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摘要：合成生物学的目标是设计或组装现有的生物部件或生物组件，以获得有用的生物特性。在过去的几十年中，人们已经取得了进展，构建了精细的生物回路、标准化的生物学构建模块，并开发了各种基因组/代谢工程工具和方法。医疗和制药需求也推动了合成生物学的发展，包括将异源途径整合到设计好的细胞中，以高效生产医疗剂；在细胞生长介质中提高天然产物的产量，使其等同于或高于从植物或真菌中提取的产物；构建新的遗传回路以实现肿瘤靶向，可控释放治疗剂以响应特定生物标志物，以对抗糖尿病和癌症等疾病。此外，还开发了新策略来治疗传统方法难以治愈的复杂免疫疾病、传染病和代谢紊乱。总的来说，合成生物学为医疗和制药研究带来了新的能力。本综述总结了合成生物学发展的历程，合成生物学在微生物生产药物、配备合成DNA电路的工程细胞用于诊断和治疗、活体和自动组装的生物材料用于医疗治疗、无细胞合成生物学在医疗和制药领域的应用，以及具有生物医学应用潜力的DNA工程方法的过去和现在。 1.引言 合成生物学的概念最早由Stephane Le Duc在1910年代提出。在这个领域，研究策略已经从描述和分析生物事件转变为设计和操纵期望的信号/代谢途径，类似于已经定义好的有机合成。与19世纪初成功发展的有机合成不同，合成生物学受到生物系统内部DNA、RNA和蛋白质技术的复杂性的限制。如今，合成生物学已经得到了广泛的开发。它已经成为一个多学科领域，旨在基于现有知识开发新的生物部件、系统甚至个体。研究人员可以应用工程范式来生产具有可预测和健壮的系统，这些系统具有自然中不存在的新功能。合成生物学与生物技术、生物材料和分子生物学等多个学科紧密相连，为这些领域提供了方法论和学科。 合成生物学发展的时间线在这里进行了总结（图1）。总的来说，合成生物学的历史可以分为三个阶段。最初阶段贯穿了整个20世纪。尽管在20世纪，病毒颗粒、细菌、古菌和真菌等最简单的生物体很难被工程化，但在早期探索中仍然取得了一些成就，包括结晶牛胰岛素的合成、DNA和RNA的化学合成、遗传密码的破译以及分子生物学中心法则的建立。在这个时期，随着20世纪末基因组生物学和分子生物学的快速发展，合成生物学一直在积累力量（图1）。 图1 合成生物学主要里程碑的时间线。时间线从20世纪50年代开始，扩展到21世纪20年代。重要事件列在右侧面板中。 发展阶段始于21世纪。在新千年的第一个十年中，合成生物学已经成为每个生物学研究人员都知道的领域，包括生物开关、基于群体感应信号的基因回路、酿酒酵母细胞工厂合成变形螺烯、BioBrick标准化组装和iGEM会议的发明。在这个阶段，合成生物学设计中考虑了两个原则，包括瓶颈和自上而下的原则，分别指通过组装基本生物分子创造人工生命的新创举和工程改造自然存在的细胞以满足实际需求。然而，大多数回路设计得很好，但仍然不足以生产复杂的代谢物或感知多种信号，特别是应用尚未为医疗和制药用途做好准备。无论如何，合成生物学逐渐成为一个最热门的领域，在快速发展的前夕。 快速增长阶段始于2010年代，特别是CRISPR/Cas9基因组编辑技术、低成本DNA合成、下一代DNA测序和高通量筛选方法的出现，以及设计-构建-测试-学习（DBTL）的工作流程和工程生物学的进步，使合成生物学进入了快速发展时期，无论是在实验室规模的发现还是工业规模的生产。典型地，Venter等人组装了一个人工染色体的支原体并将其移植到M. capricolum中，创造了新的活细胞。此外，新方法加速了代谢生物合成途径的发现和工程，微生物合成青蒿酸已成为可能，这是第一种由微生物细胞生产的工业化植物代谢物。要实现设计生物系统的最终目标，就像设计电子或机械系统一样，这仅仅是个开始。需要更多的努力来生成复杂和稳定的生物回路，以满足当前合成生物学的各种应用。 除了科学家，投资者也意识到了这个领域的潜力。金融投资帮助建立了与合成生物学相关的公司，预计到2021年全球合成生物学市场价值95亿美元，包括合成生物学产品（例如，BioBrick部件、合成细胞、生物合成化学品）和使能技术（例如，DNA合成、基因编辑），预计到2026年将达到370亿美元。大多数投资都集中在医疗应用上。科学家和资本市场对未来都持乐观态度。 从化学生物合成开始，合成生物学已经扩展到医疗治疗、药物开发、化学工程、食品和农业以及环境保护等领域。本文重点关注合成生物学在医疗和制药领域的进展，包括细胞治疗、细菌活体诊断和治疗、治疗性化学品的生产、纳米技术及纳米材料应用以及靶向基因工程。 2. 基因工程治疗载体 2.1. 用于医疗应用的工程哺乳动物细胞 随着合成生物学的进步，研究人员利用现有信号网络合理设计出用于特定目的的活细胞载体，并为其创建新的结构，开发了各种新疗法，包括例如生产医用生物分子、用于传感或诊断的合成基因网络，以及可编程生物体，以处理疾病背后的机制和相关生物体/个体事件（图2）。在这里，我们重点介绍了哺乳动物细胞工程中的合成生物学策略，用于代谢紊乱、组织工程和癌症治疗，以及细胞治疗和基因回路设计的方法。 图2 基于合成生物学策略的智能活细胞的发展。智能细胞能够感应各种环境生物标志物，从化学物质到蛋白质。外部信号被转导到细胞内以触发下游反应。产品也以化学物质或蛋白质的形式存在，以满足定制需求。感应-反应系统赋予细胞新的或增强的能力。P代表启动子。 基于嵌合抗原受体（CAR）T细胞的疗法。CAR是包含抗原结合和T细胞激活域的工程受体。T细胞从患者体内获取并在体外进行工程化，以表达特定的CAR，然后转移回原始供体患者体内，在该患者体内消除表面展示目标抗原的癌细胞。CAR-T是一种始于2000年代的新型细胞疗法。第一代CAR是针对CD19的单链可变片段（scFv）。人工CAR的发展包括三代。第一代CAR仅包含CD3ζ细胞内域，而第二代CAR还具有共刺激域，例如4-1BB或CD3ζ（图3）。研究还在进行中，以开发具有多个共刺激信号域的第三代嵌合抗原受体（图3）。由于scFv具有识别细胞表面蛋白的能力，通过CAR-T细胞介导的肿瘤靶向既不受限制也不依赖于抗原的处理和呈递。因此，CAR-T细胞不仅限于MHC丧失的肿瘤逃逸。对于癌症免疫疗法，采用基于CAR的方法的主要优势归因于源自抗体的scFv，其亲和力比传统TCRs高几个数量级。此外，CAR可以靶向糖脂、异常糖基化蛋白和构象变体，这些通常不容易被TCRs识别。根据临床试验结果，越来越多的证据表明CAR-T细胞具有传递强大的抗肿瘤治疗效果的能力，从而导致最近FDA批准了针对CD19蛋白的CAR-T疗法，用于治疗急性淋巴细胞性白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。 图3 合成生物学在设计嵌合抗原受体（CAR）中的应用。a 人工CAR中使用的与门。从左到右展示了三种典型的CAR：基于共刺激域的第二代CAR、由synNotch受体辅助的具有多重识别机制的CAR以及基于嵌合共刺激受体（CCR）的CAR。b 配备有抑制性CAR（iCAR）系统的人工CAR。该系统可以防止识别体细胞上的自身抗原。c 感应不同肿瘤抗原的人工CAR。两个识别不同靶标的ScFv串联融合，工程化的CAR可以被多种抗原触发。 此外，CAR-T应用正在进入商业化阶段。首个获批的CAR T细胞疗法是Kymriah，这是由诺华公司和宾夕法尼亚大学开发的针对DLBCL的CD19靶向疗法。DLBCL是一种典型的非霍奇金淋巴瘤（NHL），占所有淋巴瘤的40%。FDA还于2017年批准了Yescarta（axicabtagene ciloleucel）用于DLBCL治疗。在临床研究中，DLBCL患者接受了CD19靶向CAR T细胞治疗，有25%的部分反应者和超过50%的完全反应者。观察到超过两年的持久反应，表明CAR-T细胞的治疗效果。然而，在Yescarta治疗的患者中观察到细胞因子风暴（13%），表明需要提高安全性。 在CAR-T细胞疗法中，目标抗原的选择是决定性的。如果CAR-T细胞能够识别非恶性细胞上表达的蛋白，可能会发生严重的细胞毒性，因为非靶向活性。最佳目标抗原是在癌细胞表面一致表达但不在正常细胞表面表达的抗原。多发性骨髓瘤很难通过化学疗法或干细胞移植治疗。CAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤的临床前研究中显示出有效性。然而，到目前为止，还没有发现任何抗原在多发性骨髓瘤细胞上强烈且恒定地表达，但在体细胞上没有表达。在迄今为止使用过的抗原中，TNF超家族蛋白之一，B细胞成熟抗原（BCMA），是多发性骨髓瘤细胞定向CAR-T疗法目标的最佳候选。BCMA在几乎所有多发性骨髓瘤患者的癌细胞中表达，这种抗原在体细胞上的表达仅限于浆细胞和一些B细胞。BCMA是第一个通过CAR-T细胞方法在多发性骨髓瘤患者中使用的抗原，导致这些癌症患者出现系统反应。在剂量梯度临床试验中，12名患者接受了BCMA CAR-T细胞。接受9 × 10^6 CAR-T细胞/kg体重治疗的两名患者获得了良好的缓解，尽管治疗与细胞因子风暴相关的毒性。目前正在进行或已完成许多临床试验，研究抗BCMA CAR-T细胞的安全性和/或有效性。 Idecabtagene vicleucel（Abecma，也缩写为Ide-cel）由Bristol-Myers Squibb开发，使用与NCI测试的11D5-3-CD828Z CAR相同的抗BCMA 11D5-3 scFv。然而，共刺激域不同，用于idecabtagene vicleucel的CAR是使用慢病毒载体传递的，并且具有4-1BB共刺激域而不是CD28域。在idecabtagene vicleucel的多中心I期试验中，该疗法对治疗多发性骨髓瘤患者非常有效。正在进行的KarMMa II期试验旨在进一步评估idecabtagene vicleucel的安全性和能力。KarMMa的初步结果表明，它在大量预处理的多发性骨髓瘤患者中显示出深入、持久的反应。有效性和安全性反映在早期报告中，支持idecabtagene vicleucel在主要临床结果中的目标剂量范围内具有良好的临床益处-风险概况。 在医疗疗法中的受体工程。SynNotch受体是一类在医学应用中使用的人工工程受体（图3）。Notch受体是参与信号转导的跨膜受体，包括一个细胞外域、一个跨膜和细胞内域。通常在SynNotch架构中保留跨膜和细胞内域，而信号输入的细胞外域被设计为感应scFvs和纳米体，为在活细胞中启动信号提供了可能性。 另外，基于SynNotch理念，开发了模块化细胞外传感器架构（MESA），旨在检测细胞外游离配体。MESA设计包含两个跨膜蛋白，每个蛋白都包含一个细胞外配体结合域，该域感应化学物质或蛋白质，可以是小分子结合域或基于抗体的感应模块，一个跨膜域，以及一个细胞内转录因子，该因子具有从复合体中释放的能力、蛋白酶识别序列或蛋白酶。配体结合到细胞外域后，MESA受体二聚化并诱导细胞内蛋白水解裂解，允许转录因子解离以进行下游调节。该方法允许更灵活的传感器设计，不仅限于Notch受体。这个系统最近也被改造为通过分裂蛋白酶或分裂转录因子模式进行信号转导。SynNotch设计已经构建了一系列名为合成内膜蛋白酶受体（SNIPRs）的受体，包含来自除小鼠Notch蛋白外的其他天然受体的域，这些域也可以被内源性蛋白酶裂解。与SynNotch类似，SNIPRs结合它们的抗原并通过解离转录因子来感应细胞和免疫因子。对于SynNotch、SNIPR和MESA，配体结合域和转录因子域的选择使得在使用这些系统时可以定制感应（信号输入）和功能（信号输出）步骤。SNIPR和MESA还丰富了人工受体效应器的可用工程工具。然而，仍然存在一些限制，如高背景信号、非靶向效应、来自小鼠Notch蛋白的免疫原性、人工受体和转录调节因子的大尺寸。需要许多努力来改进这个系统。 受体工程应用通常与CAR-T疗法相关。受体可以被设计为针对两个特定抗原，一个使用SynNotch，另一个通过传统的CAR。在临床前模型中，建立了针对双重抗原表达细胞的T细胞。TEV蛋白酶可以融合到MESA受体上，裂解转录因子以实现功能化。人源化的合成构建可以减少免疫原性并最小化非靶向效应。Zhu等人构建了一个人类SNIPRs的框架，未来应用于CAR-T疗法，防止CAR-T细胞通过非肿瘤信号被激活。