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大家好，今天分享一篇发表于 Chemical & Biomedical Imaging 期刊“2026 Rising Stars in Chemical and Biomedical Imaging”特刊的化学生物学与荧光代谢成像领域综述，论文标题 Live-Cell Fluorescent Imaging of Pyridine Nucleotide Coenzymes: Sensor Platforms, Biological Applications, and Pharmacological Opportunities（吡啶核苷酸辅酶的活细胞荧光成像：传感器平台、生物学应用与药理学机遇），由复旦大学药学院王璐课题组（联合马来西亚蒙纳士大学）团队，开展的针对 NAD+/NADH 与 NADP+/NADPH 活细胞荧光传感平台的系统性梳理与比较，创新点在于把小分子探针、基因编码传感器与化学遗传传感器三类平台放入同一分析框架，并以分析物定义、选择性、可逆性、动态范围、亚细胞靶向性等性能参数连接辅酶生物学与药理应用，解决的是既往综述未系统连接辅酶代谢生物学与传感器设计、亚细胞成像能力及药物发现需求的问题，研究意义在于为活细胞辅酶成像工具的理性选择、药物靶点确证与表型筛选提供整体指南。 一、文献信息 英文标题：Live-Cell Fluorescent Imaging of Pyridine Nucleotide Coenzymes: Sensor Platforms, Biological Applications, and Pharmacological Opportunities 中文标题：吡啶核苷酸辅酶的活细胞荧光成像：传感器平台、生物学应用与药理学机遇 期刊全称：Chemical & Biomedical Imaging 期刊简称：Chem. Biomed. Imaging 专业方向：荧光传感 / 活细胞成像 / 代谢成像 / 化学生物学 作者：Yezhou Leng；Wanxin Bao；Cheng Ma；Rui Bao；Yifan Bao；Zhenglong Zhai；Thet Thet Htar；Lu Wang 作者单位：复旦大学药学院（智慧药物递送教育部重点实验室、免疫炎症性疾病新药创制教育部创新中心、中山医院内镜中心与内镜研究所），上海 201203；马来西亚蒙纳士大学药学院（School of Pharmacy, Monash University Malaysia） 团队/实验室：复旦大学药学院 王璐课题组（放射药学与分子影像中心） 团队近半年工作方向：王璐课题组聚焦新型荧光染料与活细胞动态成像：2024 年在 JACS 发表化学遗传编码 NADPH 探针 FOCS（即本文 Figure 14 的原始文献）；2026 年先后在 Angew. Chem. Int. Ed. 发表激活型单线态氧光敏探针用于细胞骨架蛋白组学、在 J. Med. Chem. 发表近红外免洗喷雾神经显像探针 N4；并搭建 GLF-MINFLUX 超分辨荧光成像平台研究药物靶点时空分布与转录因子药物筛选（2023-2026 在研）。 二、研究背景 吡啶核苷酸辅酶包括 NAD+/NADH 与 NADP+/NADPH 两对氧化还原偶，是生命体中最核心的氢负离子转移辅因子。NAD(H) 主要服务于分解代谢与能量转导：NAD+ 在糖酵解、三羧酸循环中接受电子，NADH 则向线粒体电子传递链输送还原当量驱动氧化磷酸化；此外 NAD+ 还是去乙酰化酶（sirtuins）与 PARP 等信号/调控酶的消耗性底物。NADP(H) 则主要提供还原力，用于还原性生物合成、谷胱甘肽与硫氧还蛋白抗氧化防御、异源物代谢、一氧化氮合成以及 NADPH 氧化酶（NOX）调控的活性氧生成。两类辅酶的稳态由从头合成、补救合成、相互转化与消耗多条途径共同维持，且被区室化分布于胞质、线粒体与细胞核。在癌症、衰老、神经退行与炎症中，辅酶动态常被重塑，成为通路活性的信息报告物与极具吸引力的药理学靶点，因此实时监测其时空动态具有重要意义。 三、由背景延伸出的科学问题 现有的 LC-MS、酶循环法等生化方法可高灵敏定量总辅酶丰度，却丢失了亚细胞定位、时间动态与细胞间异质性信息；多数小分子探针以 NAD(P)H 的还原能力为信号，难以严格区分 NADH 与 NADPH，也难定量游离辅酶浓度；而既往综述多聚焦单一平台或单一生物学侧面，缺少一个统一框架把辅酶生物学、传感器性能参数与亚细胞成像能力及药理应用系统地连接起来。 