Vadimezan

2025年4月23日，由哈尔滨医科大学郑桐森教授团队在《The Innovation》（中科院一区，IF：25.7）杂志上发表一篇题为“Precision targeting of STING: Challenges, innovations, and clinical outlook for cancer therapy”文献综述，阐述STING在癌症治疗中的研究进展。 图形摘要如下： 摘要： 干扰素基因刺激因子（STING）通路在固有免疫应答中发挥关键作用，已成为癌症治疗中极具吸引力的靶点。尽管临床前研究结果令人鼓舞，但STING激动剂的临床试验在很大程度上未能实现持久疗效，目前尚无药物进入III期试验。本综述探讨了癌症治疗中限制STING通路激活的生物学、药理学和临床障碍，分析了STING激动剂的内在局限性，以及由肿瘤异质性、免疫抑制和STING慢性激活引发的宿主相关耐药机制，同时还综述了获得性耐药的相关机制，如免疫检查点上调和效应免疫细胞抑制。药物递送平台、小分子设计和联合治疗策略的最新进展为后续研究提供了潜在方向。本研究重点关注基于人类STING变异体、表观遗传调控和生物标志物驱动的患者分层等精准治疗方法，以改善临床结局。这些研究结果表明，需要优化特定情境下的STING激活策略，从而充分发挥该通路在肿瘤治疗中的全部治疗潜力。 Abstract The stimulator of interferon genes (STING) pathway plays a crucial role in immune responses and has emerged as a compelling target in cancer therapy. Despite promising preclinical studies, clinical trials of STING agonists have largely failed to deliver durable efficacy, with no agents progressing to phase III trials. This review examines the biological, pharmacological, and clinical barriers limiting STING pathway activation in cancer treatment. We discuss the inherent limitations of STING agonists as well as host-related resistance driven by tumor heterogeneity, immune suppression, and chronic STING activation. Mechanisms of acquired resistance, such as immune checkpoint upregulation and suppression of effector immune cells, are also reviewed. Recent advances in delivery platforms, small-molecule design, and combination treatment strategies offer promising paths forward. We highlight precision approaches based on human STING variants, epigenetic modulation, and biomarker-driven patient stratification to improve clinical outcomes. These insights underscore the need for refined, context-specific STING activation strategies to unlock the full therapeutic potential of this pathway in oncology. 引言 干扰素基因刺激因子（STING）是细胞质病原DNA固有免疫应答中的关键蛋白，由环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）合成的环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）激活。激活后，STING磷酸化TANK结合激酶1（TBK1），进而激活干扰素调节因子3（IRF3），最终诱导I型干扰素（IFNs）和趋化因子的表达。该信号级联反应可促进树突状细胞（DC）活化并增强抗原呈递，进一步刺激CD8+T细胞募集和活化，以增强抗肿瘤免疫。由于这些作用，STING日益被认为是癌症免疫治疗中极具潜力的靶点。STING激动剂已得到广泛研发，并在多种恶性肿瘤临床前模型中显示出显著的肿瘤抑制作用，部分甚至实现了肿瘤消退。 近年来，关于STING的研究取得了重大进展，产生了大量突破性发现，为新型STING激动剂的研发提供了强有力的动力。2019年，尚领导的研究团队首次公布了全长STING的冷冻电镜结构。三年后，该团队发现STING跨膜区存在第二个激动剂结合位点，为新型STING靶向药物的研发提供了结构基础。王等人利用自主研发的STING激活纳米颗粒证实，STING激动剂可促进肿瘤血管正常化，改善缺氧微环境，增强内皮细胞黏附分子的表达，并募集更多免疫效应细胞，从而发挥肿瘤生长抑制作用（图1）。 图1 STING开发的时间轴 时间轴描述了自2008年识别以来STING发现的简史以及关于STING生物学和激动剂应用的关键事件。 尽管临床前研究结果令人振奋，但STING激动剂的临床疗效仍有限，其潜在机制尚不明确，这已成为研究成功的主要障碍。此外，STING激动剂的耐药性问题也日益受到关注。探究耐药机制并确定增敏策略，对于解决转化医学面临的挑战至关重要。本综述分析了STING激动剂临床疗效有限的相关因素，既包括STING激动剂的固有特性，也涉及肿瘤的特异性特征（原发性和获得性耐药），同时进一步探讨了旨在克服这些治疗障碍的现有解决方案和未来研究方向。 STING激动剂疗效的限制因素 药物相关挑战 膜通透性有限：STING是一种主要定位于内质网（ER）的跨膜蛋白。天然STING激动剂环二核苷酸（CDNs）由于带有负电荷、极性强且水溶性高，难以穿透细胞膜与STING结合，从而限制了其生物活性。先前的研究已发现特定转运蛋白（如SLC19A1、SLC46A和P2X7R）可促进cGAMP进入细胞内。此外，缝隙连接、容积调节阴离子通道（VRAC）、病毒颗粒和细胞内吞作用等机制也可协助cGAMP穿过脂质双分子层。张及其同事进一步证实，人类宿主防御肽LL-37可作为cGAMP转运蛋白，增强STING介导的固有免疫。然而，cGAMP的摄取效率仍然较低，且cGAMP转运蛋白的表达可能受细胞类型、细胞状态和环境因素的影响。因此，克服膜通透性障碍对于充分发挥STING激动剂的生物学潜力至关重要（图2A）。 图2 限制STING激动剂功效的因素 （A）由于膜渗透性屏障，CDN难以与STING结合，特定的转运蛋白和病毒颗粒等机制可以帮助克服这些屏障，但仍然存在许多限制。 （B）CDN表现出差的稳定性并且容易被ENPP 1水解成免疫抑制代谢物。 （C）DMXAA表现出物种特异性并且不能结合hSTING。STING的构象变化和激活机制仍需进一步探讨。 （D）肿瘤内注射和静脉内施用都缺乏肿瘤和细胞特异性靶向。肿瘤内给药面临着肿瘤内浓度差异的问题，并且肿瘤位置、大小和形态的异质性构成了重大挑战。静脉给药容易引发炎症反应和其他副作用。 稳定性差且代谢产物具有免疫抑制作用：除细胞通透性有限外，CDNs的代谢稳定性较差，静脉给药后半衰期极短。外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶I（ENPP1）可直接水解cGAMP，生成AMP和GMP，同时也可将ATP水解为AMP。两条通路产生的AMP均会被CD73迅速脱磷酸化为腺苷，而腺苷会抑制免疫细胞功能并促进肿瘤转移。这表明ENPP1可将STING激动剂的免疫刺激作用转变为免疫抑制作用（图2B）。 STING激动剂的物种特异性：5,6-二甲基黄嘌呤-4-乙酸（DMXAA，ASA404）是首批非CDN小分子STING激动剂之一，在小鼠模型中显示出抗肿瘤和免疫调节作用。然而，后续临床研究发现，DMXAA可选择性结合小鼠STING（mSTING），但无法结合人类STING（hSTING）。这一发现强调，在STING激动剂的研发过程中，需谨慎考虑物种特异性，并通过临床试验严格验证其结合和激活hSTING的能力（图2C）。 STING激动剂的激活机制具有多样性：目前普遍认为，STING在激活后会从“开放”构象转变为“闭合”构象，这一结构变化与CDN结合相关。然而，另一种STING激动剂diABZI在激活STING时，可使其维持开放构象。这种独特的构象可能代表了一种新型的STING激活机制。进一步研究STING的结构动力学和激活机制，可为STING激动剂的研发提供新的方向（图2C）。 肿瘤内递送面临挑战：尽管STING激动剂的全身给药可能引发细胞因子风暴风险，但肿瘤内注射可实现靶向给药，降低全身暴露。尽管肿瘤内注射在实体瘤治疗中具有潜在应用前景，但CDNs的肿瘤内递送仍面临多项挑战：首先，不同癌症类型和个体患者的肿瘤异质性，导致给药方案难以标准化；其次，肿瘤位置、大小、形态、血管分布和机械特性的差异，以及注射后CDNs的快速扩散，会导致肿瘤内浓度和分布存在显著差异，进而引发不同肿瘤区域的异质性应答，使剂量优化变得复杂；此外，肿瘤内注射需要先进的成像技术进行精准引导，而这并非总能实现；且由于ADU-S100等STING激动剂的半衰期较短（10-20分钟），通常需要多次注射才能达到治疗效果，这在临床实践中面临额外挑战；最后，肿瘤内递送无法解决肿瘤常见的复发和转移问题。因此，要实现STING激动剂肿瘤内给药的临床应用，必须克服重大的技术和生物学障碍（图2D）。 缺乏肿瘤和细胞靶向性：STING的最佳激活理想情况下应发生在肿瘤内，形成局部炎症环境，释放趋化因子以募集T细胞进入肿瘤微环境（TME），同时限制其在血液和其他组织中的激活。STING激动剂全身给药的主要挑战在于缺乏肿瘤和细胞特异性靶向性。全身递送不可避免地会导致正常组织中的脱靶效应，引发全身性炎症反应，可能导致严重的细胞因子释放综合征（CRS），出现疲劳、发热、头痛和多器官功能衰竭等症状。此外，全身激活还可能引发自身免疫性疾病、组织毒性，甚至形成促肿瘤炎症微环境。因此，研发可靶向递送至肿瘤的STING激动剂迫在眉睫，以增强免疫激活并最大限度地减少副作用（图2D）。 肿瘤或宿主相关耐药 hSTING变异体对STING激动剂的应答存在差异：hSTING存在单核苷酸多态性，主要有五种变异体：R232（57.9%）、HAQ（20.4%）、H232（13.7%）、AQ（5.2%）和R293Q（1.5%）。这些变异体对STING激动剂的敏感性各不相同。例如，STING-H232可响应内源性2',3'-cGAMP，但对某些外源性CDNs无应答，而STING-HAQ对外源性和内源性CDNs的应答均降低（图3A）。此外，这些变异体的分布具有地域差异，HAQ变异体在东亚人群中较为常见，但在非洲人群中罕见。这强调在临床试验招募参与者时，需考虑hSTING变异体及其地理分布，以提高研究结果的科学性和普适性。 图3 驱动对STING激动剂的原发性抗性的宿主因素 （A）hSTING存在于对STING激动剂具有不同响应性的五种主要变体中。 （B）肿瘤中的CIN导致慢性STING激活，这可能导致免疫逃避和更差的临床结果。 （C）肿瘤细胞通常抑制cGAS-STING途径以逃避具有表观遗传机制的免疫监视。 （D）STING表达在肿瘤转移期间波动，并且STING激动剂可以在早期转移期间增强免疫应答。 （E）来自TCGA数据库的肿瘤样品和配对正常组织中TMEM 173基因的表达谱。 染色体不稳定性（CIN）高的肿瘤中STING慢性激活降低对STING激动剂的应答：肿瘤内在STING激活在癌症进展中的作用仍存在争议。虽然STING激活通常与抗肿瘤免疫和细胞凋亡相关，但肿瘤中STING的高表达往往预示着多种癌症的预后较好。然而，在接受辅助化疗的乳腺癌和卵巢癌患者中，STING的高表达（尤其是在增殖细胞中）与复发风险增加相关。在晚期和转移性肿瘤中，随着肿瘤进展，染色体不稳定性（CIN）会加剧，导致STING慢性激活，进而驱动IL-6-STAT3信号传导，促进CIN阳性肿瘤细胞存活。小鼠高CIN肿瘤模型显示，通过非经典STING通路激活NF-κB，可促进免疫逃逸和转移，导致更严重的转移和更低的存活率。研究表明，细胞中反复的STING激动剂刺激最初会引发强烈的IFN应答，但随着时间推移，会抑制IFN信号传导，并激活内质网应激和NF-κB相关基因，从而有助于免疫逃逸。因此，STING慢性激活可能导致STING激动剂在晚期或转移性肿瘤患者中的应用效果不佳（图3B）。 肿瘤细胞中cGAS-STING通路受到抑制：肿瘤细胞的DNA损伤应答（DDR）系统通常存在异常，且CIN会增强。DDR是一种高度保守的机制，可保护基因组免受损伤。在肿瘤细胞中，编码DDR成分的基因突变会导致DNA修复缺陷和CIN，包括染色体分离错误，产生非整倍体细胞和微核。在高CIN肿瘤中，微核可能破裂，释放DNA并激活cGAS-STING通路。为了逃避STING介导的免疫监视，肿瘤细胞通常采用表观遗传机制阻断STING激活，以此作为生存策略。 例如，胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中STING表达受到抑制，导致免疫冷肿瘤微环境的形成。在胶质母细胞瘤中，肿瘤细胞中STING表达下调，但在肿瘤相关免疫细胞和基质细胞中保持稳定。同样，肝细胞癌（HCC）细胞的STING表达低于非肿瘤组织，这可能与免疫监视功能受损相关。黑色素瘤细胞通过表观遗传沉默cGAS或STING，从而在细胞质DNA暴露后避免产生I型IFN和免疫细胞因子。 从机制上讲，肿瘤细胞中的STING信号传导常因cGAS和STING的启动子突变或高甲基化而受到抑制。STING表达也受组蛋白修饰调控，组蛋白H3Lys4去甲基化酶KDM6B和KDM5C可抑制STING表达。此外，TMEM173基因的内源性启动子区域存在转录因子MYC的结合位点，三阴性乳腺癌中MYC敲除可导致TMEM173上调，增加CXCL10和CCL5的产生，并增强CD8+T细胞浸润。肿瘤细胞还可能通过上调某些稳定基因组并防止微核形成的基因（如单极纺锤体1（MPS1））来抑制STING激活，MPS1在有丝分裂中起关键作用，与多种癌症相关。抑制MPS1可诱导微核形成并直接激活STING。此外，IDH1突变的肿瘤表现出选择性cGAS高甲基化和沉默，抑制mIDH1可重新激活cGAS表达和某些转座元件（图3C）。 肿瘤转移不同阶段STING表达的变化：在肿瘤转移过程中，STING表达会动态波动。在转移的早期休眠阶段，低STING活性使癌细胞能够逃避免疫监视。当休眠细胞脱离休眠状态并开始增殖时，STING活性会增加，使这些细胞更容易受到免疫攻击。存活的癌细胞形成更大的转移灶，再次表现出低STING水平和增强的免疫逃逸能力。从机制上讲，休眠期间高TGF-β表达会抑制STING表达，而在转移爆发时，启动子和增强子甲基化会下调STING表达。 因此，在转移早期增殖的癌细胞中，STING上调可能使这些细胞被免疫识别和抑制，从而限制从休眠到复发的进展（图3D）。临床前研究表明，在转移早期使用STING激动剂可促进自然杀伤（NK）细胞和T细胞募集，增强对转移性癌细胞的细胞毒性，并抑制转移灶的生长。 不同癌症类型中STING表达的差异：STING表达在不同癌症类型中存在显著差异。例如，编码STING的TMEM173基因在结直肠癌、肾透明细胞癌、甲状腺癌和胃腺癌中上调，而在子宫内膜癌、前列腺癌、肺鳞状细胞癌和肺腺癌中下调。这些差异可能意味着不同癌症类型和亚型对STING激动剂的敏感性不同（图3E）。此外，肿瘤内细胞组成和STING表达的异质性使STING激动剂的疗效评估变得复杂。 获得性耐药机制 次级免疫检查点分子过表达：cGAS-STING通路的持续激活与吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的上调相关，IDO是免疫逃逸和抑制T细胞增殖的关键因素。在Lewis肺癌（LLC）STING敲除小鼠模型中，肿瘤微环境中IDO和髓源性抑制细胞（MDSCs）的水平显著降低。此外，研究表明STING激活可通过上调程序性死亡配体1（PD-L1）促进口腔鳞状细胞癌和肝细胞癌（HCC）等癌症的进展。同样，在子宫内膜癌细胞中，线粒体DNA释放和STING激活会导致PD-L1表达增加，诱导T细胞凋亡。肿瘤内注射STING激动剂后，肿瘤微环境中PD-L1、IDO和COX2的表达会升高，从而降低STING激动剂的抗肿瘤疗效。在用STING激活纳米颗粒治疗的肿瘤中，另一种与免疫逃逸相关的免疫检查点分子B7同源物3（B7-H3/CD276）的表达会增加。STING激动剂ADU-S100可增强小鼠和人类2型常规树突状细胞（cDC2）中T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3（Tim-3）的表达，抑制CD4+T细胞功能，削弱CD4+T细胞驱动的抗肿瘤应答。在Renca肺转移小鼠模型中，使用负载STING激动剂的脂质纳米颗粒治疗可显著增加免疫细胞中淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）的表达。这些发现表明，STING激动剂可通过上调IDO、PD-L1、COX2、B7-H3、Tim-3和LAG-3等免疫检查点分子诱导获得性耐药，从而帮助肿瘤实现免疫逃逸（图4A）。 图4 cGAS-STING途径激活介导的获得性耐药机制 （A）cGAS-STING途径激活可导致免疫检查点分子上调。 （B）STING活化可增强TME中免疫抑制细胞的存在。 （C）过度的STING活化可通过减少T和B细胞的增殖、浸润和促进细胞凋亡而导致T和B细胞功能的抑制。 （D）ER应激导致错误折叠蛋白质的积累。 次级免疫抑制细胞和因子的激活：评估STING激动剂的治疗潜力，需要确定是否能够建立富含T细胞的肿瘤微环境以支持cGAS-STING通路激活，因为富含T细胞的肿瘤微环境与STING激动剂的阳性应答和预后改善相关。此外，BATF3依赖性树突状细胞在STING介导的抗肿瘤免疫中起关键作用。值得注意的是，STING在肿瘤微环境中的免疫细胞和非免疫细胞（包括肿瘤细胞和血管内皮细胞）中均有表达。肿瘤微环境中不同细胞类型的STING激活可能产生相反的效果：既可能募集免疫支持细胞以抑制肿瘤生长和转移，也可能吸引免疫抑制细胞，促进肿瘤进展。cGAS-STING通路的激活可增强肿瘤微环境中免疫抑制细胞的表达，包括调节性T细胞（Tregs）、调节性B细胞（Bregs）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和髓源性抑制细胞（MDSCs），形成免疫抑制性肿瘤微环境，促进癌症进展。在人乳头瘤病毒（HPV）阳性的舌鳞状细胞癌中，STING激活可促进IL-10等免疫抑制细胞因子的产生，从而促进Treg浸润。在胰腺癌小鼠模型中，STING激动剂的全身给药通过STING-IRF3轴诱导Breg扩增，Bregs分泌IL-35和IL-10，抑制NK细胞活性和肿瘤内浸润。阿韦特及其同事发现，CAFs中STING-IRF3通路的激活会降低溶瘤病毒对肿瘤细胞的细胞毒性，影响溶瘤病毒疗法的疗效。辐射暴露后，MC38小鼠结直肠癌中STING依赖性髓源性抑制细胞（MDSCs）的激活会促进巨噬细胞M2极化和Treg增殖。在1型神经纤维瘤病中，STING激活会募集1型常规树突状细胞和T细胞，矛盾的是，这些细胞会促进肿瘤形成，尤其是通过CD8+T细胞。STING激活可上调IL-10和IL-35等免疫调节因子，抑制抗肿瘤免疫细胞活性，形成免疫抑制性肿瘤微环境（图4B）。STING激活的免疫调节作用仍不明确，且目前的STING激动剂对肿瘤内特定细胞类型缺乏特异性。 效应免疫细胞受到抑制：STING过度激活可能抑制T细胞和B细胞增殖，减少其浸润，并促进细胞凋亡。莱莫斯等人发现，STING通过减少肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润并增加髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润，促进LLC生长。此外，在Sting1S3654/S3654小鼠的肿瘤中，大量T细胞发生STING介导的、不依赖IFN的细胞死亡，加速肿瘤进展和免疫逃逸。拉金等人发现，DMXAA激活T细胞中的应激通路，并上调促凋亡基因（如BAX）的表达，导致T细胞凋亡。在混合骨髓嵌合体模型中，与对照组相比，STING缺陷条件下Ki-67+CD8+记忆T细胞的数量更多。从机制上讲，T细胞表达高水平的STING，但I型IFN应答较低。虽然树突状细胞中STING激活对于肿瘤中T细胞的募集和激活至关重要，但T细胞中STING激活会触发依赖NF-κB而非IFN的转录变化，最终导致T细胞凋亡。此外，T细胞中的LRRC8C转运蛋白可将cGAMP转运至细胞内，激活STING-p53通路，抑制Ca2+内流和细胞因子产生，并抑制T细胞介导的适应性免疫应答。STING激活还会降低B细胞对B细胞受体信号传导的敏感性，并可能诱导凋亡，从而削弱抗体应答（图4C）。 内质网应激：多种遗传和环境因素会损害内质网的蛋白质折叠和修饰功能，导致错误折叠蛋白质积累，这种情况被称为内质网应激。内质网应激是STING激动剂抗肿瘤疗效的已知障碍。在T细胞中，STING的激活（直接激活或通过Ca2+内流激活）会导致未折叠蛋白反应相关基因（尤其是Bip/HSPA5和GADD34）的显著上调。内质网中未折叠或错误折叠蛋白质的积累会引发内质网应激，阻碍蛋白质翻译，增强肿瘤细胞的免疫逃逸能力，使其能够在应激条件下存活并逃避免疫监视（图4D）。 通过药物修饰增强STING激动剂的疗效 提高CDNs的代谢稳定性 合成CDN类似物具有良好的生产潜力，但由于膜通透性有限和代谢不稳定，其药代动力学特性仍有待优化。为了解决这些局限性，研究人员通过核苷酸取代、核糖替换和引入硫代磷酸酯键等策略，开发了具有增强降解抗性的修饰合成CDNs。核苷酸修饰和核糖替换显著提高了I型IFN的产生，而硫代磷酸酯键修饰使CDN类似物对磷酸二酯酶、核酸酶、ENPP1和蛇毒磷酸二酯酶等水解酶具有抗性（图5A）。例如，利奇等人开发了一种带正电荷的多结构域肽水凝胶，能够在15小时内持续释放CDNs，与游离CDNs相比，注射部位的CDN浓度更高。这种方法在MOC2-E6E7口腔癌小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长，为CDNs的临床应用提供了潜在策略。 图5 通过药理学修饰增强STING激动剂的功效 器增强STING激动剂的功效涉及解决药代动力学、肿瘤特异性和免疫激活方面的挑战。诸如修饰CDN、开发非CDN激动剂、利用Mn2+佐剂、通过纳米载体和ADC改善靶向递送以及开发ENPP 1抑制剂等策略代表了优化STING激动剂疗法的关键方法，使其在癌症治疗中更有效。 非CDN STING激动剂和cGAS激动剂的研发 第二代STING激动剂主要为非CDN小分子，旨在克服核苷酸类药物的药代动力学局限性。值得关注的例子包括diABZI、MSA-2和SR-717，每种药物都具有独特的优势。静脉给药的diABZI比cGAMP具有更强的固有免疫激活作用，而MSA-2和SR-717由于具有口服生物利用度，因此极具应用前景。