Acalabrutinib

前言 共价抑制剂含有特定的功能基团，可以与疾病形成的关键介导蛋白的相应位点形成共价键[1]，使其构象变化，抑制其活性从而失去病理学功能。相较于非共价结合，比如氢键、范德华力、静电相互作用和疏水相互作用来说，共价结合解离需要更多的能量，通过共价键与靶蛋白结合更加持久。与非共价抑制相比，共价键的形成即使在相对较低的浓度下也能实现靶标完全占位[2]，共价抑制剂因此具有延长药效时间、给药频率减少、更高的选择性等优势。 共价键形成和解离是动态平衡的过程 (如图1所示)：抑制剂 (Inhibitor, I) 首先与目标蛋白 (Protein, P) 非共价结合，形成可逆亲和复合物 (PI)；结合的 I 与 P 在结合位点形成不可逆共价键(红色)，产生失活的共价复合物 (PI*)，大部分共价抑制剂对蛋白的修饰通常是不可逆的。共价结合药物是药物发现领域中发展迅速的学科。本文将重点介绍共价结合药物的高通量筛选与表征平台：基于完整蛋白（Intact Protein）的高分辨质谱筛选与表征平台、差示扫描荧光法（DSF）的高通量筛选平台、基于肽图分析的结合表征平台，为药物研发者提供技术支撑。 图1. 共价抑制剂机制[3] 共价药物研发的历史与策略 自从18世纪后期首次出现共价抑制剂以来，共价抑制剂领域已取得了显著进展，目前约30％的市售药物为共价抑制剂[4]。许多历史上的共价抑制剂都是偶然发现的，后来才被证明可以通过共价结合来发挥治疗作用，比如两种众所周知且广泛使用的共价抑制剂分别是阿司匹林和青霉素[5]。 阿司匹林是环氧合酶的不可逆抑制剂，通过乙酰化活性位点丝氨酸残基起作用，减少前列腺素的合成，进而达到镇痛、解热、抗炎和抗血小板聚集的效果。 青霉素与糖肽转肽酶的活性位点丝氨酸共价结合，使酶失活，在细菌细胞壁合成期间催化肽聚糖链的交联，青霉素通过干扰肽交联桥的形成，使细菌失去抗渗透能力，因此细菌停止生长或死亡。         共价结合药物经历了从偶然发现到“可逆优先”，再到“亲电优先”的一系列的发展[6]（如图2所示）。“可逆优先”是将反应性官能团（例如丙烯酰胺）附加到可逆抑制剂上，基于此方法成功开发了阿法替尼（Afatinib）、奥希替尼（Osimertinib）和阿卡替尼（Acalabrutinib）等药物。“亲电优先”是利用反应柄化合物库（亲电试剂库）筛选并识别与靶蛋白的特定氨基酸残基形成共价键的反应柄，可用于不可成药靶点。例如，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog, KRAS）是经典的不可成药靶点，具有结合浅口袋、对天然底物或辅助因子具有高亲和力，抑制剂与底物之间进行强竞争，需要高剂量抑制剂。科学家们发现KRASG12C突变体的半胱氨酸可以被共价小分子药物靶向，并成功开发了索托拉西布（Sotorasib）和阿达格拉西布（Adagrasib），它们代表了共价药物发现的第三个时代的开始，靶向共价抑制剂的开发再度兴起。 图2. 已上市共价抑制药物的发展进程[6] 除上述的直接抑制剂外，还有两种通过共价作用机制，但不需要小分子直接抑制靶蛋白的策略：一种是靶向蛋白质降解，最常用的小分子降解剂是双特异性化合物，称为PROTACs（Proteolysis-Targeting Chimeras），是利用泛素-蛋白酶体系对靶蛋白降解的技术。其中一端与靶蛋白结合，另一端与降解蛋白质的蛋白酶结合，连接酶和靶标的接近导致靶标的泛素化，最终靶蛋白降解。另外一种是分子胶（Molecular glue），小分子药物可以将两个原本没有相互作用的蛋白聚到一起，并产生新的作用，阻断靶蛋白的功能。 综上所述，无论是哪一种药物设计机制，苗头化合物必须经过验证和表征，才能进入后期结构优化阶段。 共价结合药物 高通量筛选与表征平台 苗头化合物的识别、发现和表征常用高通量筛选（High-throughput screen, HTS）、DNA编码化合物筛选技术（DEL）、计算机虚拟筛选、表面等离子体共振（SPR）、高分辨质谱（HRMS）法、差式扫描荧光法（DSF）和核磁共振（NMR）等手段，各有优势和侧重点，为了获得更加全面的分析，应使用两种以上手段进行相互验证。 1 基于完整蛋白（Intact Protein）的 高分辨质谱筛选与表征平台 质谱在共价药物发现中的应用广泛，是筛选共价结合物常用的方法。Intact protein技术借助高分辨质谱，在完整蛋白层面测定蛋白的精确分子量，并可以监测到不可逆共价键的形成，当靶蛋白与小分子化合物结合后，蛋白的分子量出现增加。运用LC-HRMS可以直观的对结合情况进行表征，判断是否有结合、结合比率等详细信息。该方法开发简便、通量高、重现性好。