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SA14-14-2乙型脑炎病毒Vero细胞疫苗候选株的筛选及其表型和基因型特征

2024-01-20

疫苗临床研究

中文摘要目的研制以Vero细胞为生产基质的SA14-14-2乙型脑炎（乙脑）减毒活疫苗候选毒株。方法将SA14-14-2株原始病毒在Vero细胞上传代并进行空斑克隆，对克隆株病毒进行Vero细胞培养。使用3周龄小鼠及3日龄乳鼠对脑内致病力进行测定，并进行乳鼠脑内回传、弱毒稳定性实验及免疫力实验等。结果挑选到10个病毒克隆株，通过全面对比后，筛选到1株病毒滴度高（>6.0 lgPFU/ml）且稳定的毒株 SA14-14-2 VC6 。将该株与SA14-14-2原始株进行主要指标对比，结果表明，VC6株全基因序列与原株相比仅有1个位点发生突变（S66L），对小鼠和乳鼠的脑内致病力、弱毒稳定性、免疫原性均与原株相同。结论筛选到的SA14-14-2 VC6株符合中国药典乙脑减毒活疫苗生产毒种的要求，各项主要指标不劣于SA14-14-2生产用毒种，是可应用Vero细胞培养生产的乙脑疫苗候选株。正文SA14-14-2乙型脑炎（乙脑）减毒活疫苗生产用细胞基质为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级地鼠肾细胞，SPF级地鼠群由成都生物制品研究所有限责任公司（成都生物公司）在中国首次建立（地鼠样品经英国Q-One Biotech LTD实验室全面安全检测，结果均为阴性），符合国际标准，特别是不含逆转录病毒。用地鼠肾细胞生产的SA14-14-2疫苗（SA14-4-2 PHK）于2013年通过WHO预认证，疫苗安全性已经WHO专家多次会议及大规模临床观察肯定。近20年来，随着乙脑减毒活疫苗的大量接种，乙脑发病率大幅下降，基本得到控制。尽管乙脑减毒活疫苗的安全性和保护效果已被国内外专家及WHO肯定，但个别学者认为SA14-14-2 PHK是应用动物原代细胞生产的疫苗，可能存在外源病毒污染的风险，另有报道否认WHO对应用地鼠肾细胞生产疫苗的认可，极大地影响了中国首创生产的乙脑减毒活疫苗的国际市场。另一方面，以非洲绿猴肾细胞（ Vero细胞）为疫苗生产基质在生产工艺和质量控制上较地鼠肾细胞更具优势，美国已开始研制SA14-14-2株全病毒的Vero细胞减毒活疫苗。鉴于发展 SA14-14-2 Vero细胞株的重大意义，本课题组开始研发SA14-14-2株Vero细胞疫苗。本研究将SA14-14-2株病毒在Vero细胞上传代和空斑纯化，以筛选SA14-14-2适应株，并比较其与原始株SA14-14-2的致病性、病毒稳定性、免疫原性和基因特征，探讨其用作Vero细胞生产用疫苗候选株的可能性。1材料与方法1.1细胞、病毒及动物Vero细胞、BHK-21细胞（幼地鼠肾细胞）均由中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室保存；SA14-14-2减毒活疫苗，为成都生物公司的SA14-14-2 PHK株；乙脑病毒野生株P3株由中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室保存。SPF级17~19日龄（12~14 g）KM小鼠、SPF级3~5日龄KM乳鼠均由中国食品药品检定研究院实验动物中心提供，所有动物实验均由中国食品药品检定研究院实验动物福利与伦理委员会批准〔批准代码：2019（A）062〕，并按照机构指南进行。