高通量筛选共价结合药物：不同分析平台的应用及策略

2024-07-18

前言共价抑制剂含有特定的功能基团，可以与疾病形成的关键介导蛋白的相应位点形成共价键[1]，使其构象变化，抑制其活性从而失去病理学功能。相较于非共价结合，比如氢键、范德华力、静电相互作用和疏水相互作用来说，共价结合解离需要更多的能量，通过共价键与靶蛋白结合更加持久。与非共价抑制相比，共价键的形成即使在相对较低的浓度下也能实现靶标完全占位[2]，共价抑制剂因此具有延长药效时间、给药频率减少、更高的选择性等优势。共价键形成和解离是动态平衡的过程 (如图1所示)：抑制剂 (Inhibitor, I) 首先与目标蛋白 (Protein, P) 非共价结合，形成可逆亲和复合物 (PI)；结合的 I 与 P 在结合位点形成不可逆共价键(红色)，产生失活的共价复合物 (PI*)，大部分共价抑制剂对蛋白的修饰通常是不可逆的。共价结合药物是药物发现领域中发展迅速的学科。本文将重点介绍共价结合药物的高通量筛选与表征平台：基于完整蛋白（Intact Protein）的高分辨质谱筛选与表征平台、差示扫描荧光法（DSF）的高通量筛选平台、基于肽图分析的结合表征平台，为药物研发者提供技术支撑。图1. 共价抑制剂机制[3] 共价药物研发的历史与策略自从18世纪后期首次出现共价抑制剂以来，共价抑制剂领域已取得了显著进展，目前约30％的市售药物为共价抑制剂[4]。许多历史上的共价抑制剂都是偶然发现的，后来才被证明可以通过共价结合来发挥治疗作用，比如两种众所周知且广泛使用的共价抑制剂分别是阿司匹林和青霉素[5]。阿司匹林是环氧合酶的不可逆抑制剂，通过乙酰化活性位点丝氨酸残基起作用，减少前列腺素的合成，进而达到镇痛、解热、抗炎和抗血小板聚集的效果。青霉素与糖肽转肽酶的活性位点丝氨酸共价结合，使酶失活，在细菌细胞壁合成期间催化肽聚糖链的交联，青霉素通过干扰肽交联桥的形成，使细菌失去抗渗透能力，因此细菌停止生长或死亡。共价结合药物经历了从偶然发现到“可逆优先”，再到“亲电优先”的一系列的发展[6]（如图2所示）。“可逆优先”是将反应性官能团（例如丙烯酰胺）附加到可逆抑制剂上，基于此方法成功开发了阿法替尼（Afatinib）、奥希替尼（Osimertinib）和阿卡替尼（Acalabrutinib）等药物。“亲电优先”是利用反应柄化合物库（亲电试剂库）筛选并识别与靶蛋白的特定氨基酸残基形成共价键的反应柄，可用于不可成药靶点。例如，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog, KRAS）是经典的不可成药靶点，具有结合浅口袋、对天然底物或辅助因子具有高亲和力，抑制剂与底物之间进行强竞争，需要高剂量抑制剂。科学家们发现KRASG12C突变体的半胱氨酸可以被共价小分子药物靶向，并成功开发了索托拉西布（Sotorasib）和阿达格拉西布（Adagrasib），它们代表了共价药物发现的第三个时代的开始，靶向共价抑制剂的开发再度兴起。图2. 已上市共价抑制药物的发展进程[6] 除上述的直接抑制剂外，还有两种通过共价作用机制，但不需要小分子直接抑制靶蛋白的策略：一种是靶向蛋白质降解，最常用的小分子降解剂是双特异性化合物，称为PROTACs（Proteolysis-Targeting Chimeras），是利用泛素-蛋白酶体系对靶蛋白降解的技术。其中一端与靶蛋白结合，另一端与降解蛋白质的蛋白酶结合，连接酶和靶标的接近导致靶标的泛素化，最终靶蛋白降解。另外一种是分子胶（Molecular glue），小分子药物可以将两个原本没有相互作用的蛋白聚到一起，并产生新的作用，阻断靶蛋白的功能。综上所述，无论是哪一种药物设计机制，苗头化合物必须经过验证和表征，才能进入后期结构优化阶段。共价结合药物高通量筛选与表征平台苗头化合物的识别、发现和表征常用高通量筛选（High-throughput screen, HTS）、DNA编码化合物筛选技术（DEL）、计算机虚拟筛选、表面等离子体共振（SPR）、高分辨质谱（HRMS）法、差式扫描荧光法（DSF）和核磁共振（NMR）等手段，各有优势和侧重点，为了获得更加全面的分析，应使用两种以上手段进行相互验证。 1 基于完整蛋白（Intact Protein）的高分辨质谱筛选与表征平台质谱在共价药物发现中的应用广泛，是筛选共价结合物常用的方法。Intact protein技术借助高分辨质谱，在完整蛋白层面测定蛋白的精确分子量，并可以监测到不可逆共价键的形成，当靶蛋白与小分子化合物结合后，蛋白的分子量出现增加。运用LC-HRMS可以直观的对结合情况进行表征，判断是否有结合、结合比率等详细信息。该方法开发简便、通量高、重现性好。如图3所示，我们以KARSG12C与其抑制剂索托拉西布（Sotorasib）结合为例，从图中可以清晰的观察到分子量偏移，计算得知正是Sotorasib的分子量。在该孵育条件下，KARSG12C已经和Sotorasib完全结合，结合率100%。图3. 基于完整蛋白高分辨质谱分析实例分享 2 差示扫描荧光法（DSF）的高通量筛选平台虽然MS方法是筛选共价结合物常用的方法，但随着人们对该领域的兴趣日益增长，正在研究更多的高通量策略，以便在更短时间内筛选出更多的化合物。差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry, DSF），是一种跟踪蛋白质折叠状态和热稳定性的方法[7]，常用于蛋白质热稳定性研究、蛋白与配体相互作用研究、蛋白的稳定剂和抑制剂筛选等研究。