Elasomeran

Chestnut Studying 摘要 The discovery and investigation of Toll-like receptors (TLRs) has fundamentally reshaped our understanding of innate immunity and inflammation over the past four decades. These pivotal pattern-recognition receptors play a canonical role as sentinels that detect pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and damage-associated molecular patterns (DAMPs). In addition, TLR signaling is subject to exquisite multilayered regulation to prevent excessive inflammation and maintain immune homeostasis. Such regulation includes posttranslational modifications, epigenetic reprogramming, metabolic rewiring, and dynamic assembly of signaling condensates. This review comprehensively summarizes the intrinsic regulatory networks and tissue-microenvironment crosstalk that fine-tune TLR responses. We highlight the central roles of TLR signaling in infection, autoimmunity, cancer, inflammaging, cardiovascular diseases, and neurodegenerative disorders, underscoring how dysregulation drives pathology. Finally, we examine recent analyses and future prospects for pharmacological modulation of TLR pathways with agonists or antagonists as a promising therapeutic strategy for a broad spectrum of inflammatory and immune-mediated diseases. By bridging foundational mechanisms with clinical insights, this article illustrates how TLR research continues to illuminate immune regulation and offers novel avenues for targeted immunotherapy. 在过去的四十年里，Toll样受体（TLRs）的发现与研究从根本上重塑了我们对先天免疫和炎症的理解。这些关键的模式识别受体作为哨兵，在检测病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）方面发挥着经典作用。此外，TLR信号传导受到精密的多层调控，以防止过度炎症并维持免疫稳态。此类调控包括翻译后修饰、表观遗传重编程、代谢重编程以及信号凝集体的动态组装。本综述全面总结了精细调节TLR反应的内在调控网络及组织微环境间的相互作用。我们重点阐述了TLR信号传导在感染、自身免疫、癌症、炎症性衰老、心血管疾病及神经退行性疾病中的核心作用，并强调了信号传导失调如何导致病理变化。最后，我们探讨了利用激动剂或拮抗剂对TLR通路进行药理学调控的最新分析及未来前景，这被视为治疗广泛炎症和免疫介导性疾病的一种有前景的治疗策略。通过将基础机制与临床见解相结合，本文阐明了TLR研究如何持续揭示免疫调节机制，并为靶向免疫治疗开辟了新途径。 INTRODUCTION Toll样受体（TLRs）为一个关键问题——免疫监视的需求——提供了一个精妙的解决方案。鉴于TLR同源基因在不同物种中进化出了多种复杂且至关重要的免疫功能，它们完美地印证了多布赞斯基的格言：“在生物学中，除非从进化的角度来看，否则任何现象都毫无意义”。事实上，过去四十年来对TLR的研究也遵循了类似的轨迹，从发现一个参与果蝇胚胎发育的特殊基因，逐渐发展成为我们理解先天免疫和炎症的基石（图1上）。在深入分析这些分子细节之前，我们首先来探讨该研究领域的历史沿革。 这场科学探索始于20世纪80年代初对果蝇Toll基因的鉴定，当时将其视为胚胎模式形成工具箱的一部分。然而，该通路在免疫学上的深远作用在随后的十多年里一直未被发现。1996年迎来关键转折：霍夫曼（Hoffmann）研究组在利用果蝇遗传学研究微生物受体多年后，发现了Toll在抗真菌防御中的关键作用，从而验证了詹韦（Janeway）关于“模式识别受体（PRRs）”的前瞻性假说。1997年，梅吉托夫（Medzhitov）和詹韦伊（Janeway）鉴定出首个人类Toll同源蛋白（后命名为TLR4），该蛋白通过激活核因子κB（NF-κB）来连接先天免疫与适应性免疫，标志着该研究向哺乳动物免疫学领域的关键转折。次年，Beutler研究组作出了一项开创性发现：Lpsd等位基因对应于Tlr4基因中的错义突变，从而确立了首个确凿的哺乳动物受体-病原体相关分子模式（PAMP）配对。这一发现解开了内毒素感知及脓毒症分子机制这一长达一个世纪的谜团。Malo等人独立验证了这一发现，进一步巩固了该结论。随后，Akira实验室于1999年进行的体内验证阐明了不同TLR在病原体感知中的独特作用。伴随髓系分化初始反应蛋白88（MyD88）等关键适配蛋白的发现，这些奠基性研究共同构建了TLR信号传导的核心框架。如同钥匙一般，这些开创性研究开启了我们理解免疫系统如何区分“自身”与“非自身”的新纪元。 最近在PubMed上以“Toll样受体”和“炎症”为关键词检索，发现2000年至2014年间发表了约10,000篇相关论文，其中仅过去10年就出现了惊人的19,000篇（图1下）。值得注意的是，2000年至2009年的十年间，对TLR生物学的理解取得了惊人进展：研究人员鉴定出多种TLR及其复杂的信号级联网络，并发现它们具有不同的PAMP特异性。内源性配体的发现还将TLR的作用扩展至无菌性炎症，这与Polly Matzinger于1994年提出的“免疫危险理论”相吻合。随后，在2010年至2019年间，人们对TLR信号传导的复杂分子调控及其在多种人类疾病发病机制中日益扩大的作用的理解发生了重大转变。 该领域的重要性在2011年得到认可，霍夫曼和博特勒因在Toll/TLR4方面的研究荣获诺贝尔生理学或医学奖，这催生了TLR研究的爆发式增长。此外，2020年至2025年的大部分文献已将研究重点转向探索在疫苗佐剂开发和免疫治疗设计中使用特异性激动剂和拮抗剂。如今，TLR研究已远远超出了单纯的病原体检测范畴。该领域现已将TLR信号传导视为一个多层级的调控系统，其失调与多种病理过程密切相关，涵盖从感染、自身免疫性疾病到癌症及炎症性衰老等广泛领域。正是这种基础机制与人类疾病之间的深刻联系，赋予了TLR通路作为治疗靶点的非凡潜力。 本文旨在通过系统梳理TLR信号网络的内在调控逻辑及其在组织微环境中的相互作用，提供一个全面的视角，从而阐明其在生理和病理状态下的不同作用。我们还将重点探讨通过激动剂或拮抗剂调节TLR通路能否以及如何干预广泛的炎症和免疫介导性疾病，并探索将其转化为新型免疫治疗策略的前景。我们不仅总结了这一动态领域过去的成就，更致力于搭建连接已确立原理与未满足临床需求的桥梁，从而激发开创性的贡献，以开启未来的治疗新篇章。 TLR的配体与信号传导通路 TLR通过识别不同的分子模式发挥作用，这是一种经过进化优化的策略，使宿主能够辨别具体的威胁。通过对所有哺乳动物TLR及其配体（包括病原体相关分子模式（PAMPs）和内源性损伤相关分子模式（DAMPs））的系统性鉴定，这一认识得到了进一步巩固。DAMPs（如高迁移率族盒1蛋白（HMGB1）、热休克蛋白（HSP）和定位异常的自身核酸）将TLR激活与无菌性炎症、组织修复、自身免疫及癌症联系起来。值得注意的是，关于HSP和HMGB1等蛋白质类DAMPs是否直接作为TLR配体发挥作用，目前仍存在持续的批判性探讨。早期的一些研究将这些分子的TLR激活效应归因于重组蛋白制备过程中共纯化的细菌内毒素污染。尽管后续采用更严格纯化技术和无内毒素系统的研究证实了某些DAMPs的固有活性，但关于部分DAMPs是否具有固有的先天免疫刺激能力，争议依然存在。这一局限性强调，在评估内源性配体与TLR之间的直接相互作用时，必须严格排除微生物产物的污染，才能获得真正可靠的见解。如图2所示，TLR的配体谱体现了其作为感染哨兵和细胞应激传感器的双重功能，使其成为生理和病理背景下危险信号的核心整合者。 TLR 根据亚细胞定位被战略性地划分，这决定了其配体特异性。细胞表面 TLR（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、 TLR10，以及小鼠TLR11等物种特异性变体）专门识别微生物膜成分，包括脂蛋白、脂茶碱酸、鞭毛蛋白，以及通过TLR4-髓系分化因子2（MD-2）复合物感知的典型内毒素脂多糖（LPS）。作为专门的核酸传感器，内体TLR（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9及小鼠TLR13）通过分别检测双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）、未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）DNA以及细菌核糖体RNA，对这一识别系统起到了补充作用。这种区室化将微生物结构分子的识别与核酸识别在物理上分离，从而提供了一个关键的检查点，以防止自身核酸引起的不当激活。在RNA感知成员中，TLR3、TLR7、TLR8和TLR13已经进化形成了一个针对不同RNA结构的分层识别系统。TLR3对长度要求最为严格，需要至少40个碱基对的双链RNA（dsRNA），且该双链必须跨越位于TLR3胞外域两端的两个结合位点。相比之下，TLR7的激活可由单链RNA（ssRNA）配体触发，仅需在第一个结合位点存在单个鸟苷核苷，同时在第二个结合位点存在含尿苷二聚体的ssRNA三聚体。TLR8的配体结合机制与TLR7非常相似，但在第一个结合位点更偏好尿苷，而在第二个结合位点则偏好UG二聚体。与这些受体不同，TLR13对配体的识别具有序列特异性，可识别一段13个核苷酸的单链RNA序列（5’-XCGGAAAGACCXX-3’），该序列在细菌23S核糖体RNA中高度保守，并存在于类似的病毒单链RNA序列中。这些精密调校的配体鉴别模型确保免疫系统能够针对不同类型的病原体（如双链 RNA 病毒和单链 RNA 病毒）以及病原体生命周期的各个阶段，发起精确且相称的炎症反应。 从结构上看，TLR 是 I 型跨膜蛋白，具有用于配体结合的富含亮氨酸重复序列 (LRR) 胞外域和启动信号传导的胞质 Toll/白细胞介素-1 受体 (TIR) 域。MyD88 最初被鉴定为白细胞介素-1 受体 1 (IL-1R1) 信号传导的介质。随后研究证实其是TLR4的适配蛋白，关键证据源自对MyD88缺陷小鼠的研究——这些小鼠对除TLR3以外的所有TLR均表现出反应缺陷。超分子组织中心（SMOCs）的概念被提出，旨在解释先天免疫受体如何实现信号放大与特异性。SMOC被定义为围绕激活受体形成的更高阶寡聚体复合物，是信号转导的主要场所。TLR信号传导分为两条核心通路：大多数TLR利用MyD88依赖性途径组装SMOC（称为Myddosomes），其核心组分包括MyD88和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）。早期的结构研究揭示，MyD88、白细胞介素-1受体相关激酶4（IRAK4）和IRAK2组装成螺旋状复合物，为激酶活化提供支架。该途径驱动NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化，从而诱导促炎性细胞因子的释放。后续研究表明，Myddosomes 不仅是体外实验中的产物，更是活细胞中动态且寿命较长的细胞器。一旦通过基因工程改造使巨噬细胞表达化学诱导型 MyD88 等位基因，Myddosomes 即可被重新编程以诱导多种输出，例如 I 型干扰素 (IFNs) 或坏死性凋亡，且不受上游受体的影响，这凸显了该信号传导平台的固有灵活性。在第二条通路中，内体 TLR3/4 特异性通路与 TRAF3/6 共同形成了一个以假定的 TIR 域含适配体诱导干扰素-β（TRIF）为中心的 SMOC（triffosome）。该复合物可激活 NF-κB 及 TANK 结合激酶 1 (TBK1)-干扰素调节因子 3 (IRF3) 信号通路，从而诱导促炎性细胞因子和 IFNs 的产生。 正如近期研究所强调的，对人类和小鼠巨噬细胞中 MyD88 的内源性标记，为 TLR 通路提供了分子层面的定义，这从根本上修正了我们对 Myddosomes 功能的理解。与经典的线性级联观点相反，邻近蛋白质组学和高分辨率显微镜技术揭示，Myddosomes 作为中央枢纽，负责招募并激活所有 TLR 通路组分。这些组分涵盖从受体到 IKK 复合物、p38 等 MAPKs、TBK1，甚至转录因子 p65。这一发现确立了Myddosomes不仅是一个上游信号复合物，更是执行整个通路的中央组织枢纽。TLR本身仅短暂结合，在解离前为Myddosomes的形成提供种子，而下游效应因子则持续参与数小时之久。在TRAF6/TGF-β激活的激酶1（TAK1）/NF-κB通路中， NF-κB 关键调节因子 (NEMO) 通过与 IKKα 和 IKKβ 形成抑制因子 κB (IκB) 激酶 (IKK) 复合物，成为 NF-κB 活化的关键调节因子。该复合物通过磷酸化 IκB 触发其多泛素化及蛋白酶体降解，从而释放 NF-κB 使其转位至细胞核并随后诱导炎症基因的表达。因此，Myddosomes 作为一种分子平台，整合了受体近端和受体远端的事件，确保信号转导在空间和时间上都得到协调。总体而言，这些信号适配体、激酶和转录因子共同构成了一台动态的分子机器，能够将配体-受体识别精确转化为量身定制的炎症反应，从而调控免疫输出的特异性、强度和多样性。这一严格调控系统的强大效能需要多层精细的调控机制来防止附带损害，这凸显了每个组分既是干预的关键节点，也是治疗潜力的来源。 TLR通路的内在调控 TLR信号传导系统并非一个简单的线性开关，而是一个复杂的信息处理枢纽。它将感染和损伤信号系统地整合到一个灵活的调控网络中，通过启动并精确调节先天性炎症反应，从而产生针对性的免疫应答。为了维持有效免疫防御与有害炎症之间的微妙平衡，该系统的信号传导受到多层内源性调控网络的严格约束，其中包括翻译后修饰（PTMs）、表观遗传调控、代谢重编程、动态信号复合物组装以及可变剪接等机制（图 3）。这些内在调控层共同维持着清除病原体与预防免疫病理学之间的动态平衡。理解这一内在调控网络是破译TLRs如何作为生物学决策枢纽的关键，从而使其能够在多种病理生理背景下实现精确的信号转导和功能可塑性。 翻译后修饰可动态调节TLR信号通路 蛋白质翻译后修饰（PTMs）是Toll样受体（TLR）信号传导中研究最为广泛的调控机制。这些共价化学修饰能够对蛋白质的功能、定位及相互作用进行动态且精确的调控。通过扩展蛋白质组的复杂性，PTMs不仅调控一般的信号转导，还通过可逆修饰精确调节TLR信号传导，这些修饰涵盖了从传统的磷酸化、泛素化、甲基化和乙酰化，到近期发现或非传统修饰，包括但不限于(去)SUMO化、去琥珀酰化、S-亚硝基化和O-GlcNAc化。 磷酸化 最近在PubMed上以“Toll样受体”、“炎症”和“磷酸化”为关键词进行检索，结果显示自2000年以来约有2,442篇相关文献，这凸显了TLR研究中对这一修饰机制的持续关注。在蛋白质翻译后修饰（PTM）的范畴内，磷酸化是典型的、且最易被调用的调控开关，它直接调控TLR的激活阈值、信号振幅及终止动力学。因此，从磷酸化入手探讨翻译后调控既合乎逻辑，又极具启发性，因为它体现了精细调节TLR信号传导的调控机制所具有的动态、精确和即时特性。 作为一种至关重要的可逆性PTM，蛋白质磷酸化在信号传导通路中发挥着关键的调控作用。目前已鉴定出多种通过调节蛋白质的（去）磷酸化来抑制TLR信号传导的蛋白质，包括蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2）、主要组织相容性复合体I类（MHC-I）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、含SET和MYND结构域蛋白2（SMYD2）、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B），以及蛋白激酶哺乳动物STE 20样蛋白激酶4（MST4）。