1.2主要试剂耗材DMEM（Cat.11965-092）、MEM （Cat.11965-080）培养基，胎牛血清（Cat.10091-148），0.25%胰蛋白酶（Cat.25200-072）均购自美国Gibco公司；MEM粉末培养基（Cat.M0769）、甲基纤维素粉末（Cat.M0512）购自美国Sigma公司；病毒RNA提取试剂盒（Cat.52904）购自德国QIAGEN公司；逆转录试剂盒（Cat.A5000）购自美国Promega公司。1.3病毒传代稳定性及空斑纯化将Vero细胞培养传代，待细胞长至致密单层时，以病毒感染复数为0.1的比例接种SA14-14-2株病毒，37 °C吸附1 h后，补加病毒维持液，置于37 °C细胞培养箱进行培养。待显微镜下观察到明显的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）时，离心收取上清病毒液。按上述操作将病毒连续传代。将Vero细胞转移至6孔细胞板进行培养，待细胞生长至致密单层时，使用病毒稀释液将病毒进行系列稀释，细胞37 °C吸附1 h后，补加1层琼脂覆盖物，置于37 °C细胞培养箱继续培养，5 d后补加第2层中性红覆盖物，48 h后挑选病毒形成的单个噬斑。将挑取的病毒克隆株在Vero细胞上进行病毒扩增传代。1.4病毒滴度测定将BHK-21细胞转移至6孔细胞板进行培养，待细胞生长至致密单层时，使用病毒稀释液将病毒进行系列稀释，细胞37 °C吸附1 h后，补加甲基纤维素溶液，置37 °C细胞培养箱继续培养，5 d后用结晶紫染色液室温染色20 min，流水冲洗、晾干后计算病毒滴度，以 lgPFU/ml表示。1.5脑内致病力及皮下致病力17~19日龄（12~14 g）的KM小鼠10只脑内注射病毒或病毒稀释液，每只0.03 ml，观察14 d，记录发病及死亡情况。17~19日龄（12~14 g）的KM小鼠10只皮下注射病毒或病毒稀释液，每只0.1 ml，同时空刺小鼠右侧脑腔破坏血脑屏障，观察14 d，记录发病及死亡情况。1.6乳鼠脑内致病力实验3~5日龄的KM乳鼠脑内注射不同稀释度病毒液，每只0.02 ml。观察小鼠14 d，记录发病及死亡情况，计算lg半数致死剂量（median lethal dose，LD50）/ml。1.7弱毒返祖实验3~5日龄的KM乳鼠10只脑内注射病毒，每只0.02 ml。每日观察小鼠，取最早发病的3只乳鼠，立即处死取鼠脑，每只乳鼠鼠脑以2 ml 病毒稀释液进行研磨，离心后收取上清液，即为鼠脑病毒研磨液。将研磨液进行系列稀释后，用12~14 g KM小鼠进行脑内致病毒力测定。1.8免疫原性实验17~19日龄（12~14 g）的KM小鼠皮下注射病毒或病毒稀释液，每只0.1 ml，共免疫 2组。免疫14 d后，对其中1组的每只小鼠进行采血，分离血清后以噬斑减少中和实验测定其中和抗体滴度；另1组小鼠以乙脑强毒株P3株进行腹腔攻毒，每只0.3 ml，同时空刺小鼠脑腔，记录14 d内发病及死亡情况。1.9噬斑减少中和实验将BHK-21细胞以2.5×105 ml -1转移至24孔细胞板培养，待细胞长至致密单层时，加入不同稀释度的免疫血清（见1.8）与1 000 PFU/ml P3强毒株的等量混合液，置于37 °C中和90 min；中和完成后，取血清病毒混合物，37 °C 吸附于细胞1 h后，补加甲基纤维素溶液，置于 37 °C细胞培养箱继续培养，5 d后使用结晶紫染色液室温染色20 min，流水冲洗待晾干后进行滴度计算，结果采用双因素方差分析和 Tukey多重比较检验，分析不同组别中和抗体滴度的差异。病毒基因测定提取不同代次病毒RNA后反转录为cDNA。