除了上述合成受体外，基于相同理念，Engelowski等人设计了一种合成细胞因子受体，通过将GFP/mCherry纳米体融合到天然IL-23细胞内域来感应纳米体。另一种受体工程策略是将受体转导的信号重新连接到新的效应基因。使用与VEGF互补的scFv，工程化受体感应VEGF并释放dCas9蛋白，然后IL-2表达上调。该系统已成功在Jurkat T细胞中探索。 用于糖尿病治疗的HEK-β细胞。β细胞存在于胰岛中，合成并分泌胰岛素。作为哺乳动物唯一的胰岛素合成场所，β细胞通过包括糖酵解和刺激-感应-分泌耦合过程的信号转导途径来感应血糖。胰岛素的分泌包括以下步骤。血糖被输送到β细胞内，通过细胞内的糖酵解代谢，导致细胞膜去极化、能量产生和K+ATP通道关闭，激活钙通道Cav1.3以诱导钙内流和胰岛素颗粒的分泌。糖尿病患者过高的血糖浓度源于1型糖尿病胰岛素产生β细胞的缺乏，或2型糖尿病身体细胞对胰岛素敏感性低。使用基于合成生物学的多重筛选方法，Xie等人将人类肾脏细胞HEK-293工程化，以感应血糖水平进行胰岛素分泌。设计结合了糖尿病治疗中的自动诊断和治疗。研究人员证明，Cav1.3的过度表达为在体细胞中构建类似β细胞的葡萄糖感应模块提供了途径。Cav1.3控制的钙和合成Ca2+诱导型启动子的结合，允许使用调整后的体内转录反应来监测血糖水平。在构建人工HEK-293-β细胞后，通过将细胞植入小鼠腹腔内，这种细胞系HEK-293-β用于葡萄糖反应性胰岛素生产，维持了超过3周的血糖稳态，也在本研究中在1型糖尿病小鼠内3天内自我校正了高血糖。 HEK-293-β细胞的优势是明显的。与灵长类动物胰岛相比，HEK-293-β细胞在稳定1型糖尿病小鼠的餐后血糖代谢方面同样有效。此外，HEK-β细胞更容易在体外培养。预计工程化的人类细胞有望根据当前的制药生产规则和法规，容易、成本效益高且稳健地生产，允许生产具有良好产品纯度、稳定性和质量的即用型商业产品。这种高度创新的工程细胞提高了任何细胞类型都可以通过合理重编程实现定制能力的可能性，如血糖控制。 诱导多能干细胞（iPSCs）在医学应用中的作用。合成生物学还有助于通过过表达某些与去分化相关的基因来生成人类干细胞。其中一种应用是诱导多能干细胞。iPSCs是从体细胞中生成的多能干细胞。由山中伸弥实验室开创，引入包括Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4在内的四个转录因子，将成纤维细胞转变为类似胚胎干细胞（ES）的细胞，这些细胞可以重新分化为血细胞、骨细胞或神经元，用于可能治疗各种组织和器官的损伤。iPSCs不是使用人类胚胎创建的，避免了与ES细胞相比的伦理问题。此外，来自自体体细胞的iPSCs避免了免疫排斥。iPSCs具有自我更新能力，并具有持续的亚培养特性。来自患者的体细胞样本被诱导成iPSCs，能够作为医学研究的无限资源库。已经建立了唐氏综合症和多囊肾病的iPSC细胞系。一个名为StemBANCC的项目呼吁收集iPSC细胞系，用于药物筛选。结合治疗化学物质和iPSC细胞系的各种应用正在进行高通量药物筛选和分析。 iPSCs旨在用于组织再生和疗法开发。可以从iPSCs中衍生出O型红细胞，以满足输血需求。当癌症患者需要大量NK细胞进行免疫疗法时，可以使用iPSCs制造这些细胞，以解决它们的低可用性问题。在小鼠研究中观察到iPSCs的抗衰老效果。iPSCs的化学诱导分化为心肌细胞已被广泛使用。这些iPSC心肌细胞具有与患者衍生的遗传代码相同的特征，允许建立长QT综合征和缺血性心脏病的模型。可以诱导脐带血细胞成为多能干细胞，用于治疗小鼠视网膜功能障碍，重新分化的iPSCs被用来治疗小鼠的脑损伤，治疗后它们的运动能力得到恢复。 iPSCs已成功用于器官再生，例如，体外心肌细胞可以通过山中的方法用于将胎儿心脏再生为正常心脏。可以从包括iPSCs、内皮干细胞和间充质干细胞在内的三种不同的细胞中生成人类“肝脏芽”。生物模拟过程使肝脏芽自包装成一个复杂的器官，用于移植到啮齿动物中。它在药物代谢方面功能良好。 一些iPSC应用已进入临床阶段。例如，大阪大学的一组人员从iPSCs中制造了“心肌片”，将它们移植到严重心力衰竭的患者中，日本的临床研究计划已经获得批准，正在招募患者。此外，中国的两名男性接受了iPSC分化的心肌细胞治疗。据报道他们状况良好，尽管没有透露详细数据。来自六名患者的皮肤细胞的iPSCs被重新编程为视网膜上皮细胞（RPCs），以替换正在进行的I期临床试验中的退化RPCs。类似地，使用自体iPSCs分化的造血干细胞治疗地中海贫血的I期临床试验也在进行中，正在招募患者。 到目前为止，还没有进行过任何与干细胞治疗相关的III期研究。主要关注点是iPSCs的安全性，存在致癌可能性：在注射iPSCs的小鼠中观察到畸胎瘤，低诱导效率，基因组的不完全重编程，免疫原性和载体基因组整合也是令人关注的问题。需要更多的努力用于临床应用。 合成生物学在组织工程中的应用。组织工程旨在修复受损组织并恢复其正常功能。合成生物学在组织工程中的应用可以控制细胞行为。人工遗传构件可以通过重新连接细胞信号来调节细胞功能。作为具有特殊属性的组织工程中的构建块，以实现更智能的功能，合成生物学允许复杂的组织工程用于新的医学研究。 通过过表达功能基因或转录因子，干细胞可以成功分化生成特定组织细胞。这是基于干细胞的组织工程中一种简单而常见的方法。然而，基因过表达缺乏反馈控制机制，以避免过量营养消耗或细胞毒性。例如，抗凋亡因子Bcl-2的持续过表达导致肿瘤形成风险。CRISPR/dCas9生物开关或合成mRNA被发现能够通过时间和空间特异性的基因表达来解决问题。此外，引入感应小分子或细胞表面蛋白的遗传电路已经得到了深入研究，特别是基于四环素抑制子的系统。Gersbach等人设计了一个四环素关闭系统来控制Runx2因子，可以调节体内的成骨过程。Yao等人使用了一个四环素开启系统，在工程化的大鼠软骨细胞中特异性表达Sox9，Sox9是维持软骨细胞活性的关键因子，激活软骨组织中II型胶原蛋白和聚合蛋白的蛋白表达。在植入的细胞支架中注射Dox（四环素系统诱导剂）后，软骨细胞降解被抑制。四环素开启系统也被用于在软骨修复过程中过度表达白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）基因，以调节炎症细胞因子（表2）。四环素开关有助于组织工程中的时间控制基因表达。 表2. 哺乳动物细胞基础治疗中的合成生物学 光遗传诱导系统也用于控制组织工程中的细胞行为。光诱导蛋白能够响应紫外线和远红外光，使光诱导成为可能。通过将光敏感基序融合到特性良好的转录因子中，构建了各种光遗传电路。成功地使用空间特异性基因激活来指导细胞的排列。Sakar等人使用蓝光诱导的通道视紫红质-2实现了组织的动态和区域特异性收缩。光遗传控制工程化的小鼠来源肌肉细胞提供了通过光敏感膜Na+通道和离子诱导的下游元素进行远程基因激活或沉默，用于组织工程。 受到CAR-T细胞成功的启发，G蛋白偶联受体（GPCRs）被工程化以感应人工配体，用于组织工程。Park等人成功设计并使用了GPCR感应氯氮平-N-氧化物（CNO）在原代细胞中控制细胞迁移，响应CNO浓度梯度。这项技术可以成为创伤愈合和细胞再生的宝贵模块。 合成生物学使得将细胞编程到多细胞结构以自组装方式成为可能。Toda等人使用synNotch方法在一群小鼠成纤维细胞中工程化细胞粘附信号，这些细胞根据synNotch受体类型变成了多层并极化。 除了细胞，生物材料在组织工程中也常用作支架和仿生器官。生物材料的自调节特性，响应刺激或化学物质，对基于生物材料的组织工程非常有用。Baraniak等人通过RheoSwitch配体1（RSL1）诱导的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因工程化B16细胞系，RSL1涂覆在聚酯脲烷膜上，允许在膜上激活GFP长达300天。Deans等人在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中构建了一个异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的Lac-off系统，IPTG被封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架或PEG珠子中，并以可持续的方式释放。报告基因显示，在小鼠模型中，通过背部皮下植入，诱导持续了10天以上，GFP荧光水平被观察到受其位置的控制。空间诱导的基因表达调控已成为许多应用中的概念验证，如软骨修复和体内3D细胞支架。 总之，生物回路的表达可以为组织工程生成功能化的细胞。多种合成生物学设计，例如时间和空间依赖的基因表达、诱导和自调节系统以及智能生物材料，在这一领域都是可用的。尽管最先进的发展仍然存在许多障碍，将真正的合成组织真正地应用到临床，但至少为未来的研究奠定了一些基础。 2.2. 工程化细菌细胞在治疗应用中的作用 合成生物学方法促进了基因工程细菌作为新型活体治疗剂的开发（图2）。包含合成基因回路的细菌可以控制细菌治疗活动的时机、定位和剂量，感应特定的疾病生物标志物，从而开发出一种强大的新方法来对抗疾病。基于合成生物学的工程方法允许将活细菌细胞与独特的治疗功能编程，提供灵活性、可持续性和可预测性，为传统疗法提供新的设计和工具包。这里介绍了一些进展，包括能够感应和转导来自细胞内或细胞外生物标志物信号的基因回路的工程化细菌细胞，以及基于这些信号通路的治疗和诊断。基于细菌细胞的活体治疗和诊断的概念是快速增长的策略，为有效治疗各种人类疾病提供了希望。 工程化细菌细胞在癌症诊断和治疗中的应用。一些厌氧/兼性厌氧细菌细胞是肿瘤治疗的良好候选者。它们可以靶向肿瘤的厌氧微环境，它们还具有诱导肿瘤溶解和触发炎症的能力，有助于对抗实体瘤。工程化微生物可以成为癌症体内诊断的合适工具。Danino等人将含有LacZ报告基因的大肠杆菌工程化，当细菌与肿瘤细胞接触时，产生LacZ。随后，小鼠被注射了LacZ的化学发光底物（表3）。尿液中的发光在富含时呈现红色。该方法比显微镜更敏感，可以检测到小于1厘米的肿瘤。同样，Royo等人构建了一个由水杨酸诱导的回路，将5-氟胞苷转化为毒性产物，用于杀死肿瘤的减毒沙门氏菌。注射沙门氏菌后，沙门氏菌在肿瘤组织中定位，通过额外提供水杨酸（诱导剂）和5-氟胞苷（底物），肿瘤细胞通过细菌细胞形成5-氟尿嘧啶而被消除。 表3. 微生物基础疗法中的合成生物学 为了提高基于细菌的癌症治疗效果，一些研究旨在进一步提高细菌对肿瘤的趋向性。一些细菌对实体肿瘤的厌氧环境具有天然亲和力，如大肠杆菌或减毒的霍乱弧菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。然而，这种亲和力对于靶向治疗来说还不够，体内的细菌细胞仍然普遍分散。通过引入合成表面粘附素，可以增强与肿瘤特异性分子（如新抗原）或其他在癌细胞中富集而不是在体细胞中积累的化学物质或蛋白质的结合。粘附素工程已被证明在增强细菌对肿瘤的反应方面是有效的。粘附素是具有细胞外免疫球蛋白结构域的膜展示蛋白，可以通过库定向进化筛选进行工程化。Piñero-Lambea等人在大肠杆菌中构建了一个构成型遗传回路，其中包含一个人工粘附素，靶向绿色荧光蛋白（GFP）作为概念验证的证据，证明了工程化细菌细胞膜与GFP表达的HeLa细胞的结合在体外和小鼠中都成功。重要的是，这种工程化细菌的静脉注射到小鼠体内，在HeLa细胞的异种移植实体瘤中实现了有效和高效的定植，剂量比表达不相关对照粘附素的细菌株或野生型菌株低100倍，表明类似的工程化细菌可以用来在低剂量和边际潜在系统基础毒性的情况下将治疗剂运送到肿瘤。然而，很少有针对肿瘤的细菌进入了临床阶段。兼性厌氧的鼠伤寒沙门氏菌VNP2000已经在临床前研究中进行了安全性工程化，并具有抗肿瘤能力，但在I期临床试验中失败了，因为其抗肿瘤效果边缘化和剂量依赖的副作用。一些其他基于细菌Clostridia novyi-NT或Bifidobacterium longum APS001F的临床研究正在进行或招募进行I期试验。 工程化细菌细胞在糖尿病诊断和治疗中的应用。细菌已被工程化以检测糖尿病的葡萄糖浓度。Courbet等人描述了一种在人类尿液样本中感应异常葡萄糖浓度的方法。他们将细菌传感器封装在水凝胶珠中，尿液中的葡萄糖将珠的颜色变为红色。体外细菌血糖仪发现，尿液试纸的检测限低了一个数量级。 