MSA-2设计有质子化羧基，在酸性肿瘤微环境中可增强细胞膜通透性，有效促进IFN-β分泌，并在小鼠模型中诱导肿瘤消退。当与抗PD-1疗法联合使用时，MSA-2可显著提高治疗效果，且副作用最小。然而，MSA-2的全身给药可能导致其他组织中STING的脱靶激活，因此需要进一步进行安全性评估。 为了更清晰地说明CDN类与非CDN类STING激动剂的优缺点，表1比较了肿瘤选择性、细胞因子释放谱以及血浆半衰期和hSTING变异体的EC50等临床疗效指标。该对比分析为评估各类药物和指导治疗策略的制定提供了全面框架。 同样，cGAS激动剂因其能够模拟内源性cGAMP激活STING的能力而受到关注。诱导有丝分裂应激或细胞内递送双链DNA等技术为模拟这种自然激活过程提供了潜在途径，为STING通路激活研究提供了新的思路（图5B）。 激活佐剂的应用 Mn2+和Mg2+等金属离子已被证实具有作为STING通路激活佐剂的潜力。这些离子可局部应用，或通过药物平台与STING激动剂一起递送，以增强STING通路激活。其中，Mn2+在cGAS-STING通路激活和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。研究表明，小鼠体内Mn2+缺乏会加速肿瘤生长和转移，同时肿瘤浸润CD8+T细胞数量显著减少。在细胞内，Mn2+被隔离在高尔基体和线粒体等膜结合细胞器中，病毒感染后释放到细胞质中。在细胞质中，Mn2+在STING激活中具有多种作用：可独立激活单体cGAS（无需双链DNA）；通过变构相互作用增强cGAS-双链DNA结合；提高cGAS的催化活性以产生更多cGAMP；并可能提高cGAMP对STING的亲和力。此外，Mn2+可独立于STING诱导TBK1磷酸化，促进IFN-β产生。这些特性使Mn2+成为STING激活的重要佐剂。例如，陈及其同事报道，Mn2+-cGAMP纳米疫苗（Mn2+-cGAMPNV）在小鼠黑色素瘤模型中显著增强了抗肿瘤免疫，与抗PD-L1抗体联合使用时，对原发性和远端肿瘤的控制效果更佳（图5C）。 增强STING激动剂的靶向性和递送效率 尽管STING激动剂具有全身给药的潜力，但其缺乏肿瘤特异性可能导致广泛的炎症反应。为了实现最佳治疗效果，STING激动剂必须特异性靶向肿瘤组织，最大限度地提高抗肿瘤疗效，同时最大限度地减少对正常组织的不良影响。这促使研究人员探索肿瘤靶向、稳定的STING激动剂和先进的药物递送系统，以优化STING激动剂的药理学特性和与载体材料的相容性，实现对肿瘤的可控、靶向递送，增强肿瘤内滞留，并减少脱靶效应（图5D）。 通过生化信号靶向肿瘤微环境：肿瘤微环境独特的生化特征（如缺氧、低pH和膜电位改变）为STING激动剂的靶向递送提供了途径。例如，MSA-2在酸性肿瘤微环境中具有更高的细胞膜通透性，有助于在肿瘤内积累并激活STING。 抗体-药物偶联物（ADCs）：抗体-药物偶联物（ADCs）为STING激动剂的靶向递送提供了巨大潜力。通过将生物活性药物与肿瘤特异性单克隆抗体偶联，ADCs能够在肿瘤部位精准释放药物，降低对正常组织的毒性。XMT-2056是一种将diABZI与抗HER2抗体结合的ADC，在体内成功诱导了强大的抗肿瘤免疫，其疗效是diABZI单独使用的100倍。尽管全身细胞因子水平仅轻微升高，但XMT-2056的I期试验在发生5级（致命）严重不良事件后暂停，这强调了创新药物研发中确保安全性的重要性。 纳米载体递送策略：纳米载体已成为极具前景的递送平台，通过细胞吞噬等机制促进STING激动剂的肿瘤靶向递送。其小尺寸和大表面积使其能够高效载药，并通过增强渗透和滞留效应延长循环时间。经过特殊修饰的纳米载体可进一步增强靶向性，甚至能够穿越血脑屏障等生物屏障。例如，戴恩等人巧妙设计了携带CDN-PEG化脂质的脂质纳米盘（LND-CDNs），以增强CDNs的膜通透性和细胞摄取。静脉注射后，LND-CDNs有效激活了肿瘤中的STING通路，引发了强烈的免疫应答。汉森等人利用PEG化脂质纳米颗粒将CDNs递送至引流淋巴结，其效果优于30倍剂量的可溶性CDNs。黄等人设计了一种肿瘤靶向脂质-树状大分子-磷酸钙纳米载体，该载体不仅具有出色的质粒DNA递送能力，还能有效激活STING通路。一种由Mn、STING激动剂（ABZI）和萘酞菁（ONc）配位的纳米颗粒（ONc-Mn-A）与马来酰亚胺修饰的普朗尼克F127（malF127）胶束组成的金属胶束纳米疫苗（ONc-Mn-A-malF），可有效激活STING通路，促进树突状细胞成熟，并最终通过CD8+T细胞和NK细胞清除肿瘤细胞。麦克安德鲁斯等人还设计了外泌体（iExoSTINGa），用于将cGAMP递送至抗原呈递细胞（APCs），与单一STING激动剂相比，其肿瘤抑制效果更优。其他例子包括：纳米颗粒-cGAMP，可增强cGAMP的细胞质释放；纳米颗粒PC7ANP，可引发强烈的细胞毒性T细胞应答，同时最大限度地减少全身细胞因子表达；ZnS@BSA（牛血清白蛋白），可在酸性肿瘤微环境中释放锌离子，显著增强cGAS/STING信号传导；以及cGAS-STING纳米激动剂（BSA-Man@Mn2+-Ft@Lap），可增强体内针对低免疫原性实体瘤的肿瘤特异性T细胞介导的免疫应答。 选择STING激动剂纳米载体递送系统的主要目标包括：最大限度地提高肿瘤特异性靶向性、延长半衰期、确保高效的细胞摄取和细胞质递送，最终在最小化脱靶效应的前提下，在内质网实现有效的STING激活。 ENPP1抑制剂的研发 为了应对CDN的不稳定性，研究人员开发了ENPP1抑制剂，以在肿瘤内局部抑制ENPP1，有效提高细胞外cGAMP浓度，同时减少免疫抑制性腺苷的产生。ENPP1抑制剂通常分为核苷酸类和非核苷酸类。前者虽然合成相对容易，但选择性有限，口服生物利用度低，且由于其与天然底物结构相似，存在脱靶效应风险。相比之下，非核苷酸ENPP1抑制剂（包括聚磺酸盐、多金属化合物、多糖和杂环化合物）正在探索中。尽管非核苷酸ENPP1抑制剂的早期研究面临挑战，但这些化合物为增强癌症治疗中的抗肿瘤免疫提供了一种有前景的新方法（图5E）。 优化STING激动剂的给药剂量和研发策略以改善治疗效果 探索STING激活的分子机制 郑团队最近发现了一种新型质膜结合STING异构体，称为“质膜STING（pmSTING）”。与经典的内质网结合STING（erSTING）不同，pmSTING的C末端位于细胞外，使其能够直接感知细胞外cGAMP，诱导TBK1和IRF3磷酸化，并触发免疫应答。这一发现表明pmSTING的进化在物种间可能具有保守性。传统上，研究主要集中在erSTING上，针对pmSTING的抗肿瘤治疗探索较少。这一研究重点的转变有助于降低药物剂量，提高治疗指数，并最大限度地减少全身毒性和副作用（图6A）。 图6 优化基于STING的免疫疗法的战略框架 （A）分子机制：pmSTING介导的免疫激活的示意图。pmSTING独特的拓扑结构和激活机制突出了其作为替代免疫靶标的潜力。 （B）药物开发：正在研究包括相分离调节和VRAC介导的递送在内的各种策略以增强STING激动剂性能。 （C）剂量-效应关系：钟形剂量-反应曲线表明，剂量不足和过量都会损害治疗效果，强调需要精确优化的给药方案。 （四）临床试验：扩大高质量试验证据对支持系统评价、指导合理临床应用至关重要。 研发STING相分离抑制剂和VRAC通道激动剂 在cGAMP浓度升高时，STING会发生液-液相分离，形成STING相分离器，隔离STING和TBK1，限制I型IFN产生并防止免疫过度激活。微管破坏剂可抑制STING凝聚物的凝胶状转变，为增强STING激活提供了一种新方法。除了传统的STING激动剂外，其他药物（如VRAC通道激动剂）在增强STING信号传导方面显示出潜力，尽管其在癌症免疫治疗中的应用仍有待进一步探索（图6B）。 优化STING激动剂的剂量和给药方式 为了最大限度地提高STING激动剂的抗肿瘤疗效，必须监测其在肿瘤微环境中的半衰期，以便精确控制给药剂量和给药方案。改进现有的纳米颗粒递送系统也可能有益，特别是如果这些载体能够同时递送STING激动剂和其他药物，以发挥协同抗肿瘤作用。简化制备步骤将进一步提高临床可行性。然而，值得注意的是，长时间暴露于高浓度的STING激动剂可能导致T细胞凋亡，从而抵消预期的免疫激活效果。因此，在临床开发之前，必须进行全面的安全性评估，确保治疗效果，同时最大限度地减少免疫毒性，以保护患者安全（图6C）。需要注意的是，优化STING激动剂的剂量和创新给药方式不仅可以提高抗肿瘤疗效，还可以降低与这些药物全身应用相关的细胞因子释放综合征（CRS）风险。此外，监测IL-10、IL-6和铁蛋白等CRS生物标志物，有助于发现CRS的发生。 推进STING激动剂的临床试验 目前已有多种STING激动剂正在进行临床试验，为优化剂量、递送方式和联合治疗提供了宝贵见解。一项临床研究表明，一线免疫治疗患者的客观缓解率（ORR）为16.2%，高于先前接受过免疫治疗的患者（7.2%），这表明在PD-1抑制剂之前使用STING激动剂可以更有效地激活免疫系统。值得注意的是，一名先前未接受过PD-1治疗的三阴性乳腺癌患者，接受200μgMIW815与spartalizumab联合治疗后，经过五个周期的治疗实现了完全缓解，这表明先前未接受过免疫治疗的患者可能特别受益于STING激动剂与PD-1抑制剂的联合治疗。 这些研究正在加速新一代靶向性更强、副作用更小的药物的研发。尽管已有多种STING激动剂进入临床试验，但已发表的临床数据有限，阻碍了对其疗效和安全性的全面了解。扩大临床试验数据将有助于更系统地评估其治疗价值，并指导未来的临床应用，以实现更安全、更有效的治疗（图6D）。 个性化治疗方案：增强STING激动剂疗效的策略和研究方向 不适用于STING激动剂的高CIN肿瘤患者的新策略 由于STING下游通路的快速适应可导致免疫逃逸，因此STING激动剂和抑制剂的分层使用至关重要。必须根据肿瘤分期、基因表达和CIN评分对患者进行分层。确定哪些患者将从STING激活中受益，以及哪些患者可能因肿瘤微环境诱导的应激而需要STING抑制，将有助于优化治疗效果。此外，在STING激动剂治疗期间，监测经典和非经典STING通路中的关键分子至关重要。应密切监测IRF3和NF-κB的激活，可使用荧光素酶报告系统（如ISRE-荧光素酶）反映IRF3活性，而双报告系统（THP-1-dual）可用于评估IRF3和NF-κB的激活（图7A）。 图7量身定制的方法：增强STING激动剂疗效的策略和研究方向 通过个性化的STING激动剂治疗，结合肿瘤特征和微环境因素，可以最大限度地提高抗肿瘤疗效。 （A）用于不适合STING激动剂的CIN高肿瘤患者的新策略。 （B）基于hSTING变体选择STING激动剂以提高功效。 （C）基于肿瘤和微环境生物标志物的分层治疗。 （D）逆转肿瘤细胞cGAS-STING信号传导的抑制。 （E）基于转移阶段优化STING激动剂时机。 （F）基于癌症类型和STING表达的间隔选择方法。 （G）用组合疗法克服对STING激动剂的继发性抗性。 （H）设计基于生物标志物的临床试验。 根据hSTING变异体选择STING激动剂以提高疗效 基于hSTING突变选择STING激动剂，需要通过基因测序鉴定癌症患者的特定hSTING突变，从而选择对这些变异体具有高活性的STING激动剂。然而，hSTING基因变异体的多样性和分布不均给选择带来了挑战。为了解决这一问题，研究人员正在开发广谱STING激动剂，例如新型环二核苷酸类似物c[G(2',5')U(2',5')]，其能够激活所有已知的hSTING变异体，且疗效与cGAMP相当（图7B(1)）。尽管其体内抗肿瘤作用尚未得到验证，但为设计通用STING激动剂提供了重要参考。SR-717的结合模式不受STING等位基因差异的影响，这进一步支持了在不同患者群体中探索此类药物的可能性（图7B(2)）。除了广谱激动剂外，设计特定STING激动剂可选择性调节STING活性。例如，酸响应纳米颗粒（PC7A）可非竞争性结合并激活STING，有效靶向对cGAMP不敏感的hSTING变异体，并产生快速且持续的生物学效应（图7B(3)）。 