RSV F protein

▎药明康德内容团队编辑本月初，人工设计蛋白领域先驱David Baker教授团队发布了增强版的蛋白模拟工具RoseTTAFold All-Atom和蛋白设计工具RFdiffuion All-Atom。仅仅2周后，Baker教授团队在bioRxiv上发表另一项突破性进展：通过对其生成式AI系统RFdiffusion进行微调，他们成功得以针对任意选定的抗原表位从头设计基于重链可变区（VHH）的单域抗体，且该抗体与靶向抗原的有效结合经过具有原子级解析度的冷冻电镜（cryo-EM）结构所验证。这项进展有望加速未来更精准、靶向范围更广抗体疗法的开发，造福广大患者。目前开发治疗性抗体的过程仍然主要依赖于动物免疫或抗体库筛选，这不仅耗时，而且不一定能够产生与治疗关键表位产生相互作用的抗体。在抗体的计算设计领域，虽然已有研究团队尝试通过计算手段来优化抗体结构，但完全从头设计出结构准确的抗体仍然是一个巨大挑战。近期，尽管在设计能够与多种与疾病相关的蛋白质紧密结合的非抗体蛋白方面，RFdiffusion系统取得了一定的进展，但这种方法未能实现抗体的从头设计。这是因为该方法设计的蛋白与目标蛋白之间的结合主要是通过与目标表位的规则二级结构（比如螺旋或链结构）进行相互作用，因而不适用于抗体设计。根据David Baker教授实验室网站的介绍，RFdiffusion是一款结合了结构预测网络和生成式扩散模型的创新型生成式AI系统，它可以创造出与自然界中任何已知蛋白质不同的新蛋白。传统设计方法可能需测试成千上万个分子才能找到一个性能符合预期的分子。而采用RFdiffusion新方法，研究团队在每个设计挑战中只需测试少量分子即可。▲RFdiffusion系统可以产生与目标分子结合的新型蛋白质（视频来源：David Baker实验室网站）为了突破RFdiffusion在生成抗体分子方面的限制，研究人员利用已有抗体和抗原结合生成的复合体的结构数据库对RFdiffusion进行了训练，让RFdiffusion学习了抗体中抗体互补决定区域（CDR）与抗原之间相互作用的规律，从而设计出维持抗体重链可变区整体结构，但是可以靶向特定抗原表位的新抗体。在完成RFdiffusion的优化后，研究人员针对多个与疾病相关的靶标，包括艰难梭菌毒素B（TcdB）、流感病毒H1血凝素（HA）、呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白的I和III位点以及白介素-7受体α（IL-7Rɑ）等，设计了一系列抗体VHH结构。随后，再利用经过微调的RoseTTAFold2网络对所设计的抗体进行了筛选。▲利用RFdiffusion进行抗体设计的图示（图片来源：参考资料[1]）为了评估设计抗体的结合精度，研究团队通过cryo-EM结构测定，考察了所设计靶向流感病毒HA的VHH与天然糖基化的三聚体流感病毒HA糖蛋白复合物的相互作用。实验结果表明，具有原子级解析度的cryo-EM结构显示，其中一款所设计的VHH能够有效地与完全糖基化的HA三聚体结合，验证了通过计算方法所从头设计VHH的功能性，展示了RFdiffusion在抗体设计方面的高度精确性和创新潜力。▲从头设计的VHH与流感病毒HA结合的冷冻电镜结构（图片来源：参考资料[1]）这项研究结果显示，采用RFdiffusion及其相关方法，能够精确地针对特定的抗原表位进行抗体设计、优化抗体的关键药物属性、扩大靶向抗原范围，有望在未来大幅改善现有抗体疗法开发的效率与成本。然而，虽然本研究证明从头设计VHH是可行的，但这一领域仍有很大的改进空间。例如作者在文中提出，这些抗体虽然能够与抗原结合，但是亲和力却一般，仍有进一步改进的空间。让我们期待通过人工智能在医学上应用的技术不断往前，在不远的将来，我们能够针对各式疾病，快速、有效地设计出适用于临床治疗的抗体，实际上造福广大患者。大家都在看药明康德为全球生物医药行业提供一体化、端到端的新药研发和生产服务，服务范围涵盖化学药研发和生产、生物学研究、临床前测试和临床试验研发、细胞及基因疗法研发、测试和生产等领域。如您有相关业务需求，欢迎点击下方图片填写具体信息。▲如您有任何业务需求，请长按扫描上方二维码，或点击文末“阅读原文/Read more”，即可访问业务对接平台，填写业务需求信息▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放参考资料：[1] Nathaniel R. Bennett, Joseph L. Watson, Robert J. Ragotte, Andrew J. Borst, DeJenae L. See, Connor Weidle, Riti Biswas, Ellen L. Shrock, Philip J. Y. Leung, Buwei Huang, Inna Goreshnik, Russell Ault, Kenneth D. Carr, Benedikt Singer, Cameron Criswell, Dionne Vafeados, Mariana Garcia Sanchez, Ho Min Kim, Susana Vazquez Torres, Sidney Chan, David Baker，”Atomically accurate de novo design of single-domain antibodies.” bioRxiv 2024.03.14.585103; doi: https://doi.org/10.1101/2024.03.14.585103免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新