如图3所示，我们以KARSG12C与其抑制剂索托拉西布（Sotorasib）结合为例，从图中可以清晰的观察到分子量偏移，计算得知正是Sotorasib的分子量。在该孵育条件下，KARSG12C已经和Sotorasib完全结合，结合率100%。 图3. 基于完整蛋白高分辨质谱分析实例分享 2 差示扫描荧光法（DSF）的 高通量筛选平台 虽然MS方法是筛选共价结合物常用的方法，但随着人们对该领域的兴趣日益增长，正在研究更多的高通量策略，以便在更短时间内筛选出更多的化合物。差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry, DSF），是一种跟踪蛋白质折叠状态和热稳定性的方法[7]，常用于蛋白质热稳定性研究、蛋白与配体相互作用研究、蛋白的稳定剂和抑制剂筛选等研究。DSF的原理是当温度升高，蛋白质去折叠，荧光染料会与暴露出来的疏水部分结合，荧光信号增强，数据进行玻尔兹曼（Boltzmann）方程拟合，计算出蛋白的熔解温度（Melting Temperature, Tm）（如图4所示），即50%的蛋白质样本处于折叠状态，50%处于未折叠状态的温度[7]。 图4. DSF原理图[7] DSF常用于检测小分子配体与目标蛋白的结合[8]，在共价结合药物的筛选过程中，同样可以使用DSF来观察结合前后蛋白的热稳定性变化。当共价结合药物与目标蛋白结合后，目标蛋白稳定性增强，熔解温度提高。如图5所示，显示了目标蛋白（蓝色）和目标蛋白与候选药物结合后（紫色）的状态，两者熔解温度的差异表示为（ΔTm），可以通过ΔTm来对候选药物是否与目标蛋白结合进行评价。DSF方法具有蛋白样品需求量少、通量高和分析时间短等优势，适合高通量候选药物筛选及靶标发现。 图5. 共价结合药物引起蛋白熔解温度（Tm）迁移实例分享 3 基于肽图分析的结合表征平台 肽图（Peptide Mapping）是确定蛋白质一级结构（氨基酸序列）的主要技术，常用于蛋白质和肽类药物质量控制[9]。肽图分析依赖高分辨质谱，灵敏度高，可识别样品中的末端封闭或修饰。在共价结合药物的筛选阶段，利用高分辨质谱分析经过酶解后的肽段，能够识别出小分子化合物共价结合在蛋白的哪些氨基酸位点上，用以阐释作用机理（如图6所示）。 图6. Peptide mapping原理图[10] 我们以KRASG12C蛋白和其抑制剂Sotorasib共价结合后的肽图分析为例（如图7所示），在胰蛋白酶单切的情况下可以实现100%的序列覆盖度，从分析结果中可见Sotorasib共价结合在肽段LVVVGACGVGK的半胱氨酸上，肽段保留时间为58.37min，置信得分（Confidence Score）为100分。 图7. KRASG12C与Sotorasib共价结合后肽图分析实例分享 药明康德DMPK可提供基于高分辨质谱和差示扫描荧光的药物高通量筛选与表征服务（如图8所示），包括常规共价结合药物、分子胶、PROTACs等，也可结合多样化的体内外代谢模型（体外谷胱甘肽结合模型的研究策略和应用）和代谢产物鉴定研究在生物基质中进行代谢产物的分离、分析和鉴定，深入了解共价结合药物可能的代谢和清除途径，并进行综合性的评估。 图8. DMPK共价结合药物筛选与表征平台 结语 药明康德DMPK具有丰富的共价结合药物高通量筛选和表征经验，已成功构建了基于完整蛋白（Intact Protein）的高通量筛选与表征平台、基于差示扫描荧光法（DSF）的高通量筛选平台和基于肽图谱（Peptide Mapping）的表征平台，除了筛选以外，还可对是否共价结合、结合率、结合氨基酸位点进行表征，具有方法开发时间短、通量高、准确、快速等优势，可为客户提供一体化和一站式的服务。药明康德DMPK在共价结合药物生物分析、体外ADME、体内代谢产物鉴定、放射性ADME研究等方面积累了丰富的研究经验，同时在药代动力学研究策略、数据解读及跨部门合作上有突出优势。结合共价结合药物的特性，我们专门建立了一套针对共价结合药物的药代动力学研究体系。截至目前，药明康德DMPK已成功支持近百家客户的共价结合药物项目，助力多个共价结合药物进入临床阶段，我们可根据客户的需求，确定药代动力学研究内容，选择合适的分析方法，助力加速共价结合药物的研发和申报进程。 