基于肿瘤和微环境生物标志物的分层治疗 预测STING激动剂疗效的生物标志物对于患者选择至关重要。STING通路中的关键分子（如pTBK1和pIRF3）在pIRF3核转位前的信号转导中必不可少，可作为预测STING激动剂疗效的生物标志物。结合肿瘤微环境中T细胞和BATF3谱系树突状细胞的分析，这些标志物能够更精确地选择患者（图7C(1)）。此外，探索不同肿瘤微环境细胞类型对STING激动剂的应答，对于开发更有效的细胞靶向治疗至关重要。研究不同肿瘤微环境细胞类型对STING激动剂应答的影响及相关因素，可为细胞靶向STING激动剂的研发提供参考（图7C(2)）。 逆转肿瘤细胞cGAS-STING信号传导的抑制 与DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTis）联合使用，可通过抑制DNA甲基转移酶活性、重编程表观遗传谱以恢复STING信号传导并提高肿瘤免疫原性，从而增强STING激动剂的疗效（图7D(1)）。同样，研究表明与KDM5抑制剂联合使用可恢复乳腺癌细胞系中的STING蛋白水平，支持IFN应答，其效果与DNMTis相似（图7D(2)）。此外，与MPS1抑制剂（如BAY-1217389）联合使用，可诱导CIN和微核形成，激活STING信号传导。这种重新激活可恢复KRAS-LKB1突变肺癌中的T细胞浸润，克服由于线粒体功能障碍导致的STING沉默（图7D(3)）。 根据转移阶段优化STING激动剂的使用时机 研究人员旨在利用STING通路激活，在转移发生前清除癌细胞或将其维持在休眠状态。在肝内胆管癌小鼠模型中，MSA-2治疗对早期肿瘤具有特异性抑制作用，但对晚期癌症无抑制作用。尽管目前STING激动剂正在晚期癌症患者中进行评估，但由于早期转移阶段STING表达更高，且免疫逃逸肿瘤微环境尚未完全形成，因此在该阶段进行治疗可能更有效（图7E）。 根据癌症类型和STING表达情况选择治疗方案 在临床实践中，考虑不同癌症类型之间的差异至关重要。这种方法包括根据肿瘤微环境中STING和cGAS的表达水平以及CIN评分对患者进行分层，实现STING激动剂的个性化治疗，同时避免对不敏感肿瘤类型进行不必要的治疗（图7F）。 通过联合治疗克服STING激动剂的获得性耐药 为了应对免疫检查点分子上调、免疫抑制细胞激活和免疫效应细胞活性降低等获得性耐药机制，STING激动剂正越来越多地与各种疗法联合使用。这些联合治疗在手术、化疗、放疗、光动力疗法（PDT）、CAR-T和免疫检查点抑制剂（ICIs）等领域均显示出增强的治疗效果。例如，石等人发现，STING激动剂diABZI与IDO抑制剂1-MT的联合治疗显著促进了CD8+T细胞和树突状细胞的募集，同时减少了髓源性抑制细胞（MDSCs）的浸润，产生了显著的抗肿瘤效果。莱莫斯等人发现，STING激动剂环二腺苷酸单磷酸（CDA）与IDO1抑制剂lindrostat的联合治疗在小鼠LLC模型中显著增强了抗肿瘤疗效，从而延长了小鼠的存活时间。宋等人证实，STING激动剂与Toll样受体2激动剂的联合使用降低了肿瘤单核细胞中PD-L1的表达，重塑了肿瘤微环境，并增强了抗肿瘤免疫应答。在头颈部鳞状细胞癌模型中，STING激动剂的局部递送降低了手术切除后的复发风险。此外，在小鼠模型中，5-FU与cGAMP联合使用在增强抗肿瘤效果的同时，最大限度地减少了胃肠道副作用。值得注意的是，电针与抗PD-1疗法的联合治疗也通过激活STING通路，增强了微卫星稳定结直肠癌的抗肿瘤免疫应答（图7G）。 基于生物标志物的临床试验设计 推进STING激动剂治疗的精准性，需要将生物标志物引导的临床试验设计纳入其中。通过利用pTBK1和pIRF3等指示STING通路激活状态的生物标志物，研究人员可以更准确地预测哪些患者可能对STING激动剂产生阳性应答。将这些生物标志物整合到临床试验设计中，有助于最大限度地提高治疗效果，同时最大限度地减少治疗相关不良事件。随着该领域的发展，生物标志物鉴定与临床试验设计之间的协作对于充分发挥STING激动剂在癌症免疫治疗中的潜力至关重要，从而制定出更有效、更安全的治疗方案（图7H）。 临床开发中的STING相关药物 DMXAA mSTING激动剂DMXAA是首个进入临床试验的药物，多项I期和II期临床试验证实了其在多种实体瘤中的安全性和活性（表2）。在日本患者中进行了一项I期临床试验，评估ASA404与多西他赛联合治疗晚期或复发性实体瘤的安全性、耐受性和初步疗效（NCT01285453）。该研究招募了9名患者，结果显示ASA404与多西他赛的联合治疗具有可接受的耐受性，但疗效有限，1名患者（11.1%）达到部分缓解（PR），5名患者（55.6%）达到疾病稳定（SD）。在一项II期临床研究（NCT01057342）中，与单独使用卡铂和紫杉醇相比，添加DMXAA在晚期非小细胞肺癌患者中显示出意想不到的效果。此外，在III期临床试验（NCT00662597）中，由于物种特异性差异，DMXAA在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的一线治疗中未能显示出疗效，导致试验终止。这一治疗失败凸显了STING蛋白多态性的重要性，并强调了深入了解人类药物-靶点相互作用的必要性。最近，特米佐兹及其同事提出，DMXAA在早期临床结果中的疗效可能与其对STING介导的免疫应答的有益拮抗作用有关，这值得进一步探索。尽管如此，STING激动剂的临床探索已进入hSTING激活剂的研发阶段（图8）。 图8 STING激动剂的临床开发：治疗策略和试验结果 一个时间轴总结了各种STING激动剂的临床开发，每种化合物根据其各自的临床试验阶段进行定位。颜色编码用于指示当前试验状态（例如，已终止、已完成或正在进行中），提供治疗策略和试验结局的清晰概述。 CDN类STING激动剂 由AduroBiotech开发的ADU-S100在过去十年中与诺华合作，积极开展了多项临床试验。尽管该化合物在临床前模型中显示出令人振奋的疗效，但无论是作为单药治疗（NCT02675439）还是与ICIs联合治疗（NCT03172936和NCT03937141），其临床活性均有限。因此，在ADU-S100单药治疗晚期/转移性实体瘤或淋巴瘤的I期试验（NCT02675439）中，该药物通过肿瘤内给药具有良好的耐受性，未出现剂量限制性毒性。然而，受益于该治疗的患者数量较少，仅2.1%的患者（n=1/47）达到PR，38%的患者（n=18/47）达到SD。随后，在一项Ib期研究（NCT03172936）中，ADU-S100与PD-1抑制剂spartalizumab联合使用，与单药治疗相比，应答略有改善。中期数据显示，在23名入组的三阴性乳腺癌（TNBC）患者中，17名可评估疗效，其中1名（4.3%）达到完全缓解，3名（13%）达到PR。 38名黑色素瘤患者中，35名可通过影像学评估疗效，其中3名（7.9%）达到PR，12名（31.6%）达到SD。同样，ADU-S100与抗CTLA4抗体pembrolizumab联合治疗的II期临床试验（NCT03937141）显示出较弱的临床数据，由于AduroBiotech与诺华之间的合作终止，该试验已停止。截至目前，基于令人失望的临床疗效，所有ADU-S100临床试验均已终止（表2）。可能导致这一结果的因素有很多。首先，ADU-S100的药代动力学特性不佳，肿瘤内给药后吸收迅速且半衰期短，这可能限制了药物在靶点部位维持有效浓度的能力。其次，给药途径和给药方案可能未得到优化，无法最大限度地发挥药物的治疗潜力。此外，髓源性抑制细胞（MDSCs）等免疫抑制细胞的诱导可能抵消了STING激动剂的预期免疫激活作用。这些发现强调了在人类中全面评估药物的药代动力学和药效学特性，并相应优化治疗方案的重要性。 默克公司正在开发药物候选物ulevostinag（MK-1454），并在两项人类癌症免疫治疗临床试验中对其进行了测试（表2）。在MK1454单独使用或与pembrolizumab联合使用的I期临床试验（NCT03010176）中，MK-1454单药治疗未显示出疗效，而联合治疗在皮肤或皮下病变患者中的客观缓解率（ORR）高达16.1%。所有入组患者均出现治疗相关不良事件（TRAEs），10.6%的患者（n=18/170）因严重TRAEs而退出试验。这表明联合治疗虽然显示出一定的潜力，但可能未针对患者的安全性和耐受性进行优化。未来的试验应侧重于优化给药方案，并确定更有可能从治疗中受益的患者亚组，同时最大限度地减少不良事件。在其与pembrolizumab联合使用的II期研究（NCT04220866）中，联合治疗组作为转移性或不可切除、复发性头颈部鳞状细胞癌的一线治疗，客观缓解率（ORR）达到50%（n=4/8），而pembrolizumab单独治疗组为10%（n=1/10）。 另一种小分子cGAMP类似物IMSA-101由ImmuneSensorTherapeutics研发，在临床前研究中显示出强大的免疫刺激活性和抗肿瘤疗效（表2）。IMSA-101单独使用或与ICI联合使用的IIa期研究（NCT04020185）最近已完成，I期研究已证实其安全性和耐受性。虽然在单药治疗队列中未观察到实体瘤疗效评价标准（RECIST）定义的应答，但在注射和未注射病变中均观察到显著的肿瘤消退。在联合治疗队列中，1名（5.6%）难治性葡萄膜黑色素瘤患者达到了持久的PR（肿瘤大小减少66%）。目前，IMSA-101正在与PULSAR放疗和ICI免疫治疗联合使用的II期研究中进行积极探索，用于治疗转移性恶性肿瘤患者（NCT05846659和NCT06601296）。迄今为止，IMSA-101的确切化学结构尚未公开。 武田制药公司设计的dazostinag（TAK-676）是一种合成的新型CDNSTING刺激剂，在同源小鼠肿瘤模型中静脉给药后，表现出强烈的STING依赖性抗肿瘤作用，可刺激细胞因子应答并有效激活肿瘤微环境中的免疫细胞。临床前研究已证实TAK-676是一种有前景的治疗候选物，多项临床试验已启动以评估其临床疗效（表2）。TAK-676联合放疗后pembrolizumab的I期研究（NCT04879849）最近已完成，结果有待发表，预计通过增强STING-IFN信号传导，可增强免疫应答以抵抗ICI药物耐药性。另一项正在进行的TAK-676单独使用或与pembrolizumab联合使用的I期和II期研究（NCT04420884）目前正在招募晚期实体瘤患者，预计于2026年完成。目前，中国已注册一项I期临床试验（CTR20234291），以评估TAK-676单独使用或与pembrolizumab联合使用的安全性、耐受性、药代动力学和药效学，但尚未开始招募。 MK-2118是默克公司开发的另一种CDN类似物，其结构尚未公开（表2）。2017年，其I期研究启动，旨在评估MK-2118单独使用或与pembrolizumab联合使用的安全性、耐受性和推荐的2期剂量（RP2D），MK-2118采用肿瘤内给药或皮下给药（NCT03249792）。公布的结果显示，在晚期/转移性实体瘤或淋巴瘤患者中，4.9%的患者（n=7/140）报告出现剂量限制性毒性（DLT），11名患者报告因治疗相关不良事件（TRAEs）而停药。目前，该研究已因商业原因终止。这表明未来的试验必须根据药代动力学和药效学研究结果优化剂量和给药频率，以提高治疗的安全性和有效性。 BMS-986301是下一代CDNSTING激动剂，最初由IFMTherapeutics设计，随后被百时美施贵宝收购（表2）。在小鼠结直肠癌肿瘤模型中，无论是单独使用还是与ICIs联合使用，该药物都能显著抑制肿瘤复发，同时在CT26小鼠模型中诱导免疫记忆。最近，研究人员发现，在PDAC小鼠模型中，肌内注射BMS-986301与肿瘤内给药相比，可实现相当的效应T细胞激活和抗肿瘤疗效，同时有效减轻T细胞耗竭和免疫抑制信号。在小鼠胰腺和肝脏原位模型中也观察到了相同的远隔抗肿瘤活性，这进一步支持了该药物全身给药的临床开发。