ATHENS, Ga. & SAN JOSE, Calif.--(BUSINESS WIRE)-- Blue Lake Biotechnology, Inc., a clinical-stage intranasal vaccine company developing parainfluenza virus 5 (PIV5)-vectored vaccines that harness the full breadth of the immune system to protect against serious infectious diseases, today announced preliminary data from the first two cohorts of a Phase 1/2a clinical trial studying BLB201, the company’s investigational vaccine against severe respiratory syncytial virus (RSV) disease. The data show that BLB201 is immunogenic and well tolerated, with no significant safety events reported to date following a single intranasal dose in RSV seropositive children 18-59 months of age. The ongoing trial is currently enrolling both RSV seropositive and RSV seronegative children as young as eight months of age. “Given the challenges of developing an RSV vaccine for children, it is highly encouraging that BLB201, our intranasal RSV vaccine candidate, has been well tolerated in this age group so far,” said Biao He, Ph.D., founder and CEO of Blue Lake Biotechnology. “It is also very exciting to see RSV-specific immune responses to our vaccine in children who have previously been exposed to RSV. We are eager to generate more data in younger children, including infants who have not had prior exposure to RSV, and to develop a highly effective and safe vaccine to protect this vulnerable population from RSV.” Among the initial 10 participants ages 18-59 months who received BLB201 study vaccine in this Phase 1/2a study (NCT05655182), there have been no serious vaccine-related safety signals reported to date. In the five participants who received the higher dose of 107 PFU of BLB201, prominent increases in RSV neutralizing antibody (nAb) responses were observed at four weeks post-vaccination, with 80% having a 3.6- to 57-fold rise in nABs over baseline. RSV-specific mucosal IgA antibody and cellular immune responses were also observed. “For the first time, an RSV vaccine candidate has been shown to generate increases in anti-RSV antibody responses in RSV-seropositive children, suggesting that BLB201 could be effective even in infants who have pre-existing anti-RSV