一些蛋白质和肽在工程化肠道细菌中生物合成，用于糖尿病治疗。工程化益生菌L. gasseri ATCC 33323产生GLP-1蛋白，细菌口服给糖尿病大鼠，证明了血糖水平降低到33%。同样，工程化L. lactis FI5876被重建为在高葡萄糖浓度条件下生物合成并递送肠促胰岛素激素GLP-1以刺激β细胞分泌胰岛素。结果表明，高脂饮食小鼠的葡萄糖耐量得到改善。工程化益生菌L. paracasei ATCC 27092被设计为分泌血管紧张素（1-7）[Ang-(1-7)]，增加Ang-(1-7)（一种抗炎、血管舒张和血管生成肽类药品）的浓度，并减少了糖尿病小鼠视网膜和肾脏的副作用，因为口服细菌后胰岛素产量增加。按照设计，口服工程化B. longum HB15产生穿透素（一种具有增强胰岛素递送能力的细胞穿透肽），和GLP-1融合蛋白也增强了结肠中GLP-1的产生。L. paracasei BL23也成功设计为通过将GLP-1与肽聚糖锚蛋白PrtP融合，将单体GLP-1类似物展示在细菌膜上，工程化细菌增强了糖尿病大鼠的血糖控制。然而，效果仍然有限，需要进一步研究。除了GLP-1，一些其他蛋白质，如免疫调节细胞因子IL-10和人类胰岛素原，同时被引入到工程化L. lactis MG1363中，与低剂量系统性抗-CD3的联合治疗允许逆转非肥胖糖尿病小鼠中失调的自身免疫触发的糖尿病。这个设计可能对人类1型糖尿病的治疗有效。 工程化细菌细胞在胃肠道疾病的诊断和治疗中的应用。益生菌可用于治疗炎症性肠病（IBD）。IBD 是消化道组织慢性炎症，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。患者遭受腹泻、疼痛和体重减轻的折磨。合成生物学方法和理念帮助细菌获得了对抗胃肠道疾病更强大的能力。Praveschotinunt 等人设计了一种工程化的大肠杆菌 Nissle 1917（EcN），它能产生胞外纤维基质，增强肠道粘膜愈合能力，以缓解小鼠的 IBD。通过将卷曲蛋白（CsgA）与三叶因子（TFF）结构域融合，促进细胞表面重建，细菌能够通过修饰的卷曲蛋白的原位蛋白自组装产生纤维基质。结果表明，设计的 EcN 显著抑制了促炎细胞因子的产生，缓解了小鼠的体重减轻，维持了结肠长度，证明了其在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的急性结肠炎小鼠模型中的抗炎能力。该设计可扩展为基于益生菌的 IBD 治疗的通用方法。 细菌工程化后可望直接消除病原体，预防消化道传染病。铜绿假单胞菌是一种常见的多重耐药病原体，难以治疗。工程化的 EcN 已被用于检测、预防和治疗 P. aeruginosa 引起的肠道感染。设计的 EcN 能够感应 P. aeruginosa 产生的生物标志物 N-酰基高丝氨酸内酯，并且自溶释放生物膜降解酶分散素和 pyocin S5 细菌素，以消除肠道中的病原体。此外，重新编程的细菌显示出长达 15 天的预防 P. aeruginosa 的能力，并且在小鼠模型中比治疗已建立的感染更有用。3-羟基丁酸（3HB）是具有治疗结肠炎效果的人类酮体成分。Yan 等人构建了一个过表达 3HB 生物合成途径的 EcN。与野生型 EcN 相比，工程化大肠杆菌在小鼠体重、结肠长度、潜血水平、肠道组织髓过氧化物酶活性和促炎细胞因子浓度方面显示出更好的效果。然而，这些研究是小鼠中的初步结果，尚未进入临床试验。需要进一步努力以评估它们在人类中的应用。 工程化细菌细胞在代谢紊乱中的应用。工程化肠道微生物也已被用于针对代谢紊乱。设计了大肠杆菌来治疗肥胖，在高脂饮食的小鼠中合成厌食脂质前体。一些努力通过活细菌降解在患者中积累的有毒化合物。Kurtz 等人设计了大肠杆菌 Nissle 1917 菌株，在肠道中将氨转化为 L-精氨酸，减少系统性高血氨症，在小鼠和猴子模型中。Isabella 等人重新编程大肠杆菌 Nissle 1917 以过表达苯丙氨酸降解途径，以代谢苯丙酮尿症（PKU）患者中过量的苯丙氨酸。在 Pahenu2/enu2 PKU 小鼠模型中，口服工程化细菌显著降低了血液中苯丙氨酸浓度 38%。 酒精性肝病是肝病的主要原因，普遍危及重度饮酒者的健康。工程化的枯草杆菌和乳杆菌可用于表达乙醇降解途径（酒精脱氢酶和乙醛脱氢酶），以解毒酒精并减轻酒精过量摄入引起的肝损伤。此外，在慢性饮酒期间，胃肠道中的凝集素再生胰岛衍生 3 γ（REG3G）蛋白减少。乳杆菌 reuteri 被设计为过表达白细胞介素-22（IL-22）基因，这增加了肠道中 REG3G 的丰度，减少了使用酒精性肝病小鼠模型的炎症和肝损伤。 合成生物学方法已允许构建和设计工程化活体生物治疗剂。许多案例针对未来的临床应用。这里讨论的示例表明，随着电路设计和微生物宿主理解的发展，研究人员可以构建活体生物治疗剂，以精确、系统、可诱导和稳健的方式发挥作用。然而，仍需付出许多努力以降低细菌毒性并增加体内可控性。 3. 合成生物学在新兴治疗材料的制造中 除了工程化细胞外，工程化纳米材料也在医疗领域中得到广泛应用。纳米生物技术旨在解决重要的生物学问题，如基于其独特的物理、化学和生物学性质的微纳尺度材料的药物递送、疾病诊断和治疗（图4）。纳米材料具有独特的机械、磁性和电子性质，能够响应外部信号，控制其下游电路。然而，传统的纳米材料是通过物理和化学过程产生的，溶剂和修饰分子经常引起生物安全问题。最近，生物纳米材料在合成生物学的指导下得到了发展，展现出其在环保、增强生物相容性和生物活性以及低组织毒性方面的优势。基于合成生物学的概念和方法，基因工程细菌、酵母和烟草花叶病毒（TMV）可以作为纳米材料的生物工厂。哺乳动物细胞衍生的囊泡和纳米颗粒具有适宜的生物相容性，也常用作纳米药物。生物材料可以在合成生物学的帮助下进行构建和工程化，扩大其在现代疾病治疗中的应用场景。 图4 合成材料生物学中的设计与应用。通常，构建一个遗传电路来合成生物材料或感应环境。工程化细菌被赋予了新的特性，如颜色变化和独特的表面特性。具有细胞外基质的细胞应用多样，包括磁场诱导治疗、新型药物载体的开发或通过复杂的生物制造过程进行健康监测。 3.1.合成生物学在人工细胞器中的应用 遵循合成生物学的原则，生物催化或触发感应模块的纳米颗粒可以被加工成自组装细胞器，这些细胞器模仿活细胞的特征，如酶反应的分隔和刺激响应（图4）。这种设计还为构建人工细胞提供了新的输入。此外，人工细胞器与工程化活细胞载体的结合，包括CAR-T细胞和工程化细菌，纳米活体混合系统可以发挥其双重效应，以增强治疗效果或更严格地控制人工系统。 聚合物体是由两亲性聚合物制成的人工空心囊泡，用作人工细胞器的外壳。van Oppen等人使用了一个聚合物体系统，其外膜上锚定了细胞穿透肽。人工细胞器内部含有过氧化氢酶，允许降解外部活性氧分子，作为合成细胞器，保护细胞免受H2O2触发的活性氧损伤，这在人原代成纤维细胞和人胚肾细胞中显示出摄取能力。一个类似的设计依赖于聚合物体配备了两种酶和相关的跨膜通道，被用来模拟细胞过氧化物酶体。这些细胞器能够处理H2O2和超氧自由基。结果进一步证明了具有过氧化氢酶活性的人工细胞器的可行性。基于类似的想法，工程化聚合物体可能在治疗帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、代谢疾病、癌症和无过氧化氢酶症等医疗状况中发挥作用，通过在人工细胞器内装载各种治疗蛋白。 此外，纳米生物技术和合成生物学的融合可能实现新功能。首先，研究人员可以通过遵循“封闭”原则组装纳米颗粒来创造“人工生命”。这个想法可以应用于使用无机支架和纳米颗粒内部的核酸和蛋白质构建生物组件。“自上而下”的原则，或为实际需求工程化自然细胞，可以作为使用纳米材料在活细胞中的指导，以增加特定医疗应用中的稳健性、稳定性和灵敏度。 3.2.构建纳米颗粒介导的遗传电路 通过内部环境刺激实现自动响应，可以诱导遗传开关开启/关闭（图4）。然而，遗传开关的不可逆情况是一个常见且难以解决的问题。为了规避遗传结构的弱点，纳米颗粒被用来感知体内信号并进行转导。光、声、热和磁刺激对纳米颗粒来说容易响应，它们可以用作实体肿瘤和糖尿病治疗的诱导系统。然而，物理刺激的空间特异性诱导很难实现。总体而言，通过结合遗传传感器和纳米颗粒的优势，通过引入纳米颗粒进行信号转导，将物理刺激转换为具有特定输入信号的遗传开关是可行的，并且通过这种方式实现了基因表达的时间空间控制。 近红外（NIR）光响应基因电路对于体内治疗应用是可行的，因为它们更好的NIR光传输能够穿透组织并降低毒性。NIR感应蛋白在植物和细菌中被发现，如细菌光敏色素（BphPs）。然而，NIR感应蛋白通常亮度较低。此外，缺乏结构信息阻碍了它们的合理工程化。为了规避NIR光响应蛋白的缺点，研究人员使用纳米材料将NIR光转换为可见光。例如，Chen等人使用掺杂了镧系元素的纳米颗粒将980 nm NIR光转换为可见光，控制小鼠模型中表达光敏蛋白的神经元的遗传门。另一种设计使用等离子金纳米棒或光热响应纳米颗粒将NIR光转换为温度上调，然后热休克蛋白的启动子被激活以进行下游基因表达。纳米颗粒的一个缺点是它们必须注入人体，这可以通过开发基因工程化纳米颗粒来解决。类似于磁遗传学，生物合成的铁蛋白可以用作准备外源顺磁性纳米颗粒的工具。然而，这些样品的穿透深度需要大大改进（不到1厘米），这不足以满足人类细胞治疗应用的需求。一些研究人员将光产生微设备与光敏感工程治疗细胞配对来解决这个问题（图4），患者可以通过自己的智能手机应用程序控制药物释放或实时监测他们的健康状况。此外，一些遗传编码的发光模块可以在现场产生光，使用各种荧光素酶等蛋白质，所有这些都在相应的底物下发出所需的波长。体内光诱导光敏感蛋白触发定制需求的转基因表达。 除了光遗传学，磁遗传学也出现了，用于调节细胞活动，并已应用于远程和非侵入性控制纳米材料治疗（图4）。磁场可以穿透人体而无损失，这是深层组织靶向治疗的首选特征。以前的磁遗传学工具主要是外部注射的磁性纳米颗粒。纳米颗粒通常半径小于10纳米，无毒且水溶性。使用远程磁场加热纳米颗粒可以激活细胞中的温度敏感阳离子通道。下一代工具是在工程化细胞中异源表达受体靶向铁蛋白蛋白，以纳米颗粒（铁载颗粒）的形式，这些可以感应并转导磁性信号到细胞膜锚定受体，如瞬时受体电位通道1（TRPV1）或TRPV4。膜受体是允许钙离子流入的离子通道，具有磁刺激。所述基因电路可以被操纵以控制NFAT依赖的转录调节因子，用于下游功能基因。植入的工程治疗细胞可以在磁场下实现目标特异性治疗和精确控制治疗剂量、时间和位置。 然而，磁性激活传感器通道的机制仍然不清楚，长期以来提出的理论一直存在争议。TRPV通道被各种信号激活，包括但不限于机械力和热量。最近，提出了一种新机制来解决射频弱磁场（1 mT）如何触发带有铁蛋白锚定的TRPV通道的活细胞中的瞬态响应的问题。机制是铁蛋白蛋白中游离Fe3+的解离，导致通过增加活性氧（ROS）的产生来增强膜脂的氧化。这些氧化脂质有能力激活TRPV通道，导致钙离子内流。最近，ROS被报道参与了在2型糖尿病小鼠中结合电场和静态磁场治疗的研究，以增加它们的胰岛素敏感性。在这项研究中，低能场可以诱导表达核因子红细胞2相关因子2（Nrf2），这是一种控制ROS水平的转录调节因子。此外，局部ROS积累在小鼠中没有副作用，通过电磁场介导的氧化还原状态诱导基因表达是有希望的。磁遗传学在远程控制和靶向治疗方面展现出潜力。然而，需要更多的努力来建立磁遗传平台。尽管近年来有所改进，细胞毒性和生物相容性是磁性纳米颗粒的两个主要障碍，仍然挑战它们在体内的应用。 3.3.合成生物学在药物递送中的应用 合成生物学构建物通常被封装在载体中，以实现其在体内的功能。病毒载体的安全性问题限制了它们在编辑人类基因组中的应用。因此，非病毒载体越来越受到关注。纳米技术可以帮助递送治疗剂，包括遗传电路和基因组工程工具。随着纳米技术的进步，有更多的选择可用于DNA/RNA递送系统的靶向和可控释放。 其中一个例子，基于脂质体纳米材料的DNA/RNA递送系统，已成为一种有效且有潜力的基因疗法方法，有多种人工脂质载体被批准用于临床用途。例如，由Alnylam Pharmaceuticals开发的RNAi治疗剂Onpattro。该药物于2018年获得批准，用于治疗多发性神经病。脂质体是小的脂质囊泡，大小在50纳米和1微米之间。脂质体通常是两亲性的，由疏水尾部和亲水头部组成，用于在各种治疗中递送药物。