与细胞内MHC II类不同——后者通过与Btk和CD40形成信号复合物来维持LPS诱导的Btk磷酸化并增强MyD88/TRIF依赖性细胞因子产生——恒定表达的膜结合型MHC-I通过Src介导的其细胞内域磷酸化来抑制TLR信号传导，招募Fps和SHP-2以抑制TRAF6依赖性TLR信号传导， 从而保护小鼠免受脓毒症侵害。此外，TLR激活的IRF3通过受激活C激酶1受体（RACK1）招募的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A介导的去磷酸化而失活，从而促进IRF3-I型干扰素（IFN-I）信号传导的终止。有趣的是，赖氨酸甲基转移酶SMYD2通过其SETi结构域招募PP1α（该过程独立于甲基转移酶功能），从而去磷酸化IRF3，进而抑制抗病毒性IFN-I反应，揭示了先天免疫的一种非经典调控机制。与直接启动炎症级联反应的核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列的受体（NLRs）不同，包括 NLRC5 和 NLRX1在内的一类独特的调节性 NLRs 作为分子开关，阻断或抑制由细胞外细菌配体触发的 TLR 诱导的信号分子磷酸化。这些调节性 NLR 本身不具备固有的激酶活性；相反，它们通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用来调节关键 TLR 信号传导组分的磷酸化状态。例如，NLRC5 与 IKKα 和 IKKβ 相互作用以阻断其磷酸化，而 NLRX1 则动态地与 TRAF6 和 IKK 复合物结合，以抑制 TLR 激活后 IKKα 和 IKKβ 的磷酸化。总体而言，这些调节性 NLR 充当关键检查点，防止病理反应过度。这突显了分层调节网络在先天免疫信号传导中的重要性，这些网络由特定区室的传感器进行协调。 泛素化 泛素化修饰在多种免疫过程中发挥着关键作用；其修饰水平通过E3泛素连接酶和去泛素酶的协同作用进行调控。图3底部列出了已知会影响TLR信号传导中泛素化（去泛素化）的众多调节因子和靶蛋白的详细清单。最近有研究报道，RNA结合型E3连接酶Makorin-2（MKRN2）会将K29多泛素链连接到翻译起始协同激活因子——多聚A结合蛋白相互作用蛋白1（PAIP1）的Lys 179残基上，从而阻断PAIP1与eIF4A的相互作用，进而选择性地破坏Il6的翻译以抑制炎症。作为一种泛素结合内切核糖核酸酶，NEDD4结合蛋白1（N4BP1）最近也被描述为通过协调IκB激酶家族内的泛素依赖性交叉谈话来抑制TLR信号传导和炎症。其他类型的调节因子包括Ig样受体和小细胞质RNA。例如，信号淋巴细胞激活分子家族7（SLAMF7）与含SH-2结构域的肌醇5'-多磷酸酶1（SHIP1）相互作用，从而抑制TRAF6的自泛素化，进而通过抑制巨噬细胞中NF-κB和MAPK的激活，减少TLR触发的炎症反应，以预防脓毒症和炎症引起的器官损伤。据报道，源自长非编码RNA（lncRNA）“转移相关肺腺癌转录本1”（MALAT1）前体转录后加工产生的MALAT1相关小胞质RNA（mascRNA），可促进TRAF6的K48连接泛素化，从而精细调节TLR诱导的先天免疫反应。 甲基化和乙酰化 甲基化和乙酰化也是重要的动态修饰，能够调节蛋白质的功能、稳定性、定位以及PTM的相互作用网络。迄今为止，研究人员已在TLR信号传导中鉴定出若干参与(去)甲基化和(去)乙酰化的调节因子，例如蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）和含SET结构域蛋白6 （SETD6）、赖氨酸去甲基酶 F-box 亮氨酸富集蛋白 11（FBXL11）、丝氨酸和苏氨酸激酶 Raf-1、乙酰转移酶 p300 、去乙酰酶 Sirtuin 2（SIRT2）以及组蛋白乙酰转移酶 1（HAT1）。研究发现，转化生长因子-β（TGF-β）抑制TLR-NF-κB信号传导的能力是由PRMT1诱导的SMAD6甲基化介导的，进而促进了MyD88的降解。有趣的是，NF-κB p65亚基上不同残基的特定甲基化和乙酰化在关键程度上调控着靶基因的选择性、转录活性及激活动力学。SETD6介导的p65 K310位点甲基化会使p65失活，并削弱由p65驱动的转录程序（包括炎症反应），而FBXL11则通过去甲基化激活型p65的K218和K221位点来调控p65依赖性基因表达。只有当 NF-κB 被 TLR 激活时，通过 DC-SIGN 激活的 Raf-1 才会导致 NF-κB 亚基 p65 的乙酰化，从而延长并增加 Il0 的转录，以增强抗炎细胞因子反应。细胞质中的 SIRT2 通过促进 p65 的去乙酰化和抑制 NF-κB 通路，降低了巨噬细胞的先天性炎症反应。此外，TLR/肿瘤坏死因子α（TNF-α）受体信号传导激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CAMK2），从而驱动HAT1介导的促髓细胞白血病锌指蛋白（PLZF）乙酰化，进而招募组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）-NF-κB p50抑制复合物来限制NF-κB反应。在TLR信号传导中，甲基化和乙酰化如何被调控以调节NF-κB活性，以及控制其时空精准性、强度、残基特异性、修饰类型及多蛋白转录复合体的机制，将是未来研究的关键焦点。 非常规PTM 对非常规蛋白质翻译后修饰（PTM）的进一步研究不断揭示出TLR信号传导调控机制的复杂性。小泛素样修饰因子介导的修饰（SUMO化）影响着广泛的生物功能，包括应激反应、DNA损伤修复、线粒体稳态和细胞分裂。据报道，SUMO特异性蛋白酶6（SENP6）可催化NEMO的去SUMO化，从而抑制其活化以及NF-κB介导的促炎基因诱导。由三元结构域含蛋白60（TRIM60）介导的TAK1结合蛋白2（TAB2）的SUMO化修饰，在LPS诱导的脓毒症及单核细胞增生李斯特菌感染中，阻碍了TRAF6/TAB2/TAK1复合体的形成及其下游MAPK和NF-κB信号通路的激活。 琥珀酰化是一种相对较新发现的PTM，通过将琥珀酰基转移至目标蛋白的残基上，参与许多细胞过程。在脓毒症中，去琥珀酰酶SIRT5可降低TBK1的琥珀酰化水平并抑制炎症反应。此外，S-亚硝基化是氧化还原信号传导中一个新兴的范式，最近发现LPS诱导的一氧化氮合酶2（NOS2）通过S-亚硝基化p65单体来失活NF-κB，从而调节炎症反应。蛋白质的 O-GlcNAc 化修饰会改变许多核蛋白和细胞质蛋白，从而影响多种基础生物活动。从机制上讲，LPS 诱导谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶 2（GFAT2）的表达，从而促进 O-GlcNAc 转移酶（OGT）介导的 O-GlcNAc 化修饰，并且还与阻止受体相互作用蛋白激酶 3 (RIPK3)-RIPK1异源相互作用及RIPK3-RIPK3同源相互作用，或通过与小鼠Sin3同源转录调节蛋白A（mSin3A）相互作用来抑制NF-κB活化和脓毒症炎症。 表观遗传编程重塑了TLR响应性染色质景观 表观遗传调控对于有效诱导免疫反应和维持组织稳态至关重要。DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及基于RNA的修饰是四种主要的表观遗传修饰。配体结合会触发TLR二聚化，并激活MyD88和/或TRIF适配蛋白，最终导致潜伏转录因子（NF-κB、AP-1、IRFs）的激活。这些转录因子长期以来被公认为在基因表达的表观遗传调控中发挥着关键作用。过去十年的研究表明，表观遗传变化构成了TLR诱导的基因表达调控中一个至关重要的新领域。 DNA甲基化 DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化，通过在胞嘧啶的第五个碳原子上形成5-甲基胞嘧啶（5mC），在细胞功能中发挥着至关重要的作用，特别是在哺乳动物的转录调控中。在LPS暴露后，TRAF6和Il6基因启动子区域依赖于DNMT1的DNA甲基化抑制了NF-κB/MAPK的激活及细胞因子的分泌。除已知的在DNA氧化中的调控作用外，甲基胞嘧啶双加氧酶ten-eleven translocation 2（TET2）通过在LPS刺激的晚期阶段招募HDAC2，抑制了Il6启动子活性。 组蛋白修饰 组蛋白的末端赖氨酸或精氨酸残基是乙酰化、甲基化、乳酸化、泛素化和SUMO化的潜在靶点，这些修饰会改变它们与DNA的相互作用，从而影响基因表达。多种组蛋白甲基化的负调节因子，包括 G9a、SET 域分叉蛋白 2 (SETDB2) 和缺失、小或同源异形 1 样蛋白 (Ash1l) ，以及组蛋白去乙酰化调节因子，如死亡域相关蛋白 (Daxx) 和视网膜母细胞瘤蛋白 (Rb)，已在 TLR 信号传导通路中得到鉴定。 作为一种组蛋白甲基转移酶，G9a 缺失抑制了 谷胱甘肽 S-转移酶 Pi 1/2 (Gstp1/2) 启动子上的 H3K9me1 水平，从而增强了 LPS 诱导的炎症以及活性氮物种 (RNS)/活性氧物种 (ROS) 的产生 。虽然以碳酸酐酶独立的方式发挥作用，但核碳酸酐酶 VI B (CA-VI B) 与 TLR 信号传导协同作用，通过招募蛋白精氨酸甲基转移酶 5 （PRMT5），从而降低Il12启动子区域组蛋白H3精氨酸8位点对称二甲基化修饰（H3R8me2s），进而提高染色质可及性并促进c-Rel结合，实现对IL-12的选择性诱导。另一个例子是Daxx，它通过HDAC1介导的组蛋白去乙酰化，在LPS刺激的巨噬细胞中选择性抑制IL-6转录。类似地，Rb招募HDAC1和HDAC8来减弱Ifnb1启动子中组蛋白H3/H4的乙酰化，从而抑制TLR和病毒诱导的IFN-β产生。其他表观遗传调控因子是否通过组蛋白修饰参与TLR信号传导，值得进一步研究。 染色质重塑 染色质重塑通过改变染色质可及性来动态调控基因表达，具体而言，它是通过响应包括TLR信号在内的各种信号，在数百个潜伏增强子和启动子上诱导性重塑核小体来实现的。NF-κB在TLR4刺激的诱导性核小体重塑中发挥广泛作用，能够激活染色质更开放的待激活调控元件，而这种重塑的选择性则源于其与IRF3和MAP激酶诱导因子等其他诱导性因子的协同作用[68]。刺激响应性核小体重塑由ATP依赖性复合物催化，尤其是SWI/SNF复合物[经典BRG/BRM相关因子（cBAF）、多溴相关BAF（PBAF） 以及非经典Brahma相关基因1相关因子（ncBAF）），这些复合物在巨噬细胞对细菌内毒素脂质A的应答过程中，促进核小体的驱逐、滑动或构象转换。三种SWI/SNF变体的协同结合与新发染色质开放及潜伏增强子的激活相关，而单独的PBAF结合则会抑制活性增强子，单独的ncBAF结合则会激活它们。此外，作为PBAF复合体的特异性组分，AT富集相互作用域2（ARID2）也能抑制TLR触发的炎症通路。相反，mSWI/SNF的另一关键组分——染色质重塑因子ARID1A——最近被发现可通过组蛋白甲基转移酶核SET结构域2（NSD2）介导的H3K4/H3K36甲基化，促进IRF3在Ifn-I启动子处的染色质可及性。这些机制揭示了染色质重塑、组蛋白修饰和转录因子如何在抗病毒免疫中协同作用。 基于RNA的修饰 虽然新兴的表观转录组学领域已鉴定出超过170种RNA修饰，这些修饰通过改变RNA的结构、相互作用和功能赋予其独特的特性，但近期研究进一步表明，基于RNA的修饰在TLR信号传导中也具有重要的免疫调节功能。这些基于RNA的机制在整个调控网络中调控基因表达，涵盖从染色质重塑到转录、转录后及翻译调控的各个环节。例如，研究发现Asp-Glu-x-Asp/His (DExD/H)盒解旋酶DEAD盒解旋酶5（DDX5）可与甲基转移酶样3 （METTL3）和METTL14形成N6-甲基腺苷（m6A）修饰复合物，该复合物向TLR2/4转录本添加m6A，从而促进YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTHDF2）介导的降解，进而降低TLR2/4的表达，作为分子开关在细菌感染期间调节炎症反应。另一个例子是，m6A去甲基转移酶肥胖相关蛋白（FTO）与Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3（BNIP3）转录本相互作用，并上调其表达，以m6A依赖性方式诱导线粒体自噬，从而缓解脓毒症。 许多调节性非编码RNA（ncRNA），包括微RNA（如miR146a和miR-466l）和长链非编码RNA（lncRNA），最近被发现是基因调控中的关键角色，可防止炎症的异常激活。其中，lncRNA 作为一种庞大、相对较新且快速进化的非编码转录本家族，因对免疫调节提供了新的机制见解而备受关注。例如，Lnc-Atg16l1 在 U84 附近的碱基与 TLR7 结合，在 A129 附近的碱基与 MyD88 结合。Lnc-Atg16l1 作为分子支架，通过在 TLR7 激活时发生茎环构象变化，增强了 TLR7-MyD88 TIR 域的相互作用，从而促进下游信号传导 [77]。Lnc-DC 特异性表达于成熟的人类树突状细胞（DC）中，已被鉴定为 LPS 诱导的 DC 成熟的关键调节因子，其通过与磷酸化信号转导和转录激活因子 3（STAT3）结合并阻止其去磷酸化来发挥作用。相比之下，LincRNA-THRIL 和 EPS 等长链非编码RNA（lncRNA）分别以 IRF3 和异质性核核糖核蛋白 L（hnRNPL）为靶标。这些 lncRNA 通过抑制转录因子、调节 mRNA 和微RNA 的稳定性、调控 mRNA 的核糖体进入和翻译，以及控制表观遗传机制的组分，从而对 TLR 信号传导和先天免疫进行负调节。因此，阐明长链非编码RNA及其修饰的体内功能，将有助于我们深入理解调控免疫系统对病原体、无菌性激活及环境信号作出反应的机制。同样重要的是，需确立这些RNA介导机制的失调与特定免疫相关疾病发病之间的因果关系。 代谢回路为TLR信号传导提供能量并调控其进程 先天免疫与代谢之间的密切联系近年来备受关注。最新证据表明，细胞代谢与TLR信号传导之间存在着深刻的整合。TLR的激活会触发快速的代谢重编程，这对满足效应功能（包括炎症、杀菌活性和运动能力）所需的能量和生物合成需求至关重要。而这些过程反过来又会双向调节先天免疫反应的强度和持续时间。因此，人们越来越认识到，代谢介质在灵活、多方面的反馈回路中发挥着重要作用，这些回路协调着平衡的先天炎症反应和抗病原体免疫防御。 能量代谢 TLR的激活会驱动免疫细胞的代谢重编程，诱导一种对树突状细胞（DC）的激活和存活至关重要的糖酵解转变，并使巨噬细胞能够利用糖酵解作为其主要能量来源，同时将线粒体从通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生腺苷-5'-三磷酸（ATP）的功能，重新导向至生物合成前体和活性氧（ROS）的生成。孤儿核受体雌激素相关受体α（ERRα）是细胞能量代谢的核心调节因子，它通过促进肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3（TNFAIP3；也称为A20）的转录，并精细调节巨噬细胞中的代谢重编程，从而对TLR诱导的炎症产生负调节作用。已知代谢传感器 AMP 激活蛋白激酶 (AMPK) 通过增殖因子激活受体 γ 共激活因子-1 α (PGC1α) 介导的线粒体生物发生来拮抗生物合成途径并促进分解代谢，从而增强氧化磷酸化，而 AMPK 的激活则会抑制 TLR 诱导的葡萄糖消耗及随之而来的 DC 激活。 除了通过催化抗菌代谢物衣康酸的产生将代谢与免疫联系起来外，还发现免疫应答基因1（IRG1）通过ROS增加A20的表达，从而促进内毒素耐受性，这增加了A20启动子区域组蛋白的H3K4me3修饰。此外，一氧化碳（CO）和血红素氧合酶-1（HO-1）可诱导 IRG1 和 A20 的表达，从而在体外及小鼠脓毒症体内模型中抑制 LPS 刺激产生的 TNF-α，这为 IRG1 的抗炎作用提供了进一步证据。有趣的是，一项最新研究表明，在病毒或细菌感染后，巨噬细胞中乙醛酶2（GLO2）的表达在mRNA和蛋白质水平上均迅速下调，从而使NF-κB介导的代谢物S-D-乳酰谷胱甘肽（SLG）积累，进而驱动半胱氨酸介导的蛋白质D-乳酸化， 从而抑制 RelA 依赖性炎症，并将这一糖酵解分支点确立为可调节的代谢检查点，用于调控炎症。 脂肪酸氧化 脂肪酸氧化（FAO）能释放脂肪中储存的能量以供细胞能量生成，而通过脂肪分解释放的游离脂肪酸会经由CD36等转运蛋白被巨噬细胞摄取，从而为线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）提供燃料 [90]。最近有报道称，在依赖于脂肪酸从头合成和 CD36 介导的外源性脂肪酸摄取的情况下，锌指-天冬氨酸-组氨酸-半胱氨酸 6（ZDHHC6）介导的 MyD88 半胱氨酸 113 位的棕榈酰化对于 IRAK4 与 MyD88 中间域的结合以及随后的 TLR/MyD88 激活至关重要。