使用Oligo7以SA14-14-2序列（GenBank accession No. D90195）为模板，设计7对引物，进行分段逆转录PCR扩增，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成及扩增片段的测序。2结果2.1SA14-14-2病毒株在Vero细胞培养传代及空斑纯化将SA14-14-2株在Vero细胞上连续传3代，从第1代开始病毒滴度已较高，为6.7 IgPFU/ml，表明Vero细胞对SA14-14-2株很敏感，继续传2代，滴度没有进一步升高，第2、3代滴度分别为7.1和6.5 lgPFU/ml。以第3代病毒收获液进行空斑纯化克隆，得到10株克隆株，分别标记为SA14-14-2 VC1 — SA14-14-2 VC10 。2.1.1 各克隆株在Vero细胞上传不同代次的病毒滴度 10株克隆株分别在Vero细胞上连续传5代，进行滴度测定，结果见表1 。各克隆株病毒在Vero细胞上传代的过程中滴度有一定波动，但是均不低于5.0 lgPFU/ml，传至第5代滴度仍维持在6.0 lgPFU/ml以上。2.1.2 各Vero细胞克隆株对3周龄小鼠的脑内和皮下致病力将10株病毒在Vero细胞上连续传5代，测定各代病毒的小鼠脑内致病力和皮下致病力。结果显示，各代病毒对小鼠皮下感染均不致病，而脑内感染后除VC3和VC9各有4个和3个代次的小鼠死亡外，仅VC1、VC4、VC7、VC8和VC10克隆株有1个代次的小鼠死亡。其中，有3个克隆株病毒（VC2、VC5、VC6）传8代后，每代均对小鼠无致病性，维持稳定的弱毒特性。2.1.3 各Vero细胞克隆株对乳鼠脑内致病力实验结果显示，各克隆株对乳鼠脑内致病力高低有明显差异，高者≥5.5 lgLD50/ml，低者≤ 3.6 lgLD50/ml，其中VC6株毒力最低（表2）。2.1.4 Vero细胞克隆株弱毒稳定性实验病毒通过3~5日龄乳鼠脑内回传1代后，测定发病乳鼠脑内病毒致病力是否提高到乙脑强毒株水平，用于评价弱毒株毒力是否返祖。按中国药典2020年版三部（药典三部）中SA14-14-2乙脑减毒活疫苗规程的标准判定，毒力≥3.0 lgLD50/0.03 ml（即≥4.5 lgLD50/ml）为毒力返祖。将P5代1、2、6号Vero克隆株进行2次重复实验，返祖致病力结果均＜4.5 IgLD50/ml，符合规程标准（表3 ）。2.1.5 Vero细胞克隆株的免疫原性比较选取 VC1、VC2、VC6株分别以不同病毒剂量单次皮下免疫小鼠，各2组，免疫14 d后，其中1组小鼠每只采血测定中和抗体，另1组以103 LD50 P3强毒株腹腔攻毒0.3 ml，14 d内观察小鼠死亡情况并计算保护率。实验结果（表4 ）显示，3株病毒株均有良好的免疫原性。10 PFU免疫小鼠后血清阳转率均≥50%，中和抗体几何平均滴度在30~80之间，其中VC6株在不同剂量免疫的小鼠中均能产生略高于另2株的抗体水平；从保护水平看，各克隆株以100 PFU免疫小鼠的保护率均能达到70%及以上，其中VC6株免疫后小鼠保护率最高，获得了100%保护率。以上结果显示，SA14-14-2 VC6株可以在Vero细胞上稳定增殖，病毒滴度可达6.0 lgPFU/ml以上；脑内和皮下接种对3周龄小鼠均无致病力，对乳鼠脑内致病力最低（≤3.6 lgLD50/ml），同时乳鼠回传后毒力也最低（＜1.0 lgLD50/ml）。免疫原性结果显示，SA14-14-2 VC6株产生了更强的抗体应答和保护效果，以下进一步将VC6株与成都生物公司生产的乙脑疫苗SA14-14-2 PHK株进行主要指标的实验比较。