antibodies,” continued Dr. He. “This is particularly encouraging given that the target population of our vaccine includes infants under eight months old who may already have passive immunity to RSV from maternal antibodies or exogenously administered anti-RSV antibodies.” About RSV Respiratory syncytial virus (RSV) is a highly contagious and common respiratory virus and one of the leading causes of acute respiratory disease, infecting more than 64 million people worldwide per year. For most people, it causes symptoms similar to the common cold, but for infants, the immunocompromised, people with chronic heart or lung disease, and older adults, it can cause severe illness and be life-threatening. Repeat infections with RSV are believed to be common, so even people who contracted RSV when they were younger adults and healthy can be at risk from RSV infection later in life. According to the Centers for Disease Control, up to 80,000 children under five years old and up to 160,000 older adults are hospitalized per year because of RSV infection in the US, with up to 10,000 deaths each year. While there are approved antibody drugs and a maternal RSV vaccine that can provide passive immunity against RSV to infants, there is no approved vaccine for generating prophylactic immunity against RSV in infants and children. Such a vaccine is needed to fully protect young populations at significant risk from severe RSV disease. About BLB201 BLB201 is an RSV vaccine candidate that is currently in Phase 1/2a clinical testing in children ages eight to 59 months of age. It has received Fast Track designation from the US Food and Drug Administration for the prevention of RSV-associated acute respiratory disease in adults (>60 years) and pediatric populations (<2 years). BLB201 encodes the RSV F protein and uses a proprietary PIV5 vector, which is not known to cause human disease. PIV5 has been commonly administered to dogs as part of combination distemper/kennel cough vaccines for decades. Blue Lake Biotechnology is developing BLB201 as an intranasal vaccine to prevent acute and severe disease associated with RSV infection. Phase 1 clinical trial results demonstrate BLB201's safety and ability to induce antibody and cell-mediated immune responses, positioning it as a promising candidate in the fight