此外，在 TLR 激动剂的作用下，转录抑制因子 BTB 和 CNC 同源物 2 (BACH2) 作为 CD36 的抑制因子发挥作用，而 CD36 或脂肪酸氧化 (FAO) 的抑制会减少 naive B 细胞向效应细胞的分化，这些细胞通常会产生 IL-6 和抗体。人们普遍认为，肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）是脂肪酸氧化（FAO）的限速酶，它通过将长链酰基辅酶 A 转化为酰基肉碱，介导脂肪酸向线粒体基质的转运，从而实现氧化能的产生。有趣的是，最近发现 CPT1A 通过促进维生素 D 受体的琥珀酰化，发挥神经炎症抑制剂的作用。这一结果与另一项研究相吻合，该研究表明，在由 LPS 诱导的急性肺损伤小鼠的肺组织中，CPT1A 的过表达缓解了线粒体功能障碍，并恢复了脂肪酸氧化（FAO）以及 IL-1β 和 TNF-α 等促炎细胞因子的表达。 脂质代谢 TLR介导的炎症过程与脂质代谢密切相关，二者之间存在双向影响：脂质代谢的改变会调节TLR信号传导、内吞作用和细胞因子分泌。巨噬细胞中TLR的激活会诱导糖脂异球三己糖基神经酰胺（iGb3）的快速生成，该物质与内体CD1d结合并激活细胞内反向信号传导，从而在抗原呈递细胞（APC）中放大TLR触发的先天免疫反应 。初步研究还表明，常规树突状细胞（cDCs）利用内部胆固醇储备来组装表面脂质纳米域，促进成熟标志物的表达，并稳定免疫受体信号传导。这一过程依赖于胆固醇通过尼曼-皮克病 C 型蛋白 1 (NPC1) 的转运来驱动稳态和 TLR 诱导的成熟，而 AXL 受体酪氨酸激酶 (AXL) 通过脂质纳米域的组装对这一过程进行负调节。 然而，脂质代谢的作用不仅限于促进 TLR 诱导的炎症，对于防止这种保护性反应发展为慢性疾病所需的积极消退也至关重要 [97]。例如，前列腺素 E2 (PGE2) 是一种关键的炎症脂质介质，具有环境依赖的双重免疫调节功能。PGE2 在体内由细菌 TLR 激动剂诱导产生，能够通过循环或神经途径传递发热信号，在 TLR 激活后，PGE2 会与环氧合酶-2 (COX-2) 表达一起被强力上调。然而，随后它通过 PGE2 受体亚型 4 (EP4)/环腺苷酸 (cAMP)/蛋白激酶 A (PKA) 轴抑制 IKK/NF‑κB 信号级联反应。这种反馈机制缓解了 LPS 诱导的炎症反应，并有助于对 LPS 引发的急性肺损伤和脓毒症产生保护作用 [98]。在炎症性肠病（IBD）的病理过程中，PGE2 也表现出抑制性调节作用。巨噬细胞中IL-10信号传导的缺失会损害STAT3的磷酸化，导致持续的LPS驱动型细胞因子产生，而升高的PGE2水平则进一步抑制其抗菌活性。这些发现揭示了一个关键的TLR/IL-10/PGE2调节轴，该轴的失调会导致巨噬细胞异常激活和宿主防御功能缺陷，从而加剧IBD的进展。 值得注意的是，脂质代谢中一种被称为“脂质介质类别转换”的程序性转变，对于炎症消退至关重要，这一过程由包括脂氧素、消炎素、保护素和马雷素在内的特殊促消炎介质（SPMs）积极调控。这些 SPM 是一组由 ω-3 或 ω-6 多不饱和脂肪酸 (PUFA) 经酶促反应生成的脂质，它们能终止炎症并促进组织修复。在人类单核细胞衍生的 M1 巨噬细胞中，发现 TLR2 或 TLR4 的激活会触发促炎性 5-脂氧合酶 (5-LO) 和 COX-2 衍生的脂质介质的生物合成，而持续的刺激则会促进 M2 巨噬细胞向促消炎性 15-LO 衍生的氧脂素转变。另有研究表明，TLR7的激活通过二十二碳六烯酸（DHA）衍生的途径，驱动D-系列SPM（如解质素D1和保护素D1）的生物合成，从而促进过敏性气道炎症的消退。此外，在脓毒症的免疫抑制阶段给予解素 D2，可通过上调 TLR2 表达、增强肺泡巨噬细胞的吞噬作用以及降低细菌负荷，从而增强宿主对继发感染的防御能力 。有趣的是，SPMs 还能通过作为 EP4 受体的偏向性正向别构调节剂发挥促消退作用，从而增强 cAMP 介导的抗炎信号传导，并重编程巨噬细胞上的 EP4 以促进吞噬作用。 总体而言，脂质代谢在TLR信号传导中的作用并非简单的“开-关”开关，而是一个动态调节器。精确理解脂质代谢与TLR信号传导之间的时空相互作用，对于针对炎症过程进行靶向干预至关重要。靶向其信号通路或恢复其生理调节环境（例如通过增强消退程序），是治疗慢性炎症性疾病和癌症免疫疗法的关键策略。 氨基酸代谢 氨基酸代谢对免疫细胞（尤其是巨噬细胞功能）的影响，是近年来备受关注的另一个研究领域。研究表明，氨基酸及其相应的代谢途径会影响M1型巨噬细胞的活化。例如，巨噬细胞中通过NOS2产生一氧化氮（NO）时，由LPS/TLR4驱动的精氨酸代谢不仅会影响与极化相关的三羧酸循环（TCA循环）变化和柠檬酸积累，还会抑制炎性细胞因子的产生。此外，氨基酸（尤其是亮氨酸）的供应使TLR3-TRIF信号通路能够通过RIPK1/Caspase 8裂解隔离体1（SQSTM1/p62），进而激活雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）并抑制自噬。先天免疫系统利用内体TLR3、7和8等受体以及胞质核酸传感器来诱导IFN-I反应，这些反应对于抗病毒防御至关重要，但如果失调则可能引发自身免疫。通过代谢组学和功能筛选，最近发现多胺精胺是干扰素-I信号传导的关键代谢抑制因子，它直接与4.1/ezrin/radixin/moesin (FERM) 结构域以及 Janus 激酶 1 (JAK1) 的 Src 同源 2 (SH2) 和 SH2 结构域，从而破坏 JAK1 与细胞因子受体的相互作用，进而广泛抑制由细胞因子触发的 JAK1 磷酸化。 高阶信号传导复合体重塑了TLR的感知与激活 TLR信号传导系统利用多种传感器、适配体和效应蛋白，并依赖于高阶信号复合体的组装，从而将病原体或细胞应激的检测与先天免疫激活联系起来。该信号复合体的组装介导了对TLR信号传导的严格调控，对于防止过度炎症至关重要，且通过多种靶向机制实现。通过调控TLR信号复合体的拓扑特性（如连接性、连续性和邻接性），调节因子能够进一步平衡TLR通路中的整体稳态。 当负调节因子（如单免疫球蛋白IL-1受体相关分子（SIGIRR）、肿瘤发生抑制因子2（ST2L）的长异构体或ERBB2转导因子2（TOB2））结合并截留关键适配蛋白时，便会发生适配蛋白截留，从而阻止这些蛋白与活化受体或下游激酶相互作用。结构模型揭示，TIR结构域的BB环通过竞争性抑制来阻断MyD88二聚化，而BB环和αC螺旋则介导TLR4二聚化，形成对称性支架以招募Mal适配体。凭借独特的结构和功能特征，SIGIRR—— 因缺乏细胞内TIR结构域的关键残基Ser447和Tyr536，通过阻断MyD88和IRAK的结合来抑制NF-κB/c-Jun N端激酶（JNK）的激活，并干扰TRIF相关适配子分子（TRAM）的二聚化来破坏TRIF信号传导，从而抑制TLR/IL-1R信号传导。ST2L对TLR2和TLR4信号传导的抑制作用是通过BB环介导的与Mal和MyD88的异二聚化实现的，该过程占据了它们的相互作用位点，进而破坏了受体后信号复合物的组装，从而阐明了TIR结构域相互作用的关键机制。有趣的是，CD4+ T 细胞表达的 CD4 或 CD4 的胞外域（可溶性 CD4，sCD4）会与 MHC-II 的 β2 域结合，从而启动反向信号传导，破坏 MHC II-TLR4 脂质 raft 域。这促进了 MHC-II 的胞质域对干扰素基因刺激因子 (STING) 和 Src 同源区域 2 含蛋白酪氨酸磷酸酶 2 (SHP2) 的招募和激活，从而抑制了 TLR4 炎症所需的 IRAK1/细胞外信号调节激酶 (ERK) 和 TRAF6/NF-κB 的激活。此外，TOB2 通过与 TRAF6 和 MyD88 结合，从而破坏来自 MyD88-TRAF6 复合物的信号传导，从而抑制 TLR 诱导的炎症反应。 相比之下，免疫特异性跨膜适配体 SCIMP 则作为 ERK1/2 的直接支架。它引导 ERK2 在空间和时间上募集到膜皱褶和巨胞内体，以激活 TLR4、c-Fos 以及促炎性细胞因子的产生。值得注意的是，这种分子机器的组装机制也体现在跨界细菌相互作用这一新兴范式中。最近研究发现，革兰氏阳性菌利用TLR2配体脂茶碱酸（LTA）促进TLR4/MD-2复合物的聚集，使其形成功能失调的二聚体，从而在肠道等血清匮乏的环境中交叉抑制革兰氏阴性菌的炎症信号传导。 细胞内区室化作为一项关键的组织原则，能够实现生物活性分子的隔离，为生化通路提供时空特异性的微环境，从而确保各类生物过程的高效进行。此外，TLR在亚细胞器中的受调控区室化与降解，以及受辅助分子调控的二聚化或降解过程，共同构成了精确激活和终止TLR介导的先天免疫应答的关键机制。结构研究通过揭示低pH条件下TLR3及TLR7-9的蛋白水解切割现象，极大推进了我们对酸性pH如何调节内体区室中TLR信号传导的理解。被切割的TLR对pH值的敏感性是合理的，因为这有助于将TLR的活性限制在内体区室中，并防止有害的促炎反应。内体TLR的精确激活取决于其配体结合胞外域在酸性pH值下的排列，而随后的信号传导则由细胞内TIR域的寡聚化状态所决定。有趣的是，一项近期发表的研究指出，TLR3不可或缺的预二聚化过程发生在早期内体中的蛋白水解切割之前。一种在内体中富集的自身RNA——Rmrp——最初将TLR3的胞外域拉近，同时使胞质TIR域保持分离，它作为配体模拟物，促使TLR3在膜上采取非活性的预二聚化构象，而非单体形式。其结果是受体被预先激活，能够快速感知致病性双链RNA并高效启动先天免疫反应。此外，预二聚化还促进了更高阶复合物的形成。内溶酶体核酸酶 RNase T2 和外切核酸酶磷脂酶 D (PLD) 协同产生 TLR7-9 的核苷酸配体。这些观察结果表明，细胞内区室化为精确调节 TLR 激活创造了独特的环境。 此外，正确的 N-糖基化对于 TLR4 的膜转运至关重要，而 calsyntenin-3 (CLSTN3) 会对其产生负调节作用，从而破坏寡糖基转移酶 (OST) 复合物的组装并减少 TLR4 的膜转位。CLSTN3 还抑制 TLR3、TLR7 和 TLR9 的膜定位，其下调与炎症性疾病中细胞因子反应增强相关。在细胞膜上，TLR4 的激活通过内吞作用终止，该过程将受体从信号传导平台移除并使其进入降解途径。随后的内体成熟和溶酶体降解决定了 TRIF 依赖性信号传导的持续时间和强度。在树突状细胞（DCs）中，PI(3)K的p110δ亚型诱导TLR4内化及随后的钙蛋白酶介导的Mal降解，从而减少促炎细胞因子的产生，同时增强TRAM依赖性内体信号传导，进而产生IL-10和IFN-β等抗炎细胞因子。随后，通过内溶酶体系统发生溶酶体降解，在此过程中，TLR/适配蛋白被泛素化，由运输所需内体分拣复合体（ESCRT）分拣到多囊泡体（MVB）的管腔内囊泡中，并最终在溶酶体融合时被降解。肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HRS）作为ESCRT-0亚基，调控TLR的溶酶体转运与降解，促进TLR7、TLR9和TLR3的内溶酶体转运，凸显了其在调控溶酶体进入过程中的关键作用。一种溶酶体相关的小鸟苷三磷酸酶（GTPase）Rab7b 也参与 TLR4 的溶酶体转运和降解。具体而言，含三联体结构域蛋白 3A （TRIAD3A）介导TLR4和TLR9的泛素-蛋白酶体降解；而TLR转运伴侣Unc-93同源蛋白B1（UNC93B1）通过招募syntenin-1来抑制TLR7（而非TLR9）的信号传导，该过程促进TLR7分拣至多囊泡体（MVB）的管腔内囊泡中，从而终止其信号传导。综上所述，这些新兴靶点通过诱导构象变化、调节配体结合亲和力及/或蛋白质区室化（这些对TLR的下游信号转导至关重要），为未来的药物研发展现出巨大潜力。 与被脂质双层包围的膜结合型细胞器不同，无膜细胞器是动态组装体，主要通过液-液相分离（LLPS）形成。LLPS是一种新兴的生物物理机制，它将生物分子组织成类液态凝集物，从而实现高效的信号转导和免疫激活。生化与结构研究表明，LLPS在TLR-NF-κB信号传导中起着关键作用：其中K63连接的线性多泛素链会特异性诱导NEMO凝集物的形成，在此过程中IKK复合物被激活，进而磷酸化NF-κB抑制因子IκBs。除了其炎症功能外，NEMO 还促进了蛋白质聚集体的自噬体清除，并通过与 p62 共凝结发挥自噬适配体的作用。相反，融合抑制因子 (SUFU) 作为关键的负调节因子，抑制了相分离的 TRAF6 液滴形成，从而防止 LPS 刺激后 NF-κB 的激活。髓系特异性 SUFU 缺失会加剧脓毒症炎症，而 TRAF6 耗竭可逆转这一效应，凸显了该调控轴在治疗上的重要性。这些发现表明，通过相分离形成的生物分子凝集物是炎症信号传导和蛋白质稳态中的基础机制，为脓毒症及相关疾病的治疗提供了潜在靶点。凝集体的形成受多种机制调控，包括 RNA 结合蛋白和核酸等支架分子的性质和浓度、磷酸化和泛素化等 PTM，以及温度、pH、离子和代谢物等微环境条件。尽管生物分子凝集体领域仍处于起步阶段，但关于相分离在调节 TLR 信号传导中的作用的研究有望为理解先天免疫反应提供新的视角。 可变剪接扩大了TLR信号网络中的蛋白质组多样性 前mRNA的可变剪接作为一种关键的负反馈机制，用于终止TLR信号传导并防止过度炎症；在此过程中，TLR通路中的众多基因既会产生促进炎症信号传导的经典亚型，也会产生作为显性负性抑制剂发挥作用的可变剪接变体。这包括 MyD88、TLR4、MD-2、IRAK1、IRAK2、IKKs、TBK1 和 IRF3 等基因，它们通过外显子跳过、内含子保留和替代剪接位点使用等多种剪接事件产生抑制性同工型。关键在于，许多抑制性变体的产生（如 MyD88 短型（MyD88-S）、MD-2 短型（MD-2s）和可溶性小鼠 TLR4（smTLR4））是由持续的 PAMP 刺激或感染诱导的，从而形成一种负反馈循环，即炎症触发其自身的终止。这些异构体通过多种机制发挥作用，包括形成无功能的复合物、充当诱饵受体，或破坏关键的蛋白质-蛋白质相互作用和磷酸化。虽然MyD88的经典长异构体（MyD88-L）促进TLR诱导的炎症，但通过外显子跳跃产生的MyD88-S则作为显性负性抑制剂发挥作用。MyD88-S 虽能结合 TLR 和 IRAK1，但缺乏招募 IRAK4 所需的结构域，从而破坏信号传导性 Myddosomes 复合体的形成，并抑制 IRAK1 的磷酸化及 NF-κB 的活化。这种剪接事件由 LPS 等炎症刺激诱导，形成关键的负反馈循环。小鼠和人类均会产生具有负调节作用的 MD-2 剪接变体（小鼠为 MD-2B，人类为 MD-2s），尽管它们在剪接机制和功能上存在差异。小鼠 MD-2B 源于第 3 外显子的部分缺失，虽然保留了与 TLR4 的结合能力，但会阻碍其表面表达。与此同时，人类 MD-2s 源于第 2 外显子的跳跃，并与野生型 MD-2 竞争 TLR4 的结合。在小鼠中，TLR4基因在第2和第3外显子之间包含一个替代外显子，从而引入了一个过早终止密码子。这导致产生一种可溶性的截短型TLR4蛋白（smTLR4），该蛋白被分泌出来，通过结合LPS并阻止其与膜结合的TLR4/MD-2复合物相互作用，从而充当诱饵受体。综合现有证据，这些效应并非出人意料，且表明调节炎症的维持而非完全消除炎症反应，可能是一种有用的治疗途径，既能治疗慢性炎症性疾病，又不损害必要的初始抗病原体反应。 与关于替代性前mRNA剪接如何调节TLR信号传导的研究类似，也有许多研究探讨了调控剪接调节因子产生的机制。作为 U2 小核糖核蛋白 (snRNP) 的核心组分，剪接因子 3a (SF3a) 复合物通过确保促炎基因的正确剪接来促进炎症，从而产生如 MyD88-L 这样的全长蛋白，进而增强 TLR 信号传导。相比之下，RNA 结合蛋白丝氨酸-精氨酸富集剪接因子 1 (SRSF1) 和异质性核核糖核蛋白 U (hnRNPU) 在 LPS 刺激下被激活，直接协调 MyD88 的可变剪接，促进显性负性 MyD88-S 的产生，并对 TLR 信号传导提供关键的反馈抑制，以消除炎症。最近的磷蛋白组学研究揭示了病原体感染期间剪接因子发生显著磷酸化，特别强调了 hnRNPM 作为一种具有潜在免疫调节功能的差异修饰蛋白。在受到各种先天免疫刺激后，包括革兰氏阴性菌感染、TLR2 和 TLR4 激动剂处理以及胞质双链 DNA (dsDNA) 转染，hnRNPM 通过剪接调节作为先天免疫基因的关键转录抑制因子发挥作用。具体而言，hnRNPM在丝氨酸574位的磷酸化会增强内含子保留，从而减弱对感染的先天免疫反应。因此，需要进一步研究以阐明这些抑制性剪接变体抑制信号传导的确切机制，以及调控其产生的调节通路——这可能构成一个终止持续性促炎信号传导的负反馈回路。 总而言之，固有TLR调控精妙的多层架构是确保信号特异性并防止异常免疫活化的核心机制。该架构涵盖了翻译后修饰、表观遗传重编程、代谢适应、动态信号体组装以及前mRNA的可变剪接。展望未来，核心处理在于理解这一预先构建的内源性网络如何与组织微环境中的外源性信号（包括来自其他免疫和非免疫通路的输入）相整合，从而将内在调控与全身性交叉调控相衔接。 TLR通路的交叉调控 在过去的二十年里，对TLR通路的研究彻底改变了我们对先天免疫和炎症的理解，揭示出有效的宿主防御需要复杂的多层级相互作用，而不仅仅局限于孤立的信号传导范式。