四、研究思路 文献作者以统一的性能标准（分析物定义、选择性、可逆性、动态范围、响应时间、亚细胞靶向性、原位校准兼容性等）为主线，将小分子探针、基因编码生物传感器与化学遗传传感器三类平台逐一剖析比较，再以代表案例展示其在疾病机制、药物机制确证、药效学分析与表型筛选中的应用，最后展望定量化、互操作性与可预测性等挑战，从而把成像工具选择与具体生物学/药物发现问题一一对应。 五、研究方法与验证实验 这文献是系统综述，方法上采用三平台对比架构： ①小分子探针部分，总结以醌、刃天青、喹啉、吡啶鎓等氧化还原响应基团为基础的氢负离子转移传感原理，并以 UQ-Rh（开-关型，NADPH 0.5–10 mM 线性响应）、DCI-MQ（近红外开启型，NADH 0–1 μM 线性响应）、BA-Resa/RA-Resa（硼酸-核糖识别辅助氢转移）为代表逐一分析其响应机制、光谱表征、选择性实验与活细胞成像验证； ②基因编码传感器部分，按 NADH（Frex、FrexH、Peredox、SoNar）、NAD+（LigA-cpVenus、FiNad、NS 家族）、NADPH/NADP+（iNap、NAPstars、Apollo-NADP+、NERNST）分类介绍设计原理（环化重排荧光蛋白插入 Rex/T-Rex、FRET/BRET/各向异性读出）与典型验证实验； ③化学遗传传感器部分，以 NADP-Snifit、NAD-Snifit 与 FOCS-NADPH 为例展示 HaloTag/SNAP-tag 自标记与合成染料结合的策略。全文以 Table 2 汇总 20 种传感器性能参数，并进一步梳理 NAD+ 供给（NAMPT、IDO1）、消耗（CD38、PARP、sirtuin）与 NADPH 氧化还原调控（NADK、G6PD、突变 IDH）的可成药节点及代表药物，结合成像引导的药物筛选与药效学案例（SoNar 高通量代谢筛选、iNap 鉴定叶酸促 NADPH）说明方法价值。 六、图表解读 图 Figure 1　吡啶核苷酸辅酶的组织、主要功能与相互转化网络 整图以蓝（上）/紫（下）两个功能区为核心，系统呈现 NAD+/NADH 与 NADP+/NADPH 两对辅酶的结构关系与代谢网络。上方蓝色区域标注 NAD(H) 承担的分解代谢反应、能量转导、氧化还原稳态与细胞信号传导：NAD+ 经糖酵解（GAPDH）、丙酮酸氧化（PDH 复合物）与三羧酸循环（IDH3、α-KGDH、MDH2）等反应生成 NADH，NADH 又经电子传递链（ETC，复合体 I）氧化回 NAD+。下方紫色区域标注 NADP(H) 的抗氧化防御、还原性生物合成、异源物代谢与活性氧调控生成等功能：NADPH 由磷酸戊糖途径（G6PD/6PGD）、异柠檬酸脱氢酶（IDH1/2）、苹果酸酶（ME）与一碳代谢（MTHFD/ALDH1L）等途径供给，并被硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽还原酶与 NOX 消耗。图中还展示了四种辅酶的化学结构式，并标出 NADK、mNADK、NNT 等相互转化酶，直观呈现“多途径生成—区室转化—多途径消耗”的网络化调控特征。 （a）结构与功能分区：上方 NAD(H) 功能区对应分解代谢、能量转导与信号传导，下方 NADP(H) 功能区对应抗氧化防御、还原性合成与活性氧调控，明确两类辅酶分工。 （b）NADH 生成与回氧化：糖酵解、PDH、TCA 生成 NADH，电子传递链（复合体 I）将其氧化回 NAD+，构成能量代谢核心循环。 （c）NADPH 供给与消耗：PPP、IDH1/2、苹果酸酶、一碳代谢供给 NADPH，硫氧还蛋白/谷胱甘肽还原酶与 NOX 消耗之，支撑抗氧化与合成代谢。 （d）相互转化酶：NADK/mNADK 磷酸化 NAD+/NADH 生成 NADP+/NADPH，NNT 催化 NADH+NADP+ 与 NAD++NADPH 互变，构成跨区室连接枢纽。 表 Table 1　连接 NAD(H) 与 NADP(H) 的关键氢负离子转移反应 整表按“途径/酶—化学反应—代谢意义”三列汇总了八类核心氢负离子转移反应。糖酵解 GAPDH 生成胞质 NADH 并耦合底物水平磷酸化与 ATP 生成；乳酸脱氢酶在缺氧或高代谢通量下快速再生 NAD+，驱动胞质 NAD+/NADH 比值的快速波动；丙酮酸脱氢酶把糖酵解与 TCA 循环相连，为氧化磷酸化提供线粒体 NADH；TCA 循环 MDH2 生成呼吸链所需的 NADH。NADPH 侧，氧化型磷酸戊糖途径（G6PD/6PGD）是胞质 NADPH 的主要生产者，同时提供核糖-5-磷酸；NADP-苹果酸酶与异柠檬酸脱氢酶（IDH1/2）分别在胞质与线粒体生成 NADPH，支持区室特异的氧化还原稳态与抗氧化防御。该表把每条反应的底物、产物与代谢意义并置，说明辅酶池是分布式网络而非单一线性通路，为理解区室化调控提供了分子层面的依据。 图 Figure 2　生理、疾病与药物发现中的吡啶核苷酸辅酶亚细胞成像 整图以“荧光传感器→活细胞动态成像→疾病机制与药物筛选”为主线，展示亚细胞辅酶成像的应用逻辑。