against RSV. About CyanVac and Blue Lake Biotechnology CyanVac LLC and its affiliate, Blue Lake Biotechnology, Inc., are developing intranasal vaccines that harness the full breadth of the immune system to keep people healthy, prevent serious infectious diseases, and protect the health of vulnerable populations. Our platform uses a proprietary parainfluenza virus 5 vector into which a foreign gene from a targeted pathogen is inserted. We have generated a robust clinical-stage pipeline of best-in-class vaccines designed to overcome the limitations of existing vaccine technologies. Our lead product candidates have demonstrated potential for high efficacy and durability with few vaccine-related side effects. Learn more at Blue Lake Biotechnology.

2021 年 1 月 29 号，Barney Graham 在推特饱含深情地写下这样一段话：明天就是 McLellan 四十岁生日。2017 年，在西班牙马拉加街头酷似病毒的圣诞装饰灯下，我们和故去的挚友 Jose Melero 拍下了这张照片。早在成功解析新冠 Spike 蛋白结构之前，我们三人就共同致力于破解 RSV F 蛋白结构。于是，我跑去查找 Jose Melero 逝世的确切时间点。结果看到，2018 年 3 月 5 号凌晨，McLellan 怀着无限感伤发推文：Jose Melero 于昨日逝世，他是一位伟大的病毒学家，在肺病毒领域，特别是 RSV，做出过开创性贡献。他是一个慷慨而又合群的人，一个绝佳的同行者。José，你将会被许多人缅怀。朋友们，如果你翻阅 RSV F 蛋白结构的解析历程，从粗糙的二级结构预测，到解析融合后构象，再到固定融合前构象，很难不被三人二十多年来不断的努力和最终的成就所打动，也更加能体会到他们对老友逝去的感伤。正道是，天之涯，地之角，知交半零落...图片来源：Barney Graham X 平台1956 年，人们从患有上呼吸道疾病的黑猩猩中分离出一种病毒，将其命名为黑猩猩鼻病毒。1957 年，研究者在患有呼吸道疾病的儿童中分离到相同的病毒，并且发现这种病毒极易感染婴幼儿。后来，该病毒被划归到副粘病毒科肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)肺炎病毒属(Pneumovirus)，称为呼吸道合胞病毒 (RSV)。RSV 是一种有包膜的负链 RNA 病毒，病毒基因组长度为 15.2 kb，包含 10 个开放阅读框，编码 8 个结构蛋白和 3 个非结构蛋白。RSV 在多种病毒株和细胞系中呈丝状。病毒丝长度为 0.5 至 12um，平均丝直径约为 130nm。1966 年，在美国，有婴儿和儿童参与到福尔马林灭活 RSV 疫苗 (FIRSV)临床试验中。那些在接种疫苗前病毒血清呈阴性的儿童回到社区后，感染 RSV 的概率和感染后疾病的严重程度显著增加。这种 RSV 疾病的增强形式表现为发烧、喘息和支气管肺炎，并导致频繁住院。在一项研究中，FIRSV 接种者中感染 RSV 的儿童比例为 80%，而未接种疫苗的对照组仅有 5%的儿童感染 RSV。更为严重的是，两名免疫婴儿在幼儿时期就因随后感染 RSV 而死亡。这一事件使得 RSV 疫苗研发事业遭遇重创，更是成为疫苗安全性的警示牌。1   选择 F 蛋白作为 RSV 疫苗抗原RSV 病毒粒子表面有 2 种非常重要的糖蛋白：附着蛋白（G）与融合蛋白（F）。G 蛋白介导病毒与宿主细胞表面受体结合，而 F 蛋白促进病毒与宿主细胞膜融合。F 蛋白还可促进病毒感染细胞与临近细胞膜融合，从而形成典型的合胞体（syncytia）。此外，在病毒感染细胞表面还会大量表达一种小的疏水性糖蛋白，称为 SH，但是，这种蛋白只会插入到极小比例的病毒粒子表面。HRSV F 蛋白一直是疫苗和抗病毒药物开发的主要靶标，因为它介导病毒入侵宿主细胞，具有高度保守的序列和结构、强大的免疫原性以及在病毒粒子中的暴露位置。而且，相比其他副黏病毒，RSV F 蛋白还有一个独特之处：在没有附着 G 糖蛋白的情况下，RSV F 蛋白自身就足以介导膜融合和病毒感染。相比之下，G 蛋白在不同 HRSV 毒株之间差异很大 ，并且已发现 SH 蛋白在病毒生长中是可有可无的 。2   F 蛋白二级结构1998 年，Jose Melero 在Journal of Virology发表文章：Antigenic Structure of Human Respiratory Syncytial Virus Fusion Glycoprotein，在 F 蛋白特异性单抗存在下，他制备了一系列 RSV 突变体。