前灌胃给予雌性无菌NOD小鼠，并研究雌性后代的微生物群定植、代谢物水平和糖尿病进展（图4A）。对照组母鼠灌胃无菌盐水 (PBS)，它们的后代保持无菌状态。 所有小鼠在整个实验期间均维持标准饮食。有趣的是，与移植了非应答者微生物群的小鼠相比，移植了干预后应答者样本（第6周供体样本）微生物群的后代粪便中，丁酸盐是唯一显著更高的SCFA (p=0.0282)，并且高于移植了基线供体样本的两组小鼠（图4C，补充图4, p=0.0061）。 移植了第6周SCFA生物疗法后应答者微生物群的小鼠，与同期非应答者组 (p=0.0198) 和PBS对照无菌组 (p=0.0087) 相比，糖尿病进展显著延迟（图4D）。相比之下，移植了应答者或非应答者基线样本的小鼠，与PBS对照组相比，未能显著延迟定植小鼠的糖尿病（图4E）。第二组无菌雌性NOD小鼠以类似方式定植，并在10周龄时分析其免疫细胞和胰腺表型。组织学和免疫荧光染色显示，与非应答者定植的小鼠相比，应答者定植小鼠的胰岛中单核细胞浸润和胰岛素含量有减少趋势（图4F，补充图5）。在移植了生物疗法后微生物群的应答者小鼠的胰腺淋巴结中，通过 tetramer 染色鉴定出的BDC2.5胰岛特异性CD4+ T细胞比例较低 (p=0.0448, 补充图6)。此外，应答者小鼠脾脏 (p=0.053) 和胰腺淋巴结 (p=0.0099) 中Foxp3+CD8+ 调节性T细胞增加。数据表明，人类SCFA干预引起的微生物变化在过继转移后仍影响小鼠自身免疫的发展，保护作用主要与丁酸盐反应相关。 Figure 4 : 来自应答者的人-鼠微生物群移植延缓了NOD小鼠的糖尿病。A 实验设计。雌性无菌NOD小鼠在第0天和第7天通过口服灌胃用人类粪便悬液定殖或保持未定殖（PBS对照），一周后交配。对雌性后代进行糖尿病进展随访，并收集粪便样本进行分析。创建于BioRender。Hamilton-Williams, E. (2025) https://BioRender.com/u03r698。B 供体样本，由蓝点（非应答者供体）和红点（应答者供体）表示，从n=18名完成SCFA生物疗法试验的参与者中选出，基于第6周粪便丁酸盐相对于基线的倍数变化。图中排除了一名异常个体，其倍数变化分别为73.2、123.8和299.5。虚线表示定义应答者状态的倍数变化2的临界值。C 移植了应答者（红色）或非应答者（蓝色）人类供体粪便样本（基线和第6周试验时间点）或对照无菌小鼠的雌性后代小鼠（7-9周龄）的粪便丁酸盐。线代表中位数。显著性基于Tukey校正的单因素ANOVA。D 移植了供体在第6周收集的非应答者与应答者粪便样本的无菌NOD小鼠或 E 移植了基线样本或接受了无菌PBS灌胃的对照无菌小鼠的生存曲线分析（对数秩Mantel-Cox检验）。糖尿病数据来自两次独立实验的汇总。F 来自10周龄雌性定殖小鼠（n=7应答者和n=9非应答者小鼠，来自一次实验）的胰腺切片，通过免疫荧光染色显示胰岛素（绿色）和胰高血糖素（品红色），DAPI核染色（蓝色）。代表性图像显示为20倍放大。另见补充图3–6。糖尿病受保护的应答者定植小鼠通过粪便代谢物而非微生物群组成聚类 使用16S rRNA测序研究了灌胃母鼠和雌性后代粪便微生物群的定植情况。与之前的研究类似，定植小鼠样本中的α多样性低于人类供体样本（补充图7）。然而，多变量PLS-DA显示，人类供体样本与其相应的定植小鼠样本聚类在一起（补充图7）。虽然供体人类样本和小鼠样本之间的类群丰度存在差异，但母鼠定植了50.1% ± 3.6%（平均值±标准差）的供体来源物种。