图中央呈现显微镜下活细胞的 NAD(H)/NADP(H) 浓度“下降/上升”监测，左侧列出传感器（小分子、基因编码、化学遗传三类）的分子结构示意；下方分两个板块：板块 1“疾病中代谢通路的变化”分别列出癌细胞（糖酵解↑、NAD+ 补救合成↑伴 NAMPT↑、PPP↑伴 G6PD↑、NAD+↑、NADPH↑）、阿尔茨海默病细胞（DNA 损伤伴 PARPs↑、NADPH 氧化酶↑、ROS↑、NAD+↓、NADPH↓）与衰老细胞（CD38↑、PARPs↑/NAMPT↓、PPP↓/NNT↓、[NADP+]/[NADPH]↑、[NAD+]/[NADH]↓）的典型辅酶重塑特征；板块 2“药物筛选与机制确证”展示从候选药物库→细胞实验→数据分析→命中鉴定的标准流程。整图把辅酶成像从描述性工具上升到疾病表型与药物研发的功能读出。 （a）传感器与成像中枢：三类生物传感器在活细胞中报告辅酶池的下降/上升，体现不同平台共用动态读出逻辑。 （b）疾病代谢变化：癌细胞依赖 NAD+ 补救合成与 NADPH 供给，AD 细胞以 PARP/NADPH 氧化酶激活与 NAD+、NADPH 下降为特征，衰老细胞呈 CD38 上调与还原力下降。 （c）药物筛选流程：候选药物文库→细胞实验→数据分析→命中鉴定，说明成像表型可直接衔接药效评价与机制确认。 图 Figure 3　小分子反应型探针的通用氢负离子转移传感原理 整图概括了反应型小分子探针检测 NAD(P)H 的通用原理：NAD(P)H 作为氢负离子供体，将其还原态烟酰胺环上的氢转移给探针中的氧化还原响应单元（醌、刃天青、喹啉、吡啶鎓等），使探针发生化学转化，进而通过光诱导电子转移（PET）或分子内电荷转移（ICT）等机制调节荧光团的发光状态，产生荧光开启（turn-on）或关闭（turn-off）两种读出。图中左右对比展示了还原态 NAD(P)H 与氧化态 NAD(P)+ 的结构差异，以及荧光关闭/开启两种状态的示意图。该原理的优点是可快速产生信号、操作流程简便，但代价是多数探针报告的是整体还原能力而非严格定义的辅酶池，且难以区分 NADH 与 NADPH，这也是后续基因编码与化学遗传平台发展的动因。 （a）氢负离子供体：NAD(P)H 的还原态烟酰胺提供氢负离子，自身氧化为 NAD(P)+，构成探针反应的化学基础。 （b）荧光状态转换：还原反应触发荧光团从关闭态转为开启态（或反向），给出 turn-on/turn-off 的信号输出。 图 Figure 4　UQ-Rh：基于泛醌-若丹醇的反应型细胞内 NAD(P)H 探针 整图以 a/b/c 三个子图完整展示 UQ-Rh 探针的传感机制、体外响应与细胞验证。a 图为机制示意：UQ-Rh 由泛醌单元与若丹醇荧光团偶联而成，经铱配合物活化后，NAD(P)H 还原泛醌单元，改变光诱导电子转移（PET）效率，使若丹醇荧光显著下降，即“强荧光→弱荧光”的 turn-off 响应。b 图为体外定量：在不同浓度 NADPH（0–10 mM）下荧光随时间变化，归一化荧光强度与 log([NADPH]) 呈良好线性（拟合方程 y=−0.8712x−1.8783，R²=0.9995），证明响应可定量且对 Na+、K+、Ca2+、谷胱甘肽等常见物种干扰小。c 图为活细胞应用：HeLa 细胞经 5 mM 丙酮酸处理后 UQ-Rh 荧光随时间（2、3、4 min）下降，与胞内还原态向氧化态转变一致，验证其监测代谢扰动的能力。该探针胜在分子紧凑、易合成、即用即测，缺点是需要铱配合物活化且为关闭型输出，背景干扰与操作复杂度较高。 （a）传感机制：NAD(P)H 还原泛醌单元调节 PET，导致若丹醇荧光下降，属于反应型 turn-off 探针。 （b）体外响应：荧光与 log([NADPH]/M) 线性相关（R²=0.9995），响应范围 0.5–10 mM，常见金属离子与谷胱甘肽干扰有限。 （c）细胞验证：HeLa 细胞加 5 mM 丙酮酸后荧光在 2–4 分钟内持续下降，与胞内还原能力下降一致，可跟踪代谢扰动。 图 Figure 5　DCI-MQ：近红外开启型细胞内 NAD(P)H 探针 整图以 a–e 五个子图完整展示近红外探针 DCI-MQ 的设计与验证。a 图为机制：NAD(P)H 还原喹啉单元生成富电子胺（DCI-MQH），增强二氰异佛尔酮荧光团的分子内电荷转移（ICT），在 660 nm 处产生强近红外发射，实现“荧光关闭→强近红外荧光”的 turn-on 响应。b 图为吸收光谱，加入 NADH 后吸收峰发生显著红移；c 图为荧光随时间上升的动力学曲线；d 图为浓度响应：荧光强度对 0–1 μM NADH 线性响应（F=22.12+134.27[NADH]，R²=0.9915），且对常见盐、氨基酸与还原剂耐受。