由于脂质体降低药物毒性，通过特异性注射直接将药物递送到目标，并通过封装药物免受降解，它们在递送方面比传统药物治疗具有优势。CRISPR/Cas9辅助的基因疗法通常使用基于脂质的纳米颗粒，通过静电相互作用将带负电荷的mRNA、gRNA支架和CRISPR基因与带正电荷的脂质体整合。Felgner等人首次设计并使用脂质体，通过将DNA封装并递送到质膜中的目标哺乳动物细胞，导致其内吞后DNA表达。脂质体载体不仅帮助治疗DNA通过细胞膜屏障，而且保护它们免受DNase降解和免疫反应，以维持它们的活性。部分受到脂质体可以应用于人类治疗的启发，脂质体还作为疫苗将编码SARS-CoV-2抗原的mRNA递送到人类。Moderna mRNA-1273和BioNTech/Pfizer BNT162b2疫苗都被封装在脂质体中，并获得了它们的临床使用批准。 纳米技术也可以帮助合成生物学递送化学物质。纳米载体递送化学物质最小化了非靶向效应，与传统药物递送相比，增强了治疗效果。外部物理刺激也可以启动化学物质的释放，使系统可持续和可控。这里，我们讨论合成生物学引导的生物化学载体的应用。 遗传编码的翻译后修饰蛋白可以自组装携带疏水药物。具有不同结构和材料性质的蛋白质可以在氨基酸序列水平上轻松操纵。基于合成生物学方法，Mozhdehi等人设计并共表达了大肠杆菌中的弹性蛋白样多肽和N-肉豆蔻酰转移酶。 N-肉豆蔻酰转移酶酶在细菌中修饰多肽，生成肉豆蔻基团，产生温度诱导的自组装行为。纯化的重组蛋白的脂质核心可以携带疏水化合物，延长药物半衰期。该蛋白可以形成复杂的组装系统，包裹化学物质。Li等人使用设计好的阳离子嵌合体近红外荧光蛋白和阴离子羧基末端PEG，准备蛋白质-PEG纳米载体。纳米蛋白是两亲性的，导致在水溶液中聚集和相分离形成纳米颗粒。工程化纳米颗粒实现了体内实体肿瘤和转移的成像，无需转染即可利用蛋白质的荧光特性，同时，纳米蛋白作为长期药物载体，可以显著提高IL1-Ra的半衰期和治疗效果。 3.4.工程化细菌外膜囊泡（OMVs）作为纳米载体 细菌外膜囊泡（OMVs）是来自革兰氏阴性细菌外膜的脂质球，它们可以用于将生化物质运输到环境中的其他细胞。合成生物学的基因操作方法可以提高生物起源纳米颗粒的能力，扩大外膜囊泡（OMV）和工程化细胞的应用场景。 带有重组蛋白的工程化OMVs潜在地用于医疗和临床领域（图4）。在OMV工程中表面展示蛋白的一般策略是在OMV表达系统中将它们的基因融合在一起。许多研究已经使用大肠杆菌溶素A（ClyA）蛋白作为融合载体，将外源蛋白锚定到OMV膜上。最近的研究表明，ClyA已成功融合到炭疽杆菌保护性抗原的域4、流感A病毒基质蛋白2（M2）的细胞外域以及GFP上，而不影响OMV形成。另一种策略是将蛋白表达到周质中，并在融合步骤妨碍蛋白功能时组装到OMV中。然而，异源蛋白被包裹在OMV内部，这是策略的主要缺点。 Bartolini等人还使用该方法将沙眼衣原体蛋白HtrA携带在OMVs中，作为针对沙眼衣原体感染的疫苗。一些链球菌蛋白使用大肠杆菌OmpA信号肽表达到周质中，并将它们打包到OMVs中。即使这些蛋白位于OMV内部，它们也能够激活免疫反应，在小鼠模型中产生的IgG抗体对特定病原体具有很强的活性。结果表明，抗原位置不是OMV诱导的免疫反应的决定性因素。 除了蛋白质，OMVs可以被工程化以携带化学物质。LPS和装饰在病原体细胞膜上的荚膜多糖（CPS）也是疫苗候选物。然而，多糖除了T细胞外还能触发免疫反应，无法建立免疫记忆。为了规避这个问题，将多糖锚定到纳米载体上以引发免疫记忆。多糖和荚膜合成基因在大肠杆菌中表达，使用上述方法打包到OMVs中。设计的OMVs经过进一步优化后，可用作疫苗。Chen等人使用了弗朗西斯杆菌O-抗原多糖，基因在大肠杆菌中异源表达，产生糖基化修饰的OMVs。注射工程化OMVs的小鼠对弗朗西斯杆菌菌株具有保护作用。另一个类似的设计使用肺炎链球菌CPS（Sp-CPS）生物合成基因。它们在大肠杆菌中过表达，位于工程化OMVs和细菌细胞的膜上。注射这些收集的OMVs进行疫苗接种后，疫苗在吞噬作用测定中有效，并且针对Sp-CPS触发了IgG抗体。总的来说，合成生物学方法已经开发了更好的工程化OMVs用于免疫疗法，在药物靶向递送和联合治疗方面前景光明。 3.5.生物模拟医用粘合材料 传统的医用粘合材料在水下使用受到限制，这限制了它们在体液中的应用。最近，基于合成生物学理念，进行了一些生物模拟设计来解决这个问题（图4）。许多海洋生物（例如贻贝和藤壶）具有非凡的粘附能力，能够粘附在岩石表面， 这是因为它们产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA），作为水下表面粘附蛋白的重要组成部分。Zhong等人报道了通过融合CsgA菌毛蛋白和贻贝足蛋白制造出一种强大的水下粘合剂。这种出色的设计结合了生物相容性和粘附活性，有希望用于体内应用，如组织修复。Zhang等人受到骨骼和贻贝足等天然生物材料的启发，他们开发了一种基于Bacillus spp.胞外基质的活性胶。这种活材料具有粘附性和再生能力。工程化哺乳动物细胞可以构建具有粘附蛋白，作为体内活功能胶。如上所述，新型活医用生物医学粘合剂是医学合成生物学的热点。然而，大多数研究集中在材料属性上，而不是它们的生物相容性和生物可降解性，需要充分的努力来推动材料用于临床应用。 3.6.医学应用中的基因编码点击化学 受点击化学启发，为建立蛋白质-蛋白质链接，工程化了异肽键。与传统点击化学相比，基因编码点击化学在活体生物中更适用。SpyTag/SpyCatcher系统是革兰氏阳性菌毛中天然类似点击反应的应用，使用生物学方法在氨基酸之间形成稳定的化学键，在点击化学导向的蛋白质中不需要额外修饰生物大分子（图4）。基因编码点击化学（或Spy化学）是通过合成生物学制造材料的强大工具。 水凝胶是交联的亲水聚合物网络，由于其生物相容性和类似细胞外基质（ECM）的属性，作为生物大分子和干细胞的载体。通过化学聚合合成的水凝胶材料面临生物活性问题。蛋白质特性由氨基酸序列决定。蛋白质水凝胶更容易使用不同的DNA序列进行合成和控制。Yang等人利用SpyTag/SpyCatcher系统合成了一种四臂星状光敏蛋白。该蛋白质可以分别响应AdoB12和光迅速形成溶胶-凝胶和凝胶-溶胶相变。生物膜降解糖苷水解酶PslG可以封装到水凝胶中，赋予材料对抗慢性感染中多重耐药细菌的能力。Sun等人设计了一个含有多个SpyTags和SpyCatchers的Spy网络，包含在弹性蛋白和白血病抑制因子中。这些蛋白质变成了一种高强度水凝胶，允许小鼠胚胎干细胞在不添加其他细胞因子的情况下保持多能性。 基因编码点击化学也在疫苗开发中使用。一些设计蛋白可以自组装成类似病毒颗粒（VLPs），以在表面展示抗原，模仿病原体。合成疫苗因其效率和安全性而越来越受到关注，与传统的死菌或减毒微生物疫苗相比。基因编码点击化学是修改表面以增强免疫原性的有用方法。基于Spy化学的化学键容易形成，为设计合成疫苗提供了定制和方便的方法，通过编码蛋白自组装。Liu等人使用SpyCatcher/SpyTag化学通过共价连接特定抗原和化学物质开发了一种合成疫苗。结果表明，这种工程化疫苗成功地靶向了树突状细胞。产生的蛋白质-化学混合疫苗保持了各自的功能，并具有触发B细胞和T细胞反应的能力。Brune等人通过在材料表面展示SpyCatcher，进一步使VLPs与SpyTag表达的疟疾抗原结合，开发了新的疫苗。VLP-抗原疫苗可以通过仅一次免疫迅速有效地触发免疫反应，表明这种有效、简单、模块化的修改方法的潜力。 3.7.医学和制药应用中的遗传密码扩展 一种蛋白质通常由20种天然氨基酸组成。为了将非典型氨基酸（ncAAs）添加到蛋白质中，已经开发了遗传密码扩展技术。ncAAs可以通过与肽或化学物质的结合来修饰蛋白质，根据实际需求。使用终止密码子（UAG/UGA/UAA），异源生物正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）-tRNA对可以将ncAAs添加到蛋白质的任何位点。已经开发了许多不同的aaRS/tRNA对。高效的遗传密码扩展装置允许生产含有ncAA的蛋白质和多个插入ncAA的蛋白质。ncAA插入在所有主要模型生物中都已成功。遗传密码扩展系统在医学领域的应用在这里总结。 遗传密码扩展用于抗体-药物偶联物。抗体-药物偶联物（ADC）结合了抗体的抗原识别能力和化学物质的肿瘤杀伤能力，通常用于肿瘤治疗。传统的ADC药物是抗体中半胱氨酸或赖氨酸的化学修饰，这可能会影响免疫原性、稳定性和半衰期。随着遗传密码扩展技术的发展，抗体中引入功能性ncAA是可行的。抗体和化学物质之间的位点特异性、高效共轭是可以实现的。Oller-Salvia等人开发了一种新的遗传密码扩展系统，将赖氨酸的环丙烯衍生物并入抗体中。抗体通过快速Diels-Alder反应与单甲基auristatin E (MMAE)偶联。得到的ADC在血清中稳定有效。Wang等人使用遗传密码扩展方法将Lck抑制剂dasatinib偶联到单克隆抗体CXCR4上。ADC避免了化学修饰过程中的副反应。得到的dasatinib-抗体偶联物以低EC50抑制T细胞激活，对细胞活性影响可忽略不计。 遗传密码扩展在双特异性抗体中的应用。双特异性抗体（BsAb）具有两个特定的抗原结合位点，具有增强的杀伤肿瘤能力。一些BsAb已经获得FDA的批准。传统的BsAb生产方法依赖于蛋白质的融合，导致配体结合域的立体位阻。此外，抗体的产量低，半衰期短。通过化学修饰合成BsAb会遇到与ADC生产类似的问题。遗传密码扩展方法可以通过PEG链接剂将两个抗体偶联起来，以规避这些挑战。Kim等人在抗HER2和抗CD3抗体的抗原结合片段Fab区域引入了一个非典型氨基酸（pAcF），通过两步反应形成BsAb。BsAb在皮摩尔浓度下诱导体外效应细胞介导的细胞毒性。利用含四嗪的非典型氨基酸和含双环庚炔的非典型氨基酸之间的Diels-Alder反应，开发了一种靶向BCMA的BsAb，用于治疗多发性骨髓瘤，成功克服了多发性骨髓瘤患者的耐药性。 遗传密码扩展用于工程化腺相关病毒（AAV）。AAV是人类和灵长类动物的小病毒。AAV通常用于基因治疗，以实现非致病性、宿主范围广和高转染及表达效率。然而，它们的可控性和靶向能力有限，限制了它们的应用。Zhang等人使用遗传密码扩展技术增强了AAV的靶向能力，将环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD）偶联到AAV的壳蛋白上，以靶向整合素。Erickson等人工程化AAV以实现感染的光控制。AAV2的vp1蛋白中的R585和R588残基被替换为光敏感的非典型氨基酸，这阻碍了vp1和HSPG蛋白的相互作用，从而抑制了AAV的感染。暴露于UV光会移除光敏基团，恢复AAV的感染能力。该方法提高了AAV载体的时间空间可控性。 遗传密码扩展用于延长蛋白质半衰期。PEG通常用于延长治疗蛋白的半衰期。然而，随机修饰的PEG通常会影响治疗剂的结合位点。因此，遗传密码扩展在修饰蛋白质方面可能具有优势。Cho等人使用遗传密码扩展在人类生长激素中位点特异性地修饰PEG，这种激素在临床应用中非常不稳定。修饰后的生长激素在生产过程中也具有良好的批次重复性。一些非典型氨基酸本身可以增加蛋白质的稳定性。Xuan等人证明将反应性异硫氰酸酯基团并入蛋白质可以提高肌红蛋白的热稳定性。类似地，使用长链含硫或氟化非典型氨基酸的设计也得到了验证。 遗传密码扩展用于开发新型疫苗。非典型氨基酸为潜在的疫苗候选物提供了广泛的抗原修饰。Gauba等人在小鼠TNF-α蛋白中插入含有硝基苯基的非典型氨基酸，即使有佐剂也能引起强烈的抗体反应。含有非典型氨基酸的基因修饰生物（GMO）对疫苗开发很有用。灭活或减毒病原体基疫苗通常效果降低。构建依赖非典型氨基酸存活的GMO菌株以放大活病毒疫苗。通过在流感A病毒、HIV-1或乙型肝炎病毒的基因组中引入终止密码子，病毒只能在具有特定aaRS/tRNA对和非典型氨基酸的工程细胞中复制。Si等人在流感A病毒的NP蛋白中插入了终止密码子，导致更强的免疫原性并触发更广泛的免疫反应。基于相同理念，越来越多的活细菌疫苗正在开发中。然而，与病毒相比，细菌更为复杂。许多突变机制可以帮助细菌逃脱表达终止。终止逃逸限制了遗传密码扩展在细菌中的进一步应用。Mandell等人构建了一种细菌，代谢上依赖于非典型氨基酸生存。