2.2SA14-14-2 VC6株与SA14-14-2 PHK株的主要特征比较2.2.1 脑内致病力 SA14-14-2 VC6株对 17~19日龄成鼠无脑内致病性，与SA14-14-2 PHK株一致，2株病毒对3~5日龄乳鼠的脑内致病力无明显差异（表5）。2.2.2 乳鼠脑内回传后毒力返祖将2株病毒在乳鼠脑内回传后进行小鼠脑内毒力比较。实验显示，2株病毒的毒力返祖结果相同，均小于1.0 lgLD50/ml，符合药典三部规定（表6 ）。2.2.3 免疫原性比较依照上节所述方法，将 2株病毒以不同病毒剂量皮下免疫小鼠，各2 组。免疫14 d后，其中1组小鼠每只采血测定中和抗体，另1组以105 LD50 P3株强毒株腹腔攻毒，14 d内观察小鼠死亡情况并计算保护率（表7）。结果显示，2株病毒诱导抗体应答的水平基本相同，SA14-14-2 VC6株在低免疫剂量时的保护力高于SA14-14-2 PHK株，SA14-14-2 VC6株保护率较原始株高1倍。2.2.4 全基因序列的比较对2株病毒进行全基因测序（表8）。结果显示，SA14-14-2 VC6在Vero细胞上传5代后，与SA14-14-2原始株相比，仅有C-292-T（S66L）1处位点发生突变，而药典三部所规定的8处包膜蛋白关键毒力位点均未发生改变，与SA14-14-2原始株相同。3讨论当前全球广泛应用的乙脑疫苗主要有3种类型：一种是中国生产的SA14-14-2株原代地鼠肾细胞制备的乙脑减毒活疫苗，另两种为基于 SA14-14-2株全病毒制备的灭活疫苗（IC50）和SA14-14-2乙脑/黄热病（JE/YF）嵌合体活疫苗JE-CV（IMOJEV），均使用Vero细胞生产。中国自主创新研制成功的SA14-14-2株乙脑减毒活疫苗由成都生物公司生产，生产用SA14-14-2株毒种由中国药品生物制品检定所建株保存。多种敏感动物脑内注射该病毒株不致病，其表型及基因型十分稳定，免疫原性良好，能诱发较强的体液免疫和细胞免疫应答。用地鼠肾细胞生产的SA14-14-2疫苗于 1989年开始在国内应用，2006年纳入国家免疫规划，在国内各省市全面接种，至今使用量已超过10亿剂次，预防效果十分显著，乙脑年发病率持续下降。2002年开始在韩国进行临床观察，之后在尼泊尔、印度等国大规模应用，至今已出口12个国家，接种量超5亿剂次。为开发以Vero细胞为基质的SA14-14-2株新一代乙脑减毒活疫苗，本研究将SA14-14-2 乙脑减毒株在Vero细胞上培养传代并空斑纯化筛选。从多株病毒培养滴度高且毒力弱的克隆株中进一步筛选得到1株病毒滴度高、神经毒力最低且免疫原性最强的SA14-14-2 VC6克隆株。与SA14-14-2原始株对比，全基因序列仅有S66L 1个位点发生突变，且该位点已被报道与Vero细胞适应性相关；其他各项指标均非劣于原始株，符合药典三部中乙脑减毒活疫苗的毒株要求，是可应用于Vero细胞生产的SA14-14-2候选毒株。以SA14-14-2株的前膜蛋白和膜蛋白与黄热病毒（yellow fever virus，YFV）17D非结构蛋白（nonstructural protein，NS）构建的 JEV/YFV嵌合体乙脑活病毒，在Vero细胞上培养制成减毒活疫苗，该疫苗已获批上市，目前正在西方国家和亚洲一些发达国家大量应用，并以Vero细胞优于地鼠肾细胞为由在亚洲扩大应用，逐步替代中国的地鼠肾细胞培养的 SA14-14-2活疫苗。本文研究的以Vero细胞培养的SA14-14-2 全病毒疫苗与国外的JEV/YFV嵌合体病毒疫苗不同，后者缺乏乙脑病毒的NS成分，而黄病毒属病毒的NS是诱生T细胞免疫应答和保护作用的主要蛋白。