e 图为细胞成像：HepG2 肿瘤细胞的荧光明显强于 HL-7702 正常肝细胞，反映两种细胞内源性还原状态差异，说明该探针可用于跨细胞类型的还原能力对比。近红外发射（650–900 nm）降低组织自发荧光、提高穿透深度，是其面向生物成像的关键优势。 （a）传感机制：喹啉还原强化 ICT，激活 660 nm 近红外发射，为 turn-on 型响应。 （b）光谱表征：加入 NADH 后吸收显著红移，荧光在近红外区增强，光谱特征清晰。 （c）动力学响应：荧光强度随时间上升，反映探针与 NADH 反应持续进行。 （d）浓度定量：0–1 μM NADH 线性响应（R²=0.9915），低浓度灵敏度高。 （e）细胞区分：HepG2 肿瘤细胞荧光强于 HL-7702 正常细胞，可用于比较内源性还原状态。 图 Figure 6　BA-Resa/RA-Resa：识别辅助反应型 NADH 探针 整图以 a/b/c 三个子图展示硼酸辅助识别策略对 NADH 探针灵敏度与选择性的提升。a 图为两步传感机制：BA-Resa 的硼酸基团先与 NADH 核糖部分形成可逆识别（Step 1 生成中间体 1），提高探针与底物的有效邻近性，随后发生氢负离子转移（Step 2 经中间体 2）将弱荧光的刃天青（resazurin）转化为强荧光的试卤灵（resorufin），同时释放 NAD+，实现高灵敏 turn-on 响应。b 图为光谱表征：随 NADH 浓度从 0 增至 50 μM，535 nm 吸收下降、485 nm 吸收上升，荧光最大发射从 620 nm 蓝移至 575 nm，插图对比反应前后样品颜色变化；该探针在 0–1 μM 低浓度区间响应最灵敏，且对金属离子与结构相近核苷酸干扰有限。c 图为细胞应用：因 BA-Resa 偏碱性条件不适用活细胞，作者进一步改造为 RA-Resa；在口腔鳞癌细胞中，RA-Resa 荧光随葡萄糖浓度（1 mM/20 mM）升高而增强，乳酸与丙酮酸处理也引起相应变化，说明其可报告与糖酵解耦合的胞内 NADH 还原状态变化。 （a）两步机制：硼酸-核糖识别增强邻近性，促进氢负离子转移，将刃天青转化为高荧光试卤灵。 （b）光谱响应：NADH 浓度升高引起 535→485 nm 吸收迁移与 620→575 nm 发射蓝移，0–1 μM 区间最灵敏。 （c）细胞验证：RA-Resa 在口腔鳞癌细胞中随葡萄糖浓度升高荧光增强，与糖酵解驱动的 NADH 还原态变化一致。 图 Figure 7　基因编码生物传感器的通用架构与信号读出模式 整图系统概括基因编码吡啶核苷酸传感器的设计逻辑。图中左侧以 FRET 为例展示通用工作架构：识别域（recognition domain）连接供体荧光蛋白 FP1（donor）与可选的受体荧光蛋白 FP2（acceptor），当 NAD(P)H 等分析物结合识别域后，蛋白构象改变使 FP1 与 FP2 相互靠近，产生福斯特共振能量转移（FRET），将分析物结合事件转化为可调制的光学读出。右侧列出该架构支持的信号输出模式：荧光强度（intensity）、发射光谱（emission spectrum）、FRET 效率、荧光寿命（lifetime）与各向异性（anisotropy），并配以相应的示意曲线。整图说明基因编码平台的核心优势——把分子识别内置于可表达的蛋白骨架中，可通过定向突变/定向进化调谐选择性，也可借助靶向肽定位到胞质、线粒体、细胞核等区室，实现多尺度、区室分辨的动态成像。 （a）识别-读出架构：分析物结合诱导构象变化，使供体/受体荧光蛋白靠近并发生 FRET，把结合事件转为光学信号。 （b）信号读出模式：荧光强度、发射光谱、FRET 效率、荧光寿命与各向异性均可作为读出，适配不同成像模态。 图 Figure 8　Frex：用于 NADH 比率成像的基因编码传感器 整图以 a–d 四个子图展示代表性基因编码 NADH 传感器 Frex 的设计与验证。a 图为设计原理：将环化重排黄色荧光蛋白（cpYFP）插入两个 Rex 亚基之间，NADH 结合使 Rex 二聚体闭合，改变 cpYFP 荧光，实现激发比率式（ratiometric）读出。b 图为光谱与剂量响应：NADH 条件下激发/发射峰与对照差异明显，荧光随 NADH 浓度变化；Frex 对 NAD+、NADP+、NADPH、ADP、ATP 响应极小，选择性优异，且动态范围大。c 图为细胞成像：293FT 细胞表达线粒体靶向 Frex（Frex-Mit）后，呼吸链抑制剂 3-硝基丙酸（3-NP）处理 10 min 使 488/405 nm 比率明显下降，而对照 cpYFP-Mit 无明显变化；d 图为时间曲线，进一步量化 3-NP 引起的线粒体 NADH 减少过程。该工作首次证明基因编码传感器可在活细胞中实时报告区室特异性 NADH 动态，但其 pH 敏感性提示需谨慎校准。 （a）设计原理：cpYFP 插入 Rex 亚基间，NADH 结合驱动闭合构象并产生激发比率式荧光变化。 （b）光谱与选择性：NADH 剂量依赖响应明显，对 NAD+、NADPH、ATP 等几乎无响应，动态范围大。 （c）线粒体成像：3-NP 抑制呼吸链后 Frex-Mit 的 488/405 比率显著下降，cpYFP-Mit 对照不变。 （d）时间动态：比率随时间逐步下降，量化 3-NP 引发的线粒体 NADH 消耗过程。 图 Figure 9　Peredox：报告胞质 NADH/NAD+ 氧化还原态的比率传感器 整图以 a–e 五个子图展示 Peredox 的设计与验证。a 图为设计原理：以细菌 NADH 结合蛋白 Rex 为识别域，NADH 结合使 Rex 闭合，增强环化重排 T-Sapphire 荧光；NAD+ 几乎不引起信号变化。b 图为激发/发射光谱：+NADH、对照与 +NAD+ 三条曲线差异明显，证明选择性。c 图为不同 NAD+ 浓度（0.8、1.7、2.5 mM）下绿/红荧光比随 NADH 浓度升高的响应曲线，显示 Peredox 报告的是 NADH/NAD+ 比例而非单一丰度。d 图为细胞成像：Neuro-2a 细胞表达 Peredox-mCherry，乳酸培养基中加入丙酮酸后，绿/红比率通道明显下降，与丙酮酸转化乳酸过程中 NADH 氧化为 NAD+ 一致。e 图为时间曲线：随乳酸/丙酮酸比例变化，比率呈阶梯式响应，且 NADH 解离约 1 分钟内完成，适合跟踪动态氧化还原变化。Peredox 的重要意义在于把传感问题从“测代谢物丰度”提升为“报告细胞主动调控的氧化还原平衡”。 （a）设计原理：NADH 结合 Rex 使环化重排 T-Sapphire 荧光增强，NAD+ 不产生信号，选择性针对 NADH/NAD+ 对。 （b）光谱表征：+NADH、对照与 +NAD+ 三条曲线差异明显，激发/发射窗口清晰，证明选择性。 （c）剂量响应：绿/红比率随 NADH 浓度升高而变化，在不同 NAD+ 背景下呈典型响应曲线，报告的是氧化还原比例。 （d）细胞成像：Neuro-2a 细胞加丙酮酸后绿/红比率下降，对应 NADH 氧化为 NAD+ 的代谢过程。 （e）动态跟踪：乳酸/丙酮酸比例变化引起比率阶梯式响应，响应时间约 1 分钟，适合实时监测。 图 Figure 10　iNap：激发比率式 NADPH 传感器家族 整图以 a–f 六个子图展示 iNap 家族的设计、选择性与活细胞应用。a 图为机制：iNap 基于重新编程的 T-Rex 支架，NADPH 结合使 407 nm 激发荧光增强、482 nm 激发荧光减弱，528 nm 处发射，构成激发比率式（R407/482）响应，幅度可达约 900%。b 图为激发光谱：加入 NADPH 后相对荧光单位显著升高，对照曲线平稳。c 图为选择性：在 NADPH、NADH、NADP+、NAD+、ATP、ADP、AMP 及 Mg 复合物等十余种核苷酸中，仅 NADPH 呈显著浓度依赖性比率升高，证明特异性切换成功。d 图为动力学：KP372-1+NQO1 处理后 iNap1 与 iNapc 的 NADPH 响应快速上升，而 SoNar（NADH 传感器）不受影响，验证互不干扰。e 图为细胞成像：HeLa 细胞加 diamide（氧化剂）后 iNap1 与 iNapc 比率明显下降（0→40 min），f 图显示 40–160 μM diamide 呈浓度依赖的比率下降，而葡萄糖补充可显著缓解。该工作证明 Rex/T-Rex 支架可被重编程以区分磷酸化辅酶对，拓宽了基因编码吡啶核苷酸成像的概念边界。 （a）传感机制：NADPH 结合 T-Rex 改变双激发荧光，528 nm 发射的比率响应可达约 900%。 （b）光谱响应：加入 NADPH 后激发谱显著变化，对照谱线平稳，读出窗口清晰。 （c）选择性：十余种核苷酸中仅 NADPH 引起比率升高，NADH、NAD+、ATP 等几乎无响应。 （d）动力学：KP372-1+NQO1 处理下 iNap 快速响应，同时监测的 SoNar 不受影响，交叉干扰小。 （e）细胞成像：HeLa 细胞加 diamide 后 iNap 比率显著下降，反映 NADPH 池被氧化消耗。 （f）浓度依赖：40–160 μM diamide 呈浓度依赖性抑制，葡萄糖补充可部分恢复，验证 NADPH 来源依赖。 图 Figure 11　Apollo-NADP+：基于荧光各向异性的 NADP+ 传感器 整图以 a–f 六个子图展示 Apollo-NADP+ 的设计原理与应用。