这种细菌表现出前所未有的抗进化逃逸能力，为活细菌疫苗的开发提供了线索。 遗传密码扩展的其他医学应用。遗传密码扩展技术可以应用于构建可控的CAR-T细胞。将p-叠氮苯丙氨酸（pAzF）并入Fab中，允许识别和偶联荧光素异硫氰酸酯（FITC），激活抗体进行癌症治疗。将诱导剂FITC改为短肽在癌症治疗中也证明是可行的。FITC或肽被用作CAR-T细胞的诱导剂，为免疫疗法提供了更安全控制的方法。遗传密码扩展也已应用于肽类天然产物的生物合成。Nisin是一种具有广泛抗细菌活性的复杂兰肽。Zambaldo等人将多种非典型氨基酸引入nisin中，赋予其新的大环拓扑结构和增强的活性。 遗传密码扩展方法正在快速发展，体内和位点特异性地修饰蛋白质。这种方法最复杂的生物是斑马鱼和小鼠。该方法应该改进，以应用于更多的高等物种。尽管已有200多种不同的非典型氨基酸用于遗传密码扩展，但大多数非典型氨基酸基于相似的结构单元。丰富结构类型是发展的另一个方向。未来，遗传密码扩展技术将为人类带来更多精细的治疗方法。 4.合成生物学在治疗药物的生物合成中 近年来，合成生物学方法在药物的可持续和成本效益生产中展现出前景。合成生物学设计（图5）构建了包括细菌、酵母、细胞培养或整个植物在内的生物电路或底盘，用于有效生产高附加值的制药产品或制药中间体。它提供了一种可扩展且可持续的生产生物产品的方式，使用基于CO2的基质，生产过程快速且稳健，适用于大规模工业生产，可以在不过度种植和收获药用植物的情况下生产生物产品（表1）。 表1. 生物合成药物的应用和产量 作为合成生物学的一个经典领域，药物合成与其他医疗应用不同。它通常使用酵母或细菌作为生产底盘。合成生物学概念在微生物中得到广泛应用，特别是DBTL（设计-构建-测试-学习）（图5）。DBTL循环包括最初的分子生物学设计和构建，实验结果为新的设计周期提供基础。单细胞系统比哺乳动物细胞更容易操作，在哺乳动物系统中，DBTL周期可能很长，这也是哺乳动物合成生物学的障碍之一。在药物的微生物合成中，高通量筛选和定向进化常用于加速实验步伐。微生物中的合成生物学在某种意义上指向了哺乳动物合成生物学的发展方向。 图5 合成生物学中常用的技术。为了推动细胞工厂构建的设计-构建-测试-学习循环，已经开发了各种合成生物学方法和工具，这些技术正在改革合成生物学在医学应用中的使用。路径设计是第一步，通过构建的遗传电路获得初步结果。在下一轮测试之前需要进行一些优化，并且从初步数据中更好地理解系统的特性。设计-构建-测试-学习循环是提高合成生物学系统稳健性和有效性的迭代过程。 4.1.萜类药物的生物合成 萜类化合物是5碳化合物异戊二烯衍生物，也是植物次级代谢产物中最大的一类，约占已鉴定天然产物的60%。它们中的许多是具有生物活性的医疗成分。抗疟药青蒿素是一种含有内过氧化物桥的倍半萜内酯。最初，青蒿素从植物青蒿中提取，含量非常低（0.01%-1%），远低于实际医疗需求。通过化学途径合成青蒿素是困难且效率低下的，主要是由于该分子的多个手性中心。微生物合成青蒿素前药降低了药物成本。合成 amorpha-4,11-diene 是合成生物学中的一个里程碑。最初重组大肠杆菌合成的量仅为24µg caryophyllene equivalent/ml。9经过持续优化，另一种青蒿素前药，即青蒿酸，通过工程化酵母生产，产量达到了25 g/L。青蒿酸的生物合成是合成生物学成功的一个例子。 紫杉醇是一种从太平洋紫杉树中提取的二萜，用作抗癌剂。其生产主要依赖于费力且效率低下的植物细胞培养。Ajikumar等人通过工程化大肠杆菌细胞生产紫杉醇前体taxadiene，产量为1 g/L。人参皂苷是存在于人参属植物中的三萜皂苷，具有预防癌症和抗衰老作用。利用酵母细胞工厂，合成了包括人参皂苷Rh2和人参皂苷化合物K在内的各种人参皂苷，产量分别为2.2 g/L和5.0 g/L。微生物方法减少了人参皂苷用于临床的短缺。 4.2.生物碱类药物的生物合成 生物碱是一类至少含有一个氮原子的有机化合物。作为天然产物，生物碱通常因其具有药理活性而被使用。生物碱的生物合成绕过了种植某些植物（如罂粟和大麻）的禁令。在生物合成过程中形成的手性中心也使大多数手性生物碱化合物的化学合成相形见绌。Galanie等人利用工程化酵母细胞生产thebaine和hydrocodone。过表达21个基因（用于thebaine）或23个基因（用于hydrocodone）导致它们的产量分别为6.6 × 10^−5 g/L和3 × 10^−7 g/L。Nakagawa等人改进了使用大肠杆菌底盘的过程。324thebaine和hydrocodone的产量分别提高到2.1 × 10^−3和4 × 10^−5 g/L。阿片类药物的生产达到了毫克级。需要进行后续的代谢工程以促进生物合成的阿片类药物满足市场需求。 类似青蒿酸的生物合成，大麻素是大麻中的天然产物，通常用于止痛和抗焦虑作用。(S)-四氢棕榈酸和cannabigerolic acid是两种难以从植物中提取的著名大麻素。Luo等人建立了cannabigerolic acid的生物合成过程。酵母的产量达到了0.1 g/L。Hafner等人通过酵母生物合成的(S)-四氢棕榈酸达到了3.6 × 10^−6 g/L，这是微生物生产复杂大麻素的成功概念验证。 4.3.氨基酸衍生药物的生物合成 氨基酸衍生物使用氨基酸作为构建块，在人类健康中也扮演着重要角色。这类化合物通常通过生物途径而不是化学合成进行合成，因为它们具有多个手性部分。与生物碱和萜类化合物相比，氨基酸衍生物结构更简单，但多样性更大。Psilocybin是L-色氨酸衍生物，具有抗药物成瘾、缓解抑郁和抗创伤后应激障碍的作用。大肠杆菌或酿酒酵母已被工程化以异源表达合成途径，分别形成1.2 g/L和0.6 g/L的psilocybin。Dencichine，也称为β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸（β-ODAP），是从蚕豆种子中首次分离出的植物代谢物。Dencichine可以在人体血液中诱导血小板聚集，是中药云南白药的主要成分。作者优化了大肠杆菌中的代谢通量，使dencichine的产量达到了最终滴度1.29 g L−1和产量0.28 g g−1甘油。微生物生产dencichine是利用人工酶和途径在合成生物学应用中生产所需化学物质的一个例子。 4.4.不对称合成的生物催化 合成生物学可以协助多个手性中心化学发展。Sitagliptin（Januvia）是一种常用的糖尿病治疗药物，通过竞争性方式抑制DPP-4酶，减少GLP-1的裂解，增加胰岛素的分泌。到2021年，Januvia市场达到了14亿美元。对于sitagliptin的化学合成，手性胺通过基于铑的手性催化剂转移，立体选择性低，产品被铑污染。利用转氨酶和基于同源建模和饱和突变的合成生物学工程方法，开发了一种显著提高sitagliptin合成效率和纯度的过程。 5.无细胞合成生物学在医学应用中 迄今为止，合成生物学的努力主要集中在重新编程生物体、开发遗传电路和生物模块上。然而，由于我们对生命运作方式的了解有限，生物体的复杂性阻碍了合成生物学的进展。用户定义的系统可以解决这个问题。无细胞系统是准备好的，在没有活细胞的情况下执行体外生物活动（例如转录和翻译）。由于它是开放的、易于控制、灵活的，并且对细胞毒性具有高耐受性，该系统已被用于合成难以表达或在细胞中有毒的蛋白质（图6）。此外，无细胞系统非常适合高通量筛选。最近，随着无细胞生物传感诊断的发展和冻干技术的进步，无细胞合成生物学的应用已经扩展到医学和制药领域。 图6 无细胞合成生物学的特点。这张图总结了无细胞系统的类型、优势、产品和瓶颈。通常，无细胞系统用于生产药物或作为体外传感器。主要优势是方便、灵活和对细胞毒性的高耐受性。在解决了高成本和不稳定等问题之后，该系统在实际医疗应用中具有前景。 5.1.无细胞合成生物学在药物蛋白合成中 蛋白质和肽类药物大多数具有目标特异性，具有高活性和低毒性，适用于医疗用途。许多知名药物是蛋白质或肽，如曲妥珠单抗（赫赛汀）、阿达木单抗（修美乐）、甘精胰岛素（来得时）和13价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）。70%的蛋白质药物是使用CHO细胞生产的。然而，有些蛋白质对细胞宿主的生长是有毒的。无细胞蛋白质合成（CFPS）为毒性问题提供了解决方案。此外，CFPS系统中的细胞内蛋白质筛选是可行的，而且冻干技术允许无细胞系统在一年保存后仍保持高度活性。 基于细胞裂解物和纯化组分系统的CFPS系统是两种常用的CFPS系统。理论上，任何生物体都可以作为基于细胞裂解物系统的来源。最常见的细胞提取物来自大肠杆菌、小麦胚芽和酵母。大肠杆菌裂解物通常用于蛋白质合成，小麦胚芽裂解物用于构建蛋白质阵列，酵母裂解物用于合成糖蛋白。纯化组分系统包括所有纯化的翻译元素。Shimizu等人使用36种与转录/翻译相关的酶和高度纯化的核糖体开发了一种无细胞系统。该系统虽然最小化，但效率很高。然而，纯化组分的高成本限制了其应用。基于细胞裂解物的系统是CFPS系统的首选。 疫苗接种是预防大流行最有效的方法。无细胞系统为快速生产疫苗提供了平台。Kanter等人开发了一种无细胞系统，高效生产一种由单链Fv抗体片段（scFv）连接到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的融合蛋白，这是一种B细胞淋巴瘤疫苗。Lu等人描述了一种CFPS，过度表达大流行H1N1流感病毒的一个域，用于潜在的广泛保护性流感疫苗。除了细菌系统，真核无细胞系统可以表达复杂的疫苗。Tsuboi等人在基于酵母裂解物的无细胞系统中成功表达了三种疟疾蛋白，这在重组细胞中很难生产。 抗体对于疾病治疗和诊断很重要。CFPS通常用于抗体的合成。Ryabova等人在基于大肠杆菌裂解物的无细胞系统中成功生产了功能性scFv片段。翻译后修饰（PTM）是蛋白质的最终成熟步骤。糖基化是PTM的主要形式，对于维持蛋白质药物的半衰期和活性很重要，包括一些抗体。CFPS也可以向蛋白质引入功能性PTM。Jaroentomeechai等人使用CFPS在大肠杆菌无细胞系统中合成N-糖基化scFv。总的来说，无细胞系统是有用的补充，用于重组表达系统，因为它们快速且按需。 5.2.无细胞合成生物学用于诊断 通常，病原体的检测基于生物传感器。传感元件包括酶、转录因子、抗体、细胞器、全细胞和组织。尽管许多生物传感器快速且敏感，但缺点包括酶的不稳定性、全细胞生物传感器的生物安全性问题以及微流控传感器制备的复杂性。因此，开发了无细胞传感器。Pellinen等人使用荧光素酶作为报告基因，Tet阻遏蛋白和MerR调节蛋白作为传感元件，在无细胞系统中检测四环素和有毒的汞。Davies等人构建了一个无细胞蛋白质阵列，筛选病毒感染后人类血清中的高免疫原性蛋白质，用于预防性使用和诊断。在偏远地区或恶劣环境中，无细胞系统冻干并附着在纸张上（或其他基质）是方便和稳定的。Pardee等人使用冻干的无细胞传感器快速检测埃博拉和寨卡病毒。未来的无细胞合成生物学可能会导致更复杂的治疗剂的复杂设计和合成，或者用于慢性疾病诊断的快速和敏感的生物传感器。 6.讨论与未来展望 自十多年前开始迅速发展以来，合成生物学已经取得了显著增长，并在科学和应用方面取得了许多成就（图1）。在这篇综述中，我们总结了合成生物学在传统制药和医疗应用方面的先进策略和设计，例如工程智能细胞（图2）、活体益生菌治疗、诊断、干细胞、药物生产、纳米载体和人工疫苗开发。这种新方法将丰富临床方案，缩短药物开发周期并降低制药价格。 合成生物学方法最有可能带来（或已经带来）生物医学领域巨大变化的包括：使用光进行时间-空间可控的精确细胞治疗（光遗传学）、设计细菌靶向癌细胞、工程细胞重构人体代谢通量或肠道-大脑-肝脏轴（工程活体治疗）。近期研究表明，上述生物系统在哺乳动物中运行良好，并在动物模型甚至志愿者中显示出相当的治疗效果。然而，它们仍处于早期发展阶段。仍需付出许多努力，将实验室发现转化为商业产品，供患者使用。 个性化工程药物是未来治疗策略的下一代。基于能够将环境信号解释为效应器活动的遗传编码电路的智能治疗将被广泛使用。自动调节的治疗细胞，能够感应诊断输入以进行治疗效果，是诊断、疾病预防和治疗的一站式解决方案（图2）。一些应用，如CAR-T疗法，已经进入临床阶段，但大多数智能细胞尚未进入。