然后，根据突变体所选择的序列鉴定出中和抗体识别的两个主要抗原区域位于 F1 上，一个位于半胱氨酸富集区前面，称为 siteⅡ，一个靠近半胱氨酸富集区的 C 端，包括 site Ⅳ,site Ⅴ,site Ⅵ。此外，在半胱氨酸富集区中部，还存在一个可被中和性抗体微弱识别的 Site I。基于这些抗原表位，Jose Melero 绘制出 RSV F 蛋白（Long 毒株）的粗略二级结构。RSV F 蛋白以无活性的前体 F0（574 氨基酸）合成，随后转运至内质网，形成三聚体，同时，发生 N-糖基化。进入高尔基体后，F0 前体在两个 Furin 位点处发生切割，变为 F1 和 F2 两条链，F1 和 F2 之间通过 2 个二硫键连接，同时释放出 27 个氨基酸的肽段 pep27。F 蛋白上存在 3 段疏水性序列：第 1 段是信号肽，位于 F2 的 N 端（1-22 氨基酸），将会从成熟的糖蛋白上移除；第 2 段是融合肽（Fusion peptide），位于 F1 N 端（1-19 氨基酸）；第 3 段靠近 F1 C 端（389-414），也就是膜锚定区。从大的分类上来讲，RSV F 蛋白属于 I 型病毒融合蛋白，此类蛋白还包括冠状病毒 Spike 蛋白(最大的 I 型病毒融合蛋白)、HIV 包膜糖蛋白（Env）、hMPV(人偏肺病毒)及 PIV3/5(人副流感病毒)。I 型病毒融合蛋白具有相似的结构特征（融合肽、HRA、HRB 及跨膜区）与融合机制，但是，序列相似性极其有限。所有这些蛋白初始合成时均为单链、无活性的前体 F0。它们需要在关键的酶切位点切割才能转变为活性形式。有些蛋白仅有一个酶切位点，而有些蛋白则有两个酶切位点，例如，RSV 或者冠状病毒。3   F 蛋白锥形杆柄与棒棒糖杆柄2000 年，Jose Melero 在Virology发表文章：Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies。为探索 HRSV F 蛋白结构与免疫原性之间的关系， Jose Melero 设计出两种 F 蛋白序列，一种为全长 F 蛋白 FWT，另外一种是截掉 C 端 50 个氨基酸的无锚定突变体 FTM-。采用重组痘苗病毒（ vaccinia viruses）作为表达载体，感染 HEp-2 细胞，表达靶标蛋白。正如预期，FWT 表达于宿主细胞表面，无锚定突变体 FTM-分泌至培养基中。采用亲和层析和蔗糖密度梯度离心纯化分离 F 蛋白，然后，在负染电镜下，发现 FWT 和 FTM-呈现完全不同的形态结构：1. 当存在去污剂（Detergent）时，FWT 沉降条带集中分布于蔗糖梯度顶部附近，表面蛋白呈现均一性。当不存在去污剂时，FWT 会沿着蔗糖密度梯度连续沉降至底部，说明蛋白存在聚集体（aggregates）。在没有去污剂的情况下，FWT 负染电镜下呈现玫瑰花结形态（rosettes）。在玫瑰花结中，包含两种形态的杆柄：一种为圆锥形杆柄（cone-shaped rods），占到 70%，另一种为棒棒糖形杆柄(lollipop-shaped rods)，占到 30%。2. 无论是否存在去污剂，无锚定突变体 FTM-在蔗糖梯度中均沉降至相似位置，仅在底部观察到存在极小比例聚集体。在没有去污剂的情况下，无锚定突变体 FTM-在负染电镜下主要呈现单个的圆锥形杆柄，彼此之间不发生交联。有意思的是，在一些样品中，FTM-也可形成玫瑰花结。然而，与全长 FWT 形成鲜明对比的是，90%的 FTM 玫瑰花结杆柄的形状为棒棒糖状。此外，当无锚定突变体 FTM-在 4℃存储时间延长，融合肽暴露，引发玫瑰花结聚集体数量增加，杆柄也从圆锥状变为棒棒糖状。也就是说，FTM-一旦形成玫瑰花结，杆柄将由圆锥形变为棒棒糖状。3. 无锚定突变体 FTM-或者全长 FWT 均呈现三聚体。Jose Melero 推测圆锥形杆柄为激活前 F 蛋白结构，而棒棒糖杆柄为激活后 F 蛋白结构，也就是说 F 蛋白的两种杆柄形态可能代表的是该分子在膜融合过程中采用的不同结构形式。4   F 蛋白完全切割是膜融合必需的2001 年，Jose Melero 在 PNAS 发表文章：Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion，他通过对 F 蛋白中间体的 N 端测序，确定了 F 蛋白前体（F0）可在两个位点发生切割：位于 109 氨基酸之后的 Site I 与位于 136 氨基酸之后的 SiteII。这两个位点均有弗林蛋白酶识别位点，并且两个酶切位点之间是独立切割的。突变酶切位点 Site I 会降低酶切位点 SiteII 的切割效率，从而减少无锚定 F 蛋白的聚集比例。然而，突变 SiteII 会完全消除无锚定 F 蛋白的聚集，即便 Site I 仍旧高效切割。这说明 SiteII 位点的切割对于无锚定蛋白 F 的形态和聚集是必不可少的，而 Site I 的切割可提升 SiteII 位点的切割效率。重组牛痘-F 蛋白感染细胞后表达的无锚定 F 蛋白并非发生完全切割，而是存在一定比例的前体 F0 和切割中间体 F△1-109。一旦加入胰蛋白酶，随着酶量增加，F0/F△1-109 逐渐被完全切割成为 F1。