参考文献： [1] Lonsdale R , Ward R A. Structure-based design of targeted covalent inhibitors[J]. Chemical Society Reviews, 2018:10.1039. [2] Adeniyi A A , Muthusamy R , Soliman M E .New drug design with covalent modifiers[J]. Expert Opinion on Drug Discovery, 2016, 11(1):79. [3] Li K S, Quinn J G, Saabye M J, et al. High-Throughput Kinetic Characterization of Irreversible Covalent Inhibitors of KRAS(G12C) by Intact Protein MS and Targeted MRM[J].Analytical chemistry, 2022(94-2). [4] Sutanto F , Konstantinidou M , Dmling A .Covalent inhibitors: a rational approach to drug discovery[J]. RSC Medicinal Chemistry, 2020(8):11. [5] Zhang T , Hatcher J M , Teng M ,et al. Recent Advances in Selective and Irreversible Covalent Ligand Development and Validation[J]. Cell Chemical Biology, 2019, 26(11). [6] Lucas S C C, Blackwell J H, Hewitt S H, et al. Covalent hits and where to find them[J]. SLAS Discovery, 2024(3):29. [7] Bruce D , Cardew E , Freitag-Pohl S, et al. How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project[J].Journal of Visualized Experiments, 2019(144). [8] Ito S, Matsunaga R, Nakakido M, et al. High-throughput system for the thermostability analysis of proteins[J].Protein Science, 33[2024-06-23]. [9] Kuril A K, Saravanan K. High-throughput method for Peptide mapping and Amino acid sequencing for Calcitonin Salmon in Calcitonin Salmon injection using Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UHPLC-HRMS) with the application of Bioinformatic tools[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2024, (243)116094. [10] Mons E , Kim R Q , Mulder M P C .Technologies for Direct Detection of Covalent Protein–Drug Adducts[J]. 2023.  （下滑查看更多） 作者：曲栗，王瑞，何勇静，王洪梅，李陟昱，邢丽丽 编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟 设计：倪德伟，张莹莹 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

2023年，国产创新药大丰收。 一方面，2023年中国国家药监局（NMPA）批准上市1类创新药40个品种，其中国产创新药36个，较2022年（21个创新药，16个为国产）大幅上涨。药物临床试验登记与信息公示平台登记临床试验总量4300项（以CTR计），为历年登记总量最高，其中新药临床试验（以受理号登记）数量为2323项，与2022年相比，2023年新药临床试验数量增长了14.3%。 另一方面，国产创新药也正在获得国际市场认可。2023年，多个国产创新药在欧美获批上市，加入全球竞争。国产创新药跨境license out交易频现，交易数量和交易金额较往年都大幅增长。据不完全统计，2023年国产创新药跨境license out交易数量超过50笔，已披露交易总金额超400亿美元。 