a 图为传感器结构：以人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）为识别骨架，荧光蛋白标记其变构 NADP+ 结合位点；b 图为工作原理：NADP+ 结合促进 G6PD 单体（mon）二聚化（dim），两个荧光蛋白单体间的同源 FRET（homo-FRET）使荧光各向异性下降，将结合事件转化为可测的各向异性变化。c 图为剂量响应：1P 各向异性随 NADP+ 浓度（约 0.01–1000 μM）呈 S 形下降，M/D 参考线标注单体/二聚体状态；d 图为选择性：NADP+ 处理显著降低各向异性，而 NADPH、NAD+、NADH、ATP 影响甚微。e 图为共成像：在 β-TC3 胰岛细胞中同时表达 Apollo-NADP+（Cerulean 通道）与 HyPer（H2O2 传感器），展示多读出整合；f 图为时间动态：0.25 mM diamide 处理后 2P 各向异性先下降，而 HyPer 的 F/F0 随后上升，说明辅酶氧化还原态变化先于 H2O2 信号，揭示二者偶联关系。该工作把吡啶核苷酸成像推向“多分析物整合”的方向。 （a）结构基础：G6PD 变构 NADP+ 结合位点与荧光蛋白标记，为二聚化传感提供骨架。 （b）工作原理：NADP+ 稳定 G6PD 二聚体，homo-FRET 使各向异性下降，实现无波长偏移读出。 （c）剂量响应：各向异性随 NADP+ 浓度 S 形下降，单体/二聚体参考线清晰界定响应区间。 （d）选择性：NADP+ 特异性响应，NADPH/NAD+/NADH/ATP 干扰小，分析物定义明确。 （e）多读出共成像：Apollo-NADP+ 与 H2O2 传感器 HyPer 在 β-TC3 细胞中共表达，可同步监测两通路。 （f）动态偶联：diamide 处理后各向异性下降先于 HyPer 荧光上升，显示辅酶氧化还原与 H2O2 信号的时序耦合。 图 Figure 12　化学遗传生物传感器的通用传感原理 整图以 a/b 两部分概括化学遗传平台的组成与读出逻辑。a 部分为组件示意：化学遗传传感器 = 基因编码的传感蛋白/识别模块（recognition module，含供体荧光团）+ 配体-染料模块（ligand–dye module，含受体荧光团），传感蛋白通过自标记标签（如 HaloTag/SNAP-tag）或配体-蛋白相互作用引入合成染料，经标记（labeling）后形成完整传感器；下方配以供体发射与受体发射光谱，说明染料可自由调谐。b 部分为分析物依赖的比率型 FRET 读出：无分析物时传感器呈开放构象、FRET 效率低；加入吡啶核苷酸后转为闭合构象、FRET 效率升高，供体荧光下降而受体荧光上升，产生比率式（ratiometric）输出。整图说明化学遗传平台在保留基因编码识别特异性的同时，借助合成染料的亮度、光稳定性与光谱灵活性弥补荧光蛋白的不足，其代价是依赖高效细胞内标记与未结合染料背景的控制。 （a）组件构成：基因编码传感蛋白/识别模块与配体-染料模块经自标记标签组装，合成染料提供灵活光谱。 （b）FRET 读出：分析物结合使传感器由开放低 FRET 态转为闭合高 FRET 态，输出比率式信号。 图 Figure 13　NADP-Snifit：活细胞 NADPH/NADP+ 比率的比率型化学遗传传感器 整图以 a–d 四个子图展示 NADP-Snifit 的设计与活细胞验证。a 图为传感机制：传感器由人 sepiapterin 还原酶（SPR，NADP 结合域）、HaloTag 与 SNAP-tag 构成，SNAP-tag 标记双功能配体 CP-TMR-SMX（供体），HaloTag 标记 SiR-Halo 硅基罗丹明（受体）；NADP+ 促进三元复合物组装、提高 FRET，NADPH 置换则降低 FRET，实现 [NADPH]/[NADP+] 的比率读出。b 图为发射光谱：NADP+ 从 1.28 nM 滴定至 100 μM 时 FRET 通道荧光逐步增强，供体通道相应下降；c 图为定量关系：TMR/SiR 发射比随 [NADPH]/[NADP+] 变化呈典型响应曲线，r50=30±3，c50(NADP+)≈29±7 nM，动态范围约 8.9 倍且几乎不依赖 pH。d 图为活细胞成像：细胞先后经 2 mM SPY（供体底物）、不同浓度 H2O2（10→200 μM）与洗涤处理，TMR/FRET 强度比随时间逐步变化，直观显示胞内 [NADPH]/[NADP+] 被氧化应激重塑的动态过程，且传感器可靶向多个细胞器。 （a）传感机制：SPR+HaloTag+SNAP-tag 三模块组装，NADP+ 提高 FRET、NADPH 降低 FRET，输出比率信号。 （b）光谱滴定：NADP+ 1.28 nM–100 μM 梯度下 FRET 通道增强，供体通道下降，光谱窗口清晰。 （c）定量响应：TMR/SiR 比随 [NADPH]/[NADP+] 变化，r50=30±3，动态范围约 8.9 倍，pH 不敏感。 （d）活细胞验证：SPY 加载与逐级 H2O2 处理后比率逐步下降，显示胞质 NADPH/NADP+ 被氧化应激重塑。 图 Figure 14　FOCS-NADPH：监测活细胞胞质 NADPH 动态的荧光原化学遗传传感器 整图以 a–e 五个子图展示 FOCS-NADPH 的设计与验证。a 图为设计机制：传感器由大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）与 HaloTag 组成，配以三甲氧苄啶（TMP）基团与 Halo 兼容的荧光原罗丹明分别作 FRET 供体/受体；游离染料无荧光、背景低，标签结合后供体呈绿色两性离子荧光，NADPH 促进受体结合 eDHFR 后切换为红色荧光并完成 FRET 对，实现低背景、可逆的比率传感。b 图为吸收光谱：FOCS-NADPH 与 1 nM 或 100 μM NADPH 孵育时吸收变化显著，显示结合响应；c 图为发射光谱：NADPH 从 10 nM 增至 128 μM 时 635 nm 受体荧光逐步上升，535 nm 供体下降；d 图为浓度响应：I635/I535 比率对 NADPH 呈灵敏响应（c50≈2.7 μM，动态范围约 4.3 倍），而 NADH、NADP+、NAD+ 响应极小，选择性良好。e 图为活细胞成像时间序列：胞质 FOCS-NADPH 在 H2O2（250 μM）处理后比率先降，葡萄糖（5 mM）补充后回升；G6PD 抑制（G6PDi）条件下回升被阻断，证明信号确实反映 PPP 来源的 NADPH 动态。该工作展示了化学遗传平台“免清洗、低背景、快速可逆”的操作优势。 （a）设计机制：eDHFR+HaloTag 与双荧光原罗丹明组成 FRET 对，NADPH 触发红色荧光开启，背景极低。 （b）吸收光谱：1 nM 与 100 μM NADPH 下吸收显著不同，体现浓度依赖的传感响应。 （c）发射响应：NADPH 10 nM–128 μM 梯度下 I635 上升、I535 下降，比率窗口清晰。 （d）选择性与定量：I635/I535 对 NADPH 灵敏（c50≈2.7 μM），NADH/NADP+/NAD+ 几乎无响应。 （e）活细胞动态：H2O2 使比率下降、葡萄糖恢复，G6PDi 阻断恢复，证明报告 PPP 来源 NADPH。 表 Table 2　活细胞 NAD(H) 与 NADP(H) 成像的代表性荧光传感器汇总 整表以“传感器/变体—平台—报告分析物—读出模式—光学读出—亲和力/响应参数—动态范围—可逆性—文献”九列，汇总 20 个代表性传感器。小分子探针类（UQ-Rh、DCI-MQ、RA-Resa、NATP-3、Rhodamine Sensor A）以强度或发射比率读出，动态范围 8.6–59.3 倍但均不可逆；基因编码类覆盖 NADH（Frex Kd≈3.7 μM、9 倍；FrexH Kd≈40 nM；Peredox KR≈330、2.5 倍；SoNar 15 倍）、NAD+（LigA-cpVenus Kd≈65 μM；FiNad Kd≈1.3 mM、7 倍；NS-Goji/Olive/Grapefruit c50 47 nM–3.1 mM）与 NADPH/NADP+（iNap Kd 2–120 μM、9 倍；NAPstars KR≈0.0006–0.28；Apollo-NADP+ c50 0.1–20 μM、各向异性变化 15–20%），绝大多数可逆；化学遗传类（NADP-Snifit 8.9 倍、NAD-Snifit 7.6 倍、FOCS-NADPH c50≈2.7 μM、4.3 倍）以 FRET 比率读出且可逆。整表直观呈现三类平台在分析物定义、动态范围与可逆性上的互补定位：小分子便捷但不可逆且选择性弱，基因编码可逆可靶向但需表达与校准，化学遗传兼具可逆性与合成染料光学优势。 图 Figure 15　吡啶核苷酸代谢中的代表性可成药节点及相关疾病背景 整图以“作用类型—代谢通路—药物—疾病背景”组织吡啶核苷酸药理学全景。左侧三色标签区分三类干预：合成抑制（Synthesis Inhibition）、消耗抑制（Consumption Inhibition）、氧化还原调控（Redox Regulation）。中心代谢通路列出关键节点酶与代表药物：NAD+ 供给侧，NAMPT（抑制剂 FK866、CHS 828、OT-82、KPT-9274、RPT1G）与 IDO/色氨酸途径（epacadostat、indoximod）被抑制；NAD+ 消耗侧，PARPs（olaparib、niraparib）、SIRT1（EX-527）、CD38（daratumumab、isatuximab、CD38-IN-78c）被靶向；NADPH 生产侧，NADK（T21195）、G6PD（polydatin、DHEA 衍生物）、突变 IDH1/2（ivosidenib、enasidenib、vorasidenib，阻断 2-HG 生成并恢复 α-KG）受到调控。