目前，BMS-986301单独使用或与nivolumab和ipilimumab联合使用的I期研究（NCT03956680）刚刚完成，其目的是评估BMS-986301多种给药途径（肌内注射、肿瘤内注射或静脉注射）的安全性、耐受性和剂量限制性毒性（DLTs）。 BI-1387446（也称为BI-STING）是勃林格殷格翰设计的一种优化CDNSTING激动剂，据报道与STING蛋白的天然配体具有相似性（表2）。其对所有主要hSTING基因型均表现出优异的活性和选择性，即使在低剂量肿瘤内给药后，也能诱导持久的肿瘤抑制和免疫记忆。BI-1387446单独使用或与ezabenlimab（BI-754091）联合使用的I期首次人体研究刚刚在实体瘤患者中完成，结果有待发表（NCT04147234）。 E7766是一种新型大环桥联STING激动剂，是一种泛基因型STING激动剂，对四种主要hSTING变异体具有强大的结合亲和力。在小鼠CT26肝转移肿瘤模型中，肿瘤内给药E7766表现出高疗效和持久的免疫记忆应答（表2）。此外，在对BCG不敏感且对抗PD-1药物耐药的非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）模型中，膀胱内灌注E7766显示出强大的抗肿瘤活性，同时伴有STING-IFN通路的有效激活和下游细胞因子的诱导。这些令人鼓舞的结果推动了E7766作为单药在BCG无应答NMIBC患者中进行膀胱内给药的I期研究（NCT04109092），但该研究在未招募参与者的情况下撤回。另一项E7766单独使用在晚期实体瘤或淋巴瘤患者中进行肿瘤内给药的I期研究（NCT04144140）由于申办者的战略决策（与安全性无关）而终止，因此剂量扩展部分未招募参与者。根据剂量递增部分公布的部分结果，600μg和780μg组的剂量限制性毒性（DLTs）发生率分别为18.2%（n=2/11）和16.7%（n=1/6）。所有参与者均至少经历了一次治疗相关不良事件（TRAEs），并报告了8起严重不良事件。E7766的临床试验必须进一步研究最佳剂量和给药方案，以提高治疗的安全性和有效性。 此外，SB11285（NCT04096638）、DN-015089（CTR20212462）、TSN222（NCT05842785）和ONM-501（NCT06022029）等CDN类STING激动剂也已进入晚期实体瘤患者的临床试验（表2）（图8）。 工程细菌载体 基于细菌的STING激活剂SYNB1891是一种工程化的大肠杆菌Nissle菌株，能够在缺氧条件下将ATP转化为CDA，从而激活STING。利用APC对细菌的主动吞噬作用，SYNB-1891可精确减少“脱靶”效应，并有效驱动肿瘤微环境中吞噬性APC的STING-IFN通路激活，同时通过模式识别受体激活互补的固有免疫通路。临床前研究已证实其在B16.F10荷瘤小鼠中具有有效的抗肿瘤活性和建立免疫记忆的能力。此外，体外研究证实，这种新型激动剂可触发多种hSTING等位基因的激活。令人信服的初步结果推动了SYNB1891在难治性晚期实体瘤或淋巴瘤患者中的I期临床试验（NCT04167137）的开展（表2）。根据公布的结果，SYNB1891单独使用或与atezolizumab联合使用通过肿瘤内给药具有安全性和耐受性，并观察到血清细胞因子（如TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL1RA）的剂量依赖性诱导。所有患者均观察到治疗相关不良事件（TRAEs），32名患者中仅报告了1起剂量限制性毒性（DLT）。36%的患者（n=9/25）达到疾病稳定（SD），其中4名患者先前对抗PD-1/L1治疗无效，其余64%可评估的参与者出现疾病进展（PD）。尽管32名患者中有11名报告了严重不良事件，但未观察到与EcN相关的感染性毒性。然而，由于研究申办者的公司重心转向非肿瘤领域，其首次人体研究已提前终止，因此该试验在招募完成前被申办者终止（图8）。 ADC类STING激动剂 ADC已被广泛探索用于STING激动剂的全身靶向递送。利用针对肿瘤特异性抗原的抗体，STING激动剂ADC可将STING激动剂精确导向癌细胞，降低毒性和脱靶效应。与未偶联（游离）激动剂相比，STING激动剂ADC在体外试验中诱导的细胞因子和IFN水平高出100倍，并增强了肿瘤细胞死亡。多项临床前小鼠研究也证实了其依赖靶点的抗肿瘤免疫，肿瘤局部炎症细胞因子和免疫细胞浸润显著增加，而全身细胞因子水平出人意料地保持较低（图8）。 XMT-2056是Mersana Therapeutics开发的一种优化STING激动剂ADC，基于专门设计的Immunosynthen平台，靶向新型HER2表位。初步数据证实，无论是单独使用还是与其他HER2靶向药物和ICIs联合使用，其在体内均具有抗肿瘤活性。此外，XMT-2056在非人灵长类动物中即使在高剂量下也表现出良好的药代动力学和耐受性。此外，XMT-2056还显示出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性功能，与STING激活协同作用，增强癌细胞杀伤效果（表2）。基于这些临床前结果，Mersana Therapeutics启动了XMT-2056单独使用在HER2阳性复发或转移性实体瘤患者中的I期临床试验（NCT05514717）。不幸的是，2023年3月，在剂量递增部分发生了一起5级（致命）严重不良事件，第二名入组患者（初始剂量水平）死亡，导致研究暂时暂停。其根本原因尚未公开，这引起了人们对ADC激动剂靶向STING的安全性和生物学平衡的关注。2023年底，美国食品和药物管理局同意继续进行该试验，但起始剂量较低。目前，该研究正在积极招募患者，预计于2027年完成。 另一种免疫刺激抗体偶联物（ISAC）STING激动剂TAK-500由武田基于TAK-676和IgG1抗半胱氨酸-半胱氨酸趋化因子受体2（CCR2）抗体开发。这种新型ISAC旨在通过将STING激动剂靶向递送至肿瘤浸润性CCR2表达髓系细胞（包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）），克服肿瘤对ICIs的耐药性（表2）。临床前小鼠模型已证实其通过诱导肿瘤微环境中CD8+效应T细胞的积累和激活，增强抗肿瘤免疫，从而提高存活率。TAK-500的作用机制包括三个方面：激活IFN信号传导、将表达CCR2的髓系细胞重编程为炎症表型，以及阻断抑制性TAM募集。TAK-500单独使用或与pembrolizumab联合使用在成人选择性局部晚期或转移性实体瘤患者中的I期研究（NCT05070247）目前正在招募患者，预计于2026年完成。 聚ADP核糖聚合酶7抑制剂RBN-2397 RBN-2397是一种选择性聚ADP核糖聚合酶7（PARP7）抑制剂，通过逆转PARP7对I型IFN应答的负调控，间接激活STING，从而恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫并抑制肿瘤免疫逃逸。临床前小鼠肿瘤模型已证实，口服RBN-2397通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导持久免疫，以I型IFN依赖性方式诱导肿瘤特异性适应性免疫记忆和完全肿瘤消退（表2）。此外，另一种PARP7抑制剂JAB-26766在2024年美国癌症研究协会（AACR）年会上公布了临床前研究数据，阐明其与STING激动剂联合使用可协同激活STING通路。佩德雷蒂等人研究了STING激动剂diABZI与PARP抑制剂奥拉帕利在同源重组缺陷乳腺癌中的联合抗肿瘤作用，发现该联合治疗显著增强了免疫细胞浸润（尤其是NK细胞），并显示出优异的抗肿瘤疗效。RBN-2397单药治疗实体瘤患者的I期研究显示出良好的耐受性和临床活性，1名HR+HER2乳腺癌患者在100mg剂量下达到确认的PR，8名患者观察到SD持续超过18周（NCT04053673）。2022年启动了另一项RBN-2397与pembrolizumab联合使用在肺鳞状细胞癌（SCCL）患者中的Ib/II期试验，旨在探索RBN-2397在先前接受过PD-1/L1抑制剂治疗且观察到应答后疾病进展的SCCL患者中恢复对ICIs应答的能力（NCT05127590）（图8）。 SNX281 SNX281是一种新型小分子STING激动剂，具有良好的药代动力学特性，可通过静脉注射进行全身给药。在临床前研究中，SNX281在小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性，能够有效根除某些肿瘤并诱导免疫记忆（表2）。目前，SNX281正在进行I期临床试验（NCT04609579），以评估其在晚期实体瘤和淋巴瘤患者中作为单药治疗和与pembrolizumab联合治疗的安全性和有效性。最终结果尚未发表（图8）。 STING抑制剂 虽然STING激动剂已进入癌症免疫治疗的临床试验，但STING抑制剂的作用主要集中在自身炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗中。这些抑制剂主要通过三种机制发挥作用：阻断棕榈酰化、与内源性配体竞争结合位点，或促进STING降解。Cys88和Cys91的棕榈酰化对于STING激活至关重要。C-176、C-178和H-151等共价抑制剂通过不可逆地修饰这些残基来阻止激活。内源性硝基脂肪酸（如10-NO2-OA）和衣康酸衍生物（如4-OI）通过烷基化Cys-91发挥类似作用。10-硝基油酸（CXA-10）是一种硝基脂肪酸，可与STING的半胱氨酸残基反应，阻止STING的棕榈酰化。CXA-10的临床试验已进入II期，其中三项已终止，一项已完成。其他化合物（包括AstinC、化合物18和SN-011）靶向C末端配体结合口袋，竞争性抑制cGAMP诱导的信号传导。最近开发的抑制剂（如BB-Cl-amidine和LB244）通过共价结合其他半胱氨酸（Cys-148或Cys-292），阻断寡聚化。此外，钩吻素甲等天然产物通过K48连接的泛素化促进STING降解。 值得注意的是，最近的研究发现，CDK4/6抑制剂哌柏西利也具有STING抑制剂的功能。其作用机制独特，可直接靶向STING的Y167位点，阻止二聚化，从而抑制其激活。此外，哌柏西利还可通过G166位点阻断STING-TBK1复合物的形成，进一步阻碍其激活。在DSS诱导的结肠炎和Trex1−/−介导的自身炎症性疾病模型中，哌柏西利已被证实可减少STING介导的炎症和组织损伤。这表明哌柏西利在STING抑制方面具有潜在的治疗应用价值，为自身炎症性疾病的治疗提供了新的见解和可能的药物选择。 尽管大多数STING抑制剂仍处于临床前开发阶段，但这些抑制剂具有令人信服的治疗潜力，值得进一步开展临床研究。 未来展望 作为癌症免疫治疗中一个新兴靶点，STING在抗肿瘤免疫周期的每个阶段都发挥着关键作用。最近，徐及其同事证实，cGAS-STING通路可独立于蛋白激酶TBK1激活转录因子EB，增加溶酶体生物发生并改善病原体清除。这一发现表明，STING激活不仅可增强免疫应答，还可影响自噬过程，这可能对癌症治疗具有重要意义。尽管STING激动剂在多种肿瘤的临床前模型中显示出显著疗效，但作为单药治疗的临床疗效仍然有限，且其机制尚不明确，这给临床应用带来了巨大挑战。本综述深入分析了STING激动剂临床应用面临的挑战及潜在解决方案。 首先，针对STING激动剂存在的细胞摄取不足、代谢稳定性差、靶向能力有限和肿瘤内递送困难等固有问题，研究人员提出了多种策略。目前的研究进展包括提高CDNs的代谢稳定性、开发非CDN类STING激动剂和ENPP1抑制剂、加入佐剂，以及采用ADC和纳米颗粒等靶向递送平台，以提高靶向特异性和递送效率。展望未来，临床试验将优先优化现有STING激动剂的给药方案和给药途径、开发新型稳定的STING激动剂，以及完善递送策略。同时，新的研究方向（如开发STING相分离抑制剂和VRAC通道激动剂）也在探索中。值得注意的是，进一步探索STING构象变化与激活之间的关系，以及pmSTING的机制作用，有望为STING激动剂的优化策略提供新的思路。 