mRNA疫苗的CMC开发策略和技术创新

2024-03-05

导读：药物相关的化学、制造和控制（CMC, Chemistry, Manufacturing and Controls）是药物研发的重要组成部分，包括药物生产工艺研究、杂质研究、质量研究、稳定性研究、工艺验证等方面内容。CMC研究对非临床研究试验和临床研究试验提供技术和物质支持，贯穿于药物研发及生产的全生命周期。以新冠肺炎（COVID-19）、埃博拉病毒（Ebola）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS）等传染病经验为素材，葛兰素史克（GSK）疫苗技术研发团队在Vaccines特刊State-of-the-Art Vaccine Researches上发表题为《CMC Strategies and Advanced Technologies for Vaccine Development to Boost Acceleration and Pandemic Preparedness》的综述文章，详细概述和讨论了加速/大流行和防范的关键推动因素，包括CMC策略以及疫苗开发中的技术创新。今天，菌菌将和大家一起摘取学习其中有关mRNA的部分。一、疫苗平台和经验储备经验储备是加速疫苗开发的关键，与平台搭建有着内在联系，在药物开发和全生命周期管理过程中为决策提供信息的既定工具。mRNA可以快速响应突发卫生事件，这要归功于其相对简单、平台型的生产流程，且对于不同的mRNA疫苗品种，其生产流程和分析方法等知识可相互借鉴。图1 加速CMC开发的推动因素1.1 mRNA原液（DS）mRNA平台的优势归因于其具有完全平台化的原液（DS, drug substance）生产工艺和分析方法。简而言之，mRNA原液以质粒DNA（pDNA）为生产起始材料，其生产工艺是一个无细胞过程。pDNA编码病原体（病毒或细菌）抗原，经线性化后与酶和核苷酸混合，经过共转录加帽或酶法加帽为mRNA添加帽结构。随后通过各种色谱技术纯化mRNA，例如亲和层析（AC）、尺寸排阻色谱（SEC）或基于HPLC的方法，以去除与工艺相关的杂质（例如T7 RNA聚合酶、加帽酶、DNase I）、产品相关的杂质（例如dsRNA、RNA片段）。mRNA药物生产中进一步缩短开发时间以及提高安全性相关的关键因素可以总结如下：（1）缩短原料pDNA的生产周期：通过无细胞合成质粒的方法取代基于细胞发酵纯化的传统工艺，从而缩短pDNA的交付时间；（2）优化mRNA合成和纯化工艺以减少副产物：通过优化上游体外转录，如T7聚合酶的体外酶进化，或者转录过程中改变三磷酸核糖核苷（NTP）的比例，同时加入额外的下游色谱步骤，如反相HPLC和纤维素，最大限度地减少或去除反应原副产物的存在。1.2 mRNA成品（DP）药物成品（DP, drug product）在整个开发、制造、分销和疫苗接种阶段发挥着关键作用。mRNA药物成品开发过程中，需进行处方开发和工艺开发，以提供稳定、稳健的药品，符合质量和生产要求，确保产品的安全性和有效性。基于mRNA的疫苗配方包括将酸性（低pH值）的RNA与脂质混合物结合在微流控装置中以制备脂质纳米颗粒（LNP）。LNP的形成是通过带负电荷的mRNA与带正电荷的可电离脂质之间的络合发生的，同时被辅助脂质（胆固醇、磷脂和聚乙二醇化脂质）稳定。随后对LNP进行缓冲液交换和过滤，冻干制剂需加入冷冻保护剂，将产物稀释至目标浓度并在冷冻前填充，通常温度低于-60℃。LNP技术可以很容易地适应平台方法，相同的药物-产品工艺和配方可用于大多数mRNA构建体或目标靶标，特别是当mRNA序列和大小的许多元件是保守的。在COVID-19大流行的情况下，利用先前的数据和技术使疫苗的快速开发成为可能，例如流感mRNA疫苗的工作和LNP的开发。如今，许多新开发的疫苗时间甚至比COVID-19疫苗更短。但开发出能够有效应对大流行的mRNA-LNP疫苗仍面临挑战：如开发出不需要超低温或冷冻储存的mRNA LNP疫苗；如何扩大生产能力；怎样制定出监管机构广泛接受或可以快速验证的平台数据等。1.3 mRNA分析方法mRNA分析平台化最明显的优势就是使用平台程序，可适用于测试不同产品的质量属性，而不会对其操作条件、系统适用性和报告结构产生重大变化，在硬件、耗材/试剂、软件和基础方法都是标准化的，将为药品制造带来许多好处。如，对于mRNA平台，用于纯度评估的色谱或电泳分离程序可能具有相同的关键方法参数，但也可根据需要对具体产品开发定制的操作条件。图2 分析方法平台化耀海生物质量研究服务平台耀海生物针对DNA原液、mRNA原液和LNP制剂成品相关的30多种质量属性建立了稳健的分析方法和检测规范。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质；mRNA原液完整性、聚集体、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA（dsRNA）、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关杂质。LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP脂质组分与含量。