从母鼠到后代的传播率很高（5周龄时平均存在44.1% ± 8.3%的供体物种），并且定植随时间相对稳定（11周龄时平均存在44.8% ± 9.9%的供体物种）（补充图8）。无监督PCA多变量分析表明，来自四个供体中每一个定植的小鼠的微生物群组成是不同的（图5A，补充图9A, B, PERMANOVAp<0.001）。虽然存在按时间点（基线或第6周供体样本）的聚类，但供体效应占主导地位，有83个类群在四个供体之间存在显著差异 (FDR < 0.05, 补充数据9)。值得注意的是，“应答者”和“非应答者”供体并未聚类在一起，供体D比其他三组更不相似。我们仍然发现42个类群在应答者和非应答者组之间存在显著差异，其中副萨特氏菌属 (Parasutterella)、毛螺菌科 (Lachnospiraceae)、另枝菌属 (Alistipes) 和布劳特氏菌属 (Blautia) 在应答者中较高，而肠球菌属 (Enterococcus)、Turicibacter 和丁酸单胞菌属 (Butyricimonas) 在非应答者定植的小鼠中较高（补充数据10）。 我们接下来分析了定植后代（仅第6周样本定植组）的粪便代谢组，过滤后鉴定出527种代谢物。与微生物群组成相反，PCA多变量分析显示，两个应答者组具有相似的代谢物谱，与非应答者不同（图5B，补充图9C）。PERMANOVA分析证实代谢物在供体之间存在显著差异 (p<0.001)，有302种个体代谢物在应答者和非应答者之间存在差异 (FDR < 0.05, 补充数据11)。通路富集发现，与非应答者组相比，应答者组中嘌呤、嘧啶、精氨酸和谷氨酸代谢是最富集的通路（图5C，补充数据12）。多种嘌呤和嘧啶通路成分在应答者中较高，精氨酸前体代谢物谷氨酸和氧代戊二酸酸也是如此，而精氨酸本身和鸟氨酸则较低（图5D, E）。此外，应答者小鼠的色氨酸代谢发生改变（图5D），这由应答者小鼠中奎尼酸 (quinic acid)（一种仅由微生物通路产生的代谢物）的极显著升高所驱动 (FDR = 2.18E-08)。应答者组中的这些代谢物变化和富集通路与人类试验参与者SCFA生物疗法后观察到的富集通路高度相似（图2C, D）。 Figure 5 : 在人-鼠微生物群移植研究中，粪便代谢物而非肠道微生物群组成驱动受体小鼠的聚类。A 对5周龄时收集的、经人类微生物群定殖的小鼠雌性后代的粪便进行16S rRNA扩增子测序的稀疏PCA。显示了移植了第6周供体样本的小鼠。B 在7-9周龄时收集的雌性NOD小鼠幼崽粪便代谢物的PCA分析。仅分析了移植了第6周供体样本的小鼠的代谢物。显著性通过双侧PERMANOVA确定。C 使用MetOrigin对移植了应答者与非应答者供体微生物群的小鼠代谢物进行通路富集分析。差异使用配对双尾t检验对单个代谢物进行确定，cut-off值为p < 0.05。绿色条—微生物组通路，黑色条—共代谢（宿主和微生物群共享）通路。D 富集分析中识别的通路中关键代谢物的丰度（log2标准化强度）。标记有#的代谢物是来自基于来源的MPEA分析确定的仅由微生物产生的通路。4-(2-氨基-3-羟基苯基)-2,4-二氧代丁酸是色氨酸通路中缩写代谢物的完整名称。箱线图显示中位数和四分位距，线表示最小值和最大值。E 嘌呤代谢通路示意图和 F 嘧啶代谢通路示意图。粗体代谢物为级别1（使用参考标准品鉴定）。红色显示的代谢物在应答者小鼠中较高。示意图创建于BioRender。Hamilton-Williams, E. (2025) https://BioRender.com/w72e215 和 https://BioRender.com/s39p554。另见补充图7–9和补充数据9−12。