唾液酸修饰的mRNA疫苗：靶向树突状细胞并促进核内体逃逸
2024-01-08
疫苗信使RNA
近期，沈阳药科大学邓意辉教授团队在《Journal of Controlled Release》期刊2023年第529-545期上发表了题为“Simultaneous dendritic cells targeting and effective endosomal escape enhance sialic acid-modified mRNA vaccine efficacy and reduce side effects”的研究论文。该团队开发了一种唾液酸胆固醇衍生物（SA-AE-AC-CH）和可断裂PEG脂质共修饰的mRNA肿瘤疫苗，该疫苗不仅能靶向树突状细胞（Dendritic cells， DCs），还能够在DCs中实现快速核内体逃逸，显著增加mRNA编码的抗原蛋白在DCs中的表达，提升疫苗的治疗效果，并减轻mRNA疫苗的副作用。图形摘要树突状细胞(Dendritic Cells, DCs)是唯一能够激活naïve T细胞的抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells, APCs)，已成为疫苗开发的重要靶点[1-2]。mRNA具有高效率和自佐剂的特性，开发DCs靶向mRNA疫苗具有良好的前景。然而，由于DCs靶向通常需要配体与细胞表面的受体结合，许多种配体与受体的结合常导致已被内吞的物质进入溶酶体腔室。如何使用单个纳米载体同时实现DCs靶向和有效的内体/溶酶体逃逸是目前开发DCs靶向mRNA疫苗亟需解决的问题。此外，维持脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles，LNPs)稳定性的PEG脂质会掩盖靶向配体[3]，降低DCs的靶向效率。基于以上问题，邓意辉教授研究团队开发了一种唾液酸（Sialic acid，SA）胆固醇衍生物和可断裂PEG脂质修饰的mRNA疫苗，该疫苗能够同时靶向DCs并有效地逃离细胞核内体。首先，唾液酸修饰的mRNA疫苗通过结合DCs上表达的唾液酸免疫球蛋白样凝集素-1 (Siglec-1)来靶向DCs[4]。其次，mRNA疫苗接种后促进I型干扰素分泌，诱导DCs上调Siglec-1[5]，进一步提高SA修饰mRNA疫苗在注射部位靶向DCs的能力。最后，90%的SA修饰 mRNA疫苗在4小时内从早期核内体(Early Endosomes，EEs)中逃逸，避免进入溶酶体途径，mRNA同时在细胞质和内质网的核糖体中翻译，使mRNA编码的蛋白在DCs中的表达量增加了一倍。该疫苗在制备过程中，用可断裂的mPEG2000-胆固醇半琥珀酸酯(Pchs)取代了市售mRNA疫苗中的mPEG2000-二肉豆蔻酰甘油 (mPEG2000-DMG)，减轻了反复注射导致疫苗效力下降和毒副作用增加的风险。PEG的脱离还促进了SA的充分暴露，进一步提高了DCs靶向效率。图1. LNPs的合成与表征首先，通过微流体混合法制备了唾液酸胆固醇衍生物（SA-AE-AC-CH）和可断裂mPEG2000-胆固醇半琥珀酸酯(Pchs)共修饰的mRNA LNPs。体外细胞转染实验表明，SA修饰的装载萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase， Fluc）/增强绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）mRNA的LNPs在DC2.4细胞和骨髓来源的树突状细胞（Bone Marrow Derived Cells，BMDCs）中的转染效率显著高于市售配方制备的LNPs和未经SA修饰的LNPs（图2）。图2. LNPs的DCs转染效率进一步研究发现，SA修饰的DiD标记Fluc mRNA LNPs在DCs中的早期核内体与溶酶体逃逸率均高达90%。基于以上实验结果，作者将细胞摄取、早期内体逃逸与溶酶体逃逸三个过程的效率整合在一起，提出了转染指数 (Transfection index，TFindex )，并用该项指标评价不同LNPs的细胞转染效率。该项指标与细胞的转染效率呈正相关，且可用于计算细胞转染实验选择mRNA浓度的合理范围（图3-4）。