其中以NS1和NS3尤为重要。在亚洲和南美洲1项为期3年的长期观察中，使用相同技术构建的YFV/登革病毒（dengue virus，DENV）四价嵌合体登革热疫苗Dengvaxia被证明缺乏保护效果，且产生了极其明显的抗体依赖性增强作用。专家普遍认为其原因主要是YFV/DENV嵌合疫苗缺乏 DENV的NS，因而不能产生针对DENV的T细胞应答和抗NS1抗体的免疫保护作用，而YFV间T细胞交叉免疫效果又很弱。记忆T细胞在YFV疫苗中对保持疫苗的免疫持久性特别重要，YFV/DENV嵌合疫苗免疫原性不全面、不持久，导致若干年后产生抗体依赖性增强效应，而难以扩大应用。近期本实验室以小鼠为模型比较了中国的SA14-14-2全病毒减毒活疫苗和国外的 YFV/JEV（JE-CV）嵌合疫苗的体液和细胞免疫应答，结果显示，对于体液免疫应答，SA14-14-2疫苗各不同剂量免疫小鼠的中和抗体滴度均略高于JE-CV组免疫小鼠；对于保护效果，在低免疫剂量组中SA14-14-2疫苗明显优于JE-CV组，小鼠保护率达到80%（JE-CV 组20%）；对于细胞免疫应答，SA14-14-2疫苗免疫小鼠可针对JEV-NS3多肽产生特异性 T细胞免疫应答，而JE-CV不能，前者针对JEV 细胞裂解物总抗原和全病毒抗原产生的T细胞免疫水平也强于JE-CV。结果证实，YFV全病毒能产生针对本病毒的T细胞免疫，而以异源YFV为骨架构建的嵌合体疫苗不能产生针对疫苗病毒的细胞免疫，且保护效果显著低于全病毒疫苗。尽管以Vero细胞生产的JE-CV嵌合疫苗在西方和亚洲某些发达国家广泛应用，但并不被西方国家专家普遍看好，美国NIH已着手研究 SA14-14-2株的全病毒Vero细胞疫苗，用于发展第2代SA14-14-2全病毒减毒活疫苗。总之，以Vero细胞为基质发展SA14-14-2新一代减毒活疫苗已被国际看好。本研究筛选到的SA14-14-2 VC6株在Vero细胞上培养后病毒滴度高、神经毒力低、弱毒特性稳定，并且免疫原性略高于SA14-14-2原始株，是适用于 Vero细胞生产的SA14-14-2候选毒株，在全球具有很大的应用前景。WHO十分重视以Vero细胞为疫苗生产基质制备乙脑疫苗，目前除上述JE-CV嵌合体活疫苗，用Vero细胞生产的IC50灭活疫苗已在全球广泛应用，近年来又有印度2家公司用Vero细胞生产乙脑灭活疫苗，其中1家很快得到WHO预认证。由于以Vero细胞生产的嵌合体活疫苗和灭活疫苗，对于中国以地鼠肾细胞生产的减毒活疫苗具有很大的挑战，因此研制Vero细胞 SA14-14-2疫苗十分必要和迫切。作者刘晓辉1,2 李淼1,2 刘欣玉1 徐宏山1 房恩岳1 俞永新1 李玉华11中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室，北京 102629；2长春生物制品研究所有限责任公司科研开发部，长春 130012通信作者：李玉华，Email：liyuhua@nifdc.org.cn引用本文：刘晓辉，李淼，刘欣玉，等. SA14-14-2乙型脑炎病毒Vero细胞疫苗候选株的筛选及其表型和基因型特征 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(6): 315-322. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230306-00022识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。