右侧疾病背景栏对应癌症、衰老与其他场景，说明同一通路在不同疾病中可产生细胞毒或保护性等相反结局。整图把传感器成像与药物机制研究连接起来，提示“在哪、多快、何种细胞群”的辅酶重塑信息对合理用药与联合策略至关重要。 （a）NAD+ 供给抑制：NAMPT 抑制剂（FK866、CHS 828、OT-82 等）与 IDO1 抑制剂阻断补救合成与色氨酸途径。 （b）NAD+ 消耗调控：PARP 抑制剂（olaparib 等）、CD38 抗体/NADase 抑制剂与 SIRT1 调节剂改变辅酶消耗方向。 （c）NADPH 氧化还原调控：NADK、G6PD 抑制剂削弱还原力供给，突变 IDH 抑制剂恢复 α-KG 并阻断 2-HG。 （d）疾病关联：癌症、衰老与炎症背景决定干预后果的细胞毒或保护性质，体现成像指导用药的必要性。 表 Table 3　靶向吡啶核苷酸代谢的代表性药理策略 整表以“药理策略—靶点—代表药物—主要机制—临床/R&D 状态—文献”六列汇总代表性干预。NAD+ 合成抑制：NAMPT 抑制剂 CHS 828/FK866 已完成 I 期但因毒性受限，KPT-9274、RPT1G、OT-82 处于 I 期/早期临床；IDO1 途径（epacadostat、indoximod）在 III 期失败或 I 期评价中。NAD+ 消耗调控：CD38 抗体 daratumumab/isatuximab 已获批用于多发性骨髓瘤，CD38 NADase 抑制剂 CD38-IN-78c 处于衰老/代谢临床前模型；PARP 抑制剂（olaparib、niraparib、rucaparib、talazoparib）已获批多个癌症适应症；sirtuin 调节剂（SRT1720、SRT2104、MDL-800）处于早期临床/临床前。NADPH 氧化还原调控：NADK 抑制剂 T21195 与 G6PD 抑制剂（polydatin、DHEA）处于临床前，耐药肺癌模型显示增敏价值；突变 IDH1/2 抑制剂（ivosidenib、vorasidenib、enasidenib）已获批或临床验证。整表与 Figure 15 呼应，说明吡啶核苷酸网络既有获批药物（PARP、mIDH、CD38 抗体）佐证可药性，也暴露 NAMPT 类药物的治疗窗与毒性问题，凸显活细胞成像在区分瞬时耗竭、区室适应与耐药亚群方面的必要性。 七、研究价值与应用前景 该综述的应用价值体现在三个层面。 科研层面，它为研究者在选择吡啶核苷酸成像工具时提供“问题导向”的对照表：想测区室特异 NADH 动态选 Frex/SoNar，想测 NADPH/NADP+ 氧化还原态选 iNap/NAPstars 或化学遗传 Snifit，想测 NAD+ 供给与消耗选 FiNad/NS 系列，想快速筛查还原能力选小分子探针，从而减少盲目试错。 疾病机制层面，传感器已揭示癌细胞依赖 NAD+ 补救合成与 NADPH 供给、AD 中 PARP/NOX 激活致 NAD+ 与 NADPH 双降、衰老细胞 CD38 上调等区室化辅酶重塑特征，为相应干预提供直接证据。 药物发现层面，SoNar 已用于高通量抗肿瘤代谢物筛选，iNap 帮助鉴定叶酸为 NADPH 提升化合物并明确其通过一碳代谢起效；未来结合类器官、患者来源样本与耐药模型，辅酶成像有望成为药效学分析（PD）与表型筛选的标准读出，并指导 PARP/NAMPT/IDH 等靶点的联合用药策略与适应症选择。 八、总结与未来意义 总结而言，这篇综述完成了一件此前缺失的系统性工作：把吡啶核苷酸辅酶生物学、三类荧光传感器平台与药理应用纳入同一框架。它梳理了 NAD(H)/NADP(H) 作为“网络化、区室化”辅酶体系的生成-转化-消耗路径，逐层比较了小分子探针（便捷但分析物定义模糊、不可逆）、基因编码传感器（特异性高、可靶向区室，但依赖表达与校准）与化学遗传传感器（兼具特异性与合成染料光学优势，但要求高效标记）的优缺点，并以 Table 2 的 20 种传感器参数与 Figure 15/Table 3 的可成药节点汇总为实操指南。 对未来研究的意义在于： ①推动原位校准、正交验证（LC-MS/同位素示踪）与定量化，让荧光信号可解释为真实辅酶浓度或氧化还原比； ②发展红移/近红外、耐光漂白与超分辨兼容的下一代传感器； ③借助 AI 蛋白设计与工程加速传感域优化； ④把辅酶成像从描述性工具升级为药物机制确证、药效学分析与表型筛选的预测性平台，从而在癌症、衰老与神经退行等场景中把代谢生物学真正转化为治疗决策。 九、文献全文链接 文献全文见其 DOI 号所在网页地址：https://doi.org/10.1021/cbmi.6c00122