其次，肿瘤细胞的原发性耐药是导致STING激动剂无效的重要原因。目前，研究人员正在开发广谱STING激动剂，以适应不同的hSTING突变。此外，不同癌症类型的STING表达水平、肿瘤微环境的细胞组成、肿瘤细胞的STING抑制、表达水平的改变以及慢性激活导致的免疫逃逸等因素，均会影响治疗效果。这些因素强调了在使用STING激动剂时，需仔细评估治疗的适用性。研究人员还在研究DNMTis和MPS1抑制剂等药物，以恢复STING表达，并探索基于肿瘤生物学特征、分期、基因表达、CIN评分和STING下游分子激活状态的患者分层策略。 最后，获得性耐药是另一个重大障碍，涉及多个因素，如次级免疫检查点分子上调、免疫抑制细胞激活、免疫效应细胞抑制和免疫抑制因子增加。为了应对这些机制，STING激动剂正与其他疗法联合使用，包括手术、化疗、放疗、PDT、CAR-T、ICIs和靶向免疫抑制因子的抗体，旨在克服耐药性。 总之，下一代STING靶向策略的发展需要复杂且多方面的方法。这包括利用先进的筛选方法、基于基因组变异的精准选择、基于肿瘤和微环境生物标志物的分层，以及逆转抑制机制。展望未来，优化STING激动剂给药的时机和间隔、通过协同联合治疗克服耐药性，以及设计基于生物标志物的临床试验，将至关重要。这些协调一致的努力不仅将加深我们对STING激动剂的理解，还将为癌症治疗开辟更加个性化和有效的道路。通过将这些策略与正在进行的研究工作和临床试验和谐整合，我们可以展望STING基疗法成为癌症患者希望的灯塔。 临床前模型中机制研究的不断推进、临床试验的持续开展，以及激活STING的物理、化学和分子策略的发展，正在加速我们对STING激动剂原理和应用的理解。我们有信心，这些努力将带来更有效的STING基疗法，为癌症患者带来新的希望。 来源： Jiaqi Shi, Yingying Zhang, Na Zhao, Ekihiro Seki, Li Ma, Gordana Kocic, Xiaobo Li, Janoš Terzić, Tongsen Zheng,.Precision targeting of STING: Challenges, innovations, and clinical outlook for cancer therapy,The Innovation,2025,101074,https://doi.org/10.1016/j.xinn.2025.101074. PS：该文著作权归文章作者所有，如有不当请在留言处敬请指出，如有侵权联系我们删除，谢谢！

作者：Fabien Vincent等（原载《Nature Reviews Drug Discovery》 2022年） 摘要 | 许多药物或其先导化合物，是通过观察它们对正常或疾病生理状态的影响而被发现的。在过去几十年里，这种表型药物发现 （Phenotypic Drug Discovery, PDD）方法已很大程度上被更具还原论的调控特定分子靶点 的方法所取代。然而，现代表型药物发现将最初的理念与现代工具和策略相结合，在过去十年中重新兴起，旨在基于真实疾病模型中的治疗效果 来系统性地推进药物发现。在此，我们讨论该方法近期取得的成功，审视其持续面临的挑战及应对策略，并探讨该领域的创新如何推动下一代成功药物研发项目的诞生。 从历史上看，新药的发现依赖于观察药物对疾病表型 的治疗效果，这既包括传统医学中直接在人体上的观察，也包括在疾病模型中的验证。随着1980年代分子生物学革命和2001年人类基因组测序的完成，药物发现的焦点转向了特定的分子靶点。随后，自2011年起，表型药物发现（PDD）出现了复兴，这源于一个令人惊讶的观察：在1999年至2008年间美国FDA批准的首创新药/首创药物（first-in-class drugs） 中，大部分是在没有预设药物靶点假设的情况下凭经验发现的。这一传统策略的现代版本将其定义修正为：专注于调节疾病表型或生物标志物，而非预先设定分子靶点，以产生治疗效益。十年过去，PDD已发展成为一个成熟的领域，成为学术界和制药界公认的发现模式，而非短暂热潮。这种持续的关注根植于过去十年取得的显著成功，包括治疗囊性纤维化的依伐卡托 和鲁玛卡托，治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的利司扑兰 和布那普兰，治疗精神分裂症的SEP-363856，治疗疟疾的KAF156，以及治疗特应性皮炎的克立硼罗。 这并非意味着PDD方法是解决制药业生产效率问题的万能灵药；表型筛选的利弊 需要与针对已验证靶点的分子方法审慎权衡。尽管PDD取得了成功，但许多历史案例使用的是高度复杂的疾病系统（体内模型甚至人体）而非基于细胞的筛选，并且/或者是偶然发现的结果。药物重定位是这种现象的一个鲜明例证：一方面，有基于偶然临床观察成功重定位的著名案例（如西地那非、米诺地尔、沙利度胺 和美金刚）；另一方面，通过预先计划筛选临床化合物库而成功重定位并获批的药物却寥寥无几。这引出了一个关键问题：如何能最好地前瞻性地 利用表型筛选来发现新药？ 图1 | 表型药物发现方法谱系。本图展示了源自表型药物发现（PDD）的药物示例，同时说明了有计划的发现和偶然性在其中所起的作用。所列出的已获批药物是基于最初将化合物系列或药物本身与疾病关联起来的原始表型检测类型进行归类的。所有源自细胞筛选的实例均是有计划努力的结果，而所有源自患者研究的实例则基于意外的临床副作用，这些副作用最终导致了化合物的重新定位。 除了对生理学和药理学复杂性的重新认识之外，PDD也挑战着我们关于何为可成药（包括非常规靶点和作用机制，以及驱动疗效可能所需的多药理学）以及何为药物（允许出现意想不到的化合物特性）的固有认知。尽管在靶点识别、安全性去风险步骤以及为表型筛选来源的候选药物规划临床路径方面仍存在重要障碍，但功能基因组学、机器学习/人工智能 和改进的疾病模型 等领域正为PDD带来令人兴奋的新机遇。鉴于PDD与基于靶点的药物发现（TDD）存在显著差异，并且现在有新技术可应用于PDD项目，该领域正飞速发展，亟需在工业界和学术界建立并分享最佳实践。尽管存在技术和文化上的障碍，PDD的再度应用已开始改变我们构思药物发现的方式，并已成为生命科学技术创新的重要试验场。PDD塑造的药物发现理念扩展的“可成药”靶点空间。 PDD的主要驱动力在于，通过此法发现了数量不成比例的首创新药。与TDD基于分子靶点与疾病状态间已确立的因果关系不同，PDD依赖于以不预设分子靶点 的方式，对疾病相关的生物系统进行化学干预。这种经验性的、“生物学优先”的策略提供了工具分子，将治疗性生物学与之前未知的信号通路、分子机制和药物靶点联系起来。 •   肝炎C疗法：靶向HCV病毒NS5A蛋白的调节剂（如达拉他韦）是直接作用抗病毒组合疗法的关键组成部分。NS5A蛋白对HCV复制至关重要但其本身无已知酶活性，其重要性及其小分子调节剂最初是通过HCV复制子表型筛选发现的。 •   囊性纤维化疗法：在不预设靶点的情况下，利用表达野生型或疾病相关CFTR变体的细胞系进行化合物筛选，不仅发现了能改善CFTR通道门控特性的化合物（如依伐卡托），还发现了具有全新作用机制的化合物：能增强CFTR蛋白正确折叠和膜定位的校正剂（如鲁玛卡托、特扎卡托 和依莱卡托）。2019年，由依莱卡托、特扎卡托和依伐卡托组成的三联疗法获批，可覆盖90%的囊性纤维化患者。 •   血液肿瘤疗法：在观察到沙利度胺对多发性骨髓瘤有效后，其优化类似物来那度胺 获得FDA批准用于多种血癌适应症并取得巨大成功。重要的是，来那度胺前所未有的分子靶点和作用机制在其获批数年后才被阐明：它结合E3泛素连接酶CRBN，并重定向其底物选择性，从而促进转录因子IKZF1/IKZF3等靶蛋白的泛素化和降解。这一新机制正被广泛用于开发新型靶向蛋白降解剂。 •   脊髓性肌萎缩症（SMA）疗法：针对由SMN1基因功能缺失突变引起的SMA，两个研究团队通过表型筛选独立发现了能调节SMN2基因前体mRNA剪接、增加全长功能性SMN蛋白水平的小分子。其作用机制是通过结合SMN2基因第7外显子上的两个位点，稳定U1小核核糖核蛋白颗粒复合物——这是一个前所未有的药物靶点和作用机制。其中一种化合物利司扑兰 已于2020年获FDA批准，成为首个口服SMA疾病修饰疗法。 这些例子表明，表型策略如何扩展了“可成药靶点空间”，涵盖了意想不到的细胞过程（如mRNA前体剪接、靶蛋白折叠、运输、翻译和降解），为传统靶点类别带来了新机制，并揭示了新型药物靶点类别。当没有已知的诱人靶点可用于调节相关通路或疾病表型，和/或项目目标是获得具有差异化作用机制的首创药物时，应考虑采用表型策略。被重新审视的多药理学。 表型筛选除了受化合物库和疾病模型系统限制外，对可及的化学和生物学空间没有其他限制，这为识别能作用于多个靶点 的分子提供了机会，即多药理学。 在追求高选择性药物的过程中，多药理学传统上常与优化不足的化合物相关联，因其脱靶效应可能导致潜在副作用。然而，在治疗相关浓度下，大多数（若非全部）已批准药物已知会与多个靶点相互作用，这些相互作用可能导致副作用，但有时也贡献于临床疗效。事实上，通过协同作用 同时低效价调节多个靶点以实现疗效，已被建议作为最大化疗效同时潜在减少副作用风险的策略。伊马替尼 是一个TDD中产生非预期多药理学的经典例子，它除了抑制BCR-ABL外，还对c-KIT和PDGFR等受体酪氨酸激酶有活性，这被认为有助于其在多种癌症中的疗效。 基于药物组合 的多靶点方法是公认的策略，例如在抗病毒和肿瘤学领域，用于应对单药治疗可能产生的耐药性。多药理学药物也常用于治疗中枢神经系统疾病 和心脏病，这些领域基于单一靶点的疗法成功率有限，而经典的体内表型模型长期用于药物发现。一般而言，多靶点药物可能更适用于复杂的、多基因的疾病。 表型方法已提供了许多药物和候选分子，它们在作用机制被识别后，显示出靶向性的多药理学特征。意料之中的是，多药理学常发生在同一蛋白质家族成员之间。药物组合、工程化的多靶点药物和多特异性抗体代表了简化的多药理学场景。然而，将更复杂的多药理学特性设计进单一分子实体，同时平衡候选药物所需的其他所有属性，仍然是一项艰巨的挑战。 表型筛选提供了识别具有新颖、无偏倚的多药理学特征苗头化合物的可能性。一个重要的实际考量是使用信号增益型表型，以帮助将精力集中在富有成效的多药理学上，而非那些与目标生物学无关的细胞应激或毒性作用。多药理学特征的初步了解可通过常规选择性筛选面板获得。在完成一定的化合物优化，减少初始苗头化合物的脱靶特征及其潜在的干扰效应之后，再开展靶点识别工作可能效率更高。即使无法明确识别所有作用靶点，也可利用现有的强大表型和分子分析平台，以参考药物为基准，获得对候选分子作用机制和潜在安全风险的深入理解。 从药物发现的角度看，源于表型筛选的多药理学，可以利用日益稳健的表型模型，结合先进的分析、组学和计算技术，从偶然发现走向基于构效关系的逆向工程方法，从而在保持甚至优化表型活性的同时，最大限度地减少潜在安全风险，提高临床成功的几率。对“类药性”的重新审视：低分子量化合物的表型药物发现成功案例 现代表型筛选也有助于拓展新药所呈现的分子属性范围。具体而言，随着靶向药物设计（TDD）的出现，过去几十年中药物的分子量已显著增加[74]。历史上，许多小分子是通过表型筛选方法发现的，这些方法常使用动物模型，例如布洛芬[75]、米诺地尔[76]和美金刚[77]（图2）。这些分子的分子量完全符合广为接受的片段标准（如分子量 < 300 Da）。当代的例子包括利用癫痫模型发现的拉科酰胺[78]，以及通过一系列中枢神经系统模型发现的用于治疗精神分裂症的SEP-363856[52,79,80]；还包括MLR-1023在经过多种体内模型测试后重新定位用于治疗2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎[81,82]，以及富马酸二甲酯用于多发性硬化症[83]（图2）。 上述例子引出一个关键问题：为何那些在当今TDD项目中可能被视为需进行大量效价优化的弱苗头化合物的片段大小分子，却能在体内疾病模型中表现出活性，并最终优化成为尺寸相似的药物？