许多尝试在早期临床阶段失败，主要原因是人类治疗能力低和意外的副作用。未来的工作应该强调其安全性以及治疗中的有效性和稳定性。 合成生物学与人工智能（AI）的结合有望加速医疗和制药领域的进展，尽管该领域仍处于初期阶段。AI不仅在计算机科学中取得了巨大成功，也在生物学研究中取得了突破。AI预测蛋白质结构被评为2021年十大科学突破之一。AI和大数据时代已经到来，深度学习技术在表征复杂对象、融合多模态特征和自动样本生成方面具有优势。AI可以应用于合成生物学领域。目前，AI与合成生物学的结合应用主要集中在以下三个方面：首先，预测未来研究方向；收集相关合成生物学数据，然后区分因果关系，分析和评估应用和发展方向。这在分析大量临床数据集时非常有帮助。其次，在制药应用中，基于AI和生物信息学大数据筛选有效药物，测试候选化学物质，并在疾病模型中模拟治疗过程。这是一种节省人力的高通量方法。第三，通过深度AI学习模型重建或修改基因组，开发新化合物用于药物发现。未来，AI有望协助医疗合成生物学根据实际需求设计更复杂的系统（工程细胞或组织），大幅减少研究人员的工作量。 图7 合成生物学基础基因治疗的现状、技术瓶颈及未来发展。目前，通过重新连接代谢和（或）信号通路，合成生物学已经提供了一些诊断和治疗方法。然而，仍需解决安全性、多功能性和有效性等瓶颈问题。此外，像AI辅助合成生物学和合理构建的活体生物和蛋白质等新设计正在进展中。 然而，医疗合成生物学仍需解决一些短板和瓶颈问题。尽管基于遗传电路的工程细胞是近几十年来最令人兴奋的设计之一，它们在实际应用中存在局限性，包括细胞外、信号转导自由疾病，这些疾病可以通过传统方式治疗。组织特异性工程治疗至今尚未成功。哺乳动物代谢的干扰仍然未知。解决这些问题将有助于合成生物学的临床应用。 大多数合成生物学仍应用于微生物。然而，解决人类健康问题的大部分重大问题需要哺乳动物系统。因此，必须付出巨大努力，推动哺乳动物合成生物学发展到下一代治疗，包括工程合成基因网络用于疾病治疗、组织工程或干细胞的生成和分化。 此外，基于合成生物学的治疗仍面临与转基因食品和干细胞治疗类似的社会问题，如伦理和法律领域，尽管它们可以通过严格的途径获得更好的控制。 即便如此，基于合成生物学的治疗前景光明，在二十一世纪的生物医学领域开发了新的工具和应用，并在高效微生物制药生产方面取得了进展。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注癌症是一种高度复杂的疾病，其特点不仅在于恶性细胞的过度生长，还包括免疫反应的改变。在肿瘤的发生和发展中，免疫系统的抑制和重新编程起着关键作用。免疫治疗的目的是重新激活抗肿瘤免疫细胞，克服肿瘤的免疫逃逸机制。有证据表明，多种免疫治疗方法的结合可能是提高治疗效果的途径之一。然而，肿瘤免疫治疗的总体临床反应率仍有待提高，这需要开发新的治疗方法和生物标志物。从过去临床和基础研究的成功和失败中学习，对于未来研究的合理设计至关重要。今天分享一篇发表在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）的综述文章。这篇综述描述了免疫系统对抗癌症的机制，并讨论了可以促进抗肿瘤免疫反应的治疗靶点和细胞类型。目 录一.  研究背景二．T细胞上的免疫抑制分子（ICs）三．T细胞上的免疫刺激分子（ICs）四．NK细胞上的免疫刺激分子（ICs）五．细胞免疫治疗六．来自ICB和CAR-T细胞的免疫治疗生物标志物七．其他类型的免疫疗法八．靶向抑制性的肿瘤微环境九．结论和展望-01-研究背景肿瘤免疫治疗的历史可以追溯到1974年，当时白细胞介素-2（IL-2）被发现在T细胞分化和生长中发挥关键作用。T细胞的激活是抗病毒和抗肿瘤适应性免疫中的关键事件，主要通过双信号途径完成。第一个信号是抗原特异性信号，包括T细胞受体（TCR）与抗原肽-主要组织细胞复合体（MHC）的特异性结合。第二个信号是由T细胞与抗原提呈细胞（APC）表面的刺激分子（CMs）的交流介导的。1986年，科学家发现了CD28，这是一个在活化T细胞上表达的分子，对T细胞的激活至关重要。随后，CTLA-4被发现，与CD28结构相似，被认为是一种潜在的T细胞抑制分子。1994年底，Allison团队发现了阻断CTLA-4可以增加T细胞的抗肿瘤活性和抑制肿瘤生长的突破性发现。这证明了抑制负性免疫调节剂可以抑制肿瘤发展，这种方法后来被称为免疫检查点阻断（ICB）。2011年，第一个针对CTLA-4的抗体ipilimumab被批准用于黑色素瘤治疗，成为第一个免疫检查点（IC）抑制剂。20多年前，京都大学Tasuku Honjo的研究小组发现了PD-1。PD-1基因敲除导致小鼠出现自身免疫性疾病和异常激活的免疫细胞，表明其具有免疫抑制作用。2000年，B7-H1被确定为PD-1的配体，也被称为PD-L1。这些发现表明，PD-1是另一种IC。总的来说，针对CTLA-4和PD-1的抗体以及CAR-T细胞疗法代表了有希望的方法，在这些方法中，免疫系统的某些成分可以被操纵，以扭转抑制并针对肿瘤。然而，并非所有患者对这些疗法都有反应，这表明肿瘤引起的免疫改变具有复杂性。Robert Schreiber博士提出了“癌症免疫编辑”的概念，描述了恶性细胞如何对最初的免疫识别做出反应，随后发展出逃逸机制，甚至“重塑”免疫系统，成为致癌物质。这样的免疫编辑过程几乎在体内或全身免疫细胞存在时都会发生，从而形成高度抑制的肿瘤微环境（TME）。因此，寻找激活抗肿瘤T细胞反应和针对抑制性TME的协同方法一直是肿瘤免疫治疗的主要研究重点。图1. 癌症免疫疗法发展的历史性里程碑-02-T细胞上的免疫抑制分子（ICs）ICs是一类免疫抑制分子，它们在免疫细胞上表达，并能够抑制免疫细胞的激活，因此在预防自身免疫中发挥关键作用（见图2）。然而，ICs的过度表达会抑制免疫功能，促进肿瘤的发生。因此，ICB疗法通过阻断ICs并增强抗肿瘤T细胞的活性来抑制肿瘤生长。ICB的发展始于针对PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/2这两个IC通路的靶向阻断，对它们的阻断已经取得了显著的临床进展。迄今为止，已经发现了T细胞上其他几个通过不同机制介导抑制性信号的IC分子，并有可能将它们作为癌症免疫治疗的靶点加以利用。图2. 免疫检查点抑制剂及其受体列表1. PD-1研究表明PD-1在调节自身免疫反应中具有重要作用，因为它能够抑制T淋巴细胞的功能。在多种类型的肿瘤中，PD-L1（最初被标识为B7-H1）的高表达使其能够与PD-1结合，从而促进肿瘤的免疫逃逸。因此，通过抑制PD-1可以重新激活T细胞的功能。需要注意的是，PD-1不仅在T细胞上表达，而且在NK细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）上也有表达。这表明PD-1可能在重塑肿瘤免疫微环境甚至全身性抗肿瘤免疫中发挥着非常有效的作用。PD-1抑制剂能够特异性地结合PD-1，减弱对T淋巴细胞的免疫抑制调节，使得T淋巴细胞能够参与肿瘤细胞的杀伤。（图3）图3. PD-1抗体工作机制示意图2. CTLA-4CTLA-4，也称为CD152，是一种跨膜蛋白，在活化的CD4+和CD8+T细胞中表达。CTLA-4通过与CD80/CD86结合来抑制T细胞的激活信号，从而防止自身免疫性疾病的发生。阻断CTLA-4可以直接作用于效应性T细胞的抑制信号，减少调节性T细胞（Tregs）的抑制作用，从而有效提高T细胞的抗肿瘤效应。尽管CTLA-4和PD-1都是代表性的免疫检查点分子，但它们以不同的方式调节T细胞功能（见图4）。CTLA-4的抑制信号消极地调节T细胞的启动阶段，而PD-1主要介导已经启动的T细胞的抑制和增殖。在肿瘤治疗方面，研究发现针对PD-1的免疫检查点阻断通常会导致现有抗肿瘤T细胞的扩增和招募，而抗CTLA-4治疗则可能产生新的T细胞克隆。这些结果表明，CTLA-4和PD-1可以同时作为治疗靶点，发挥协同的抗肿瘤作用。图4. CTLA-4和PD-1的图解3. Tim-3T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域-3（Tim-3，CD366）是一种T细胞表面抑制性分子，主要表达在CD4+T辅助细胞1（Th1）和CD8+CTL细胞，以及具有强化抑制功能的Treg细胞亚群上。后来发现，Tim-3，也被称为HAVCR2，也表达在一些先天性免疫细胞上，包括树突状细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。4. LAG-3在抗原刺激下，淋巴细胞诱导分子-3（LAG-3）可以在CD4+和CD8+T细胞上被诱导。长期感染病毒、细菌和寄生虫导致持续暴露于抗原，从而导致LAG-3的高水平和持续表达，随后细胞因子释放、细胞溶解活性和增殖潜力减少。在一些小鼠肿瘤模型中观察到LAG-3和PD-1在瘤内T细胞上的共同表达，当结合这两种分子的阻断抗体时，观察到对肿瘤生长的协同抑制作用。因此，LAG-3成为癌症免疫治疗中最关键的新靶点之一。Relatlimab是第一个进入临床的LAG-3抑制剂，它能够阻断LAG-3与MHC II的相互作用。纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）是LAG-3的配体。研究发现，它与LAG-3结合形成一个新的PD-1/PD-L1独立的免疫检查点途径，导致T细胞衰竭、功能障碍，以及肿瘤细胞逃避免疫监视。在抗PD-L1的基础上阻断FGL1可能成为临床实践中的另一种新型ICB策略，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向治疗方面。5. NR2F6核受体亚家族2群F成员6（NR2F6）最近被报道为细胞内免疫检查点分子，是淋巴细胞固有的核受体。作为转录因子，NR2F6调节与肿瘤抗原特异性T细胞反应相关的细胞的激活、募集、增殖和内稳态。在非小细胞肺癌组织的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中检测到NR2F6的高表达，NR2F6表达上调与细胞因子（IL-2、TNF-α和IFN-γ）的产生受损相关，提示TILs上的NR2F6有助于肿瘤免疫抑制。此外，NR2F6的破坏导致肿瘤抑制，并增强PD-L1阻断剂在肿瘤治疗中的作用，提示NR2F6抑制剂可能成为一种新的免疫疗法，可以克服对现有ICB治疗的耐药性。6. TIGITT细胞免疫球蛋白和ITIM域蛋白（TIGIT）是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族（IgSF）。TIGIT在T细胞、调节性T细胞、记忆性T细胞和NK细胞上表达。通过与表达在抗原呈递细胞（APC）上的配体CD155和CD112相互作用，TIGIT介导对NK细胞和T细胞激活的抑制作用。在人类肿瘤中，发现TIGIT与多个免疫检查点分子共表达，包括PD-1、TIM-3和LAG-3。TIGIT、TIM-3和PD-1的共同表达与患者的生存率低有关。同时阻断TIGIT和PD-1信号通路可以增加肿瘤特异性CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达，支持抗TIGIT治疗的发展。7. VISTAV-集免疫调节受体（VISTA），也被称为PD-1H或DD1α，是近年来发现的一种免疫调节蛋白。它主要表达于淋巴器官和骨髓细胞，其结构与PD-L1相似。研究表明，表达VISTA的抗原呈递细胞（APC）对CD4 +和CD8 + T细胞有抑制作用；当这种分子被阻断时，由T细胞介导的免疫功能得到了挽救，说明VISTA是一种抑制T细胞反应的免疫检查点（IC）分子。在T细胞中，VISTA和PD-1的抑制作用是相互独立的，在肿瘤小鼠模型中的研究也验证了同时应用抗PD-1和抗VISTA抗体可以抑制肿瘤生长，延长生存期。8. BTLAB和T淋巴细胞衰减剂（BTLA）属于免疫球蛋白超家族。它在T细胞、静止的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞上表达，其结构和功能与PD-1和CTLA-4相似。BTLA的配体是疱疹病毒进入介质（HVEM）。