这一范式转变强调了TLR之间存在内在的交叉调控，其下游信号传导通路之间的竞争性、协同性、分层性或构象性调控，能够动态地优化针对特定PAMP的免疫应答。此外，这种TLR自主协调机制与TLR及其它PRR家族之间形成的更广泛协同网络紧密结合，共同破译复杂的病原体特征，并协调产生恰如其分的免疫反应（图4）。 TLR诱导的PTM之间的相互作用 一个关键机制涉及免疫细胞通过TLR感知单一PAMP后，细胞内多种蛋白质翻译后修饰（PTM）被激活，这些PTM通过动态相互作用来调节TLR触发的反应。SHP2是一种广泛表达的胞质酪氨酸磷酸酶，它在TLR信号传导中协调多种PTM，并表现出环境依赖的作用。最近的研究表明，SHP2可直接催化TLR7在Tyr1024位的去磷酸化，从而促进其泛素化、内体转运以及随后的NF-κB驱动的促炎反应。与它在 TLR7 通路中发挥的积极作用相反，SHP2 通过与 TBK1 的激酶域结合，对 TRIF 依赖的 TLR4 和 TLR3 通路产生负调节作用。作为一种胞质 SUMO E3 连接酶，HDAC4 需要 Cys292 才能发挥其活性，对 IκBα 的 Lys21 位点进行 SUMO 化修饰，从而阻断其泛素化和降解，以抑制 TNF-α/LPS 诱导的 NF-κB 激活和炎症反应。同样，LPS 诱导 p300 对丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1 (MKP-1) 底物结合域内的赖氨酸残基 K57 进行乙酰化，从而增强 MKP-1 与 p38 的相互作用，并提高其磷酸酶活性，从而中断 MAPK 信号传导。相反，HDAC1/2/3 对 MKP-1 的去乙酰化会增强 MAPK 信号传导和先天免疫反应。 TLR信号传导中的PTM-代谢-表观遗传相互作用 这种交叉调控还通过TLR诱导的PTM、表观遗传重编程和代谢重编程之间的直接相互作用实现，共同对细胞结局进行精细调节。例如，巨噬细胞内在的适配器 B 细胞适配器磷脂酰肌醇 3-激酶 (BCAP) 促进 v-akt 小鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物 (AKT) 的磷酸化，以抑制叉头盒蛋白 O1 (FOXO1) 和糖原合成酶激酶 3 β (GSK3β) 的磷酸化。同时，BCAP将TLR信号传导与有氧糖酵解联系起来，产生乳酸，从而使组蛋白乳酸化，进而驱动修复性基因表达和巨噬细胞极化。此外，谷氨酰胺合成酶 (GLUL) 抑制促炎性巨噬细胞的分化，但在脓毒症中，其表达因 TLR4/NF-κB 诱导的 α-酮戊二酸 (α-KG) 耗竭及随后的 H3K27me3 介导的甲基化而受到抑制。相反，谷氨酰胺衍生的α-KG能抑制炎症并促进内毒素耐受性，其补充可减轻脓毒症的严重程度。核内hnRNPA2B1已被确认为一种DNA传感器，可在病毒感染期间放大IFN-α/β的产生。有趣的是，最近研究表明hnRNPA2B1参与了抗菌免疫的诱导。细菌感染早期会增加核内腺嘌呤水平；腺嘌呤直接与hnRNPA2B1结合，随后hnRNPA2B1被腺嘌呤直接招募至Il1b增强子区域，在那里通过招募核仁素和FTO介导m6A去甲基化，从而促进染色质可及性。这一过程揭示了抗菌免疫中新的代谢-表观遗传机制，确立了细胞内代谢物补充作为对抗感染的一种有前景的免疫调节方法。作为一种新型的DNA结合蛋白，ZNF667已被阐明可抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、 AKT以及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的过度磷酸化，进而通过下调己糖激酶2（HK2）和6-磷酸果糖激酶2（PFKFB3）等糖酵解基因的表达，调控mTOR依赖性的有氧糖酵解，从而抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症。有趣的是，病毒感染可重塑细胞代谢，从而改变病毒传播与宿主防御之间的平衡。病毒感染通过抑制alkB同源蛋白5（ALKBH5）的活性，诱导m6A依赖性代谢改变，导致羟戊二酸脱氢酶（OGDH）表达下降及衣康酸生成减少，从而限制病毒复制。作为应对，病毒通过直接结合其最保守的15个残基片段，诱导长链非编码RNA-ACOD1劫持谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT2）的酶活性及其代谢产物的生成，从而形成一个增强病毒感染的代谢反馈回路。这些研究从机制层面深入阐释了病原体与宿主之间的反馈性相互作用，从而为先天免疫和炎症中蛋白质翻译后修饰（PTM）、表观遗传调控及代谢重编程之间的复杂相互作用提供了另一种功能模型。 由不同TLR介导的共轭信号 组合性异二聚化通过激活的TLR之间的相互作用，能够引发有效的先天免疫应答，从而帮助仅凭有限的TLR亚型识别多种多样的微生物PAMP。例如，TLR2与TLR6或TLR1协同作用，以识别种类繁多的天然PAMP，这些TLR会被招募至巨噬细胞的吞噬体中，从而诱导细胞因子活化。此外，除了与单一PAMP结合外，触发不同TLR的特定PAMP还能激活收敛性信号通路，从而协同放大炎症信号。另一个例子是，TLR2阻断可减轻LPS诱导的炎症介质，而TLR2/4共刺激则增强了巨噬细胞的迁移，TLR4/9则协同增强了趋化吸引和细胞因子产生。与此一致的是，树突状细胞中与TRIF偶联的TLR（TLR3/4）与内体TLR（TLR7/8/9）协同作用，显著增强IL-12/IL-23的产生，并促进Th1 （Th1）促进配体Delta-4的产生，同时抑制Th2配体Jagged-1，从而产生一种强有力的Th1极化反应，可应用于免疫疗法。 多种TLR激活通路的转调 由多种TLR引发的信号传导通常涉及不同下游信号通路的相互作用。在人类浆细胞样树突状细胞和 B 细胞中，TLR7 和 TLR9 的同时刺激会触发一种反调节机制，该机制通过降低 IRF-7 和 TLR9 的表达来特异性抑制 CpG 诱导的 IFN-α 产生，同时保留 CD80/CD86 表达和 B 细胞增殖等其他免疫刺激序列功能，这表明了一种防止过度的干扰素反应的保护机制。相反，TLR3 和 TLR7 通路的协同激活与 MyD88 和 TRIF 依赖性通路协调，通过同步招募 IRF1/JunB/CCAAT/增强子结合蛋白 β (C/EBPβ) 以及动态的 MyD88 介导的 IRF1 抑制来增强细胞因子的产生，从而精确地控制促炎反应的时机。这种协同作用通过新合成的抑制因子维持的持续 ERK 磷酸化，优先放大二次应答基因。在腹膜巨噬细胞中，TLR2 和 TLR4 分别识别巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2) 和 LPS，同时共刺激可增强 TNF-α 的产生，这表明了 TLR2 和 TLR4 介导的信号传导途径之间的协同作用。然而，MALP-2预处理通过抑制NF-κB和JNK，抑制了对LPS的TNF-α产生。同样，在 DC 和外周血单核细胞 (PBMC) 中，TLR2 的同时刺激通过快速的 IL-10 介导的抑制，选择性地抑制了 TLR3/4 诱导的干扰素-γ 诱导蛋白-10 (IP-10) 和 IL-12p35。因此，不同TLR之间的通信网络可能会改变TLR对其特异性PAMP的初始反应，从而使先天免疫的调节更加复杂。 TLR与其他PRR信号通路的交叉调控 入侵的病原体通常会激活多种PRR，而由此引发的免疫反应取决于TLR及其他PRR家族所诱导信号的协同作用。 TLR 和 NLR 信号通路 经典型炎性小体在响应PAMPs/DAMPs时，通过激活Caspase-1来加工前体IL-1β和IL-18。正如预期且与文献一致，研究发现TLR信号传导通过双重调控机制协调NOD、LRR和嘌呤素结构域含蛋白3（NLRP3）炎性小体的激活： NF-κB介导的NLRP3表达转录上调，以及通过干扰素刺激基因（ISG）15修饰（ISGylation）实现的翻译后稳定化。ISGylation修饰由ISG15以及E3连接酶HECT结构域和RCC1样结构域5/6（HERC5/6）催化，这些酶通过阻断NLRP3在TLR预激活或病毒感染期间的K48连接型泛素化及蛋白酶体降解，从而稳定NLRP3。反过来，MD-2 与细胞表面的 TLR4 结合，并通过 MyD88/NF-κB 信号通路进一步增强 LPS 触发的 NLRP3 炎性小体激活和 IL-1β 分泌。一项后续研究还表明，TLR 伴侣 canopy FGF 信号调节因子 (CNPY3) 不仅对于 TLR 向细胞膜的转位必不可少，而且还能促进炎性小体的正常组装，包括与含 CARD 的凋亡相关斑点样蛋白 (ASC)/Caspase-1 的共定位。正如预期的那样，CNPY3的缺失会破坏炎性小体的结构，导致TLR信号传导受损，并降低成熟IL-1β和IL-18的产生。相反，TBK1和IKKε——这两种在TLR信号传导激活时密切相关的激酶——作为NLRP3通路的“关闭开关”，与PP2A磷酸酶的“开启开关”相互作用，以平衡NLRP3的活性。NLR家族CARD结构域含蛋白5（NLRC5）已被确认为一种神秘的NLR，其突变与炎症和传染病相关。TLR 信号传导和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)+ 水平调节 NLRC5 的表达和 ROS 的产生，使 NLRC5 能够感知 NAD+ 的耗竭以及 PAMP/血红素或血红素/细胞因子信号，与 NLRP12 形成 PANoptosome，并驱动焦亡、凋亡和坏死性凋亡（PANoptosis）以及炎症。 TLR与胞质核酸感知通路 作为胞质核酸感知通路的两种机制——病毒RNA感知RIG-I样受体（RLRs）-线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）通路，以及DNA感知环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-STING通路——正日益被公认为关键的先天免疫机制，它们通过干扰素诱导的信号级联反应启动宿主防御反应。细胞质核酸传感器与TLR协同作用的机制可理解为一种智能的两步免疫策略：首先它们联手发起强有力的防御，随后又会收缩以防止过度激活。 当病毒通过内吞作用进入细胞时，其核酸在内体中暴露出来，并被TLR3、TLR7或TLR8等TLR识别。随后，当病毒基因组释放到细胞质并开始复制时，产生的RNA中间产物会被RLRs检测到。例如，IRF3可通过多种信号被激活，包括经由TLR4介导的LPS信号、经由RIG-I-MAVS通路和/或内体TLR3介导的双链RNA信号，以及经由cGAS-STING通路介导的双链DNA信号。这些信号级联最终均汇聚于 TBK1 和 IKKɛ 的激活，并由多种适配蛋白协助完成。经 TBK1-IKKɛ 磷酸化后，IRF3 形成二聚体并转运至细胞核。这种序列性的双重识别机制能够强效且协同地激活先天免疫。Munc18-1相互作用蛋白3（Mint3）已被鉴定为一种正向调节因子，它通过促进TRAF3的多泛素化，从而增强IRF3的激活和IFN-β的产生，进而增强TLR3/4和RIG-I介导的抗病毒反应。然而，在后期阶段或强信号条件下，占主导地位的 RLR 通路会主动抑制 TLR 信号传导，以优化细胞资源分配，并防止过度或有害的免疫激活。作为 E3 泛素连接酶，TRAF 相互作用蛋白 (TRIP) 在巨噬细胞中 TLR 激活和仙台病毒 (SeV) 感染后上调，并与 TBK1 结合以促进其 K48 连接的多泛素化及降解，从而抑制 TLR3/4 和 RIG-I 介导的 IRF3 激活和 IFN-β 产生。这种交叉调节使宿主能够高效消除病毒威胁，同时将自我伤害降至最低，这反映了先天免疫系统的非凡复杂性和适应性。 多种免疫通路，如 TLR、IL-1R、肿瘤坏死因子受体 (TNFR)、生长因子受体 (GF-R) 和蛋白激酶 C (PKC)，均可汇聚于 NF-κB，通过诱导微管解聚来强效增强 STING 介导的免疫，从而阻断 STING 的溶酶体降解并延长其激活时间。TLR-NF-κB-STING协同作用可放大干扰素反应并增强抗病毒防御。最新研究表明，中性粒细胞外陷阱（NETs）——一种由中性粒细胞 DNA 组成的纤维——通过 cGAS/TLR9 信号传导，在长期接触香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺病（COPD）中促进 NF-κB 依赖性自身免疫，这突显了将 NET-DNA 和 cGAS/TLR9 作为缓解持续性气道炎症的潜在治疗策略的重要性。在组织损伤或自身免疫性疾病中，线粒体DNA（mtDNA）会释放到细胞质中。mtDNA可被cGAS直接识别，或通过自噬或内吞作用进入内体，并在其中被TLR9检测到。TLR激活后产生的I型干扰素以自分泌/旁分泌方式作用于细胞，上调数百个干扰素刺激基因的表达，其中部分基因可能增强cGAS-STING通路的敏感性或活性。这导致免疫激活并加剧炎症反应，该机制被认为在系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中起着关键作用。在维持稳态和预防自身免疫方面，这些通路还表现出精细的相互调节，以防止对自身DNA产生过度反应。新兴证据表明，STING的激活也会产生调节效应。cGAS-STING通路的预激活可抑制pDC中随后TLR9介导的干扰素产生。除了引发促炎反应外，这种交叉抑制可能涉及由细胞因子信号抑制因子（SOCS）1/3和A20上调驱动的自身抑制环路，从而抑制过度的TLR介导的信号传导。此外，STING依赖性信号传导可在应答细胞中驱动炎症细胞因子和耐受性介导物的表达，例如吲哚胺2,3-二氧合酶1（IDO-1）。IDO-1的诱导随后促进调节性T细胞（Tregs）的招募和活化，这些细胞的功能是抑制邻近或远端免疫细胞中由TLR驱动的炎症反应。对这种交叉谈话机制的深入探索，不仅加深了我们对先天免疫复杂性的理解，还为通过联合疗法控制传染病、自身免疫性疾病和癌症提供了新的战略见解。 TLR 和抑制性模式识别受体 (iPRRs) 炎症调节的另一个关键复杂层面在于激活受体（如TLRs和iPRRs）之间的动态相互作用，其中包括癌胚抗原相关细胞粘附分子（CEACAM1）、白细胞相关免疫球蛋白样受体1（LAIR1）、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）、 CD300a/f、白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族（LILRBs）、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（TIGIT）、脊髓灰质炎病毒受体（PVR）、C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）以及含V-set和跨膜结构域蛋白1（VSTM1）。虽然TLRs在响应PAMPs和DAMPs时对启动促炎级联反应至关重要，但iPRRs则发挥着关键的负反馈调节作用。这些iPRRs识别通常存在于内源性和微生物分子模式中广泛相似结构的分子模式，提供有助于塑造适当免疫结果的上下文线索。从机制上看，iPRRs主要通过其胞质尾部的免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIMs）传递抑制信号。当配体结合后，磷酸化ITIMs会招募SHP-1、SHP-2和SHIP等含SH2结构域的磷酸酶，这些酶随后会抑制包括TLRs在内的激活受体下游的信号级联反应。例如，来自Moraxella catarrhalis和Neisseria meningitidis的特定微生物粘附素与CEACAM1结合，通过ITIM磷酸化和SHP-1招募，抑制呼吸道上皮中TLR2驱动的NF-κB活化，从而建立了一种关键的免疫逃逸策略。作为胶原信号的传感器，LAIR-1 通过抑制 TLR4 介导的激活并调节树突状细胞（DC）的分化来抑制炎症反应。因此，炎症反应的结果不仅取决于激活配体的存在，还取决于 PRR 和 iPRR 信号之间的综合平衡。这一精密的调控网络使免疫系统能够准确解读免疫环境，在对良性或已消退的激活产生耐受的同时，对真正的威胁作出果断反应。因此，TLR-iPRR轴是炎症反应中的关键调控枢纽，对其进行治疗性干预在治疗多种炎症性疾病方面具有巨大的潜力。 TLR与细胞外可溶性模式识别分子（PRMs） 值得注意的是，细胞外可溶性模式识别分子（主要分为五聚素、集素和纤维素）在先天免疫中发挥着多方面的作用：一方面协调病原体的清除，另一方面通过关键性调节TLR驱动的免疫应答。在短链五聚素中，C反应蛋白（CRP）可增强中性粒细胞经TLR介导的超氧化物释放，尽管这会加剧氧化应激，但可能增强宿主防御能力 。同样，在发炎的牙龈中升高的血清淀粉样蛋白A（SAA），通过激活人类牙龈成纤维细胞中的TLR2来触发IL-6和IL-8的分泌，从而促进牙周炎症。相反，长五聚素3（PTX3）通过抑制TLR信号传导在脓毒症模型中发挥抗炎作用，从而减轻肠道屏障损伤。