在蔗糖密度梯度离心中，用胰蛋白酶处理的无锚定 F 蛋白，只会检测到 F1 条带，并且，相比胰蛋白酶处理之前，F1 沉降条带朝着梯度中部迁移。在电镜下， 胰蛋白酶处理后，无锚定蛋白形态由未聚集的圆锥形杆柄（cones）转变为棒棒糖杆柄（lollipops）聚集而成的玫瑰花结。此外，抑制无锚定 F 蛋白任意一个 Furin 酶切位点，都会消除 F 蛋白促进膜融合的能力。5   无锚定 F 蛋白玫瑰花结与融合肽暴露胰蛋白酶完全切割无锚定 FTM-蛋白，引发蛋白聚集，形成玫瑰花结。为搞清楚这种聚集是否由单体蛋白上的疏水性融合肽之间的相互作用引发，人们将融合肽前面的 10 个氨基酸删除，形成 FTM-(Δ137-146)。在蛋白印记胶图上，纯化得到的无锚定 FTM-蛋白存在一条主条带 F1，还存在未切割的前体 F0、仅在 site I 发生切割的 FΔ1-109 以及仅在 siteⅡ发生切割的 F2。纯化得到的 FTM-(Δ137-146)突变体也存在类似的酶切中间体，但是，这些中间体条带相对于主条带 F1 的比例与无锚定 F 蛋白又是不相同的，这说明删除融合肽前面的氨基酸会对 Furin 切割效率产生影响。无锚定 FTM-和 FTM-(Δ137-146)突变体经过胰蛋白酶处理后，FΔ1-109 和 F2 剩余位点发生切割。在蔗糖密度梯度离心中，无锚定 F 蛋白经过胰蛋白酶处理，沉降条带将会向更高密度梯度迁移。在电镜下，无锚定蛋白 FTM-以未聚集的圆锥杆存在，但是，胰蛋白酶处理后的无锚定 FTM-蛋白将会聚集成棒棒糖杆状的玫瑰花结。与此形成鲜明对比的是，胰蛋白酶切割前后的 FTM-(Δ137-146)在蔗糖密度梯度离心中的沉降位置始终未发生变化，同时，在电镜下，胰蛋白酶切割前后的 FTM-(Δ137-146)突变体均处于未聚集的单体。正是基于以上数据，2004 年，Jose Melero 在 Journal of General Virology 发表文章：Thermostability of the human respiratory syncytial virus fusion protein before and after activation: implications for the membrane-fusion mechanism，他们认为 F 蛋白激活后发生的一个关键事件便是融合肽的暴露，无锚定 FTM-蛋白的未切割和切割形式可能代表着 RSV F 蛋白的融合前和融合后构象。在 RSV 病毒入侵靶细胞表面时，F 蛋白发生最后的酶切位点切割，触发膜融合和感染。2005 年，有研究者在 PNAS 发表文章：Structure of the uncleaved ectodomain of the paramyxovirus (hPIV3) fusion protein，研究人员采用杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中表达切除跨膜锚定区、未发生切割的副粘病毒、人副流感病毒 PVI3 solF0 蛋白（I 型病毒融合蛋白）。解析未发生切割的 solF0 蛋白结构，发现其由三部分组成：一个球形的、含有β 折叠片组成的头部结构域，由β折叠片和α螺旋组成的颈部（neck），α螺旋占主导的茎部构成（stalk）。切除跨膜锚定区、未发生切割的分泌型 hPIV3 F 蛋白最为典型的特征是存在由 HRA 和 HRB 形成的 6HB 结构，这代表着该蛋白处于融合后构象，同时，说明跨膜锚定区对于蛋白实现融合前亚稳态构象极其重要。6   F 蛋白构象转变与膜融合2006 年，有学者在 Nature 发表文章：Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable, prefusion conformation，通过在副流感病毒 PIV5 F 蛋白羧基末端添加三聚化结构域，稳定其融合前构象，完成 PIV5 F 蛋白晶体结构的解析。在 PIV5 sF-GCNt 三聚体中，HRB 形成的 3 个α螺旋卷曲螺旋附着于一个大球状头部。GCNt 三聚体结构域位于茎部的 C 末端，使得 PIV5 sF 头部远离病毒膜。F-GCNt 每个亚基的头部区域包含 3 个结构域（DI-DIII），它们围绕三聚体轴延伸，形成广泛的亚基间接触。头部底部有一个大空腔，由 DII 形成的侧面和 DI 形成的底部组成。在头部区域存在 3 个突出的尖峰，每个尖峰由两对环构成（残基 60-65 和 残基 178-185），这些环从每个亚基的球状结构域向上突出。DIII（残基 42-278）覆盖腔体顶部，包括突出的尖峰、HRA 和融合肽。融合肽采用部分延伸、部分β折叠和部分α螺旋构象，夹在其自身亚基的 DIII 和另一个亚基的 DII 之间。PIV5 sF 蛋白处于一种非常特殊的、明显的 pretriggered 构象，表明 sF 蛋白 C 端结构域对于维系此融合前构象是至关重要的。此外，热激可触发 PIV5 sF 蛋白融合前构象发生改变。通过比较 PIV5 F-GCNt 融合前构象与 PIV3 solF0 融合后构象，研究者提出了 F 蛋白介导的膜融合与其构象变化相互偶联的模型：HRB 螺旋融化，破坏底部相互作用，使得 F 蛋白从预融合构象转变为“开茎”构象。接着，DIII 重新折叠形成预发夹中间体，促进 HRA 形成卷曲螺旋并将融合肽插入靶细胞膜。牵拉病毒膜与宿主细胞膜，F 蛋白 6HB 组装完成，转变为融合后构象，完成膜融合。