我们假设有几个原因可能解释这种出乎意料的模式。首先，已知片段大小分子在针对特定靶点进行筛选时，由于其分子小且能更多方位地适应结合位点，能提供更高比例的有效苗头化合物[84]。如前所述，多药理作用是PDD药物的常见特征，可能在此也有贡献（例如，SEP-363856与TAAR1和5-HT1A受体相互作用）[52,80]。最后，较小分子在肠道通透性（通过细胞旁路径运作）方面已证实具有优势，并且由于其分子尺寸较小，它们为代谢酶提供的修饰位点也更少[85]。尽管许多这类片段大小药物的剂量和相应暴露量可能按大分子的标准来看偏高，但它们仍可能对其靶点表现出高配体效率，从而得以安全用药[86]。换言之，对于分子量为200 Da的化合物与500 Da的化合物而言，相同的高化合物浓度在暴露量方面所蕴含的安全意义是不同的。 因此，存在一个机遇，可以有意识地利用表型筛选的这种能力，去探索TDD项目覆盖不佳的化学和药理学空间[87]。近期SEP-363856、MLR-1023和拉科酰胺的发现表明，利用体内动物模型进行表型筛选依然能够成功。这种成功在很大程度上取决于模型的临床相关性——这是一个有争议但仍值得探索的话题，后文将进行讨论。展望未来，第二个可考虑的选项是调整思路，在复杂的多细胞类器官检测法中筛选更少、更小的分子。已知片段库尽管数量仅以千计，却能覆盖巨大的药效团空间[84]。检测片段库或分子量介于片段与典型高通量筛选所用化合物之间的分子，可能即便采用低通量的复杂3D检测法，也能覆盖相当大的药理学空间[87]。 一个相关的概念是使用共价片段——这是片段的一个子集，含有能与蛋白质形成化学键的反应性基团——既能用于识别新靶点，也能为调节靶点的化合物揭示化学起点。它们用于基于细胞的表型分析，因其可通过发现可逆化合物无法触及的结合位点来探索更广泛的生物学领域而获得认可[88]。例如，在原代人T细胞中对共价片段进行分析，揭示了通过不同机制（包括直接功能性扰动和/或蛋白质降解）起作用的T细胞活化抑制剂[89]。值得注意的是，被调控的靶点包括先前已配体或未配体的蛋白质。靶点识别与项目推进——一个日趋成熟的讨论。 从安全和临床转化角度看，普遍认为对活性化合物系列进行靶点识别有助于降低项目风险。然而，对于化合物进入临床前是否绝对必须明确靶点，多年来一直存在争议[3]。如今这场讨论正趋于成熟。靶点识别通常被视为导致一个简单的二元结果：靶点要么被识别，要么没有被识别（图3a）。在此，我们希望提供一个不同的框架来讨论此话题。首先，需牢记靶点识别仅是达到目的的一种手段，其目的是为通往临床及处于临床阶段的化合物系列获取决策信息。因此，靶点识别只是实现此目标的选项之一。此外，识别出分子靶点并不等同于理解化合物系列的作用机制（MoA），并且可能对项目决策产生误导。 图3 | 表型药物发现中的靶点识别。（a）靶点识别有时被认为是表型筛选来源的候选药物取得进展的必要条件，并且被视作一个简单的二元结果：靶点要么被识别，要么未被识别。（b）我们提出，其实可以获得一个连续的信息谱，这有助于实现靶点识别的最终目标：为候选药物进入临床获得足够的安全性和转化可行性信心。 例如，记载NS5A是HCV药物达克拉他韦的靶点，并未合理解释其显著的亚纳摩尔级细胞效价，也无法说明如何能以低于1:1000的化合物-蛋白质化学计量比获得疗效[90]。类似地，在发现核糖体是某PCSK9分泌抑制剂的靶点后，理性的反应本应是终止项目，因为这引发了通过广泛抑制蛋白质合成可能带来严重安全性问题的担忧。然而，进一步的研究（包括蛋白质组学分析）揭示，其分子MoA能异常特异性地抑制PCSK9 mRNA转录本的翻译，这是由核糖体、化合物和新生的PCSK9多肽之间形成三聚体复合物所致[91,92]。另一类例子包括因其靶点降解（如氟维司群与雌激素受体）[93]或修饰其蛋白质结合伴侣（如DNMDP与PDE3A）[94]而在此类化合物中展现出独特表型效应的化合物。 作为靶点识别的替代方案，我们建议关于MoA的许多可行知识可以通过经验性获取（图3b）。实际上，细胞和体内实验可提供与药效和安全性相关的读数，进行无偏倚的化合物评估；而目前常采用“组学”方法的机制研究，可能揭示与MoA相关的信息，例如化合物影响的具体生物通路[95]。在项目进程中，关于化合物系列的信息获取是一个连续统，而非识别靶点与否的二元开关，基于对安全性和转化信心的累积，可能推动其进入临床。靶点识别与MoA分析策略。 尽管为小分子筛选苗头化合物寻找直接结合物有望提供“那个/一个”靶点，但在试图解析表型筛选结果时，这并非全貌[96-98]。亲和力（或光亲和）富集结合化学蛋白质组学方法[99-103]，或近期使用的细胞热位移分析[104]来识别与小分子苗头化合物结合的蛋白质，是理解MoA的一种途径（例如，自噬抑制剂indophagolin的靶点P2X4）[105]。但这可能不够充分，甚至可能产生误导，如上文PCSK9的例子所示。 RNAi和CRISPR-Cas9的发展开启了筛选全基因组文库的能力，使得能够以高特异性进行功能获得和功能丧失研究[106]。遗传扰动与化合物处理相结合，可提供对MoA更深入的机制理解，并可能导向分子靶点本身的识别（例如，抗白血病剂STF-118804的靶点NAMPT，以及抗病毒药GSK983的靶点DHODH）[107-110]。一项大规模的努力是“癌症依赖性图谱”项目，其旨在利用PRISM方法在带有分子条形码的细胞系中，通过大规模并行化合物筛选，系统性地识别遗传依赖性和小分子敏感性[111,112]。 近来，能够提供化学扰动所致生物学变化的全面信息的分子分析技术，在表型筛选苗头化合物的后续研究中扮演重要角色[9]。此类大规模分析工作实例可分为基因表达测量、细胞形态学测量或生物标志物活性测量几类。“连接图谱”拥有测试化合物和已注释化合物的基因表达谱，可用于特征相似性映射[113]。其扩展是“基于整合网络的细胞特征库”（LINCS）[68,114]，这是美国国立卫生研究院（NIH）共同基金的一项计划，旨在分类记录细胞系对化学、遗传和疾病扰动产生的响应变化。“细胞绘画”利用形态学分析：从细胞的显微镜图像中提取定量数据，以识别样本间具有生物学相关性的相似性和差异性[115-118]。“BioMap”面板则是在（化学或生物）处理后对原代细胞系统进行分析，读出与载体对照相比升高或降低的生物标志物活性[69,119,120]。这些技术提供的一个关键优势是，测试大量化合物（例如，顶级苗头化合物列表）的可行性日益增加，而不必像传统的蛋白质组学策略那样必须严格局限于少数几个化合物。这些平台的价值很大程度上源于将苗头化合物的生物学特征与参考化合物、已注释化合物获得的特征数据库进行比较。这可能揭示匹配项，或有助于构建关于其MoA的假设。例如，利用BioMap面板将tapinarof匹配为AHR激动剂，并在后续研究中验证了其自身的AHR激动活性[121]。实际上，分子分析现正被整合到筛选流程中，用于决定哪些苗头化合物和系列将获得进一步的投资和研究[9]。 这些大规模分析技术，虽然通量更高且聚焦于通路水平信息，但在很大程度上依赖于参考数据库中具有相似表型的已知化合物。鉴于表型筛选的目的是发现新的MoA，构建知识库以使这些方法达到查表式的期望可能需要时间。然而，许多表型筛选现在由特定的机制信息指导（由Moffat等人提出的“机制知情的PDD”）[122]。该策略提供了一个关键的生物学框架，基于上述工具，将产生的数据置于假设背景下，用以解释表型筛选苗头化合物的MoA。PDD来源化合物的临床开发考量。 在缺乏靶点信息的情况下，将PDD来源的临床前候选药物推进到临床，给开发团队带来了若干挑战。简言之，靶点验证为降低安全性担忧以及预测和监测疗效提供了宝贵信息。本节将介绍应对这些障碍的具体策略和实例。 “可转化性链条”——即驱动原始表型分析的机制、后续临床前疾病模型以及人类疾病内在组成部分之间的分子水平关联——对于一个PDD项目在临床取得成功至关重要[3]。例如，HBV抗病毒药物RG7834在体外能降低含有耐受性病毒S抗原的非感染性膜颗粒的分泌，因此捕捉到了人类疾病的一个关键（且具有预后意义的）组成部分[50,51,123,124]。用于脊髓性肌萎缩症（SMA）的branaplam和risdiplam研发项目也为此概念提供了有力例证。如前所述，SMA由SMN1基因功能丧失突变引起，这两项努力均源于高通量表型筛选项目，旨在通过调节几乎相同的SMN2基因的剪接（使其包含第7号外显子）来产生功能性SMN进行补偿（该外显子通常缺失，导致产生不稳定的Δ7蛋白）[22,23,125,126]。这些项目筛选的是具有明确临床相关性的疾病替代生物标志物（SMN2 mRNA中第7号外显子的包含），后续的临床研究也证明了这一点。例如，在一项针对健康男性志愿者的I期单次递增剂量研究中，用risdiplam治疗导致了SMN2剪接向全长SMN2 mRNA的预期转变，这进一步在SUNFISH（NCT02908685）关键临床试验中转化为对SMA患者具有医学意义的益处[127]。总之，在靶点未明确识别但具有基于对分子MoA深入理解而可在人体中监测的清晰生物标志物的情况下，临床开发可能是可行的。 在安全性方面，靶点信息及其相关的生理表达模式和功能知识，常被用于关注潜在的安全信号。这些可能在TDD项目早期就被研究，以降低风险或迅速终止项目。然而，监管指南并不要求安全性评估必须提供靶点信息。相反，它们提供了一份必需的毒理学研究清单，以指导选择可用于人体测试的可接受的化合物剂量。降低风险是2019年基斯顿表型药物发现研讨会一个专题讨论会的主题，讨论中产生了多个主题和策略。 首先，安全性考量需要在PDD项目的苗头化合物筛选和验证阶段就尽早纳入。有效的方法包括细胞毒性反筛选（排除通过常见干扰机制或其它不良MoA起作用的苗头化合物）以及分子分析[9]。当苗头化合物列表精简到少数几个令人感兴趣的化合物后，使用活性-非活性化合物对已被证明有助于增加或减少对特定化合物系列及其同源靶点/MoA的信心。这些分子工具能够识别特定生物标志物和感兴趣MoA的特征信号，同时也能评估与化合物MoA不直接相关的（类似于TDD中的“脱靶”）不良反应。这种方法曾被用于增加对初始PCSK9分泌抑制苗头化合物（R）-IMPP的MoA的信心[91]。与常见的筛选苗头化合物一样，该苗头化合物活性较弱且易产生非特异性作用，引发了对进一步投资的担忧。但其对映体（S）-IMPP被观察到具有类似的非特异性，却在PCSK9分泌分析中无活性，这表明（R）-IMPP系列是通过特定的分子靶点起作用，而非通过广泛的细胞应激或损伤（图4）。相反，此策略曾被用于证明终止一个用于治疗囊性纤维化的CFTR矫正剂系列的合理性[128]。在此案例中，在观察到先导分子长期给药后产生严重的体内毒性后，一个结构密切相关但无活性的类似物同样在体内进行了测试。该无活性化合物在相似暴露水平下耐受性良好，表明毒性更可能与MoA相关，而非化合物本身相关。 图4 | 利用活性-非活性化合物对解决靶点或作用机制未知的化合物系列的安全性问题的效用。图中显示了PCSK9分泌抑制剂 (R)-IMPP（左）及其非活性类似物 (S)-IMPP（右）在BioPrint药理学面板中的分析谱图。 此外，研究人员可以利用更复杂的表型分析，并将化合物特异性图谱映射到斑马鱼[129]或基于人原代细胞的疾病系统（如BioMap，该系统已使用临床批准药物生成的特征图谱进行了验证）[130,131]的参考集合中。尽管这些系统不能完全重现人体中可能观察到的所有安全性问题，但它们仍提供了检测某些多器官毒性的机会，同时允许测试数量大得多的化合物或系列。最后，体内毒理学研究（包括在两种不同动物物种中测试多种化合物剂量）是关键步骤，随后确定的无可见不良反应水平（NOAEL）为指导人体测试的化合物剂量选择提供依据。在此，确保所选的两种物种能显示出与疾病生物标志物或该系列MoA相关的生物学特征的调节，对于在进入临床前最大化这些研究的价值至关重要。 源自PDD的候选药物能够在不知晓分子靶点的情况下，并且已经成功过渡到临床阶段[1]。