应答者定植小鼠的粘膜B细胞基因网络减少 我们接下来通过转录组学研究了移植了应答者与非应答者供体微生物群的小鼠的粘膜免疫和肠道屏障。在10周龄时，收集移植了应答者（供体C）或非应答者（供体B）第6周样本微生物群的小鼠的结肠和回肠组织用于RNA测序。回肠中有143个差异表达基因，结肠中有16个（图6A，补充数据13）。基因本体分析发现，与非应答者回肠组织相比，多个与B细胞活化和免疫球蛋白产生、先天免疫反应、炎症反应、对细菌的防御反应和对脂多糖反应相关的通路在非应答者回肠组织中富集（图6B，补充数据14）。非应答者中B细胞通路的强烈富集诱导了免疫球蛋白重链基因 Ighg1, Ighg3 和 Ighd，但不是IgA重链，以及与B细胞活化相关的基因，如 Cd40，这表明分泌到粘液层和管腔的抗体类型在应答者和非应答者小鼠之间发生了转换。KEGG富集鉴定出几个参与色氨酸代谢的基因在应答者小鼠中下调，包括 Cyp1a1, Kmo 和 HAAO（图6C）。Cyp1a1 是通过芳烃受体 (Ahr) 进行色氨酸代谢物信号传导的负调节因子，可降解Ahr配体。KEGG富集还发现NFKB信号传导、细胞因子受体相互作用以及B细胞受体信号传导在应答者小鼠中下调（图6C和补充数据15）。这些数据表明，炎症性粘膜免疫，特别是抗体产生，通过移植源自SCFA生物疗法应答者供体的微生物群而减少。 为了进一步研究小鼠免疫细胞的活化状态，我们分析了一组10周龄后代的抗原呈递细胞表型。与基因表达数据一致，我们发现，移植了非应答者第6周样本微生物群的小鼠中，IgM B细胞上的CD40表达更高。与此同时，非应答者定植小鼠的总常规树突状细胞和2型树突状细胞的CD40表达也更高。这表明在非应答者定植的小鼠中，类别转换的IgM B细胞和树突状细胞都更加活化。 Figure 6 : 应答者微生物群定殖小鼠回肠中B细胞、先天免疫和色氨酸代谢基因特征的变化。A 对移植了SCFA生物疗法应答者（供体C, n=4）和非应答者（供体B, n=4）第6周样本微生物群的小鼠后代，在10周龄时收集的回肠组织进行RNA测序。回肠中差异表达基因的火山图。显著性使用Bioconducter包DESeq2（双侧分析）确定。B 基因本体和 C KEGG分析在应答者和非应答者回肠中富集的选定通路。红色标签：在应答者中增加的基因，蓝色标签：在应答者中减少的基因。D 在10周龄时，应答者(n=7)和非应答者(n=9)小鼠脾脏中常规树突状细胞(cDCs)、CD11b+XCR1-树突状细胞(cDC2)、总B细胞和IgM- B细胞上的CD40表达。设门策略见补充图12。数据来自两次实验的汇总。线代表中位数。显著性使用未配对双尾t检验确定。另见补充数据13–15。应答者定植小鼠的芳烃受体配体产生增加 由于色氨酸代谢为Ahr配体是肠道微生物群调节肠道稳态的关键介质，我们研究了应答者定植小鼠体内的Ahr配体活性。我们用从定植小鼠粪便颗粒中分离的粪便水刺激了Ahr-荧光素酶报告基因细胞（图7A）。我们发现，无论是在基线 (p<0.0001) 还是第6周样本 (p<0.0001) 定植的小鼠中，应答者小鼠的粪便水都具有比非应答者小鼠更高的Ahr刺激活性。两组第6周样本定植小鼠的Ahr刺激活性均有所增加。然后我们使用人类研究参与者的粪便水，并证实Ahr配体活性在干预后第6周显著增加 (p=0.0029, 图7B)。值得注意的是，两名应答者供体在所有三个时间点的Ahr活性均高于非应答者供体。通过免疫荧光染色，我们发现与非应答者小鼠相比，应答者小鼠回肠组织中的Ahr和IgA蛋白均更高（图7C）。这表明SCFA生物疗法后Ahr配体可用性增加与糖尿病保护相关。 