通过 PIV5 与 PIV3 F 蛋白结构的解析， 我们可以看出，副粘病毒融合糖蛋白 F 以亚稳态（metastable）、预触发(pretriggered)形式锚定于病毒粒子膜上。一经触发，F 蛋白经历剧烈的构象延伸，将其疏水融合肽插入到靶细胞膜，自身回折，将两种膜拉在一起，启动膜融合。7   首次表达融合前 RSV F 蛋白2011 年 4 月 15 号，Mark E. Peeples 在 Journal of Virology 发表文章：Soluble Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in the Fully Cleaved, Pretriggered State Is Triggered by Exposure to Low-Molarity Buffer，为研究 RSV F 蛋白触发机制，他使用 6His tag 标签替换跨膜区和胞质区，生成一种可溶性的 F 蛋白（sF）。sF 蛋白可从 293T 细胞中以未切割形式，高效释放。这种 sF 蛋白可被中和抗体识别，在电镜下呈现球形，且未聚集，这些特征说明与天然的、未触发的三聚体相一致。F 蛋白在 Ni +2 柱上纯化并用含有 500mM NaCl 和 250mM 咪唑的 50mM 磷酸盐缓冲液洗脱。透析至 10 mM 缓冲液中，将会触发 sF 蛋白构象改变，形成“帽针”（hat pin-shaped）状分子，聚集成玫瑰花结，这是典型的触发后特征。触发效率与缓冲液摩尔浓度降低息息相关。稀释缓冲液摩尔浓度导致融合肽暴露，与脂质体融合，证实 sF 蛋白已被触发。突变紧邻融合肽的 furin 切割位点会阻止脂质体融合，更进一步证实膜融合需要融合肽。Jose Melero 对 RSV F 蛋白结构的一系列相关研究，一直采用的是 Long 毒株 F 蛋白，而 Mark E. Peeples 采用的是存在 6 个氨基酸差异的 D53 毒株 F 蛋白。因此，Mark E. Peeples 认为 Jose Melero 观察到的 RSV F 蛋白电镜下的形态结构均处于融合后构象。因为 Jose Melero 推测认定的融合前（未切割）和融合后（已切割）的无锚定 F 蛋白具有非常相似的外形：一个小而圆的头，连着相对较长的茎。关键 Bug 在于，这两种形式的 F 蛋白均表现出非常耐热，在温度达到约 90°C 之前均没有显示出构象变化。极端热稳定性并不是亚稳态蛋白 F 蛋白的典型特征，相反，极度热稳定是触发后、处于 6HB 形式的 F 蛋白特征。Mark E. Peeples 还认为 Jose Melero 观察到的融合构象的 F 蛋白换可能是由于纯化处理过程触发的。Mark E. Peeples 发现 10 mM 磷酸盐、100 mM NaCl 缓冲液可将大部分 sF 蛋白转化为触发后形式的玫瑰花结。此外，分离和储存过程中的差异也可能触发 F 蛋白构象的转变。冷冻和解冻会触发 F 蛋白构象改变。如果将融合前、预触发形式的 F 蛋白在 4°C 条件下储存在 50 mM 磷酸盐 （pH 8.0）、500 mM NaCl、250 mM 咪唑缓冲液，那么直到三周后才会转变为触发后形式。Mark E. Peeples 构建的 RSV sF 蛋白可被完全切割，但是，依然表达产生融合前构象的 F 蛋白，这说明 Furin 位点的完全切割并不会触发 F 蛋白形成融合后构象。在解析其他副粘病毒 F 蛋白晶体结构时，为避免触发构象变化，研究者均采用突变 F 蛋白切割位点，该突变 F 蛋白不能被弗林蛋白酶切割。然而，令人惊讶的是，未切割的 PIV3 sF 蛋白/新城疫病毒 F 蛋白均处于融合后构象。胰蛋白酶处理已触发的 PIV3 sF 蛋白，引发 Furin 位点切割，形成玫瑰花结。显然，玫瑰花结的形成是融合肽暴露的结果，而不是触发蛋白构象改变的结果，因为 PIV3 sF 蛋白在胰蛋白酶处理之前已经处于触发后形式。F 蛋白 Furin 位点的完全切割显然不能像 Jose Melero 提出的那样作为 F 蛋白构象改变的触发机制 。移除 PIV3 F 蛋白的膜锚定区会触发构象改变。为避免这种情况，研究者将来自外源蛋白 GCNt 的三聚体化结构域融合到 PIV5 sF 蛋白的 C 末端。在电镜下，这种携带三聚体化结构域 PIV5 sF 蛋白表现为一个球体，其短茎由其 HRB 和 GCNt α螺旋延伸组成，处于融合前构象。GCNt-PIV5 sF 蛋白 F1 与 F2 之间的 Furin 位点是完全切割的，但是，并没有触发构象变化，依然处于融合前构象，再次证实酶切位点的切割并不是 F 蛋白构象变化的触发因素。加热后的 PIV5 sF 蛋白具有更小的头部和更长的茎，类似于 PIV3 sF 蛋白触发后的 6-HB 形式，形成玫瑰花结，说明加热可触发 PIV5 sF 蛋白从融合前构象转变为融合后构象。总的来说，对于 RSV F 蛋白来说，膜锚定区和三聚化结构域均不是维系其融合前构象所必需的。Mark E. Peeples 首次制备了完全切割的、分泌型的、融合前构象的 RSV F 蛋白，并且，无需添加外源三聚体化结构域。8   首次解析 RSV F 蛋白融合后构象RSV F 的融合前和融合后形式作为疫苗抗原均具有潜在的缺点。在负染电镜下，棒棒糖形的融合前 F 三聚体和拐杖形（Crutch）融合后 F 三聚体之间存在明显的结构差异，这表明融合前和融合后 F 三聚体可能具有不同的抗原属性。