转染指数的计算公式：TF index A = {eEE + (1 - eEE) × eLyso } × MFI LNPs = (eEE + eLyso - eEE × eLyso) × MFI LNPsTF index B = eEE × eLyso × MFI LNPs(eEE: 早期核内体逃逸效率, eLyso:溶酶体逃逸效率, MFI LNPs: 细胞吞噬LNPs的平均荧光强度)图3. SA修饰的LNPs的溶酶体逃逸效率图4. SA修饰的LNPs的早期核内体逃逸效率及转染指数为进一步验证SA修饰LNPs是否能够在体内有效靶向DCs，将包封Fluc mRNA或EGFP mRNA的LNPs静脉注射入小鼠体内。结果表明，SA修饰不仅促进了LNPs在小鼠脾脏中表达mRNA编码蛋白，还增加了LNPs在脾脏DCs中的转染效率。在充分证明了SA修饰mRNA LNPs具有体内DCs靶向性之后，作者将编码卵清蛋白的mRNA（Ovalbumin，OVA，是一种在疫苗体内研究实验中常用的抗原蛋白）包封于SA修饰的LNPs内，并将其用于评价SA修饰mRNA疫苗体内抗肿瘤效果的相关研究。实验结果表明，SA修饰还能够激活并产生大量抗原特异性T淋巴细胞，启动肿瘤免疫循环，显著提升mRNA疫苗的抗肿瘤效果（图5-6）。图5. SA修饰的LNPs能有效转染脾脏DCs图6. SA修饰mRNA疫苗经静脉注射可提高抗肿瘤效果，启动肿瘤免疫循环一般而言，皮肤组织中含有丰富的抗原提呈细胞，疫苗通过皮下注射的疗效往往优于静脉注射。为此，作者进一步研究了疫苗皮下注射的抗肿瘤效果，结果表明SA修饰的mRNA疫苗治疗组小鼠的肿瘤抑制达到95%，远高于市售配方制备的mRNA疫苗组。而未修饰SA的mRNA疫苗治疗组中，一半的小鼠肿瘤抑制率高于90%，另外一半小鼠的肿瘤抑制率仅有60%，组内存在较大的治疗差异。说明SA修饰的mRNA疫苗能够更准确地将抗原信息传递给DCs，随后DCs在注射部位附近的淋巴结中将抗原提呈给T淋巴细胞，产生一群能够特异性识别肿瘤抗原的T淋巴细胞，这些抗原特异性T淋巴细胞被运输到肿瘤组织，对肿瘤进行精准打击。此外，作者还发现市售配方制备的mRNA疫苗导致50%的小鼠在首次疫苗接种后的第14天（第三次疫苗注射后）出现体重显著减轻，其体重下降百分率高达15%。这表明，目前市售配方制备的mRNA疫苗存在严重的毒副作用，而SA修饰mRNA疫苗组的小鼠没有出现这种情况。副作用的显著减轻可归因于使用可断裂的PEG脂质材料，因为有报道称PEG2000-脂质偶联物可能参与SARS-Cov-2 mRNA疫苗的过敏反应，而不是天然形式的PEG[6]。值得注意的是，SA修饰的mRNA疫苗也显著延长了荷瘤小鼠的生存时间，其中一只小鼠肿瘤完全消退，在随后的6个月内无复发迹象（图7）。图7. 皮下注射SA修饰mRNA疫苗治疗肿瘤机理研究发现，SA修饰的mRNA疫苗治疗组小鼠的脾脏和淋巴结中的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTLs）水平最高，CD8+IFN-γ+ T细胞的百分比是1.5Pdmg-LNPs组小鼠的2倍。皮下注射SA修饰的mRNA疫苗后, 肿瘤引流淋巴结产生的CTLs占比达3%，静脉注射SA修饰的mRNA疫苗后，肿瘤引流淋巴结产生的CTLs占比为1%（图8）。图8. 皮下注射SA修饰的mRNA疫苗可激活肿瘤引流淋巴结中的T细胞总之，作者开发的唾液酸(SA)修饰的mRNA疫苗，同时实现了DCs靶向和有效的核内体逃逸。SA修饰的mRNA疫苗可被DCs快速摄取，并有效逃离早期核内体，避免进入溶酶体，实现mRNA在分布于细胞质与内质网的核糖体中同时翻译，使mRNA编码蛋白在DCs中的表达量显著增加。作者整合了LNPs在细胞内多个过程中的效率，首次提出了转染指数计算公式，并通过转染指数逆推得到体外细胞转染实验中mRNA的最优浓度范围。作者首次将可断裂的PEG-胆固醇半琥珀酸酯(Pchs)应用于mRNA疫苗中，不仅Pchs具有与mPEG2000-DMG相似的LNPs成型性，而且PEG脱离LNP有利于细胞摄取和充分暴露SA，进一步提高了DCs靶向效率。作为免疫药剂学（Immune pharmaceutics，Immunopharmaceutics）的一个重要例子，SA修饰的mRNA疫苗比按照市售配方制备的mRNA疫苗具有更好的治疗效果和更低的副作用，且由于Siglec-1具有高度保守性[7]，更有利于此项研究成果的临床转化。