当BTLA与HVEM结合时，它产生抑制性信号并抑制T细胞的激活。抗BTLA治疗可促进T细胞增殖，BTLA基因敲除的小鼠显示出更高的免疫活性。-03-T细胞上的免疫刺激分子（ICs）1. OX40OX40，也被称为CD134，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族的成员，在T细胞激活后24-72小时表达。它的配体OX40L，也被称为CD252，主要表达在活化的APC表面。OX40和OX40L的相互作用可以启动T细胞激活信号，促进细胞周期蛋白A、Bcl-2抗凋亡分子、细胞因子以及细胞因子受体的表达。在小鼠模型中，刺激OX40的特异性抗体可以减少Tregs的数量，从而保持效应T细胞的功能，并表现出高抗肿瘤活性。目前已有许多针对OX40-OX40L途径的临床研究，包括对激发OX40的特异性抗体的单药应用或与化疗、放疗、手术、小分子靶向治疗、细胞因子或其他免疫检查点阻断药物的组合治疗。2. ICOS诱导共刺激分子（ICOS），又称CD278，是免疫球蛋白超家族的一员。ICOS在活化的T细胞表面表达，调节T细胞增殖和功能。ICOS的激活依赖于其配体ICOS-L，主要在B细胞和抗原呈递细胞（APCs）中表达。ICOS已被证明是免疫检查点阻断疗效的一个重要标志。在治疗恶性黑色素瘤时，发现ICOS+CD4+T细胞的丰度与较好的治疗效果相关。在小鼠模型中，单独使用ICOS激动剂很难引起足够的抗黑色素瘤反应；但ICOS激动剂与抗CLTA-4药物存在协同效应；此外，ICOS敲除小鼠对抗CLTA-4治疗的反应较差。3. 4-1BB4-1BB，也称为CD137，是TNFR家族的一员。对于调节性T细胞上4-1BB的作用存在一些复杂性，研究结果有时相互矛盾。但重要的是，4-1BB基因敲除小鼠会出现自身免疫性疾病的症状，这表明其在免疫平衡中发挥着重要作用，并且有可能成为靶向治疗的对象，以引发肿瘤特异性免疫识别。4. CD27与TNFR家族的其他成员不同，CD27只在淋巧细胞表面表达，包括新生和活化的CD4+和CD8+T细胞。当CD27与其配体CD70相互作用时，它能够诱导效应性和记忆性T细胞的增殖和分化，并增强B细胞和NK细胞的激活。小鼠模型的研究表明，通过诱导CD27信号通路可以抑制肿瘤的生长，显示了CD27/CD70信号通路在抗肿瘤免疫中的重要作用。Varlilumab是一种针对CD27的人源化单克隆抗体，可促进细胞因子的产生和T细胞的激活。在I期临床研究中，Varlilumab在晚期实体瘤患者中的耐受性良好，并显示出初步的安全性结果。除了单药治疗外，Varlilumab还可以与抗PD-L1抗体联合使用。-04-NK细胞上的免疫刺激分子（ICs）在人体内，NK细胞主要以CD3- CD56+淋巴细胞群为特征，而CD16+ CD56dim亚型主要存在于血液中。NK细胞作为自然免疫系统的重要组成部分，在清除衰老细胞和致病微生物方面发挥着重要作用。与T细胞不同，NK细胞不需要通过特定的受体识别靶细胞；它们通过种系基因表达的受体来识别细胞。NK细胞的负调控因子包括KIR（免疫球蛋白样受体）、CD94-NKG2和MHC-I。在肿瘤免疫学的背景下，肿瘤细胞通过下调MHC的表达来逃避获得性免疫，从而更容易受到NK细胞的细胞毒性作用。此外，在抗体治疗中，NK细胞在介导抗体诱导的细胞毒性（ADCC）中发挥着重要作用。NK细胞还可以通过分泌细胞因子或招募树突状细胞、巨噬细胞和T细胞等免疫细胞参与清除肿瘤细胞的过程，直接发挥抗肿瘤作用，使其成为癌症免疫治疗的诱人靶点。1. KIR杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）家族是一类高度多态性的分子，主要表达在一些NK细胞和T细胞的表面，可分为多个亚型。其中，KIR2DL1-3和KIR3DL1通过结合MHC分子（HLA-C/HLA-B）发挥抑制作用。由于基因多态性高的特点，多个KIR基因及其配体的结合可引起多种疾病，包括自身免疫性疾病。特别是部分KIR基因与特异性配体的结合，可增加癌症的风险。在小鼠模型中，针对活化的NK细胞表面受体KIR2DS2的治疗显示出比针对传统共刺激分子更明显的抗肿瘤活性。2. NKG2ANK细胞凝集素样受体亚家族C成员1 (NKG2A)是NKG2家族的“抑制性”成员，主要在CD56 hi NK细胞、NKT细胞和CD8+αβ T细胞亚群中表达。它与CD94形成异二聚体受体，并与其配体结合，非经典的MHC I分子HLA-E，在大多数正常组织中表达。NKG2A/CD94与HLA-E的相互作用可抑制NK细胞和T细胞的激活，表明其作为免疫检查点分子的靶向性。Monalizumab (IPH2201)是一种NKG2A单克隆抗体，可阻断NKG2A与HLA-E之间的相互作用。已经在白血病小鼠模型中显示了其治疗效果。3. CD96CD96是免疫球蛋白超家族的一员，在NK细胞表面表达，并能够识别其配体CD155。研究表明，在肿瘤浸润的NK细胞中，CD96的表达水平高于周围组织中的NK细胞。特别是在肝细胞癌样本中，高水平的NK细胞CD96表达与较差的预后相关。-05-细胞免疫治疗具有细胞毒性潜能的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞，能够识别并清除感染或受损的细胞。T细胞的细胞毒性作用不同于其他细胞，因为它具有抗原特异性。细胞免疫疗法，也称为过继细胞移植（adoptive cell transfer，ACT），利用这些类型的免疫细胞的杀伤能力来治疗癌症。在此，作者讨论已经取得重大研究和临床进展的四种主要ACT类型：CAR-T细胞治疗、TIL治疗、工程TCR治疗和NK细胞治疗。1. TIL 治疗TILs是可以从肿瘤组织中识别和纯化的异质性淋巴细胞，它们的丰富程度已被发现与较好的预后相关。TILs是第一批被用于ACT的细胞之一。这些细胞可以从肿瘤中分离出来，在实验室环境中进行体外扩增，并大量重新注射到癌症患者体内以消除肿瘤细胞。TIL疗法已经在临床研究中进行了严格的测试，作者总结了TIL疗法针对不同类型肿瘤的最新进展，包括黑素瘤、肺癌、宫颈癌、转移性乳腺癌、骨肉瘤和卵巢癌。2. 工程TCR治疗 TCRs是T细胞表面的特异性受体，通过识别和结合MHC呈递的抗原来激活T细胞的分裂和分化。然而，并非所有患者都拥有可以识别肿瘤的T细胞。因此，TCR-T疗法从患者身上提取T细胞，并将这些细胞扩大，使患者拥有能够识别特定癌症抗原的新的TCR。工程TCRs的设计高度依赖于特异性肿瘤抗原的识别。一些抗原，如NY-ESO-1，在肿瘤组织中广泛表达，可用于开发TCRs治疗不同类型的肿瘤。然而，TCR可以以患者特异性的方式进行识别和合成。TIL治疗利用了瘤内淋巴细胞与全身淋巴细胞之间的差异，对患者肿瘤中特定突变的识别指导了TCRs的生成和应用，从而有效地靶向这些突变。然后，这些TCRs可以被分离、克隆并在T细胞上表达，然后这些工程T细胞在体外扩增并重新注入患者体内。这是一种高度个性化的治疗方法，增强了治疗的特异性。TCR疗法在黑色素瘤的治疗上取得了突破性进展，在肝癌、乳腺癌和卵巢癌的治疗上也取得了一定成效。然而，肿瘤细胞通过降低MHC的表达来逃避T细胞的杀伤，这对于TCR的抗原识别构成了挑战。3. CAR-T细胞治疗CAR-T细胞治疗是另一种ACT策略。与TCR-T疗法的原理相似，患者的T细胞“装备”了合成的CAR，然后这些细胞在体外扩增并重新注入患者体内，以产生肿瘤特异性免疫反应。CAR被设计用于识别肿瘤相关抗原(TAAs)，其独立于MHC呈递，因此使T细胞能够以MHC不受限制的方式识别癌细胞。图5. CAR-T细胞的结构① CAR-T细胞治疗的原理和成果：CAR-T细胞是通过在T细胞的质膜上表达肿瘤特异性CARs而产生的。CARs的结构通常包括三个部分：细胞外抗原结合域、连接体/跨膜域和细胞内信号传导域。细胞外抗原结合区是利用抗体、配体和肽的序列设计的，以便与TAAs特异性结合。跨膜结构域负责连接细胞外结合结构域和细胞内信号结构域并将其固定在细胞膜上。细胞内信号区，包括CD3-zeta结构域和共刺激结构域，将抗原识别的信号转发给细胞，介导T细胞的激活。CAR-T细胞治疗涉及合成生物学（CAR设计）、病毒技术（CAR转导）和细胞制造（CAR-T细胞扩增）的整合。CAR的引入在工程T细胞中产生了肿瘤特异性激活潜力，而体外培养和扩增允许绕过肿瘤引起的免疫抑制。因此，大量的肿瘤特异性细胞被输回病人体内。CAR-T细胞疗法对几种类型的癌症显示出有希望的临床结果。图6. CAR-T治疗的工作流程② CAR-T细胞治疗的挑战：CAR-T细胞治疗的更广泛应用仍然面临着来自不同方面的挑战。首先，当CAR-T细胞攻击肿瘤细胞时，可能会引起严重的副作用和毒性，可能是致命的。其次，一些CAR-T细胞的细胞毒性不是高度肿瘤特异性的，可能会对正常组织造成损伤。第三，大多数CAR-T细胞产品的制造过程是耗时的，这可能会导致一些患者的肿瘤在细胞生产窗口期进一步恶化。此外，CAR-T治疗血癌的长期疗效仍需长期随访观察，CAR-T细胞治疗实体瘤的应用有待进一步研究。这些挑战将决定未来整个T细胞工程领域的发展。细胞因子释放综合征(CRS)，也被称为“细胞因子风暴”，是CAR-T治疗最常见的不良反应。大多数CAR-T细胞的临床研究表明，长期疗效不确定，因为癌细胞表达的各种免疫逃逸因子导致T细胞衰老和衰竭。针对实体瘤的CAR-T细胞面临的挑战包括阻断T细胞浸润的血管疾病，有限的TAA选择和肿瘤异质性，这导致了抗原逃逸。CAR-T细胞在实体瘤中的应用需要进一步探索。③ CAR-T细胞改良的策略：利用特异性和广泛的靶向性：CAR-T细胞的长期抗肿瘤功能因输注后肿瘤复发而复杂化。考虑到CAR-T治疗后抗原逃逸的风险，设计针对多个TAAs的双特异性CAR-T是可以采用的。提高CAR-T细胞的适应度，包括活化潜能、增殖能力和生存能力，延长CAR-T细胞在患者体内的生存时间，是提高临床疗效的关键方向之一。降低制造成本：所有批准的CAR-T细胞疗法都使用自体T细胞来产生治疗产品。生产这种高度个性化的疗法需要很高的成本。除了高成本外，CAR-T细胞疗法的质量和稳定性一直是人们关注的主要问题。自体T细胞在质量和数量上不一致，特别是在接受过大量放疗和化疗的患者中。毒性控制：CAR-T细胞治疗显示的毒性和副作用表明需要制定一些控制程序来调节CARs的活性。大量的方法已经被用来控制CAR-T细胞的安全性; 其中包括通过安装自杀开关快速清除注入的细胞，这种开关可以由小分子或抗体控制。常用的自杀开关包括诱导型caspase-9 (iCasp9)、单纯疱疹病毒中的胸苷激酶(HSV-TK)和自杀表位。然而，这样的自杀开关清除了所有的治疗CAR-T细胞，从而降低了抗肿瘤反应。因此，不清除CAR-T细胞的非细胞毒性可逆系统正在开发中，并具有保持细胞毒性和控制毒性反应之间平衡的潜力。 (表1)4. NK细胞治疗 NK细胞可以介导直接细胞毒性。从机制上讲，NK细胞在对抗癌症的第一道防线上发挥着关键作用，通过两种途径介导抗肿瘤作用：通过释放穿孔素和颗粒酶或死亡受体的直接细胞毒性，以及通过分泌激活APCs和T细胞的细胞因子和趋化因子的调节作用。因此，除了本文前面讨论的以NK细胞上的ICs为靶点的药物外，利用NK细胞的ACT也在快速发展中。与T细胞类似，NK细胞也可以转导表达CARs。CAR-NK细胞的发展紧随CAR-T细胞治疗的演变，CAR-NK细胞往往直接采用CAR-T细胞的设计。许多临床前研究已经证实了CAR-NK细胞针对其他类型肿瘤的抗肿瘤活性。由于NK的细胞毒性是由 "缺失自我"的识别引发的，因此NK细胞尤其具有杀死MHC下调的肿瘤细胞的能力。NK细胞对病毒感染的细胞也有特殊的杀伤能力，因此特别适合于治疗HPV或EBV相关的肿瘤。NK细胞毒性可受多种免疫抑制机制的影响，包括IL-10，吲哚胺2,3-双加氧酶，前列腺素E2，转化生长因子β (TGF-β)和缺氧。增强NK细胞的细胞毒性和在体内的持久性被认为是推进NK治疗的主要方向。支持NK细胞维持的细胞因子：IL-15已被确定为增强NK细胞活性的关键细胞因子。在黑色素瘤、结直肠癌、淋巴瘤和肺癌等癌症的同基因小鼠模型中，IL-15的注射具有良好的耐受性，并促进NK细胞的扩增。随着对NK细胞活化和维持的研究越来越深入，未来的治疗方法不仅必须产生肿瘤特异性NK细胞，还必须增加其在体内的持久性，以增强其治疗效力。