在 collectin 家族中，表面活性蛋白 A（SP-A）通过涉及 Rab7 和 β-arrestin2 的溶酶体降解，限制了牙槽巨噬细胞中 LPS 诱导的 TLR4 信号传导，突显了其在抑制过度 TLR4 激活方面的治疗潜力。与此同时，表面活性蛋白 D (SP-D) 直接与 TLR4/MD-2 复合物结合，以抑制软骨细胞中的 PI3K/Akt 和 NF-κB 信号传导，这说明了它在炎症消退中的调节作用。值得注意的是，小鼠的菲科林被鉴定为急性期反应物，在 LPS 诱导的全身性炎症期间，其 mRNA 和蛋白质水平的表达均显著增强。此外，研究表明，小鼠菲科林A和菲科林B通过调节肺泡和间质巨噬细胞的反应，会加剧聚肌苷酸-聚胞苷酸（poly I:C）和LPS刺激模型中的急性肺损伤。 因此，通路的交叉调控是信号整合的主要机制，可确保细胞反应既具有特异性，又与集体刺激成比例。这种内在的调控框架反过来又受组织微环境的调节，下一节将探讨这一主题。 TLR 网络连接免疫信号与组织微环境信号 炎症在生理状态下对维持组织稳态起着双重作用，但在失调时则会造成损伤。尽管大量研究聚焦于炎症如何影响器官功能，但组织微环境如何塑造炎症反应这一问题正日益受到关注。TLR网络作为核心枢纽，整合免疫信号与组织特异性信号，从而调节炎症的强度、持续时间和结局（图5）。这些多重调控机制确保免疫反应能精确适应微生物威胁和组织生理状态，在优化宿主防御的同时，将附带损伤降至最低。 受调控的细胞死亡（RCD）包含结构严谨的信号级联和分子定义的效应机制，对维持组织稳态以及在应激条件下恢复生物平衡至关重要。RCD包括五种广受关注的形式，即凋亡、焦亡、自噬依赖性细胞死亡、坏死性凋亡和铁死亡。TLR信号传导也可触发RCD，其既能通过清除受感染细胞提供宿主防御，亦可能通过释放免疫原性分子引发病理性炎症，从而导致组织损伤。随着我们对各细胞死亡通路及TLR信号传导的认识不断加深，越来越清楚的是：除了调控各通路的独特机制外，它们之间还存在显著的交叉作用。例如，TLR信号传导为经典NLRP3炎性小体的激活提供必要的启动信号，而第二信号（如ATP、孔形成毒素或结晶颗粒）则触发其完全组装，进而通过Caspase-1介导的Gasdermin D（GSDMD）裂解引发焦亡性细胞死亡，导致IL-1β和IL-18的释放。HMGB1作为细胞应激的广谱传感器，通过平衡细胞存活与死亡反应来维持稳态，同时作为关键的DAMP激活TLR4信号通路；HMGB1/TLR4轴在脑内出血后亦会促进NLRP3炎性小体介导的焦亡。该领域最近的研究进展还揭示了 RIPK1/RIPK3-Fas 相关死亡域 (FADD)-Caspase-8 信号复合体与 PANoptosis 执行之间的密切联系。同样，通过 MyD88 或 TRIF 信号通路的 TLR 预激活，在 TAK1 缺失的巨噬细胞中，通过促进 RIPK3-混合谱系激酶域样蛋白 (MLKL) 途径驱动的多蛋白细胞死亡复合体的形成，绕过了诱导细胞死亡所需的 RIPK1 激酶活性。因此，TLR信号传导与细胞死亡途径之间的相互作用构成一个关键的决策节点，决定了结果是保护性的细胞清除，还是由免疫原性细胞内容物的释放驱动的病理性炎症。 由TLR调节的细胞因子网络介导宿主防御，同时也通过调节TLR信号传导形成反馈回路。TLR的激活既通过NF-κB/AP-1/MAPK通路诱导促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6），又通过IRF-3/IRF-7诱导I型干扰素（IFN-I）反应。在最重要的细胞因子中，I型干扰素（IFN-I，即IFN-α和IFN-β）具有强大的抗病毒活性，并在炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用。巨噬细胞中的TLR信号传导会触发I型干扰素的产生，进而激活下游的I型干扰素受体-JAK1-STAT1信号级联反应。随后，I型干扰素信号传导通过SET-domain containing 2（SETD2）介导的STAT1在K525位的甲基化以及ISG启动子上的H3K36me3修饰来增强抗病毒免疫，同时通过miR-145/HDAC11轴抑制先天性IL-10的产生。这种协调形成了一个精确的反馈回路，平衡了免疫反应的强度和持续时间。面对流感或病毒模拟物的处理，巨噬细胞来源的肿瘤素 M (OSM) 通过对抗 I 型干扰素介导的免疫病理学并增强 II 型肺泡细胞的增殖来促进肺上皮修复，从而相应地提高生存率。近期研究进一步揭示，IFN-I诱导的长非编码RNA-ISIR通过结合IRF3的DNA结合域来取代Fli-1，从而促进IRF3的磷酸化、二聚化、核转位以及随后抗病毒和炎症反应的放大，进而介导正反馈回路。据推测，II型干扰素（IFN-γ）通过JAK/STAT介导的巨噬细胞转录重编程，激活了强大的抗细胞内细菌免疫。TLR 介导的 单核细胞增生李斯特菌 检测诱导巨噬细胞中 miR-1 的表达，通过降解 lncRNA Sros1 增强 IFN-γ-STAT1 信号传导，揭示了病原体感知与细胞因子激活的先天免疫之间至关重要的交叉对话。作为针对细胞内细菌感染的先天免疫反应中的关键步骤，IFN-γR2 的膜转位对于功能性 IFN-γR 的组装以介导 IFN-γ 信号传导至关重要。有趣的是，尽管循环中的 IFN-γ 水平升高，但 E-选择素的缺失会损害巨噬细胞针对单核细胞李斯特菌的先天性激活，因为 E-选择素促进了 BTK 介导的 IFN-γR2 磷酸化以及依赖于 EFhd2 的高尔基体到膜的转运，从而使功能性细胞因子受体组装得以实现，从而产生有效的免疫反应。事实上，一项最新研究表明，IFN-γ和TLR信号传导通过Caspase-8介导的B细胞淋巴细胞/白血病2基因（Bcl-2）抑制，以及iNOS依赖性的Bcl2相关蛋白X （BAX）/Bcl-2 拮抗剂/杀伤因子（BAK）的激活，进而加剧了严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）的致病过程。已知IL-4诱导的表观遗传重编程通过NF-κB-p65基因组扩展、增强的增强子活性以及巨噬细胞亚型特异性早期生长反应基因2（EGR2）的参与，产生延长的协同作用，从而驱动对TLR激活的炎症高反应性，最终导致肺部病理变化。作为这些效应的制衡，抗炎细胞因子IL-10通过多种机制（包括转录抑制和促炎细胞因子的RNA不稳定化）强力抑制TLR诱导的炎症。值得注意的是，它诱导miR-146b直接靶向TLR4/MyD88/IRAK1/TRAF6，在单核细胞中提供了额外的抗炎调控层。综上所述，这些细胞因子介导的反馈和前馈回路构成了一个动态的调节微环境，其中免疫应答会根据不断变化的威胁和组织背景，实时地被持续微调、放大或抑制。 氧气感知是TLR调节的另一个关键维度。局部组织缺氧是感染和炎症的特征，由氧气需求增加和血供减少引起。最新研究表明，缺氧通过炎症部位局部及招募的免疫细胞中的氧敏感机制积极调节免疫反应，且缺氧与TLR信号通路之间存在广泛的相互作用。缺氧对氧感知羟化酶的抑制会调节下游信号传导，从而影响缺氧诱导因子（HIF）-1α的稳定性和NF-κB的活性。稳定的 HIF-1α 与 HIF-1β 二聚化，并招募共激活因子 CREB 结合蛋白 (CBP)/p300，形成转录活性复合物，通过重编程免疫细胞代谢来微调 TLR 信号传导。例如，作为关键氧气传感器的脯氨酰羟化酶结构域蛋白（PHDs）会对 HIF-1α 进行羟基化，从而通过 TLR4/MyD88 介导的 AKT/NF-κB 和 MAPK 通路调节缺氧适应并促进人类牙龈成纤维细胞中 LPS 诱导的炎症。在缺氧条件下，PHD活性受抑制会减少NF-κB组分的羟基化，从而在体内减弱LPS触发的NF-κB信号传导。这种转变促进内毒素耐受性，驱动M2型巨噬细胞极化，并上调IL-10表达，共同在内毒素血症中发挥保护作用。此外，LPS激活的巨噬细胞会经历代谢重编程转向糖酵解，积累的琥珀酸可稳定HIF-1α以驱动IL-1β的产生，而2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）对糖酵解的抑制则阻断了这一依赖于HIF-1α的炎症通路。另一个关键例子涉及缺氧敏感性转录因子 NF-κB，它是 TLR 信号传导的下游效应因子，已在该通路的组分上鉴定出多个羟基化位点。此外，作为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的标志性特征，低氧血症可通过调节髓系造血迅速重塑循环中髓系细胞的反应，这一机制得到了缺氧LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型证据的支持。然而，一项更近期的研究表明，全身性缺氧通过骨髓前体细胞中组蛋白3的剪切及H3K4me3的丢失，引发中性粒细胞持续性功能障碍，从而增加ARDS康复后的感染风险。因此，缺氧既作为TLR信号传导的传感器，又作为其调节器，整合代谢和表观遗传重编程，使免疫反应适应组织氧张力。揭示这些机制有助于深入理解缺氧与TLR失调相互交织的炎症性疾病治疗。 TLR信号传导的神经免疫调节是组织微环境中一个引人入胜且复杂的过程。大多数内脏器官或屏障部位（如脾脏、淋巴结、肠道、皮肤和肺）都受到广泛的自主神经支配，主要来自交感神经和迷走神经。感觉神经元的细胞体位于神经节中，它们通过在屏障组织中具有周围神经支配的神经末梢检测感染、炎症和组织损伤的信号，随后向局部微环境释放神经递质以调节免疫细胞的活性。除了直接的神经连接外，可溶性介质（包括全身循环的糖皮质激素和局部起作用的神经肽）进一步增强了这种交叉对话。在这个回路中，TLR 的激活会引发炎症反应以在感染期间消除病原体，随后，包括胆碱能抗炎通路和下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA) 轴在内的抗炎通路会释放乙酰胆碱和糖皮质激素，以“冷却”炎症微环境。与这一观点一致，最近的研究表明，α7 尼古丁乙酰胆碱受体 (α7nAChR) 的刺激通过 PI3K 信号传导激活胆碱能抗炎通路，从而抑制 TLR4 的表达并预防脓毒症损伤。此外，由感觉神经释放的神经肽降钙素基因相关肽（CGRP）通过cAMP/PKA介导的诱导型cAMP早期抑制因子（ICER）上调，抑制TLR诱导的炎症；该机制在不影响NF-κB活化的前提下，在Tnfa启动子位点与激活转录因子2（ATF-2）竞争结合位点。某些神经递质还促进组织修复与再生，积极塑造有利于再生的微环境。在伤口愈合过程中，α7nAChR的激活会通过抑制NF-κB和ERK1/2通路，阻碍角质形成细胞的迁移，并减少TLR2介导的促炎细胞因子和抗菌肽的产生，最终削弱细菌清除能力。这种调控机制表现出显著的器官特异性。例如，肠道中的肠神经系统形成了一个独特的神经微环境，精细调控着屏障功能和微生物共生，这说明神经模式如何根据组织背景来定制免疫反应。进一步证据表明，卒中后肠道交感神经的激活会释放去甲肾上腺素，从而下调TLR5的表达，进而启动miR-150-5p/TLR5/IgA致病级联反应。该级联反应通过导致针对鞭毛蛋白的特异性IgA生成不足、抗菌肽分泌受损，以及随之而来的黏液屏障破坏和鞭毛菌入侵，最终引发微生物群失调。神经系统绝非被动的旁观者，越来越多的证据表明，它还通过组织微环境中的局部和全身神经信号积极塑造免疫反应，尽管这些信号通过何种环境依赖机制和组合代码来微调TLR信号传导，目前仍大多未被探索。这一神经免疫轴突显了系统级别的稳态控制，其中神经系统提供在空间和时间上精确的信号来调控局部 TLR 驱动的炎症，从而维持器官功能。 其他应激条件，如营养感知、机械性微环境改变或 pH 值波动，也已显现为 TLR 活性的重要调节因子，从而塑造免疫反应。营养转运蛋白，特别是溶质载体 (SLC) 家族，通过介导葡萄糖、氨基酸和铁等底物的摄取，充当细胞代谢门户，这一过程对免疫细胞的发育、稳态、激活和分化至关重要。例如，葡萄糖转运蛋白1型（GLUT1）是巨噬细胞中的主要葡萄糖转运蛋白，其表达受LPS上调，可诱导代谢重编程，从而升高活性氧（ROS）水平，进而驱动与肥胖相关胰岛素抵抗有关的过度炎症表型。此外，氨基酸作为关键的环境刺激因子，通过多种氨基酸传感器（包括溶质载体家族 38 的氨基酸转运蛋白成员 9，即 SLC38A9）激活 mTORC1，其中精氨酸和谷氨酰胺等关键氨基酸会通过 Rag GTP 酶机制触发 mTORC1 向溶酶体的募集。与此同时，内体上的TLR3和TLR7通过不同的转运模式在特化的溶酶体区室上激活mTORC1，从而驱动I型干扰素的产生。作者进一步推测，虽然 TLR/IFN 信号传导促进 mTORC2 驱动的反应，但营养信号通过促进 mTORC1 在溶酶体中的定位来促进其激活。硒通过硒蛋白重编程 LPS 刺激的巨噬细胞代谢，从动力学上增强氧化磷酸化和关键代谢节点（如琥珀酸脱氢酶），从而促进炎症消退。近期研究表明，作为感染和癌症标志物的细胞外基质刚度变化会激活机械敏感离子通道，这些通道将机械力转化为信号以调节吞噬细胞行为和炎症反应，凸显了细胞外基质在免疫中的关键作用。机械传感器Piezo1通过将LPS诱导的信号转化为钙离子内流，从而激活钙/钙调蛋白依赖性激酶II（CaMKII）-STE20样丝氨酸/苏氨酸激酶MST1和MST2（MST1/2） -Rac轴，以实现病原体的吞噬和杀灭，这为理解巨噬细胞的力学生理学及宿主反应提供了关键见解。炎症会引发组织和细胞内区室pH值向酸性方向的显著转变，这作为一种关键的微环境信号发挥作用。从机制上讲，最近发现这种pH波动会直接作用于转录共激活因子溴结构域含蛋白4（BRD4）。具体而言，其固有无序区域内组氨酸残基的质子化会溶解含有BRD4和介导复合物亚基1（MED1）的相分离转录凝集物，从而对TLR驱动的炎症基因表达施加负反馈，并调节免疫应答的强度。这些例子强调了一个原则，即 TLR 信号传导并不是一个细胞自主的过程，而是依赖于细胞外环境的物理和化学状态，从而确保免疫激活与组织的更广泛生理状态相整合。 致病性效应因子通过调节TLR信号传导来逃避免疫监视 宿主通过进化形成了复杂的先天免疫系统，利用TLR等PRR来检测和清除病原体，这些受体严格调控免疫信号传导并维持机体稳态。为了对抗这一系统，致病性病毒、细菌和真菌会采用多种规避策略来躲避、削弱或破坏宿主的免疫防御，从而促进病原体的定植、存活和扩散。这些机制包括掩盖病原体相关分子模式（PAMPs）、降解或劫持关键信号分子，以及操纵宿主调控网络以抑制抗菌反应。此外，除了经典的免疫激活外，感染还可能破坏细胞器功能、改变细胞凋亡通路，并削弱细胞防御系统。深入理解病原体如何颠覆TLR信号传导及其他免疫机制，或将为恢复有效免疫功能和对抗传染病开辟新的治疗途径。 掩盖TLR的PAMPs 病原体采用的一种主要且直接的免疫逃逸策略，是通过结构掩蔽来规避TLR所感知PAMP的识别。在受体介导的内吞作用过程中，包膜病毒通过膜融合逃离内体，而非包膜病毒则利用肽类物质裂解内体膜；然而，许多病毒通过将核酸封装在保护性衣壳中来规避TLR的识别。那些未能逃逸的病毒会在晚期内体/溶酶体中被降解，从而可能使病毒基因组暴露于内体TLR（如TLR3、TLR7/8和TLR9）之下。钩端螺旋体属具有广泛的致病潜力，从非传染性疾病到危及生命的疾病不等。值得注意的是，钩端螺旋体 interrogans 通过规避 NOD1/2 感知肽聚糖、TLR4 感知 LPS 以及 TLR5 识别鞭毛蛋白亚单位，逃避先天免疫识别，从而作为一种隐形病原体发挥作用。在31种莱姆螺旋体参考菌株中，已鉴定出10种不同的脂质A谱型，莱姆螺旋体正是通过这些脂质A谱型来降低TLR4的激动作用，从而逃避先天免疫识别——这一关键策略可抑制促炎反应，并促进全身性感染的建立。尽管钩端螺旋体鞭毛的鞭毛蛋白 B (FlaB) 亚基可以激活人类 TLR5，但活的致病性钩端螺旋体在很大程度上逃脱了 TLR5 的识别，这很可能是由于其鞭毛位于周质中，且 FlaB 在丝状核心内被结构所掩盖。 同样，天然存在的 RNA 修饰，特别是假尿苷 (Ψ)，会抑制 TLR 激活，这解释了为什么内源性 RNA 和 Ψ 修饰的 RNA 基本上不具有免疫刺激性。这一特性推动了基于mRNA的技术发展，包括使用其衍生物 N1-甲基假尿苷（m1Ψ）的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗（mRNA-1273 和 BNT162b2）。Ψ和m1Ψ均通过共同机制抑制TLR激活：它们通过干扰内溶酶体核酸酶（RNase T2和PLD3/4）对RNA的加工，从而减少免疫刺激性RNA降解产物的生成。然而，在直接激活TLR的层面存在关键差异：含Ψ的片段难以被TLR7/8识别，而m1Ψ仍保留激活TLR8的能力。这种识别差异或许解释了为何Ψ修饰的RNA能实现近乎完全的免疫逃逸，而m1Ψ修饰的RNA仍保留一定程度的免疫刺激能力。 m1Ψ的部分免疫识别性，结合脂质纳米颗粒的佐剂效应，共同促成了m1Ψ修饰mRNA疫苗的疗效，在免疫逃逸与足够的免疫原性之间实现了平衡。重要的是，先天免疫激活的最佳程度因治疗背景而异：对于蛋白质替代疗法，最小化免疫反应至关重要；而对于癌症免疫疗法，则可能需要更强的激活作用。这一原则应以预期的临床目标为导向。综上所述，这些关于Ψ和m1Ψ的机制见解为理解基于RNA修饰的免疫调节提供了分子基础，并为未来RNA治疗药物的理性设计提供了依据。 降解或劫持TLR信号分子 被识别后，许多病原体会表达致病因子，这些因子直接作用于下游信号分子，从而抑制促炎性细胞因子和干扰素的产生。乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）作为一种对HBV复制和疾病进展至关重要的病毒转录激活因子，不仅促进病毒复制，还通过调节TLR通路中的关键分子来促进病毒相关病理的进展。与此同时，丙型肝炎病毒核心蛋白（HCVc）通过TLR2信号通路抑制单核细胞向M2a、M2b和M2c巨噬细胞亚群的分化，导致吞噬功能受损，并可能促进丙型肝炎病毒的持续感染。丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶通过裂解适应蛋白MAVS和TRIF来抑制先天免疫应答， 从而阻断RIG-I和TLR3信号传导，并抑制IRF-3的激活及IFN-β的产生；尽管这种抑制作用可被逆转，但其催化效率的变异与病毒致病性相关，且依赖于特定的非结构蛋白4A（NS4A）协同因子残基来增强活性。此外，病原体还会干扰关键转录因子的激活。例如，基孔肯雅病毒（CHIKV）的结构蛋白（衣壳和包膜蛋白）及非结构蛋白（nsP1、nsP2、nsP3 和 nsP4）会破坏 TLR 信号传导，并干扰关键的干扰素应答步骤，包括 IRF3 激活、JAK-STAT 信号传导以及 IFN-β 启动子活性，从而导致抗病毒应答减弱和病毒复制增强 [249]。单纯疱疹病毒（HSV）的糖蛋白H/L和gB在病毒入侵过程中均作为TLR2配体，但只有gH/gL能触发TLR2依赖性的NF-κB激活，这种功能差异对于开发改良的亚单位疫苗至关重要[250]。此外，某些病毒和细胞内病原体会劫持TLR信号传导以抑制免疫级联反应。人类免疫缺陷病毒（HIV）的Vpu和Nef蛋白通过抑制STAT1磷酸化，破坏IFN-α诱导的JAK/STAT通路激活，从而使病毒能够在局部微环境中逃避免疫干扰素介导的抗病毒免疫。在丙型肝炎病毒（HCV）感染期间，树突状细胞（DCs）上的TLR2表达会下调；而在伯氏考克斯氏体（Coxiella burnetii）感染中，该病原体通过破坏TLR-2/TLR-4的结合以阻止其激活，从而在巨噬细胞内存活。这一机制依赖于肌动蛋白细胞骨架的重组，阻断该过程可恢复TLR复合物的形成并恢复p38α-MAPK的激活。此外，巨噬细胞中的TLR信号传导通过触发一氧化氮（NO）的产生，对抗病原体免疫至关重要；而结核分枝杆菌和弓形虫等细胞内病原体则利用这一漏洞，通过劫持TLR-MyD88-C/EBPβ通路来诱导精氨酸水解酶精氨酸酶1（Arg1）的表达。这种不依赖于STAT6的精氨酸酶诱导代表了一种有效的免疫逃逸策略，它通过与一氧化氮合酶竞争精氨酸底物来限制抗菌性一氧化氮的生成，这从特异性消除Arg1后宿主预后改善的事实中得到了证实。识别病原体免疫逃逸的关键因子并破译相关信号通路，将有助于建立控制传染病的新干预措施和治疗方法。 利用TLR诱导的宿主免疫紊乱获益 在某些情况下，病原体可能会主动触发TLR信号传导，从而诱导失调的免疫反应，以利于其生存。病原体感染会导致免疫抑制性细胞因子的扩增，从而形成有利于病原体持续存在的耐受性环境。鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的LcrV蛋白不仅能调节、定向并介导细胞毒性Yops蛋白的III型转运，还能通过直接结合TLR2的IRRL314-317主题来促进免疫逃逸，从而触发TLR2/CD14依赖性或非依赖性的抗炎因子IL-10上调及TNF-α抑制，进而破坏宿主先天免疫。由于其独特的 ability，即在 TLR7/9 介导的病毒核酸感知后能迅速产生大量 I 型/III 型干扰素，pDC 被公认为抗病毒免疫中的关键角色。然而，一项利用 pDC 缺陷小鼠进行的新研究表明，pDC 反而会通过引发局部细胞因子风暴，在呼吸道甲型流感病毒 (IAV) 或 SARS-CoV-2 感染期间加剧肺部免疫病理。这一结论得到了以下证据的支持：在经过基因工程改造、特异性且持续性缺乏pDC的动物模型中，存活率显著提高，病理损伤明显减轻。过度的TLR激活会引发细胞因子风暴，这是一种临床表现异质且危及生命的病症，表现为血清细胞因子水平严重升高以及脓毒症休克等症状。这种过度炎症反应会导致组织损伤和免疫失调，常见于重症脓毒症或流感中。值得注意的是，某些病原体将此过程作为一种逃逸策略加以利用，通过劫持炎症反应来破坏免疫协调，从而增强其传播和存活能力。此类机制对包括2019冠状病毒病（COVID-19）和脓毒症在内的严重感染具有重要意义。 利用TLR信号传导的生物分子凝集物 近期研究强调了生物分子凝集体在介导宿主-病原体相互作用中的作用。病原体利用相分离和生物分子凝集体的形成来改变细胞器结构、调节病原体诱导的细胞死亡、逃避免疫反应，并维持其复制周期。细菌效应蛋白通常通过专门的分泌系统输送，也能通过生物分子凝集来调节先天免疫信号传导，从而破坏宿主的防御机制。例如，由尿路致病性大肠杆菌（UPEC）产生的关键毒素——细胞毒性坏死因子1（CNF1），通过低临界点相分离（LLPS）诱导形成CNF1-JAK1/2复合物，进而激活STAT信号通路，从而在尿路感染期间增强炎症反应。在另一个例子中，结核分枝杆菌分泌效应蛋白 EsxB（Rv3874），该蛋白在小鼠巨噬细胞中与 p38 MAP 激酶结合，并触发 METTL14 的磷酸化。这种相互作用破坏了METTL14的核内凝集，而该过程对于介导m6A甲基化及稳定NADPH氧化酶2（NOX2）mRNA至关重要，最终导致先天免疫受抑制。 总而言之，TLR信号网络是宿主-病原体相互作用中的关键接口。对病原体编码的致病因子进行分析，有助于识别该网络中的关键节点。因此，阐明这些破坏机制不仅对于理解致病机制至关重要，对于设计新型宿主导向疗法——无论是中和病原体效应因子还是调节靶向宿主信号通路——也具有关键意义。 TLR信号传导在炎症性疾病发病机制中的作用 TLRs 作为先天免疫与适应性免疫之间的关键分子桥梁，其功能紊乱常导致病理后果。通过识别保守的微生物模式或内源性危险信号，TLRs 协调一系列免疫反应，这些反应始于先天免疫细胞，并最终塑造适应性免疫。激活后，TLRs 诱导树突状细胞（DC）成熟，通过上调 MHC 表达、共刺激分子（CD80/CD86）以及细胞因子（IL-12、IL-6）的产生，增强其抗原呈递能力。这种专业的抗原呈递引导 naive T细胞分化为效应亚群（Th1、Th2、Th17），同时促进B细胞在生发中心进行类转换和抗体亲和力成熟。然而，过度的或持续的TLR信号传导会破坏这种微妙的平衡，导致过度炎症状态或免疫耐受。慢性TLR刺激可能导致T细胞极化异常、自身抗体产生或细胞毒性反应耗竭。反之，TLR信号传导缺陷则可能导致病原体清除不足或免疫记忆形成受损。此类TLR介导的免疫失调所引发的全身性后果在多种疾病中均有体现，因为当保护性免疫所必需的机制控制不当，便会成为病理发展的驱动因素（表1）。这种双重特性使TLR既成为维持免疫稳态的主调控因子，又在其调控网络失灵时成为诱发疾病的元凶。 TLR在传染病中的保护与炎症反应中起着关键作用 Toll样受体（TLRs）是先天免疫系统对抗传染性病原体的重要“哨兵”，通过识别保守的微生物模式来协调复杂的免疫应答。因此，在感染过程中，TLRs犹如一把双刃剑：其精确的调控确保了病原体的有效清除，而其功能障碍或过度激活则会导致严重的免疫病理学反应，从而决定了传染病的病程走向——或是局部的控制，或是极端情况下的全身性崩溃。 细菌感染 TLR在识别细菌病原体和调控免疫应答方面起着关键作用。免疫多态性显著影响宿主对传染病的易感性，其中TLR中的关键单核苷酸多态性包括：TLR1中的I602S、TLR2中的C2029T和G2258A、TLR3中的P554S、TLR4中的D299G/T399I， TLR5的c.1174C>T、TLR6的S249P、TLR7的Q11L、TLR8的M1V、TLR9的G1174A以及TLR10的G1031T等关键单核苷酸多态性，在免疫应答中发挥着关键作用。例如，TLR1的I602S变异体通过拦截可能源自肉芽肿的可溶性分枝杆菌产物，在遇到完整分枝杆菌之前就发挥作用，从而预防分枝杆菌疾病。TLR2 多态性（C2029T 和 G2258A）显著影响刺激后的细胞因子产生模式（TNF-α/IL-12 减少，IL-1β 增加），特定的基因型会导致易患或不易患结核病。在脓毒症期间，LPS 过度激活 TLR4 会引发致命的细胞因子风暴，其中 D299G/T399I 多态性会增加对革兰氏阴性菌脓毒症和呼吸道感染的易感性，这已通过人类遗传关联研究得到证实，并在小鼠模型中得到验证，这些模型显示 LPS 反应受损且信号传导发生改变。这些 SNP 会降低 TLR4 的表面表达，同时保持部分活性，从而形成病原体特异性的易感模式。TLR5:c.1174C>T多态性会削弱鞭毛蛋白依赖性免疫，同时通过调节LPS-TLR4信号传导来降低对假结核杆菌感染的促炎性细胞因子反应，并通过降低变异携带者的菌血症发生率以及减少IL-10和TNF-α的产生，从而降低假结核杆菌病死亡率。此外，近期发现一种新型致病性IRAK4变异（c.1049delG），该变异导致一名婴儿出现完全性IRAK4缺陷，并伴有肺炎链球菌菌血症和金黄色葡萄球菌淋巴结炎。这些多态性影响TLR结构和功能的确切机制尚不明确。对这些基因变异进行详细的分子研究，有望为免疫应答调节提供宝贵的见解，并为治疗方法的开发开辟新途径。这些例子共同表明，TLR基因多态性通过改变受体的功能或表达，成为宿主易感性的关键决定因素，从而定义了个体在处理细菌时炎症设定点。 病毒感染 在病毒感染中，TLR 既具有保护作用，也具有致病作用。TLR3 识别双链 RNA 中间体，对控制中枢神经系统中的 1 型单纯疱疹病毒 (HSV-1) 至关重要，TLR3、UNC93B1（TLR3 转运所必需）或下游适配体 TRIF 和 TRAF3 的缺失会增加患 HSV-1 脑炎的风险。同样，TLR7 通过检测 IAV RNA 来介导保护性免疫，同时差异性调节呼吸道反应，其缺失会增强鼻腔的抗病毒反应，但在感染期间会减轻肺部炎症。不同的TLR（如TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9）在COVID-19发病机制中同时发挥保护性和致病性双重作用，是早期感染控制和SARS-CoV-2疫苗研发中极具前景的治疗靶点。这些发现突显了一个事实：特定TLR在病毒感染中的作用因具体病毒、解剖位置和应答细胞类型而异，这决定了其结果是保护性的还是致病性的。 真菌感染 除了病毒感染外，像烟曲霉这样的真菌病原体也是通过TLR2的识别来加以控制的，该受体通过上调IL-10来抑制过敏性曲霉病中的肺嗜酸性粒细胞增多和Th2反应。严重哮喘伴真菌过敏（SAFS）中独特的遗传关联突出了关键的免疫相关基因，如 TLR3 和 TLR9，这些基因将 SAFS 与特应性哮喘区分开来。供体 TLR4 单倍型 S4 包含 D299G/T399I 多态性，这些多态性会损害 TLR4 信号传导，与非亲属供体造血干细胞移植受者患侵袭性曲霉菌病的风险增加有关。这突显出，即使 TLR 信号传导能力存在细微差异，也会对机会性真菌感染的易感性产生重大影响，特别是在免疫功能低下情况下。 寄生虫感染 尽管相关研究较少，TLR3在寄生虫感染中发挥着双重作用：一方面通过抑制I型干扰素来促进疟原虫的存活；另一方面通过TRIF介导的Th1反应增强宿主对犬弓形虫和旋毛虫的防御能力。阴道毛滴虫的多种成分，如糖基磷脂酰肌醇（GPI）、阴道毛滴虫病毒（TVV）、脂磷甘露聚糖（LPG）和鞭毛蛋白，可激活不同的TLR（分别激活TLR2、3、4、5），从而在宫颈阴道黏膜中诱导促炎性细胞因子/趋化因子的产生。TLR11/12 通过感知弓形虫的肌动蛋白结合蛋白，触发去泛素化酶 OTU 结构域、泛素醛结合蛋白 1（OTUB1）介导的树突状细胞（DCs）中 NF-κB 的激活，从而驱动针对寄生虫扩散的保护性 IL-12/IFN-γ 反应。其他TLR在寄生虫感染中的作用仍存争议，且TLR与其他PRR之间的交叉调控机制尚不明确，这凸显了我们对TLR-寄生虫相互作用认识中的不足。 TLR在自身免疫性疾病中破坏了自身耐受性 TLR通过识别自身核酸和其他DAMPs，在自身免疫性疾病的发病机制中发挥着至关重要且多样的作用。一项最新研究表明，acp3U碱基的小RNA N-糖基化会掩盖免疫刺激主题，从而阻止TLR3/7对其进行识别。通过基因敲除acp3U合成酶DTW结构域含2蛋白（DTWD2）或进行酶促去糖基化处理，可揭示这些主题，从而触发I型干扰素反应。这表明，RNA糖基化缺陷可能通过使内源性RNA异常激活先天免疫和炎症反应，从而导致自身免疫性病理。当TLR信号传导失调时，会破坏免疫耐受机制，从而引发针对机体自身抗原的异常免疫反应。这种自耐受的破坏是多种自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）和银屑病）背后的根本病理过程，其中不同的TLR介导通路会导致疾病特异性的炎症表现。 系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮（SLE）是一种异质性自身免疫性疾病，其特征在于核酸耐受性受损、自身抗体产生，且大多数患者表现出I型干扰素（IFN-I）特征。TLR7 F506S 突变和其他获得功能变异（F507S/L528I）表现出增强的单链 RNA（ssRNA）结合亲和力和激动剂反应性，导致信号传导过度激活，从而驱动患者外周血单核细胞（PBMC）中促炎性细胞因子的产生。遗传学研究已确凿证实，TLR7过度激活驱动SLE发病机制，而TLR8/9则发挥调节控制作用，且TLR7位于X染色体上的位置解释了该病以女性为主的特征。SLE患者中的等位基因型（rs1143679G/ rs1143683T) 与I型干扰素活性升高相关，而CD11b激动剂LA1对CD11b的激活，可通过AKT/叉头框O3 (FOXO3)/IRF3/7通路抑制TLR激动剂（LPS或R848）刺激的I型干扰素信号传导。这些突变会异常地将TLR7从其作为病毒RNA传感器的生理作用转变为致病性自身免疫驱动因子，使其识别自身来源的RNA，从而破坏免疫耐受，并导致经典SLE表现和神经系统并发症。重要的是，这种 TLR7 的过度激活与 TLR9 的悖论性保护作用之间存在着微妙的平衡。TLR7 通过 B 细胞和 pDC 中对自身 RNA 的异常识别驱动疾病，而 TLR9 尽管参与抗双链 DNA 自身抗体的产生，却通过抑制 TLR7 的活性发挥悖论性的保护作用。这种微妙的平衡进一步受到 UNC93B1 变体（例如 E92G）的调节，这些变体通过蛋白质不稳定化和受体相互作用受损，选择性地过度激活 TLR7 信号传导。近期研究在SLE中鉴定出一条关键的TLR7/9-IRF5信号通路，该通路通过溶质载体家族15成员4（SLC15A4）-TLR适配体与溶酶体上的SLC15A4（TASL）轴相互作用而发挥作用。与此同时，研究表明，由心肌细胞特异性肌醇需求酶1α （IRE1α）-X-盒结合蛋白1（XBP1）介导的未折叠蛋白反应受损，导致其在系统性硬化症（SSc）和SLE中均无法抑制TLR7/9激活的pDCs中的IFN-α，这进一步支持了内体TLR反应失调与狼疮发病机制中病理性干扰素产生之间的关联。这些发现突显了联合抑制TLR7和调节TLR9的治疗策略在恢复SLE患者免疫稳态方面的潜力。 类风湿性关节炎 类风湿性关节炎（RA）是一种以进行性关节破坏为特征的慢性自身免疫性疾病，其病理机制涉及TLR信号传导的失调——该信号传导既识别内源性配体，也识别微生物成分，从而加剧滑膜炎症。这一致病过程由多种因素驱动，包括异常的TLR配体暴露、受体过表达、遗传易感性以及肠道微生物群的改变，这些因素共同促成了RA病理基础中持续存在的炎症级联反应。RA滑膜细胞中TLR2、TLR3、TLR4和TLR5的激活会调节炎症因子的产生，并通过促进血管生成和骨破坏来加剧关节炎。TLR的基因多态性（包括TLR4 rs7873784 G/C和TLR9 rs187084）与RA的发病相关。虽然通过体外和实验模型已充分阐明了 TLR2 和 TLR4 在类风湿性关节炎中的功能，但最近的研究表明，TLR5 也通过以 TNF-α 依赖性方式促进单核细胞浸润和破骨细胞形成，在 RA 病理中起着重要作用 。有趣的是，RING指蛋白13（RNF13）通过介导溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）的K48连接多泛素化及蛋白酶体降解，从而促进巨噬细胞的炎症反应，这会阻碍溶酶体的成熟并延长内体TLR信号传导；该通路在类风湿性关节炎患者中失调，且可被羟氯喹调节。这些机制研究结果推动了针对类风湿性关节炎预防和治疗的TLR靶向疗法的开发。 银屑病 在银屑病中，TLR3在驱动角质形成细胞炎症和免疫失调方面发挥着关键作用。由于二酰甘油酰基转移酶2 (DGAT2)表达下降导致的脂质代谢紊乱，会增强角质形成细胞中TLR3介导的炎症信号传导；而锌指蛋白750 (ZNF750) 或赖氨酸去甲基酶-1A (KDM1A)的缺失，则会导致TLR3失控激活，从而加剧银屑病炎症。CARD11-BCL10-黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1（MALT1）（CBM）复合物通过TLR3下游调控MAVS依赖性抗病毒反应。