例如，这包括来那度胺（2005年批准用于多发性骨髓瘤，其MoA于2014年被阐明）[20]、拉科酰胺（2008年批准用于癫痫，其可能复杂的MoA仍在研究中）[78,132,133]和RG7834（近期进入I期试验，尽管靶点识别工作尚未成功）[50,51,134]。然而，在缺乏靶点信息的情况下，有必要识别能有效转化到人类患者的替代疾病生物标志物。同样，特定策略有助于评估给定系列及其相关MoA的安全性风险。另一个需考虑的因素是特定适应症领域未满足的医疗需求及临床现状，因为缺乏经过充分验证的靶点可能为在无靶点信息情况下将化合物推进临床提供额外动力[3]。展望未来表型筛选中的替代表型 表型筛选有时会带来两难困境：对于缺乏充分验证治疗靶点且认知有限的疾病，其价值显而易见；然而设计具有临床相关性的表型检测（需包含合适的体外/体内生物系统、刺激信号和读数指标）并建立必要的转化链条，又离不开扎实的疾病知识基础。正如用于阐明小分子作用机制（MoA）的方式，高维特征谱（如基因表达谱和细胞形态学特征）可被用于定义替代疾病表型作为表型检测的读数指标。此时，"扰动因子"不再是化学分子，而是疾病本身——筛选目标是将系统从疾病状态逆转为健康状态。 基因表达谱已用于定义癌症基因组变异等疾病状态。例如，通过高通量mRNA谱对肺腺癌等位基因进行功能影响聚类，为既往未知意义的变异制定治疗策略奠定基础。如前所述，LINCS计划旨在通过编录扰动因子或疾病状态引发的基因表达变化，建立基于网络的生物学理解框架。该计划的目标之一是开发计算框架，通过恢复受干扰通路/网络至正常健康状态来发现疗法。近期一项研究结合高通量药物筛选与现有转录组数据集的计算机模拟分析，鉴定出能在体内逆转肺动脉高压的化合物。作者指出，若使用血管细胞（而非癌细胞）生成LINCS基因表达特征谱，可进一步提升研究质量。然而，这些方法的潜力仍处于起步阶段，Alvarez等人的研究揭示了其局限性：他们整合基因表达谱与多种计算算法定义胃肠胰神经内分泌肿瘤的主调控蛋白，并对经107种化合物处理的肿瘤细胞进行转录组分析。概念上，该方法证明能逆转肿瘤检查点主调控蛋白协同活性的化合物可有效破坏肿瘤细胞状态稳定性，但两种预测诱导患者特异性主调控蛋白崩溃的药物的验证结果尚不明确。 细胞形态表型（包括细胞区室的形状、大小、强度和纹理）已被证实会响应小分子或疾病相关等位基因等扰动而发生改变。LINCS门户网站已整合来自"细胞绘画"技术和"药物重定位中心"的此类数据，报告了1,571种化合物的细胞绘画数据（其中92%已映射至人类蛋白靶点或标注MoA）。这些数据可用于定义已知MoA药物逆转的表型特征。 计算比较和可视化药物与疾病基因表达谱的其他方法可用于定义疾病表型的逆转。逆转基因表达评分（RGES） 系统提供了一种将疾病基因表达与药物诱导表达谱相关联的系统方法。整合TCGA、LINCS、ChEMBL和CCLE数据表明，有效抗癌药物逆转疾病基因表达的能力显著优于无效药物。 类似基因集富集分析，Nassiri等人开发了细胞形态富集分析方法，评估转录组变化与细胞形态改变的关联，强调转录与细胞形态的相互依赖性可能与疾病状态相关（以骨肉瘤细胞系的形态变化为例）。 本部分提及的高维分析数据集存储库已存在于公共领域。对药物发现而言，如何最佳利用这些数据定义可逆转的替代疾病表型（作为治疗效能的指标），是该领域即将面临的重要挑战。部分制药公司已开始将此方法用作筛选平台。Recursion Pharmaceuticals公司自2013年起率先通过"细胞绘画"技术筛选替代疾病特征谱的逆转，专注于罕见单基因疾病的药物重定位。人工智能与PDD 人工智能在药物研发多个领域的应用已被广泛接受，包括药物设计、蛋白质折叠预测、化学合成、计算机毒性预测及药物重定位。该方法的指数级应用依赖于机器学习算法识别模式并从与效价/选择性等参数的关联中学习的能力。 文献分析显示，人工智能在PDD的应用主要分两类：应用于大型化合物/化学结构库的机器学习分类器，以及应用于表型检测衍生特征的分类器。绝大多数研究属于前者——基于图模型或深度学习算法（利用既往筛选的药理学数据）预测新型骨架化合物。典型案例如DeepMalaria研究：基于GSK抗疟数据集训练图模型预测恶性疟原虫生长抑制（及哺乳动物细胞毒性），辅助合理选择骨架化合物进行后续研究。为克服训练数据有限的困难，该研究采用了无关数据集的迁移学习。 相反，将机器学习分类器应用于表型衍生特征的研究仍较少见——尽管这显然是极具吸引力的方向，能揭示看似混沌数据中的隐藏规律。PDD本质上依赖表型模式变化来识别和优化分子，而对生物靶点或MoA知之甚少。细胞水平的药物扰动表征（如"细胞绘画"技术）表明，亚细胞特征指标可用于聚类和分类化合物及基因扰动。当特征空间定义不明确时，机器学习对PDD尤为重要。例如Hofmarcher等人利用大型细胞绘画数据集（30,616种化合物诱导的126,779个形态特征谱）证明，基于原始图像的卷积神经网络提取细胞形态变化的能力优于传统图像处理流程。有趣的是，使用不同细胞染料可能非必需——明场图像也能训练出判别特定表型的算法。 机器学习与PDD的整合还存在其他机遇。例如结合表型筛选与机器学习，从混杂化合物库（如非选择性激酶抑制剂）中提取靶点信息。研究表明，即使使用混杂激酶抑制剂，也能解卷积活性分子的激酶依赖性，并鉴定出促进神经突生长或诱导乳腺癌细胞死亡的激酶组合。 两项研究凸显了机器学习应用于PDD的变革潜力。Zoffmann等人结合高内涵成像、基因组学与机器学习数据分析，有效缩小范围并预测化合物MoA。该研究中机器学习在特征空间定义化合物"原型"，使化学家能在优化过程中持续监控结构修饰对类似物MoA的影响——这与传统PDD有本质区别。强生研究人员进一步整合高通量成像与机器学习，证明特定细胞检测的图像可预测跨生物检测的活性，将命中率提高50倍以上。生理与疾病相关检测系统的进阶发展 PDD项目的成败取决于连接初始表型检测与最终患者疗效的"可转化性链条"的强度（通常需经动物疾病模型验证）。Scannell和Bosley的分析提示，研发效率下降可能与最具预测性疾病模型的逐步耗尽相关，而新型疾病相关模型的创建速度可能是制约研发生产力的主要因素。值得注意的是，疾病模型预测效度或可转化性的微小提升，可弥补检测通量上的巨大差距（数量级差异）。因此，开发具有临床转化效度的真实疾病相关检测系统对未来PDD至关重要。 所幸干细胞生物学、功能基因组学、生物工程/微加工及仪器/数据分析等领域的进步，为开发潜在疾病相关检测系统提供了广阔技术储备，包括：模式生物平台方法、高通量体内药理学、高保真Cas9基因调控技术、原代细胞/患者来源细胞/iPSC衍生细胞等新型细胞系统、2D/3D共培养体系、以及整合微加工/生物工程的微图案细胞培养表面、3D基质/微流控系统和器官芯片技术。 设计疾病相关生物模型涉及的实验变量复杂度与数量巨大。完全复现患者生物学特征仅是理想目标，实际研究通常聚焦重现关键疾病特征。即便如此，这些复杂系统仍需大量开发、优化和验证工作。与分子靶点验证类似，疾病模型需在发现数据与临床数据一致后方可视为具转化价值——这是项目后期才能跨越的高门槛。 虽然相关细胞类型和培养条件是开发生理相关模型的必要条件，但仅此不足以保证疾病相关性。细胞系统的可转化性链条需从形态学、多组学特征和药理反应等多维度对标人类临床状况。非酒精性脂肪肝/肝炎体外模型的开发印证了这一点：该模型采用人原代肝细胞、库普弗细胞和肝星状细胞的3D共培养，展现出疾病相关组织形态、生物标志物表达/分泌、转录谱，以及对奥贝胆酸（改善组织学特征的临床阶段化合物）的响应。类似地，源自患者活检的3D类器官肿瘤模型能保留原始肿瘤的组织病理学、生物标志物表达和基因组特征，其体外治疗反应与患者临床化疗反应高度匹配。 在大数据时代，整合大规模人群真实世界患者记录（如UK Biobank和FinnGen）及其组学数据，有助于构建和验证模型系统。Mittal等人通过帕金森病模型（监测α-突触核蛋白基因表达的表型筛选）鉴定出β2-肾上腺素受体调节剂，随后通过400万患者记录验证了激动剂/拮抗剂与帕金森病风险降低/升高的相关性。"肿瘤分析研究"则通过整合患者临床数据、高分辨率多组学谱和离体药物反应，在临床周转时间内提供个体化治疗建议。 人类疾病动物模型是临床前药物发现的重要组分。尽管当前主要用于验证特定分子靶点调节，哺乳动物模型在二十世纪末前一直是表型筛选的主力，推动了癫痫、胃溃疡、高血压、炎症和疼痛等领域治疗药物的发现。随着对高转化潜力表型检测需求的日益明晰，或许应重新考量将体内模型作为一线筛选系统的价值。但需注意：即使包含原代细胞和3D结构，某些复杂或多器官疾病仍需整体动物模型更完整地复现疾病状态，而开发有效的体内转化模型绝非易事。 体内疾病模型存在物种转化障碍等问题（如黄酮类DMXAA因选择性激活小鼠STING蛋白而在临床试验失败）。伦理、成本、可转化性和通量等因素共同提高了适用体内模型的开发和使用门槛。提升转化价值的努力包括建立"小鼠医院"和"共同临床试验"概念——通过临床前小鼠模型与早期临床研究的紧密衔接，降低转化风险。亨廷顿病遗传小鼠模型的比较表达谱与患者谱高度吻合，也增强了模型的预测效度。 疾病模型的发展还可能体现在数据采集与分析层面。精神药物SEP-363856（具有独立于D2/5-HT2A受体调控的新MoA）即通过SmartCube表型筛选发现：该系统捕获小鼠行为多维度数字视频，经算法降维至约2,000个特征，再通过监督学习建立基于已验证治疗药物行为特征的"药物类别-行为特征谱"。虽然此类体内系统存在通量瓶颈，但历史成功案例证明基于假设和药效团信息的体内表型筛选仍可鉴定苗头化合物。SEP-363856研发中对1,000个类似物的体内分析表明合理通量仍可实现。基于斑马鱼等低等生物的模型则提供了高通量替代方案，但转化相关性可能进一步降低。 疾病模型开发固有的多学科性质及优化/关联发现与治疗终点的迭代过程，对生物医药研究界构成重大挑战。学术界拥有多学科专业知识，而生物医药部门则掌握确定模型开发优先级的经验。学术研究的资助不确定性、时间限制及产业界对长周期基础研究的低投入意愿，共同阻碍了新疾病模型系统的发展。生理与疾病相关模型的开发或可受益于非营利性、前竞争性研究组织（类似针对前竞争性分子靶点的探针开发联盟）。结语 PDD通过发现药物、靶点和MoA证明了其独特价值——这些发现在许多情况下是基于靶点的方法无法实现的。该策略为疾病病理生理学分子信息缺失时提供了新治疗路径，助力探索由蛋白质组及其他生物分子/细胞过程构成的"暗生物物质"。表型模型的临床可转化性与化合物库的选择同样关键。 本文强调的核心维度包括：PDD独有的新MoA发现途径、更好复现复杂疾病病理生理的表型模型需求（如整合免疫/神经系统组分）、多药理学提供的机遇，以及使用亚常规尺寸分子库的优势。生物活性分析和MoA表征方法在药效/安全性评估中的广泛应用，结合日益强大的计算技术，对释放PDD全部潜力至关重要。 图5 | 工业化表型药物发现流程示意图。将专为表型筛选设计的化合物库与能够提供足够通量的疾病相关体外或体内模型系统相结合，可在表型筛选活动中识别苗头化合物。这些苗头化合物的优化、表征及向临床阶段的推进，可以利用当前丰富的组学、分析（功能分析）和计算方方法。靶点或作用机制信息用于支持临床候选药物的进展。如果靶点得以识别，另一种可能性是将其作为新靶点药物发现计划的起点。图中所示的"可转化性链条"代表了驱动表型检测的机制、临床前疾病模型和人类疾病之间的分子关联。"反筛选"指旨在验证苗头分子相对于其他非预期表型终点的选择性的检测。 当前挑战在于如何理性整合这些关键要素以实现PDD的"工业化"。鉴于该领域的指数级增长，我们确信机器学习（尤其是深度学习）的深化应用将推动PDD的有效实施（图5）。我们预见PDD的工业化进程，结合十余年现代表型药物发现实践积累的丰富经验，将催生更高效的药物发现范式——无缝整合基于靶点与基于表型的双轨策略。 参考文献：Vincent, F., Nueda, A., Lee, J. et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nat Rev Drug Discov 21, 899–914 (2022).