进入2024年，国内医药行业的创新活力持续迸发。7月4日，在“2024国际医药服务产业创新发展大会暨第九届中国医药研发·创新峰会（PDI）”上，《2024中国药品研发综合实力排行榜TOP100》（以下简称《总榜》）隆重发布。这份榜单汇聚了百家国内医药行业的中坚力量和创新领衔企业，它们凭借在研发创新方面的卓越表现成功入榜，共同书写了中国医药研发的新篇章。 榜单显示，排名前十的企业变化不大，但是排名50之后的企业名单变动较大。 恒瑞医药连续7年第一，显示了其在药品研发领域的强大实力和持续的创新能力。百济神州排名上升3位，位居第二。正大天晴、复星医药、齐鲁制药都保住了前五位置。 与上年榜单相比，本次榜单有不少新面孔，其中济民可信排名进步最大，取得第21名的好成绩，再鼎医药排名第40，其他新上榜企业还有我武生物、施美药业、红日药业、京卫制药、博锐生物等。 头部企业，稳健发展 过去几年，创新药企研发投入节节攀升，每年研发投入动辄上亿元，头部企业的投入金额更是高达数十亿元，甚至上百亿元。 这些大额的研发投入构建了企业稳固的研发基石，铸就了其在激烈市场竞争中的独特优势与核心竞争力。 从榜单来看，头部药企很难被撼动，排名变化很小。《总榜》前五的药企未出现新面孔，依然是恒瑞医药、百济神州、正大天晴、复星医药、齐鲁制药。这些企业凭借强大的研发实力、丰富的产品线以及卓越的市场表现，稳居行业前列。 恒瑞医药连续7年第一 恒瑞医药自转型创新药物研发以来，累计研发投入近400亿元。截至2023年，恒瑞已有16款创新药上市，包括自研14款、引进2款，另有90多个自主创新产品正在临床开发，管线布局十分全面。 恒瑞建立了全面、完整的技术平台，覆盖PROTAC、多肽、单抗及多抗、ADC、siRNA、mRNA、基因治疗、细胞治疗、核药、AI制药等多类型分子。 图1 恒瑞技术平台 图片来源：恒瑞JPM2024 PPT 在ADC领域，恒瑞已有十多个新型、具有差异化的ADC分子成功获批临床，HER2、TROP2、Claudin18.2、HER3等热门靶点应有尽有。其中HER2 ADC产品SHR-A1811、TROP2 ADC产品SHR-A1921和Claudin 18.2 ADC产品SHR-A1904已进入临床Ⅲ期研究阶段。 在GLP-1领域，恒瑞在2024年将其3款GLP-1产品除大中华区以外的全球范围内开发、生产和商业化的独家权利有偿许可给美国Hercules公司，交易潜在总金额超过60亿美元。 百济神州在创新之路上“狂飙” 2018—2023年，百济神州累计研发投入超过了500亿元，研发持续“烧钱”带来创新业绩的持续增长。 目前，百济神州已有BTK抑制剂泽布替尼和PD-1单抗替雷利珠单抗两个创新药在包括中国、美国、欧洲的多个国家获批上市。 泽布替尼是百济神州开发的一款第二代BTK抑制剂，是中国首个“出海”成功的原研抗癌药。2022年，泽布替尼“头对头”击败伊布替尼，成为全球CLL/SLL患者的新的标准治疗。2023年，泽布替尼销售额突破10亿美元，2024年第一季度泽布替尼销售额4.89亿美元，同比增长140.2%，增速远超同为二代BTK抑制剂的阿可替尼，有望成为BTK赛道的下一个领导者。 图2 三大BTK抑制剂销售情况 数据来源：各企业财报 百济神州还有多个临床阶段的血液学和实体瘤管线，包括BCL-2抑制剂Sonrotoclax、BTK CDAC药物BGB-16673、抗TIGIT抗体欧司珀利单抗、抗OX40抗体BGB-A445、HPK1抑制剂BGB-15025、CDK4抑制剂BGB-43395、CDK2抑制剂BG-68501、B7H4 ADC药物BG-C9074等。 排名前十的药企还有石药集团、科伦药业、上海医药、信达生物和鲁南制药，他们也都在创新研发之路上取得了不错成绩。 例如，科伦药业一方面不断巩固其在大输液领域的领先地位，另一方面其控股子公司川宁生物正逐步确立其在抗生素行业的领军地位，生物科技子公司科伦博泰是下一代ADC龙头的有力竞争者。 新军崛起，格局重塑 与上年相比，一批研发新势力崛起，26家新入《总榜》之列，如济民可信、再鼎医药等，它们的上榜不仅体现了中国药品研发行业的活力，也预示着未来可能的行业新星。 表1 新进《总榜》企业名单 济民可信虽然在2018年才正式成立创新研究院开启转型创新，但短短几年内创新成果丰硕，已拥有大分子创新药、小分子创新药、创新技术三大研究院，治疗领域涉及癌症、肾病、抗感染疾病、心血管、呼吸等。 在研管线中多个新药已进入临床阶段，包括小分子创新药JMKX001149、JMKX003142、JMKX003002、JMKX003801等，大分子创新药GARP/TGF-β1单抗JYB1907、MASP-2单抗JYB1931、JYB1904等。