与银屑病相关的CARD14突变会破坏这种调控，导致IRF3过度激活和细胞因子过度产生。此外，MALT1通过促进MAVS降解来限制TLR3信号传导，这表明抑制MALT1可能增强I型干扰素（IFN-I）反应。综合来看，这些发现将角质形成细胞内在的TLR3信号传导确认为银屑病中的核心节点，其过度活化整合了代谢应激与遗传易感性，从而驱动皮肤炎症。 炎症性肠病 在炎症性肠病（IBD）等炎症状态下，源自微生物组的丁酸和丙酸作为细菌来源的危险信号，在Toll样受体（TLR）激活的情况下，通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）来促进NLRP3炎性小体的激活和IL-1β的释放，从而抑制FLICE样抑制蛋白（cFLIP）和IL-10的转录，同时促进Caspase-8依赖性的炎性小体激活。此外，共生菌Roseburia intestinalis通过激活TLR5，刺激肠上皮细胞产生胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP），在克罗恩病中既能维持对抗菌群失调和结肠炎的稳态，又能增强免疫力。研究发现，口腔共生菌韦荣菌（尤其是V. parvula）通过TLR4介导的炎症促进克罗恩病中的艰难梭菌感染（CDI），其中其高度促炎性的脂多糖（LPS）激活c-Jun/c-Fos以抑制顶端钠依赖性胆酸转运蛋白（ASBT），从而增加管腔内胆酸的可用性并触发艰难梭菌的萌发。值得注意的是，TLR 功能紊乱已被证实与上述疾病以外更广泛的自身免疫性疾病相关。然而，鉴于不同受累组织中 TLR 之间存在功能冗余，阐明特定疾病背景下的精确分子机制及细胞特异性免疫调节变得至关重要。 TLR信号传导失调导致免疫衰老和炎症性衰老 与年龄相关的生理衰退会引发一系列细胞和分子变化，导致免疫系统逐渐衰退，这种状况被称为免疫衰老。免疫功能的受损进一步削弱了清除病原体和衰老细胞的能力，从而导致DAMPs的全身负担持续增加。若干内源性蛋白质（如细胞外组蛋白、HMGB1和热休克蛋白（HSPs））作为DAMPs发挥作用，当它们释放到细胞外空间时，会成为PRRs的持续配体来源，从而维持一种被称为“炎性衰老”（inflammaging）的普遍性、低度慢性炎症状态。尽管多种途径共同促成了这一现象，但先天免疫信号传导的失调——尤其是通过TLR介导的失调——已成为核心机制。由外源性刺激和累积的内源性配体共同驱动的、与年龄相关的TLR信号传导紊乱，建立了一个自我维持的慢性炎症循环。这一循环进而加速细胞衰老，促进免疫功能障碍，并导致多系统器官功能衰退。关键在于，炎症性衰老不仅是衰老的副产物，更是一种主动的致病力量，它驱动着免疫系统、心血管系统以及包括大脑和肝脏在内的关键器官的功能受损。随着年龄增长，这种失调的TLR信号传导会形成一种悖论状态：关键的宿主防御机制受到损害，导致无法及时修复的累积性组织损伤；与此同时，过度的炎症反应又加速了退行性病变，最终增加了与年龄相关的炎症性疾病的负担。 免疫衰老 在免疫细胞中，衰老会削弱TLR介导的细胞因子产生，从而减弱机体对感染的防御能力。老年人的髓系树突状细胞（DC）在响应TLR1/2、TLR2/6、 TLR3、TLR5和TLR8的激活，其程度与TNF-α和IFN-α的产生下降相一致，这与表达TLR7或TLR9的pDC比例降低有关，所有这些均与年轻个体相比。这些缺陷与对流感疫苗的抗体应答不良相关，突显了TLR信号传导减弱是导致衰老过程中疫苗无效的主要驱动因素。这种树突状细胞和巨噬细胞中受损的TLR功能——进一步体现在西尼罗河病毒感染期间IFN-I分泌减少以及TLR3调节失常上——共同导致了老年人中观察到的免疫效能普遍下降以及发病率和死亡率的增加。与普遍的年龄相关TLR功能下降相反，老年个体的单核细胞表现出TLR5表达的特异性增强和IL-8水平升高，但其NF-κB激活不完全，无法增加TNF-α的产生。老年巨噬细胞中的TLR信号传导途径表现出NF-κB激活基因的广泛下调以及负调节因子IRAK-3的增加，而p38 MAPK活性的增强通过促进抗炎细胞因子IL-10的过量产生，进一步加剧了这种失调。 作为造血的主要场所，骨髓的微环境会随着年龄增长发生改变，从而破坏造血干细胞（HSC）的功能，导致再生能力下降、免疫反应失衡以及患血液系统恶性肿瘤的风险增加。TLR信号传导广泛参与HSC的自我更新，这体现在IRF8对NK细胞和髓系细胞中TLR9表达的调控上，该调控影响炎症细胞因子的产生，并在IRF8缺失小鼠中观察到HSC动态的改变——这些小鼠的HSC数量减少，但重建能力增强。此外， 肠道微生物群通过肠-骨髓轴调节造血干细胞的维持：微生物相关分子模式（MAMPs）可激活TLR-MyD88信号通路以驱动造血和炎症性衰老；而由微生物群诱导的髓系前体细胞中的JAK信号通路则与TLR激活协同作用，促进髓系造血及TLR响应性单核细胞的积累。 作为naive T淋巴细胞发育的场所，胸腺会经历渐进性的年龄相关性退化，其特征为基质萎缩和脂肪组织替代，这会降低T细胞输出，并构成老年人免疫衰老的基础。TLRs也参与T细胞的发育、分化和功能。内毒素血症会诱发急性胸腺萎缩，其特征包括细胞数量减少、T细胞受体（TCR）α重排受损、特异性双阳性（DP）胸腺细胞丢失以及显著的结构重塑，而LPS诱导的氧化应激、细胞衰老和功能紊乱会加剧上述所有情况。值得注意的是，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）通过AMPK/SIRT1信号通路减轻LPS诱导的损伤，从而展现出保护作用，这表明其作为对抗胸腺萎缩的治疗剂具有潜力。病毒信号在胸腺中激活TLR3或TLR7会诱导IFN-I的产生，从而促进胸腺细胞凋亡、降低胸腺细胞密度，并最终导致naive T细胞输出减少且TCR谱受限。这些发现阐明了TLR的先天免疫识别如何直接塑造胸腺功能和退化，为在感染、应激和衰老期间维持T细胞免疫的策略开发提供了见解。 心血管疾病 衰老伴随着心血管结构和功能的进行性衰退，导致心血管疾病的发病率和死亡率上升。研究发现，作为细胞外组蛋白的下游效应分子，FOXO4通过AMPK依赖性表达参与介导组蛋白调节的血管平滑肌细胞炎症和衰老，且AMPK抑制可在体外和体内抑制组蛋白诱导的血管炎症[366]。此外，TLR4缺失通过HDAC1-核受体共抑制因子1（NCOR1）依赖性机制改善与年龄相关的心脏功能障碍；与此同时，衰老血管平滑肌细胞（VSMCs）中的TLR4-MyD88信号传导会升高基础IL-6的产生，从而促进慢性炎症并加剧动脉粥样硬化的进展。富含额外结构域A的纤维连接蛋白（Fn-EDA）是一种内源性TLR4配体，在晚期动脉粥样硬化病变中大量存在，它通过促进巨噬细胞中TLR4依赖性基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达，在衰老的ApoE−/−小鼠中诱导斑块不稳定，这与急性冠状动脉综合征患者相比稳定型心绞痛患者中观察到的TLR4水平升高相一致。内源性TLR4配体HMGB1通过TLR2/TLR4介导的M1型巨噬细胞极化，在衰老易感（SAMP8）小鼠中驱动与年龄相关的心脏功能障碍；而TLR4缺失可防止细胞外HSP27介导的损伤，尽管存在与年龄相关的TLR4上调和NF-κB过度活化，这揭示了TLR4作为治疗靶点。线粒体功能障碍作为心血管衰老的标志性特征，会导致线粒体DNA（mtDNA）外泄增加，进而激活TLR9介导的炎症反应；当线粒体自噬无法维持线粒体质量控制时，这种机制会驱动慢性炎症并加剧与年龄相关的心血管病理。综上所述，这些发现表明TLR4和TLR9是年龄相关性心血管应激的关键转导因子，它们将全身性炎症和局部DAMP释放转化为动脉粥样硬化和心功能障碍等特定病理结果。 神经退行性疾病 越来越多的研究表明，TLR与神经发生和突触形成等多种大脑功能密切相关。越来越多的证据表明，TLR参与了伴随正常衰老而发生的周围和中枢炎症过程，并为各种神经退行性疾病提供了病理基础。随着衰老进程，大脑会经历显著的结构和功能衰退，其特征表现为脑血流减少、DNA损伤累积以及DAMPs的释放。这些改变会激活表达TLR的胶质细胞，从而引发慢性无菌性炎症，进而促进神经元丢失并破坏脑网络，最终导致额叶和海马体等关键区域体积缩小，并导致认知功能障碍。实验模型一致表明，TLR4缺失通过维持血脑屏障完整性并减轻神经炎症，在衰老过程中发挥神经保护作用；而海马区HMGB1水平升高介导了与年龄相关的神经炎症预激活，阻断其作用可使小胶质细胞脱敏，并防止在免疫处理后出现过度神经行为障碍。近期研究还揭示，与年龄相关的认知衰退是由微生物群-肠-脑轴紊乱驱动的，其中肠道菌群失调会损害肠道屏障和血脑屏障，从而升高全身性LPS水平，进而激活TLR4/MyD88/NF-κB通路，促进神经炎症和突触功能障碍。相比之下，源自百岁老人的益生菌组合通过调节肠道微生物群并抑制TLR4/NF-κB信号传导，从而对抗与年龄相关的神经炎症和认知衰退，进而恢复中枢神经系统与肠道微生物组之间的双向通信。 同样，衰老是阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等常见神经退行性疾病的主要风险因素。通过在神经炎症过程和淀粉样蛋白清除中的复杂参与，TLR已成为AD发病机制中的关键调节因子。例如，在包围淀粉样β斑块的小胶质细胞中，TLR2和TLR4的表达显著上调。在AD早期，β-淀粉样蛋白（Aβ）对TLR2和TLR4的激活可增强小胶质细胞的募集及对Aβ沉积物的吞噬清除，从而在小鼠模型中维持认知功能。此外，慢性轻度 TLR4 刺激可通过激活神经元自噬来减轻与 AD 相关的微管相关蛋白病变，这体现在自噬活性显著增强，且与脑内磷酸化微管相关蛋白水平降低及认知功能改善相关。然而，在疾病进展过程中，TLR2和TLR4的持续激活会促使小胶质细胞向促炎性M1表型极化，并随后释放TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子，从而引发广泛的神经炎症；这些因子共同激活星形胶质细胞并加速神经元死亡，最终导致严重的神经毒性后果。遗传学研究将 TLR4 多态性与 AD 易感性联系起来，其中 rs4986790 A/G 等变体通过调节 IL-1β 并维持大脑结构而表现出保护作用。虽然某些单核苷酸多态性（SNPs）（如 rs10759930、rs1927914）在特定人群中似乎具有保护作用，但另一些（如 rs11367、rs1927907）则可能增加患病风险。除了 TLR2 和 TLR4 之外，Aβ 相关小胶质细胞中 TLR3 的升高与病理进展相关，而 let-7b 微 RNA 激活的 TLR7 会诱导神经元凋亡。相反，通过诱饵受体对 TLR5 进行调控可抑制 Aβ 聚集，而通过 CpG 寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）激活 TLR9 则能增强认知表现，同时减轻 AD 病理。因此，这一复杂的网络使 TLR 成为极具前景的治疗靶点，其中，通过战略性调节来抑制过度活跃的炎症或增强保护功能，是抵御 AD 进展的一种可行方法。与AD中的观察结果相似，研究表明PD中TLR4的激活和过表达既具有神经保护作用，也具有神经毒性作用。通过激活TLR2，磷酸化α-突触核蛋白（p-α-syn）在周围神经系统（施万细胞）和中枢神经系统（星形胶质细胞）中均驱动病理过程。这些分子事件共同导致帕金森病中α-突触核蛋白的积累、多巴胺能神经元丧失以及自主神经功能障碍。因此，对TLR的此类分析为该疾病提供了新的机制见解和有前景的治疗靶点。最近的研究还表明，TLR5、7、8和9也与帕金森病的发病机制有关。 衰老还与明显的肝脏退化有关，包括肝脏炎症和纤维化。在衰老小鼠的肝脏中，包括TLR1、2、4、6和9在内的大多数TLR的mRNA表达显著上调，而TLR5下调，TLR3、TLR7和TLR8则保持不变。肝脏富含库普弗细胞等免疫细胞，持续暴露于源自肠道的病原相关分子模式（PAMPs）中。研究表明，退行性衰老与肝脏内细菌内毒素水平升高及TLR4信号传导有关，而LPS结合蛋白（LBP）的缺失则会降低衰老和炎症标志物，这突显了肠道来源信号传导的作用。此外，老年小鼠的肠道屏障功能发生显著改变，且与肝脏退化相关。近期研究发现，肝内微生物群中的S. maltophilia通过激活TLR-4介导的NF-κB信号通路，在肝星状细胞中引发促癌级联反应。该通路诱导衰老相关分泌表型（SASP）及NLRP3炎性小体的形成，进而导致慢性炎症，同时推动肝硬化和肝细胞癌的进展。进一步印证了该通路的功能重要性：来自女性供体的粪便微生物群移植（FMT）可恢复中年雄性酒精暴露小鼠的肠道通透性，并减轻其肝脏损伤和炎症，这表明FMT可能是逆转与年龄相关的肠道通透性增加、肝细胞损伤及脂肪变性的新型治疗途径。 TLR 既参与抗肿瘤免疫反应，也参与肿瘤发生 TLR在癌症中发挥着复杂且环境依赖的作用，通过与宿主来源和微生物来源的配体相互作用，对抗肿瘤和促肿瘤免疫均产生双重且相互矛盾的影响。 肿瘤-宿主相互作用中的免疫细胞TLR信号传导 TLR激动剂可激活巨噬细胞、树突状细胞、T细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，从而引发急性炎症反应并增强抗肿瘤免疫应答。例如，在肝细胞癌（HCC）中，自然杀伤细胞中TLR3的激活通过ERK和NF-κB通路恢复自然杀伤细胞功能，从而增强索拉非尼的疗效。通过鞭毛蛋白/TLR5/NF-κB通路激活免疫细胞，可增强癌症治疗效果。重组鞭毛蛋白能增强沙门氏菌对黑色素瘤的治疗效果，以及设计好的TLR5激动剂肽能抑制结直肠肿瘤，这些证据共同表明TLR5是广谱的免疫治疗靶点。在肺癌中，全身性给药R848可上调树突状细胞（DCs）中的TLR7表达，促进DCs、NK细胞和CD8⁺ T细胞的活化，增加Th1相关血清细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）的水平，并降低肿瘤微环境（TME）中Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）的比例。 然而，由持续性刺激或消退失败引发的慢性炎症也是肿瘤的关键驱动因素。TLR信号传导可在髓系细胞中激活一种促转移的TLR-NF-κB炎症程序，该程序在乳腺癌模型中促进了转移前微环境的形成；与此同时，微环境内增强的NK细胞细胞毒性揭示了免疫控制的潜在可能性。在向肺转移的过程中，肿瘤来源的外泌体RNA会激活肺上皮细胞中的TLR3，从而启动中性粒细胞依赖性的转移前微环境形成。肿瘤内微生物群增添了另一层调控机制，如在结直肠癌中，Fusobacterium nucleatum 及升高的铁水平会增强肿瘤相关巨噬细胞通过 TLR4/NF-κB 介导的 CCL8 分泌，从而加速肿瘤进展。卵巢癌中慢性TLR5信号传导通过破坏XCR1⁺CD103⁺ cDC1的分化并扩增免疫抑制性程序性死亡配体-1（PD-L1）阳性髓系亚群，从而损害CD8⁺ T细胞的活化。 因此，尽管通过治疗手段激活TLR是将免疫学上“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的一种有前景的策略，但这需要精确选择激动剂和细胞靶点，以引导免疫应答向抗肿瘤细胞毒性方向发展，并避免促转移性炎症。 肿瘤-宿主相互作用中的肿瘤内在TLR信号传导 肿瘤相关的TLR可触发促肿瘤性炎症，为肿瘤提供生存信号以诱导肿瘤发生，促进炎症性和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的形成，并促进癌症转移。在乳腺癌中，对癌细胞中高表达的TLR3进行刺激，可通过协调β-catenin/NF-κB信号通路促进癌干细胞（CSC）表型的获得，从而导致临床预后恶化。在转移性三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型的肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中，空间转录组学研究在血管化及T细胞富集区域识别出具有免疫抑制作用的成纤维网状细胞（FRC）-单核细胞微环境。这些微环境由TNBC来源的内源性TLR4配体驱动，这些配体可刺激FRC产生CCL2和CCL7，从而促进单核细胞招募。值得注意的是，局部TLR4抑制联合抗程序性死亡蛋白1（PD-1）治疗可减少单核细胞归巢，增强T细胞功能，并最终减轻肺转移[345]。有趣的是，最新研究表明，呼吸道病毒感染（如SARS-CoV-2和流感）可能通过TLR介导的炎症和IL-6信号传导，重新激活肺部潜伏的乳腺癌播散性肿瘤细胞（DTCs），通过破坏免疫监视和改变肿瘤微环境（TME）来促进转移进展，这揭示了病毒感染是癌症进展中意想不到的加速因素。在肝细胞癌（HCC）中，肝癌细胞内在的TLR9激活通过聚(ADP-核糖)聚合酶1（PARP1）-STAT3信号轴上调PD-L1表达，从而解释了TLR9激动剂与PD-1/PD-L1阻断疗法联合使用时观察到的协同抗肿瘤效应。此外，TLR3通过直接诱导癌细胞发生Caspase-3介导的凋亡，以及间接激活依赖于CD103+树突状细胞的CD8+ T细胞应答，在非小细胞肺癌（NSCLC）中发挥抗肿瘤作用，这与患者预后的改善相关，并支持将TLR3激动剂作为潜在的治疗策略。