5. CRISPR技术促进了细胞免疫治疗近年来，CRISPR/Cas9技术极大地提高了我们对肿瘤基因组学的认识，并为癌症免疫治疗做出了贡献。使用该基因组编辑系统，可以进一步改造治疗性免疫细胞，以增强肿瘤识别并减少衰竭。CRISPR/Cas9技术使研究人员能够有针对性地编辑T细胞或NK细胞中的基因，从而调节细胞的免疫活性和抗肿瘤功能。通过CRISPR/Cas9技术，可以实现对免疫细胞中与抗肿瘤功能相关的基因的精确编辑，例如增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别能力、提高细胞毒性效应、增强细胞的存活能力和增殖能力等。此外，CRISPR/Cas9技术还可以用于研究免疫逃逸机制、抗原识别和免疫调节等方面的基础研究，为癌症免疫治疗的进一步优化提供了重要的工具和理论基础。图7. 基于CRISPR技术的免疫治疗工作流程-06-来自ICB和CAR-T细胞的免疫治疗生物标志物1. ICB的生物标志物PD-L1被作为抗PD-1治疗的第一个生物标志物，已经被纳入pembrolizumab的处方指南中。目前，与免疫疗法疗效相关的常见或潜在的生物标志物主要分为以下几类，根据其获取途径和类型不同：(i) 表面标志物，包括PD-L1和其他一些抑制性受体，可以通过免疫组化检查肿瘤组织获得。(ii) 基因生物标志物，如肿瘤突变负荷（TMB）、错配修复系统缺陷（dMMR）、高微卫星不稳定性（MSI-H）、新抗原和抗原呈递途径的突变等，需要进行肿瘤基因组分析来获取。(iii) 循环肿瘤DNA（ctDNA），可以通过外周血样本分析获得。这些生物标志物中的一些已经通过III期临床试验验证，并在临床实践中得到广泛应用。2. CAR-T细胞治疗的生物标志物    生物标志物对于癌症临床治疗具有重要意义，它们可以用来确定适合CAR-T治疗的患者、预后、治疗反应预测和监测疾病进展。CAR-T治疗的第一个生物标志物是CD19，一种主要在恶性B细胞上表达的B细胞表面蛋白。      目前，正在根据免疫治疗的阶段寻找不同的生物标志物，包括确定患者基线状态的生物标志物、CAR-T细胞功能、CAR-T细胞耗竭、CAR-T细胞毒性的生物标志物以及癌症预后、反应和复发的生物标志物。基线生物标记物包括细胞因子，如IL-2、IL-5、IL-7、TNF-α等；乳酸脱氢酶（LDH）和CD9细胞已被广泛应用。     对于CAR-T细胞功能，提出了以下生物标志物：CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD25、CD127、CD57和CD137。目前，还没有成熟的生物标志物可用于评估患者输注后的CAR-T细胞耗竭。一些间接参数可能有助于实现这一目的，如PD-1、LAG-3、TIM-3等抑制性受体的高水平表达。      尽管CAR-T治疗取得了重大进展，但仍有必要继续探索不同癌细胞类型特异性的生物标志物，以开发更特异的治疗方法。到目前为止，尚未有生物标志物被用于指导患者的治疗，但一些CAR-T细胞的内在和外在因素显示出与治疗反应相关的趋势。肿瘤抗原的表达是其中最为关键的因素。作为一种靶向治疗，CAR-T细胞需要在肿瘤细胞上表达靶向抗原以诱导T细胞的活性。由于肿瘤抗原逃逸是CAR-T细胞治疗后肿瘤复发的主要机制，一些研究发现，虽然下调了靶向抗原的表达，但并未完全丧失，而是抑制了CAR-T细胞的功能。尽管CAR-T细胞可以被设计成增加其对低水平靶向抗原的敏感性，但靶向抗原的表达密度可能成为一种预测性的生物标志物。-07-其他类型的免疫疗法肿瘤疫苗：预防性肿瘤疫苗可预防某些癌症的发展，如HPV疫苗预防宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和尖锐湿疣，以及HBV疫苗预防肝癌。治疗性肿瘤疫苗以肿瘤抗原的形式注射自由肽或载体到APC上，以激活免疫细胞，恢复其自主抗肿瘤能力。在临床前模型中，治疗性肿瘤疫苗已被证实可以防止癌症的生长和转移，并减少终止其他类型治疗后的复发。肿瘤疫苗主要分为四种类型：肿瘤全细胞疫苗、基因工程疫苗、蛋白肽疫苗和树突状细胞疫苗。新抗原和免疫疗法：新抗原是存在于癌细胞上的蛋白质片段，提供了一种实现癌细胞特异性靶向的新方法。新抗原疫苗是根据患者的特定肿瘤情况定制的。生产新抗原疫苗的一般步骤包括：（1）肿瘤活检，即从患者身上提取肿瘤样本进行基因组纯化；（2）对肿瘤细胞和正常细胞的全外显子组测序，使研究人员能够寻找肿瘤细胞中独特的突变；（3）特异性新抗原的预测和筛选；（4）开发个性化疫苗，这是基于预测的新抗原，可以通过多种方法实现，包括多肽、mRNA和树突状细胞。最关键和最具挑战性的一步是患者特异性新抗原的鉴定。溶瘤病毒：有额外病毒感染的癌症患者通常病情恶化。然而，病毒也可以被修改为专门针对癌细胞。这些“溶瘤病毒”通过基因组编辑和大规模筛选产生，其解读包括对癌细胞的裂解能力，同时保留正常细胞。由此产生的溶瘤病毒抗原可以复制并随后溶解肿瘤细胞，向肿瘤部位释放更多的病毒颗粒。因此，小剂量的病毒可以在体内扩增。溶瘤病毒具有介导肿瘤抗原扩散的能力，可导致浸润肿瘤的淋巴细胞增多，增强了ICB治疗的抗肿瘤疗效。另一种方法是使用溶瘤病毒作为载体，结合细胞免疫治疗。通过额外的基因工程，病毒的细胞溶解功能可以被抑制，同时允许合成分子的表达。-08-靶向抑制性的肿瘤微环境巨噬细胞：作为先天免疫系统的“士兵”，清除了受损、衰老和危险的细胞。然而，在癌症中，巨噬细胞促进了肿瘤的免疫逃逸，已成为药物开发的一个重要领域。巨噬细胞具有多种功能，包括清除细胞碎片和病原体，以及调节炎症反应。它们也是高度可塑性的细胞，可以根据微环境刺激和信号从一种表型转换到另一种表型。巨噬细胞的激活状态通常分为两类：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。某些M2型巨噬细胞亚群参与促进肿瘤进展和介导免疫抑制。从机制上讲，已发现肿瘤将单核细胞和巨噬细胞招募到肿瘤微环境（TME），并将它们极化为M2型表型。巨噬细胞靶向癌症治疗的中心目标是将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）重编程为促炎（抗肿瘤）亚型。图8. M1和M2巨噬细胞的特性TAMs上的抑制和刺激分子：对TAMs的最成熟的干预方法之一是阻断集落刺激因子-1（CSF-1，也称为M-CSF）/CSF1R轴。这种干预可以减少TAMs的数量，也可能导致TAMs向M1型表型的再极化。另一个影响TAMs致瘤功能的分子是TGF-β，它是一种抗炎分子，通常在损伤修复过程中由巨噬细胞表达。在小鼠模型中，阻断TGF-β并同时使用STING激动剂治疗可以通过上调I型干扰素的表达来导致肿瘤的消退。Toll样受体（TLRs）参与先天免疫感应。TLR激动剂可以增加单核细胞的招募/浸润，并促使巨噬细胞向促炎性表型转化。此外，TAMs也表达CD40，而CD40激动剂的使用可以防止肿瘤的生长并减弱其抗药性。这些抑制性（CSF1R、TGF-β）和刺激性（TLRs、CD40）分子都可以用来恢复TAMs的促炎性功能。CD47，又称整合素相关蛋白，属于免疫球蛋白超家族。它通过与巨噬细胞或树突状细胞表面的信号调节蛋白α（SIRPα）结合，调节细胞的增殖、迁移和凋亡。在大多数肿瘤细胞表面，CD47被过度表达。阻断CD47/SIRPα通路可以诱导巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，这一点已在小鼠异种移植模型中得到证实。工程巨噬细胞：巨噬细胞治疗的发展需要增加靶向激活受体和更持久的M1巨噬细胞极化方法。利用基因修饰增强巨噬细胞的抗肿瘤能力逐渐引起了人们的关注。一个直接的策略是通过耗尽抑制信号，如SIRPα来增强巨噬细胞的功能。研究表明，SIRPα缺失的巨噬细胞在联合放疗中具有抗肿瘤作用。另一种方法是设计巨噬细胞表达CARs（CAR-Ms）。CAR-Ms能够诱导周围肿瘤微环境的促炎特征。值得注意的是，即使存在M2型巨噬细胞，CAR-Ms的肿瘤杀伤能力也不受影响，这突显了其对肿瘤微环境免疫抑制的抵抗力。此外，CAR-Ms还表现出更强的T细胞刺激能力，能够在吞噬肿瘤细胞后向T细胞呈递抗原，从而招募静止和激活的T细胞到肿瘤部位。图9. CAR-M治疗的多效抗肿瘤机制靶向骨髓来源抑制细胞（MDSCs）：MDSCs起源于造血干细胞（HSCs），是骨髓造血功能改变的结果。这种短暂的骨髓增生在刺激物被移除后会终止，骨髓细胞的平衡也会随之恢复。然而，在慢性炎症、癌症和自身免疫性疾病中，持续的骨髓造血可能发生，以防止宿主广泛的组织损伤，不断产生IMCs。这些细胞具有明显的特征，如不成熟的表型和形态，相对较弱的吞噬功能，以及抗炎和免疫抑制功能。异常的骨髓细胞对其他免疫细胞有抑制作用。因此，人们采用表面标志物Gr-1和CD11b来定义这些免疫抑制性骨髓细胞。在人类中，这些骨髓细胞的表型特征是CD34、CD14和CD15的表达，功能特征是它们能够抑制T细胞的激活。MDSCs可大致分为粒细胞（G-MDSCs或PMN-MDSCs）和单细胞（M-MDSCs）亚型。MDSCs的存在是肿瘤进展的基本特征之一。MDSCs发挥多种功能，影响T细胞、Treg细胞、DC细胞和NK细胞。目前，MDSC靶向治疗大致可分为五种类型：(i) 抑制MDSCs扩张和招募的疗法；(ii) 恢复正常骨髓分化的疗法；(iii) 针对MDSCs上IC分子的疗法；(iv) 阻断MDSCs分泌的抑制性分子的疗法；(v) 直接耗尽MDSCs的疗法。图10. MDSCs的功能靶向B细胞：肿瘤相关B细胞（TABs）在肿瘤环境中具有促炎和抗炎功能，其丰度与黑色素瘤对免疫检查点抑制剂（ICB）治疗的耐药性相关。TABs富集于肿瘤组织的第三淋巴组织结构（TLSs）中，可被激活以识别癌细胞。在肺癌（NSCLC）患者中，肿瘤中TABs水平较高的患者更可能对免疫治疗产生积极反应。色氨酸代谢酶IDO过度表达于多种肿瘤中，其作用是将色氨酸转化为犬尿氨酸。肿瘤抑制基因BIN1对IDO的表达有负向调节作用。在小鼠模型中，BIN1的耗尽已被证实可诱导IDO的表达并抑制免疫反应。IDO可增强癌细胞的迁移能力，抑制肿瘤被T细胞的识别和清除。IDO的靶向药物在临床前模型中单药治疗显示出疗效，但与靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1的ICB联合使用可能更有效。目前，正在进行临床研究的主要IDO抑制剂包括indoximod、navoximod、epacadostat和BMS-986205。图.肿瘤产生色氨酸代谢酶或是新免疫治疗靶点IL-41可增强肿瘤的侵袭性，抑制抗肿瘤免疫。因此，靶向IL-41可能是一种新的免疫治疗途径。腺苷是RNA合成的重要组成部分，但也被证明可以抑制T细胞在肿瘤微环境中的功能。CD39是一种参与细胞外腺苷产生的酶，在多种人类肿瘤中高度表达。TME中CD39的表达水平升高，包括血管内皮细胞、成纤维细胞和一些免疫细胞。CD39在多种免疫细胞中发挥重要作用。因此，CD39联合ICB可能成为一种新的肿瘤免疫治疗方式。-09-结论和展望这篇文章系统性地回顾了肿瘤免疫治疗的历史，并深入探讨了癌症免疫治疗的各种策略，包括免疫检查点抑制剂和刺激性分子的靶向药物、细胞免疫治疗以及抑制性肿瘤微环境的靶向策略。此外，作者还讨论了与免疫检查点抑制剂和CAR-T细胞治疗相关的临床疗效所涉及的生物标志物。总的来说，肿瘤免疫学的研究结合了先进的免疫细胞技术，为未来癌症免疫治疗的发展指明了方向。这需要更多临床和基础研究项目的整合，以全面分析未满足的临床需求，并指导未来的研究方向。参考资料：[1]Wang DR, Wu XL, Sun YL. Therapeutic targets and biomarkers of tumor immunotherapy: response versus non-response. Signal Transduct Target Ther. 2022 Sep 19;7(1):331. doi: 10.1038/s41392-022-01136-2. PMID: 36123348; PMCID: PMC9485144.文章信息源于公众号医世象，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读