为了识别可能导致Ahr活性差异的特定代谢物，我们使用“计算机模拟”靶向分析关键色氨酸通路代谢物重新审视了我们的代谢组学数据集（补充图10）。该分析发现，黄尿酸 (xanthurenic acid)，一种已知在犬尿氨酸下游具有Ahr刺激活性的色氨酸代谢物，在移植了第6周应答者供体微生物群的小鼠中显著更高 (p=0.0013, 补充图10A)。在人类粪便代谢组中，2,8-二羟基喹啉 (2,8,dihydroxyquinoline) 和黄尿酸在第6周增加，在随访时减少。黄尿酸在第6周倾向于在应答者个体中更高（补充图10B）。在血清中，色氨酸代谢物包括色氨酸、犬尿氨酸和黄尿酸在随访时均升高（补充图10C）。这些数据表明，黄尿酸可能是小鼠和人类研究中关键的Ahr激活代谢物。 Figure 7 : 应答者微生物群定殖小鼠中增强的芳烃受体活性。A 使用从7-10周龄人源微生物群定殖小鼠后代的粪便颗粒中分离的粪便水刺激Ahr荧光素酶报告基因细胞。显著性通过Sidak校正的单因素ANOVA（双侧）确定。数据来自两次实验的汇总。B 使用人类研究参与者(n=18)的粪便水提取物刺激Ahr荧光素酶报告基因细胞。用于小鼠研究的人类供体用颜色表示（非应答者供体–蓝色，应答者供体–红色）。使用合成Ahr配体FICZ作为阳性对照，数据表示为相对于未刺激细胞的倍数变化。显著性通过重复测量单因素ANOVA和Dunnett校正（双侧）确定。C 10周龄人源微生物群定殖小鼠后代回肠组织的代表性图像，用抗IgA（红色）、抗Ahr（青色）和DAPI（蓝色）染色。图像代表来自一次实验中n=5应答者和n=6非应答者小鼠的染色。多组学因子分析将微生物组标记、代谢物、粪便蛋白质和芳烃受体配体产生与血糖控制指标相关联 我们接下来使用多组学因子分析 (multi-omic factor analysis, MOFA) 来理解我们人类研究中不同数据集（粪便蛋白质组和代谢组、血浆代谢组和粪便宏基因组、微生物类群和通路）、临床指标、SCFA和Ahr之间的关系。MOFA方法识别出由模型中不同数据集选出的相关变量组成的潜在因子，这些因子解释了数据的基础变异（补充数据16）。然后我们将这些潜在因子与血糖控制的临床指标、SCFAs和Ahr活性相关联。MOFA模型识别出6个潜在因子，所有五个数据集都有贡献（补充图11A）。潜在因子3与所有三种粪便SCFA和估算的C肽正相关（图8A）。潜在因子3的正向变量主要是血浆代谢物，包括色氨酸代谢物吲哚乳酸 (indolelactic acid)、犬尿氨酸、色氨酸和吲哚丙酮酸（图8B）。对潜在因子3有负向贡献的变量包括许多粪便代谢物，如假尿苷、黄嘌呤 (xanthine)、氧代戊二酸酸和鸟氨酸，这些在生物疗法后减少。潜在因子4与粪便和血浆丁酸盐以及Ahr活性正相关，而与HbA1c (%) 和基础胰岛素 (%) 负相关。潜在因子4由青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescentis) 和在第6周增加的微生物通路驱动，如TCA循环、糖酵解通路和同型乳酸发酵 (homolactic fermentation)（补充图11B）。潜在因子1与粪便Ahr活性和血浆乙酸盐负相关，并由类群（狄氏副拟杆菌 Parabacteroides distasonis 和统一拟杆菌 Bacteriodes uniformis）和与嘧啶和嘌呤代谢相关的宏基因组通路在负方向上驱动（补充图11C），这些变量在第6周增加。潜在因子2也由类似的类群负向贡献，并且与Ahr活性、HbA1c和基础胰岛素%负相关（补充图11D）。