研究亮点首次应用SA-脂类衍生物和可断裂PEG-胆固醇半琥珀酸酯共同修饰mRNA疫苗； 所制备的SA修饰mRNA疫苗兼具DCs靶向性和高效的内体/溶酶体逃逸，提高抗肿瘤效果，降低毒副作用；提出了转染指数，并用这一指标优化了对mRNA递送载体进行效率评价的方法。文章信息Volume 364, December 2023, Pages 529-545https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.11.008作者信息 通讯作者 邓意辉，沈阳药科大学，教授，研究方向为靶向纳米药物递送系统及聚乙二醇的加速血液清除现象。宋艳志，沈阳药科大学，副教授，研究方向为靶向纳米药物递送系统。 第一作者 汤雪莹，沈阳药科大学，博士研究生，研究方向为靶向纳米药物递送系统及肿瘤疫苗。参考资料Y. Gao, Z. Wang, Y. Cui, M. Xu, L. Weng, Emerging strategies of engineering and tracking dendritic cells for cancer immunotherapy, ACS Appl. Bio Mater. 6 (2023) 24–43.Y. Bo, H. Wang, Biomaterial-based in situ cancer vaccine, Adv. Mater. (2023) 1521–4095, e2210452.Fan, K., et al., Ferritin Nanocarrier Traverses the Blood Brain Barrier and Kills Glioma. ACS Nano, 2018. 12(5): 4105-4115.E. Samaridou, J. Heyes, P. Lutwyche, Lipid nanoparticles for nucleic acid delivery:current perspectives, Adv. Drug Deliv. Rev. 154 (2020) 37–63.A.J. Affandi, J. Grabowska, K. Olesek, M. Lopez Venegas, A. Barbaria,E. Rodríguez, et al., Selective tumor antigen vaccine delivery to human CD169(+)antigen-presenting cells using ganglioside-liposomes, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.117 (2020) 27528–27539H. Akiyama, N.P. Ramirez, G. Gibson, C. Kline, S. Watkins, Z. Ambrose, et al.,Interferon-inducible CD169/Siglec1 attenuates anti-HIV-1 effects of alphainterferon, J. Virol. 91 (2017). Oct 13;91(21):e00972-17. B. Cabanillas, N. Novak, C.A. Akdis, The form of PEG matters: PEG conjugated with lipids and not PEG alone could be the specific form involved in allergic reactions to COVID-19 vaccines, Allergy 77 (2022) 1658–1660.K.F. Bornhofft, ¨ T. Goldammer, A. Rebl, S.P. Galuska, Siglecs: a journey through the evolution of sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins, Dev. Comp. Immunol. 86 (2018) 219–231. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。
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