为了防止病毒进入，在病毒包膜与细胞膜融合之前，F 特异性中和抗体可能必须结合病毒粒子上 F 的融合前构象。因此，研究人员推测 RSV F 必须以融合前构象存在才能有效引发中和抗体。关键的问题是，融合前 F 是一种“亚稳态”结构，处于较高的能级，很容易重新排列成较低能量的融合后状态，加上疏水性融合肽的暴露而聚集。2011 年 5 月 17，诺华公司研发团队在PNAS发表文章：Structural basis for immunization with postfusion respiratory syncytial virus fusion F glycoprotein (RSV F) to elicit high neutralizing antibody titers，他们删除融合肽、跨膜区和胞质结构域，保留 Furin 切割位点，构建表达稳定的、非聚集的 RSV F 蛋白。在电镜下，这种无锚定的 F 蛋白突变体形成非聚集的均质拐杖状分子（nonaggregated, homogeneous crutch-shaped molecules），与融合后的 F 三聚体一致。用两剂 5 μg 剂量的明矾吸附 RSV F 可保护棉鼠免受鼻内 RSV 攻击，触发高水平的中和抗体滴度。他们解析了融合后构象 F 蛋白的晶体结构，发现融合后 RSV F 的总体结构与融合后副流感病毒 F 糖蛋白总体相同。糖蛋白由三个紧密缠绕的亚基组成，形成球状头和细长的茎。每个亚基包含三个结构域，分别指定为 I、II 和 III。结构域 I 和 II 位于三聚体头部的顶部，形成三角形冠。域 III 形成头部的基部。长螺旋 HRA 从结构域 III 延伸并在茎的中心形成三聚体卷曲线圈。HRB 螺旋与结构域 II 相连，向下到达茎的头部远端，在那里它与 HRA 内部卷曲线圈形成六螺旋束的外部线圈。在全长 F 中，疏水性融合肽（HRA 的 N 端）和跨膜区（HRB 的 C 端）将并置在茎的底部并插入靶细胞膜中。融合前和融合后 RSV F 中 A 和 C 位点的保留合理地解释了融合后 RSV F 抗原在免疫动物中引发高效价中和抗体的能力。与这一假设一致，竞争 ELISA 表明，用明矾吸附的融合后 RSV F 抗原免疫的小鼠的混合血清（而非未免疫小鼠的血清）抑制帕利珠单抗结合。RSV F 融合后三聚体的晶体结构表明，帕利珠单抗/莫他珠单抗表位（位点 A）在融合后三聚体结构上暴露且可接近，因此，用 RSV F 融合后三聚体免疫的小鼠血清竞争性抑制帕利珠单抗竞争性与 F 蛋白的结合。位点 C（被中和抗体（如 101F）识别的另一个重要中和表位）也很好地暴露在融合后 RSV F 上三聚体。因此，融合后 RSV F 三聚体的晶体结构表明，关键的中和结合位点均可暴露出来，为引发高效价中和抗体提供了基础。2008 年，McLellan 进入位于美国国立卫生研究院（NIH）疫苗研究中心四楼的 Peter Kwong 实验室，接受博士后期间的训练。由于实验室空间紧张，McLellan 在疫苗研究中心二楼毗邻病毒学大佬 Barney Graham 房间的位置办公学习。没过多久，Barney Graham 邀请 McLellan 共同从事 RSV 疫苗相关的研究，自此开启两人长达多年的友情。McLellan 为得到 RSV F 蛋白晶体结构，最初将跨膜结构域删除，构建无锚定突变 RSV F ΔTM（1-513 氨基酸）。该突变体蛋白在 HEK293F 细胞中表达良好，可高效切割为 F1/F2。但是，由于融合肽暴露，该无锚定突变体 F 蛋白会聚集成为玫瑰花结。后来，McLellan 借鉴 Jose Melero 2004 年发表的文章，又将融合肽前 9 个氨基酸（137 至 146 氨基酸）删除，构建 RSV F ΔFP，可避免形成聚集体，形成的是分散的、单个的、融合后三聚体，从而能够进行结晶并确定其结构。2011 年 8 月，McLellan 在 Journal of Virology 发表文章：Structure of Respiratory Syncytial Virus Fusion Glycoprotein in the Postfusion Conformation Reveals Preservation of Neutralizing Epitopes。在电镜下，观察到 RSV F ΔFP 呈现锥形杆状形态，具有典型的 6 螺旋束，证实其处于融合后构象。莫维珠单抗和 101F 表位（位点 II 和 IV）暴露于溶剂中，其构象与抗体结合肽结构中观察到的相似。此外，Pro389 位于 F 蛋白顶部环的顶端，其突变会导致靶向靶向抗原位点 I 的抗体失去结合能力。这三个抗原位点的位置、暴露、构象以及表面等离子表明融合后 F 蛋白与靶向三种不同中和表位的抗体发生紧密结合。9   融合后 RSV F 蛋白疫苗相继失利自从融合后 RSV F 蛋白结构被解析出来，并且，有研究团队在绵鼠中验证了其免疫原性，以 Novavax 和 Medlmmune 为代表的多家公司开始以融合后 F 蛋白为抗原进行开发 RSV 疫苗。然而，不幸的是，融合后 F 蛋白 RSV 疫苗均在临床试验期间遭遇失败。此后，McLellan将目光转向融合前F蛋白，即将迎来自己的高光时刻...识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。