总之，这种整合分析支持SCFA、血浆色氨酸代谢物和粪便Ahr活性都与TID血糖控制的临床特征相关。 Figure 8 : 多组学因子分析识别出与血糖控制、SCFA和Ahr活性相关的潜在因子。使用MOFA整合细菌类群(n=22)、细菌通路(n=91)、人类粪便蛋白质(n=101)、粪便代谢物(n=101)和血浆代谢物(n=92)数据集。将识别出的潜在因子与临床数据、SCFA和Ahr活性进行相关性分析。A 显示临床变量与模型因子之间双侧Pearson相关性的热图。***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05。B 对潜在因子3有贡献的变量。仅包含绝对权重>0.4的变量。黑色文本：人类蛋白质，蓝色文本：血浆代谢物，红色文本：粪便代谢物。讨论： 这是首个证明在患有TID的成人中施用高效产SCFA干预后，粘膜免疫和肠道屏障反应发生重塑的研究。我们证明了在施用SCFA生物疗法后，肠道来源的抗氧化蛋白、中性粒细胞修复和先天免疫反应、上皮和紧密连接蛋白以及氨基酸代谢增加，同时细胞死亡通路减少。这伴随着粪便和循环中涉及谷氨酸、精氨酸、丁酸盐、嘌呤、嘧啶和色氨酸通路的代谢物的转变。然后我们证明，将生物疗法后的粪便微生物群从丁酸盐应答者参与者移植到无菌NOD小鼠体内，延迟了糖尿病的发病。糖尿病保护与精氨酸、谷氨酸、嘌呤、嘧啶和色氨酸代谢的改变相关，类似于人类研究中富集的通路。在糖尿病受保护小鼠的肠道组织中，免疫球蛋白G (Immunoglobulin G, IgG) 抗体、B细胞反应和炎症性先天免疫相关基因下调，而芳烃受体配体活性和IgA增加。芳烃受体配体活性和微生物标记与患者的血糖控制指标相关。这些数据提供了机制性的见解，说明一种独特的富含乙酸盐和丁酸盐的多糖，如何通过中间代谢物与宿主相互作用，以增强粘膜免疫、影响肠道屏障并保护其免受自身免疫性糖尿病的侵害。 使用粪便蛋白质组学使我们能够研究宿主对SCFA生物疗法的局部反应。在干预后改变的人类蛋白质中，存在与中性粒细胞和髓系细胞以及上皮连接蛋白和减少的细胞死亡通路相关的强烈特征。前梯度蛋白同源物2 (Anterior gradient protein homolog 2, AGR2) 在干预后增加，它保护杯状细胞免受内质网应激，并且是凝胶形成粘蛋白产生和加工所必需的。总之，这表明生物疗法后中性粒细胞在肠道上皮的影响不是细胞毒性的或对肠道上皮有损害。增加的中性粒细胞蛋白包括MMP9和CD11b，它们是三级中性粒细胞颗粒的特征。三级颗粒的细胞毒性远低于初级/嗜天青中性粒细胞颗粒，并且在某些情况下可以是调节性的并参与炎症的消退。中性粒细胞产生的炎症蛋白，如钙卫蛋白 (calprotectin)、髓过氧化物酶 (MPO) 和中性粒细胞弹性蛋白酶 (neutrophil elastase) 在SCFA生物疗法后没有改变。MMP9是一种促进中性粒细胞向组织迁移的蛋白酶。迁移的中性粒细胞可以通过局部耗氧来增强粘膜上皮愈合和炎症消退。我们的通路分析显示，与缺氧反应和细胞氧化还原稳态相关的抗氧化蛋白富集。已知丁酸盐能稳定缺氧诱导因子 (hypoxia-inducible factors)，有助于维持健康结肠上皮中发现的低氧环境。高MMP9表达也是促血管生成中性粒细胞的特征，对于缺氧部位的血管再生很重要。限制肠道中的氧气可用性是宿主用来促进有益厌氧菌生长和限制致病菌的一种机制。因此，肠上皮中氧水平的调节可能是SCFA生物疗法下游的一个事件，由中性粒细胞和丁酸盐介导。 N2中性粒细胞是参与组织修复反应的亚群，其特征是表达MMP9、NOS2、ARG1、TGF-β和IL-10。