DSF的原理是当温度升高，蛋白质去折叠，荧光染料会与暴露出来的疏水部分结合，荧光信号增强，数据进行玻尔兹曼（Boltzmann）方程拟合，计算出蛋白的熔解温度（Melting Temperature, Tm）（如图4所示），即50%的蛋白质样本处于折叠状态，50%处于未折叠状态的温度[7]。图4. DSF原理图[7] DSF常用于检测小分子配体与目标蛋白的结合[8]，在共价结合药物的筛选过程中，同样可以使用DSF来观察结合前后蛋白的热稳定性变化。当共价结合药物与目标蛋白结合后，目标蛋白稳定性增强，熔解温度提高。如图5所示，显示了目标蛋白（蓝色）和目标蛋白与候选药物结合后（紫色）的状态，两者熔解温度的差异表示为（ΔTm），可以通过ΔTm来对候选药物是否与目标蛋白结合进行评价。DSF方法具有蛋白样品需求量少、通量高和分析时间短等优势，适合高通量候选药物筛选及靶标发现。图5. 共价结合药物引起蛋白熔解温度（Tm）迁移实例分享 3 基于肽图分析的结合表征平台肽图（Peptide Mapping）是确定蛋白质一级结构（氨基酸序列）的主要技术，常用于蛋白质和肽类药物质量控制[9]。肽图分析依赖高分辨质谱，灵敏度高，可识别样品中的末端封闭或修饰。在共价结合药物的筛选阶段，利用高分辨质谱分析经过酶解后的肽段，能够识别出小分子化合物共价结合在蛋白的哪些氨基酸位点上，用以阐释作用机理（如图6所示）。图6. Peptide mapping原理图[10] 我们以KRASG12C蛋白和其抑制剂Sotorasib共价结合后的肽图分析为例（如图7所示），在胰蛋白酶单切的情况下可以实现100%的序列覆盖度，从分析结果中可见Sotorasib共价结合在肽段LVVVGACGVGK的半胱氨酸上，肽段保留时间为58.37min，置信得分（Confidence Score）为100分。图7. KRASG12C与Sotorasib共价结合后肽图分析实例分享药明康德DMPK可提供基于高分辨质谱和差示扫描荧光的药物高通量筛选与表征服务（如图8所示），包括常规共价结合药物、分子胶、PROTACs等，也可结合多样化的体内外代谢模型（体外谷胱甘肽结合模型的研究策略和应用）和代谢产物鉴定研究在生物基质中进行代谢产物的分离、分析和鉴定，深入了解共价结合药物可能的代谢和清除途径，并进行综合性的评估。图8. DMPK共价结合药物筛选与表征平台结语药明康德DMPK具有丰富的共价结合药物高通量筛选和表征经验，已成功构建了基于完整蛋白（Intact Protein）的高通量筛选与表征平台、基于差示扫描荧光法（DSF）的高通量筛选平台和基于肽图谱（Peptide Mapping）的表征平台，除了筛选以外，还可对是否共价结合、结合率、结合氨基酸位点进行表征，具有方法开发时间短、通量高、准确、快速等优势，可为客户提供一体化和一站式的服务。药明康德DMPK在共价结合药物生物分析、体外ADME、体内代谢产物鉴定、放射性ADME研究等方面积累了丰富的研究经验，同时在药代动力学研究策略、数据解读及跨部门合作上有突出优势。结合共价结合药物的特性，我们专门建立了一套针对共价结合药物的药代动力学研究体系。截至目前，药明康德DMPK已成功支持近百家客户的共价结合药物项目，助力多个共价结合药物进入临床阶段，我们可根据客户的需求，确定药代动力学研究内容，选择合适的分析方法，助力加速共价结合药物的研发和申报进程。参考文献： [1] Lonsdale R , Ward R A. Structure-based design of targeted covalent inhibitors[J]. Chemical Society Reviews, 2018:10.1039. [2] Adeniyi A A , Muthusamy R , Soliman M E .New drug design with covalent modifiers[J]. Expert Opinion on Drug Discovery, 2016, 11(1):79. [3] Li K S, Quinn J G, Saabye M J, et al. High-Throughput Kinetic Characterization of Irreversible Covalent Inhibitors of KRAS(G12C) by Intact Protein MS and Targeted MRM[J].Analytical chemistry, 2022(94-2). 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High-throughput method for Peptide mapping and Amino acid sequencing for Calcitonin Salmon in Calcitonin Salmon injection using Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UHPLC-HRMS) with the application of Bioinformatic tools[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2024, (243)116094. [10] Mons E , Kim R Q , Mulder M P C .Technologies for Direct Detection of Covalent Protein–Drug Adducts[J]. 2023. （下滑查看更多）作者：曲栗，王瑞，何勇静，王洪梅，李陟昱，邢丽丽编辑：富罗娜·克里木，钱卉娟设计：倪德伟，张莹莹声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