耀海生物基于CE, HPLC, LC-MS, ELISA, qPCR, 及细胞转染平台，可为mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测，全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）耀海生物mRNA质量研究服务详情：耀海生物mRNA药物分析方法开发及样品检测服务二、创新和数字化解决方案的利用2.1 数字平台的使用越来越多的证据表明，mRNA技术的一些关键挑战（如热稳定性差、免疫原性和蛋白质产量有限）与mRNA分子本身的性质有着内在的联系。特别是与RNA序列和结构紧密相关。由于各项参数的选择空间极大，优化疫苗设计的mRNA序列有着极多的组合，使用传统的实验方法花费成本极高且效率较低，但计算模型可以有效地通过空间进行采样，以寻找最佳候选疫苗。因此，可以通过构建机器学习等计算方法，以根据来自各种mRNA 分子的实验数据来识别与重要 mRNA 特性相关的序列和结构模式，包括候选疫苗、编码模型蛋白的mRNA，甚至天然人类转录组。除了为RNA生物化学和分子生物学提供新的见解外，还可以开发计算方法来优化mRNA分子以改善其相关特性。使用这种方法优化的mRNA 疫苗序列与源自病原体基因组的原始序列有显着不同，但仍编码相同的病原体蛋白并提供良好的免疫保护。与野生型序列相比，优化的mRNA可能表现出，例如，密码子优化性增加，导致人细胞中蛋白质表达增加，或更高水平的二级结构，与溶液稳定性的提高有关。在COVID-19大流行初期批准的两种mRNA疫苗都经过了计算优化，这不仅改善了产品特性，而且缩短了开发时间。例如，Moderna之前开发的序列优化平台技术使Spikevax疫苗的mRNA序列能够在短短一小时内完成设计。2.2 连续生产（CM）连续生产（CM, Continuous Manufacturing）在原液和制剂层面越来越受到关注，同时也得到了监管机构的支持。CM具有多种优势，例如占地面积小，由于水和能源消耗更低以及全球变暖潜力更低，因此更具可持续性。此外，CM通过建模和过程分析技术的引入为数字化带来了更多的机会，大大缩短了研发周期。目前，连续生产的概念可以扩展到 mRNA 平台，首先是mRNA原液的连续生产：以线性化DNA为起始材料，mRNA的体外转录、加帽等反应是酶介导的无细胞体系，更有潜力实现连续生产。其次是RNA-LNP制剂的连续生产：将LNP包封工艺进一步连接到连续配方和灌装过程。利用LNP形成过程本身是连续的特性，将溶解在乙醇中的脂质与含有mRNA的水性缓冲液连续混合，以封装在微流控装置或其他混合装置中。脂质通过可电离脂质的存在沉淀捕获mRNA。混合质量直接调节粒径分布和包封率，影响疫苗的稳定性和效力。连续自动化的mRNA LNP生产过程可以通过减少人员和耗材控制成本，同时也使得工厂的刚需规模变小，便于在全球范围内快速部署。图3 连续生产工艺流程示意图三、结语这篇综述全面概述了包含mRNA在内的多种疫苗的CMC开发策略和技术推动因素，以支持加速获得疫苗。这些方法的成功实施取决于在原液（DS）、制剂（DP）和分析和检测平台方面的疫苗相关经验储备，跨学科协同也必不可少。同时，在mRNA序列优化和结构设计方面着重引入数据模型和算法，可加快最优序列的开发。此外，实现mRNA的连续生产也可能是未来开发的一大趋势。作为一种新兴技术，使用mRNA作为疫苗仍然面临诸多挑战，仍需克服核心技术的高壁垒。同时，对监管机构而言，与产品特性相匹配的相关法规和技术指导原则仍有待完善。随着生物技术的飞速发展，相信在不久的将来，基于mRNA技术的产品将在生物制品领域占有重要的地位。基于在IVT RNA制备方面的开创技术和丰富经验，耀海生物可为全球客户提供IVT RNA（mRNA, saRNA, circRNA）一站式制备服务，涵盖DNA序列设计、IVT RNA制备、RNA环化、RNA纯化、RNA冻干、LNP包封、RNA质量检测。耀海生物还提供各种预制型质粒模板（质粒+菌液）、以及IVT RNA产品（原液/冻干粉）、LNP成品，编码蛋白涵盖报告基因、靶点蛋白、基因编辑蛋白和抗原蛋白，包括eGFP、mCHERRY、luciferase、IL-2、Cas9、OVA、新冠S蛋白等，以满足不同的实验或项目需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）。耀海IVT RNA业务详情：耀海生物重磅推出mRNA科研级样品定制合成一站式解决方案 eGFP mRNA和mCherry mRNA在293T细胞中实现高表达参考文献[1] Castellanos MM, Gressard H, Li X, Magagnoli C, Moriconi A, Stranges D, Strodiot L, Tello Soto M, Zwierzyna M, Campa C. CMC Strategies and Advanced Technologies for Vaccine Development to Boost Acceleration and Pandemic Preparedness. Vaccines (Basel). 2023 Jun 26;11(7):1153. doi: 10.3390/vaccines11071153.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。