促炎和抗炎免疫亚群之间的极化很大程度上由精氨酸可用性驱动，低精氨酸被认为是抗炎性的。NOS2和ARG1都在ASS1的下游，并且是尿素循环和精氨酸代谢通路的一部分，这些通路在人类粪便蛋白质组和宏基因组数据集中富集。ASS1是精氨酸生物合成的限速步骤，在SCFA生物疗法后增加并在洗脱期后持续存在。NOS2（在第6周强烈增加）和ARG1都降解精氨酸，降低其生物利用度。N2中性粒细胞，类似于N2巨噬细胞，通过将精氨酸转化为一氧化氮 (NO)、鸟氨酸、脯氨酸和多胺来消耗精氨酸，这些通路参与伤口修复和调节免疫。精氨酸饥饿通过多种机制抑制T细胞增殖，包括CD3ζ下调。精氨酸在糖尿病受保护的小鼠中减少，而肌酸（精氨酸降解的产物，可促进M2巨噬细胞极化）在人类粪便代谢组中升高。通过NOS2产生NO是另一种免疫抑制介质，通过硝化T细胞受体和MHC分子来减少T细胞活化。尽管来自宿主的过量NO在转化为硝酸盐时，可以驱动兼性厌氧菌的扩增，从而导致生态失调，但我们没有观察到失调细菌的增加。 我们的数据表明，SCFA生物疗法后，微生物群和宿主中的精氨酸代谢都被激活。在一项针对有TID风险的儿童（TEDDY研究）的大型队列研究中，未进展为TID或胰岛自身免疫的对照受试者，其微生物群内精氨酸和鸟氨酸降解、精氨酸生物合成和发酵途径的丰度更高。在我们的鼠标模型中，我们观察到糖尿病进展延迟的小鼠粪便中鸟氨酸和精氨酸较低。在NOD小鼠中，精氨酸酶-I (arginase-I) 将精氨酸转化为鸟氨酸的抑制剂已被证明可以保护 against 糖尿病进展。在体内，鸟氨酸是多胺（如腐胺 putrescine、亚精胺 spermidine 和精胺 spermine）的主要前体。多胺在多种自身免疫性疾病中增加，并且在T细胞免疫中很重要。在β细胞内，多胺被认为有助于内质网和氧化应激，并在胰岛炎症中发挥作用。补充亚精胺导致NOD小鼠糖尿病发病率更高。α-二氟甲基鸟氨酸 (Alpha-difluoromethylornitine, DFMO) 是一种将鸟氨酸转化为多胺的酶的抑制剂，延迟了实验性自身免疫性脑脊髓炎的发作。在最近一项针对新发TID的I期临床试验中，DFMO在治疗6个月后显示出保留C肽的初步证据，目前正在一项II期研究中进行试验 (NCT05594563)。 血浆中的色氨酸代谢通路在随访时显著富集。肠道微生物群将膳食色氨酸转化为吲哚衍生物，如吲哚乳酸和吲哚丙酮酸。这些化合物作为Ahr的配体，Ahr是维持肠道平衡和免疫耐受的关键通路。色氨酸也被宿主酶IDO代谢产生犬尿氨酸，这导致了随访时血浆中色氨酸通路的富集。据报道，患有TID的儿童IDO活性降低。产生吲哚乳酸的微生物包括狄氏副拟杆菌、卵形拟杆菌 (Bacteroides ovatus) 和青春双歧杆菌，所有这些在我们的研究参与者干预后都增加了。在我们的鼠标模型中，色氨酸代谢物奎尼酸和黄尿酸在应答者小鼠的粪便中更高。奎尼酸在胃肠道中被代谢，导致全身色氨酸可用性增加。据报道，与缓慢进展者相比，快速进展为TID的儿童血清中的奎尼酸降低。黄尿酸是犬尿氨酸下游的Ahr配体，通常被认为是内源性色氨酸代谢物。然而，某些肠道细菌可以将犬尿氨酸通路中间体代谢为黄尿酸。黄尿酸在炎症性肠病患者中较低，并且黄尿酸在动物模型中减轻了结肠炎症状和炎症，并促进了上皮修复。然而，这些代谢物在1型糖尿病中的作用仍有待探索。 回肠组织的基因表达分析确定了上调易患糖尿病/非应答者组中的 Cyp1a1。虽然Cyp1a1 受Ahr信号传导上调，但它通过消耗Ahr配体作为Ahr的负调节因子。我们的Ahr报告基因检测证明SCFA生物疗法后的微生物群具有更高的Ahr刺激活性，并且Ahr本身在回肠组织中上调。