此外，济民可信在布局全球市场方面取得了显著进展，已有多个新药获得美国FDA批准临床。 博锐生物在2019年才成立，但目前已有多个商业化产品，包括1类新药泽贝妥单抗（商品名：安瑞昔），适用于CD20阳性弥漫大B细胞淋巴瘤，非特指性（DLBCL，NOS）成人患者，应与标准CHOP化疗（环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松）联合治疗。该药品在上市的首年就顺利被纳入了医保目录。公司在自免和肿瘤免疫领域还有多个在研管线，覆盖单抗、双抗、三抗、ADC等热门领域。 亿帆医药在2016年后猛烈发力生物药，并立下了出海的大志向。2023年5月，亿帆医药的艾贝格司亭α注射液（亿立舒）在国内获批上市，同年11月，该药在美国获批上市，商品名Ryzneuta，用于治疗肿瘤患者在接受抗癌药物后出现的中性粒细胞减少症。亿帆医药成为国内首家以药品上市持有人（MAH）身份在美国FDA获得批准的创新生物药企业。 创新加速，迈向全球市场 受益于中国药政改革和资本市场助推的利好，我国创新药行业正在迅速发展，为国内患者带来创新疗法。据统计，2018—2023年已有超过一百个国产创新药获得获批上市，涵盖PD-1、BTK、EGFR、BCMA等创新靶点。 在国际市场，国产创新药也正在获得认可。2023年有4款国产创新药在欧美获批上市。另外，国产创新药已成为全球医药交易的重要来源，尤其是在新兴热门领域，例如ADC。 表2 在国外上市的国产创新药 数据来源：药智数据、企业公告 《2024中国药品研发综合实力排行榜TOP100》不仅彰显了中国药品研发领域的领军企业风采，也映照了整个行业的蓬勃发展态势与巨大潜力。随着研发投入的增加和创新能力的不断提升，我们有理由相信，未来将有更多中国创新药在全球医药市场占据重要地位。 附件：《2024中国药品研发综合实力排行榜》评分规则 1.排行榜评分规则 《2024中国药品研发综合实力排行榜》由2023年度的国内药品受理批准情况得分、药企研发投入资金情况得分、国内药品临床试验得分、国外药品研发情况得分、专利得分及企业历史药品研发排行榜得分（2023年）六部分按比例计算所得。其中研发投入情况只针对上市企业或提供审计数据的企业，没有研发投入数据的企业不计算该项。没有研发投入数据的企业总分由2023年度国内药品受理批准情况得分、国内药品临床试验得分、国外药品研发情况得分、专利得分及企业历史药品研发排行榜得分（2023年）五部分按比例计算所得（各部分所占比例如表3所示）。 表3 《总榜》分数组成部分及比例 2.特别说明 （1）关于特别加分项的说明 i：已登记的临床试验，在当年有实际进展的企业给予适当加分； ii：国家级重大科学技术奖项给予适当加分； iii：中药企业新增中药保护品种、中药配方颗粒备案给予适当加分。 （2）关于药品注册分类权重的说明 2023年药品受理情况、批准情况得分计算时，通过对不同的药品注册分类（如化药1类、化药2类等）赋予不同的权重，来体现药品研发实力的差别。 （3）关于数据来源的说明 数据来源于“药智药品注册与受理数据库”，企业包括药企、研究所（不包含大学、医院）等单位。其中受理情况（承办日期：2023年1月1日-12月31日）得分、批准情况（状态开始日期：2023年1月1日-12月31日）得分通过“药智药品注册与受理数据库”数据计算所得；临床试验登记完成得分通过“中国临床试验数据库”数据计算所得；国外研发情况得分通过“全球药物分析系统”数据计算所得；专利得分通过“药智专利通”数据计算所得；药企研发投入资金情况来源于主要上市药企2023年年报数据，包括a.上证、深证、港股、新三板、创业板、美股；b.已发布招股公告的拟上市企业；c.主动提供审计报告的企业（非上市）。 值得说明的是，本届榜单主要依据企业“2023年单年指标”按权重进行综合评分，原则上仅代表企业2023年度研发实力和品牌知名度。本次榜单为第9届发布（每年度发布一次），药品研发实力排行榜专家委员会和2024中国医药研发·创新峰会组委会秉承专业、专注、诚信、负责的原则，尽量做到公平公正，但评分难免会有不到之处，敬请见谅。 药品研发实力排行榜专家委员会 2024中国医药研发·创新峰会组委会 2024年7月 声明：本内容仅用作医药行业信息传播，为作者独立观点，不代表药智网立场。如需转载，请务必注明文章作者和来源。对本文有异议或投诉，请联系maxuelian@yaozh.com。 责任编辑 | 琉璃 转载开白 | 马老师 18996384680（同微信） 商务合作 | 王存星 19922864877（同微信）  点击阅读原文，了解研发百强榜更多内容