在NOD小鼠中施用合成Ahr配体已被证明通过影响Foxp3+Tregs和RORγt+ T细胞群来减少胰岛炎并预防糖尿病。类似地，施用产生丁酸盐或乙酸盐或两者组合的饮食保护NOD小鼠免受糖尿病和胰岛自身免疫，以及保护小鼠免受肠道感染。将乙酸盐和丁酸盐代谢物结合到多糖生物分子上具有更有效和协同的免疫调节作用以保护 against 糖尿病。因此，我们的数据表明SCFA生物疗法可能诱导多种有益的代谢途径。 我们对肠道组织的分析表明，非应答者小鼠中B细胞相关基因的有效上调，包括 Ighg1和 Ighg3 抗体重链基因，而IgA蛋白在应答者回肠组织中增加。微生物群特异性IgG生产和FcγR被IgG激活被认为在肠粘膜内是炎症性的，并与溃疡性结肠炎相关，而粘膜IgA与稳态相关。乙酸盐和丁酸盐都被证明能促进肠道IgA的产生，特别是丁酸盐促进较低亲和力、T细胞非依赖性IgA生产。T细胞非依赖性IgA通路倾向于识别保守的微生物抗原，如脂多糖 (LPS)，而T细胞依赖性IgA导致类别转换和高亲和力抗体反应。诸如“对脂多糖的反应”、“对细菌的防御反应”和“炎症反应”等通路在非应答者定植小鼠回肠组织中的富集表明存在一个性质不同的环境，可能促进了更有效的免疫激活。患有TID的人具有更高比例的IgA包被细菌，表明通过类别转换产生了高亲和力IgA，这与SCFA水平负相关。在我们对人类粪便的蛋白质组学分析中样本，多种抗体随时间变化而丰度改变，有些上调，有些下调。然而，非靶向蛋白质组学无法解析这些抗体的类别。因此，虽然在我们的小鼠模型中丁酸盐的产生可能减少了粘膜IgG并增加了IgA产生，但这种机制仍需要在人类研究中得到证实。 我们的研究有几个局限性，涉及我们初步人类研究的单臂、开放标签设计和小样本量。我们的粪便蛋白质组学分析无法识别检测到的蛋白质的来源，这些蛋白质可能来自肠道的任何部分、胰腺或其他器官。我们的非靶向蛋白质组学方法只能检测到丰度相对较高的蛋白质，许多具有生物学相关性的低丰度蛋白质会被遗漏。我们也没有通过肠道通透性评估直接研究参与者的肠道屏障功能。同样，我们的代谢组学分析可以针对感兴趣的通路进行靶向分析跟进。虽然人类粪便微生物群移植被认为是建立疾病因果关系的最佳方法之一，但该模型有局限性。只有一部分人类微生物群在小鼠体内定植，并且那些成功定植的与供体样本相比丰度发生了变化，这可能是由于小鼠不同的饮食、饲养环境、生理状况或粪便样本的保存方法所致。一些重要的类群在母鼠中定植但没有很好地传播给后代（例如，粪杆菌属Faecalibacterium）。然而，我们在小鼠体内观察到了人类供体丁酸盐反应和代谢物谱的功能性复制。 我们证明了在接受产SCFA生物疗法后，患有TID的成人显示出肠道上皮、粘膜免疫以及一系列代谢物产生的变化。肠道微生物群的功能转变驱动了局部和全身氨基酸和核苷酸代谢的增强，特别是精氨酸、谷氨酸、嘌呤、嘧啶和色氨酸相关代谢物。嘌呤和嘧啶代谢物与血糖控制标志物相关。然后，我们能够使用我们的小鼠微生物组移植模型将这些人类系统的变化与减少的糖尿病进展联系起来。我们的分析显示，施用SCFAs后粘膜免疫反应的变化与嘌呤、嘧啶、精氨酸、谷氨酸和色氨酸的代谢，以及Ahr配体的抗炎作用有关。这些变化与血糖控制指标相关，表明具有潜在的临床益处。在此，我们发现了一种专门的产乙酸盐-丁酸盐生物疗法对有益下游代谢物产生的积极影响，表明了SCFAs在减缓、阻止或逆转TID进展方面的广泛潜力。 原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-025-58319-y#Sec11