在胰腺导管腺癌（PDAC）和其他癌细胞中，最近的研究表明TLR3的核转位依赖于JAK1介导的磷酸化和进口蛋白α5，这通过蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）依赖性c-Myc激活促进化疗耐药性和肿瘤进展。这些观察结果强调，肿瘤细胞中TLR的异常表达及其内在的TLR信号传导，往往通过增强肿瘤细胞的增殖、存活、转移、化疗耐药性和免疫逃逸来促进恶性表型。这使得直接抑制癌细胞内异常的TLR通路，或阻断其异常的亚细胞定位，成为一种极具吸引力且独特的治疗途径。 基于TLR通路的炎症性疾病和癌症治疗策略 将TLR生物学转化为治疗手段，是现代免疫学领域最具吸引力却也最具挑战性的探索之一。我们已不再将TLR单纯视为炎症的诱因，而是将其视为免疫状态的主调控因子。这种双重性质既决定了它们的治疗潜力，也蕴含着固有风险。核心且尚未解决的问题是：如何实现对TLR信号传导的精准、环境依赖调控，以纠正免疫失调，同时避免引发灾难性炎症或免疫抑制？ 尽管临床现状尚显零散，但已提供了关键启示（表2）。诸如 MPLA（TLR4）和伊米奎莫德（TLR7）等获批药物并非单纯的药物；它们是概念验证，证明了在时空受限条件下激活 TLR 可被用于治疗。伊米奎莫德在局部治疗中的成功突显了一个基本原则：局部激活可避免全身毒性。反之，TLR4拮抗剂Eritoran在针对脓毒症的III期临床试验中失败，以及TLR9激动剂PF-351267在III期肺癌试验中失败，则令人警醒地提醒我们：在超炎症性全身性危机中阻断先天免疫的核心枢纽极为复杂；事实上，给药时机、患者分层和药代动力学必须完美协调。EMD 1201081的案例典型地体现了“疗效叠加”的陷阱：这种耐受性良好的TLR9激动剂未能在头颈部鳞状细胞癌中增强西妥昔单抗的临床疗效。其无法充分重塑免疫抑制性肿瘤微环境的事实表明，仅将机制不同的药物联合使用并不能保证产生有意义的治疗协同效应。这一结果强调了联合疗法必须基于坚实的生物学依据，以实现真正的免疫激活，而非仅依赖于互补机制或良好的耐受性。 最具前景的进展正源于战略性局部给药和联合疗法。BO-112（一种用于抗PD-1耐药性黑色素瘤的肿瘤内注射用TLR3激动剂）的II期开发便是典范。它提出了一个具有变革性的问题：局部TLR激活能否将免疫学上“冷”的肿瘤转化为“热”的肿瘤，从而使肿瘤重新对全身性检查点阻断产生反应？这种方法巧妙地规避了全身性毒性，同时利用TLR作为原位免疫启动剂。同样，针对CpG 1018（TLR9）在疫苗佐剂开发及滤泡性淋巴瘤中的探索，以及其在更广泛癌症免疫治疗背景下的评估，旨在探究TLR激动剂能否根据生物学背景差异性调节病原体特异性免疫、抗肿瘤反应及免疫微环境调控。 新兴证据表明，针对TLR信号通路的治疗正通过多样且创新的机制得以实现。其中包括直接靶向抑制，例如两种IRAK4抑制剂PF-06650833和Zabedosertib。此外，间接免疫调节剂沙格列汀通过增强GLP-1活性来抑制TLR信号传导。另一种方法是通过独特的蛋白质修复，例如西穆菲拉姆（PTI-125）可恢复肌动蛋白A的天然构象，从而破坏其与TLR4的病理性结合，并间接抑制TLR驱动的神经炎症。值得注意的是，作为TLR4细胞内信号传导的直接小分子抑制剂，TAK-242在晚期脓毒症中的临床失败表明，即使强效的通路阻断，若超出狭窄的治疗窗口，或未根据免疫表型对患者进行分层，也可能无效。综上所述，这些案例不仅强调了TLR信号传导仍是病理性炎症治疗的核心轴线，同时也指出有效的干预不仅需要机制上的精准性，还需结合具体情境进行优化。这意味着需根据具体的疾病阶段和微环境，针对性地选择作用节点（如受体、适配体或激酶）并把握干预时机，从而在扩展先天免疫驱动型疾病治疗工具箱的同时，最大限度地降低广泛免疫抑制的风险。 展望未来，该领域必须从泛免疫刺激转向针对特定疾病的信号重塑。未来的研究方向必须处理以下关键挑战：首先，通过开发偏向性配体或别构调节剂，将信号传导从简单的模式识别转向信号调节，从而引导信号向有益结果发展，例如促进组织修复细胞因子而非破坏性炎症。其次，通过整合纳米颗粒或水凝胶等智能递送系统，满足时空精准性的要求，以实现TLR激活的解剖学精准性和动力学控制。第三，通过生物标志物界定治疗窗口，将可能从TLR增强中获益的患者与需要抑制的患者进行分层。最后，通过设计策略将宿主-微生物组对话纳入其中，这些策略要么将系统性TLR调节的影响进行隔离，要么将微生物生态学纳入治疗方案。综上所述，基于TLR的治疗学未来不在于寻找通用的激动剂或拮抗剂，而在于开发具有情境智能的调节剂。这一重大处理在于设计能够解读病变组织免疫学背景的分子及递送平台，并传递经过校准的信号（无论是激活还是抑制信号），从而引导免疫反应回归稳态。这是分子免疫学必须与系统生物学及精准工程学融合的前沿领域。 挑战与展望 在过去的四十年里，我们见证了TLR研究从发育生物学中一项边缘性的发现，发展成为一个蓬勃发展的领域，为理解免疫稳态提供了核心范式。这一精密系统不仅能精确破译微生物的分子特征，还能将内在调控信号（如翻译后修饰、表观遗传重塑和代谢重编程）与外在微环境信号（包括神经输入和机械力）动态整合，从而对免疫反应的强度、性质和时机进行精细校准。这一认知飞跃从根本上重塑了我们对感染、自身免疫、免疫衰老和肿瘤发生的理解，同时为通过调节先天免疫系统治疗人类疾病开辟了全新的领域。然而，该领域目前面临的核心悖论在于，如何将这种精妙而复杂的自然调控逻辑转化为可预测且可控的临床干预策略。 核心处理：从信号特异性到临床转化 主要障碍在于实现基于上下文的识别精度。这要求TLR能够在结构上相似的分子阵列中，准确区分病原体来源的分子与宿主来源的危险信号。其识别能力不仅受受体-配体相互作用静态构象的制约，还通过动态的亚细胞定位、共受体网络以及组织特异性的翻译后修饰模式进行调节。使这一任务尤为复杂的是，DAMPs在组织修复与疾病进展中扮演着双重角色，这进一步模糊了“己”与“非己”之间的界限。免疫系统的多层级架构进一步加剧了这一处理：组织特异性应答模式、PRR家族间的功能冗余，以及不同物种间补偿机制的差异（尤其是小鼠与人类系统之间的关键区别），共同构成了一个高度稳健的防御网络。TLR诱导的PTM、表观遗传重编程、代谢重编程以及与其他细胞内PRR的交叉谈话所产生的相互交织的影响，共同确保了宿主防御的可靠性，同时也为选择性治疗干预设置了重大障碍。值得注意的是，尽管Toll通路是已知最著名的非哺乳动物免疫通路，但在无脊椎动物模型中的情况尚未被深入探索，也未在医学背景下进行过类似深度的研究。尽管哺乳动物中TLR的作用与果蝇中的Toll通路存在显著相似性，但也存在主要差异，特别是在激活模式方面。在哺乳动物中，TLRs作为直接PRRs与PAMPs结合，而大多数果蝇Toll受体则由经蛋白水解切割的配体Spätzle触发。然而，最新研究表明这一模式更为复杂，因为果蝇中的Toll-9可直接结合病毒双链RNA以启动抗病毒免疫。因此，果蝇的Toll系统作为一种多功能免疫传感器，同时采用间接和直接识别策略，凸显了先天免疫的可塑性。这些见解加深了我们对果蝇先天免疫机制的理解，反映了不同物种间免疫反应的进化保守性，并为进一步研究TLRs在整个动物界中的作用提供了动力。对这一主题的全面探索，包括其进化与功能意义，将成为未来研究的重点。 尽管TLR调节剂具有巨大的治疗前景，但其临床转化仍面临显著风险，这要求对给药途径、干预时长以及由此产生的风险-获益比进行细致评估。局部给药（如外用咪喹莫德或肿瘤内注射TLR9激动剂）可将免疫激活限制在靶组织内，从而最大限度地减少全身暴露并保持良好的治疗指数。相比之下，全身给药则存在引发细胞因子风暴及破坏免疫耐受的风险，可能诱发自身免疫。同样，虽然急性TLR激活能提供对疫苗佐剂作用至关重要的瞬时危险信号，但慢性信号传导——无论是源于持续性感染、DAMPs积累还是缓释药物——都可能导致组织纤维化、三级淋巴组织形成，并营造出易诱发自身免疫和恶性肿瘤的促炎性微环境。因此，治疗窗口既狭窄又受环境依赖。临床转化的瓶颈恰恰在于此，因为我们尚未掌握在维持该复杂网络整体稳态的同时对其进行精准调控的艺术。当前的双重障碍具体表现如下：一方面，缺乏能够实现时空精准给药的靶向递送系统；另一方面，预测性生物标志物的缺失使得难以在治疗前识别最可能获益的患者群体。这种在系统性理解和工具层面的双重缺陷，严重阻碍了TLR调节剂向安全有效疗法的转化。要突破这一瓶颈，不仅需要发现新的激动剂，更迫切的是开发组织特异性靶向和控释给药系统（如纳米颗粒和抗体药物偶联物），同时识别可靠的预测性生物标志物，从而真正将TLR调节的强效疗效与其固有的致病潜力脱钩。 前进之路：从机械式剖析到系统性整合与设计 虽然传统的机制研究方法揭示了TLR通路的核心组分，但此类视角在把握其动态网络的涌现特性方面存在固有局限。为解决这一问题，我们需要建立一个跨越不同尺度的多层次综合研究范式。在原子层面，可通过冷冻电镜（cryo-EM）和人工智能（AI）模拟解析TLR信号复合物的动态构象。细胞层面的研究则需要借助活细胞成像和单细胞多组学技术，追踪信号网络的时空重构。最后，在系统层面，应通过人源化类器官和计算建模推导出跨尺度的调控逻辑。这场方法论革命的精髓在于将机制阐明的精准性与系统理论的整体视角相结合。 新兴技术已为这一范式转变提供了支撑。整合了单细胞组学、空间转录组学和蛋白质相互作用组测序的系统免疫学，正在破译TLR网络的动态拓扑结构。人源化模型、类器官和芯片器官平台等转化桥梁工具，弥合了物种差异与人类生理复杂性之间的鸿沟。与此同时，CRISPR介导的表观遗传编辑与代谢干预技术为免疫重编程提供了“分子手术刀”，纳米载体实现了时空精准的药物递送，而人工智能驱动的模型则加速了偏向性配体及个性化治疗方案的设计。唯有通过对完整的TLR调控图谱进行全面绘制，我们才能识别关键节点，从而从被动观察网络转向主动设计干预方案。这将最终推动TLR调节剂超越其当前作为机制探针的角色，发展成为具有临床应用价值的精准治疗药物。 下一波浪潮：从破译非经典功能到精准免疫工程 未来十年TLR研究将由三个相互关联的命题所定义，这些命题共同致力于将免疫调节从观察性科学转变为精准免疫工程。第一个命题探讨免疫记忆的精确编码，旨在探究如何将TLR介导的训练免疫转化为可控的治疗资源。训练免疫被定义为先天免疫细胞在初次刺激后发生的长期功能性适应，这一过程由代谢重编程和表观遗传重塑驱动。这一处理要求我们超越现象学观察，通过代谢-表观遗传耦合的视角，从机制层面剖析免疫记忆的形成与消退，其中TLR作为关键的“守门人”，架起了急性病原体识别与持续功能重编程之间的桥梁。最终目标是利用TLR在宿主防御与疾病发病机制中的双重作用，在避免病理性炎症的同时，定向诱导保护性先天免疫记忆。 第二个命题聚焦于损伤信号的上下文重编程，探索是否能够对DAMP-TLR信号传导进行定向调控。其核心处理在于破译损伤信号的双重语义，并开发能够识别微环境背景的智能调控策略，从而使同一DAMP信号在修复情境中促进组织重建，而在疾病情境中阻断其破坏性输出。第三个研究方向探讨相分离物理学在免疫学中的应用，考察生物分子凝集物能否作为新型免疫调节的介面。这需要建立跨尺度研究方法，从物理化学原理出发理解TLR信号体（signalosomes）的组装动力学，并探索通过扰动相平衡来精确调控信号流与特异性的治疗潜力。关键在于，这需要破译相分离的TLR信号体如何选择性地招募或排斥特定的RBP-RNA复合物——这些复合物在冷凝体内的组成和空间组织可能决定了RNA介导的信号是驱动炎症还是促进炎症消退[438]。确立这些隔室中RBP-RNA分隔的调控原理，有望开辟出既能破坏致病性信号枢纽，又能维持整体RNA稳态的策略。 推进这些宏伟设想，需要构建一个综合性的方法学联盟，整合基于单粒子冷冻电镜和人工智能驱动预测的结构解析、通过实时光学和多组学融合实现的动态监测，以及利用器官芯片平台结合计算模拟进行的系统验证。最终目标是通过在严格维持整体稳态的同时，对免疫系统进行时空精确的编程，从而创造出局部可预测的治疗微环境。这一努力不仅是渐进式的进步，更标志着从发现生物学向设计免疫学或免疫工程学的根本性范式转变，同时通过系统探索生命系统的复杂性边界，重新定义治疗的可能性。通过这一综合框架，TLR研究有望从分析免疫反应转向主动工程化免疫系统以获得治疗效益。 结语 破译TLR信号传导这种古老而精妙复杂的语言，不仅仅是一项学术追求，更是掌握免疫系统在保护与病理之间平衡的关键一步。从驯服炎症风暴、使肿瘤重新对免疫疗法产生反应，到潜在调节神经炎症和衰老，TLR研究掌握着处理医学领域一些最紧迫挑战的钥匙。未来十年必将成为发现的黄金时代，将深厚的机制洞察与尖端技术及临床敏锐度相结合，将开启精准免疫学的新纪元。从模式识别到情境感知免疫工程的征程才刚刚开始，TLR无疑将继续处于前沿，引领我们走向与免疫系统本身一样细腻且适应性强的治疗方案。 Toll-like receptors in innate immunity and inflammation: from fundamental biology to clinic insights Cheng Qian, Xuetao Cao & Jules A. Hoffmann（TLR诺奖） Immunity & Inflammation （国产新刊）

引言 脂质体（Liposome）是由一层或多层磷脂双分子层包裹水相内核形成的纳米囊泡结构（粒径通常为50–500 nm），由Bangham等人于1965年首次描述。 其独特的双亲性结构赋予了脂质体同时包封亲水性药物（水腔内）和疏水性药物（磷脂双层中）的能力，使其成为药物递送领域应用最广泛的纳米载体之一。迄今已有多种FDA批准的脂质体药物上市，包括脂质体阿霉素（Doxil®）、脂质体伊立替康（Onivyde®）及用于mRNA疫苗的脂质纳米颗粒（LNP）平台（mRNA-1273、BNT162b2）。 在脂质体药物的质量控制、生物分析及体外释放研究中，一个核心技术问题是：如何将包封于脂质体内的药物完整、高效地释放出来？这一操作是测定包封效率（Entrapment Efficiency, EE）、建立体外释放模型（In vitro Release Profile）、以及进行生物样品定量分析的前提步骤。不同的裂解方法在效率、对药物的破坏程度、与下游分析方法的兼容性及操作复杂度方面存在显著差异。 本综述系统梳理了当前主要的七种脂质体药物释放/裂解方法，包括有机溶剂裂解法、表面活性剂裂解法、超声破坏法、冻融循环法、pH/温度诱导释放法、酶解法和机械均质法，分别从方法原理、关键操作参数、优缺点比较及典型应用案例四个维度进行深入分析，并提供综合比较表和方法选择决策指南，旨在为从事脂质体药物研发、分析方法开发及生物分析的研究人员提供全面、实用的技术参考。 1. 有机溶剂裂解法 1.1 方法原理 有机溶剂裂解法（Organic Solvent Disruption）是利用有机溶剂与磷脂分子之间的强溶剂化作用，破坏脂质双分子层结构，从而将包封于脂质体内部的药物释放出来的经典方法[1]。常用有机溶剂包括甲醇（methanol）、乙腈（acetonitrile）、异丙醇（isopropanol）及氯仿（chloroform）。其中，甲醇和乙腈与水互溶，广泛用于生物分析样品前处理；氯仿则与水不互溶，常用于液液萃取分层操作。 从分子机制看，磷脂分子由亲水头部与两条疏水脂肪酸尾链构成。在水溶液中，磷脂自发形成双分子层，将亲水腔包裹其中。当加入足量有机溶剂后，有机溶剂分子插入并溶解磷脂的疏水区，降低双分子层的稳定性，最终导致膜结构瓦解，释放包封药物。 1.2 操作参数 溶剂种类选择：甲醇（最常用，溶解度广）、乙腈（适用于LC-MS兼容性）、氯仿（适用于液液萃取） 溶剂比例：有机溶剂与脂质体样品体积比通常为 3:1 至 10:1（v/v），以确保完全裂解 混合方式：涡旋振荡（10–30 s）或超声辅助（5 min，室温） 温度：通常室温（20–25°C）操作；氯仿萃取需控温避免蒸发 离心：5,000–10,000 × g，5 min，去除磷脂聚合物残渣 LC-MS前处理：乙腈沉淀蛋白后直接进样，或蒸干重溶于流动相 1.3 优缺点 优点： 操作简便，无需专用仪器设备 与LC-MS/MS分析平台高度兼容（特别是甲醇、乙腈） 裂解效率高，通常可达 >95% 的药物释放率 适用于小分子药物（化学药）、脂溶性药物的提取 缺点： 有机溶剂可能导致不稳定药物（如蛋白质、核酸）变性失活 挥发性溶剂（氯仿、乙醚）存在安全隐患，需通风操作 需要蒸干重溶步骤，增加操作时间，存在样品损失风险 部分蛋白质结合型药物可能因蛋白质沉淀而损失 1.4 典型应用案例 在脂质体阿霉素（Doxil/Caelyx）的生物分析中，血浆样品中的脂质体用甲醇（1:4 v/v）沉淀破乳后，经LC-MS/MS定量游离阿霉素及总阿霉素，从而计算包封效率与体内释放行为。在小分子靶向药物脂质体（如阿法替尼脂质体）的质量控制中，乙腈沉淀法可有效破坏脂质双分子层，结合紫外分光光度法测定包封效率。 2. 表面活性剂裂解法 2.1 方法原理 表面活性剂裂解法（Surfactant Lysis / Detergent Solubilization）是目前脂质体/脂质纳米颗粒（LNP）包封效率测定的金标准方法之一。其原理基于表面活性剂分子的双亲性结构：当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度（CMC）时，表面活性剂单体插入磷脂双分子层的亲水-疏水界面，取代磷脂分子的占位，逐步破坏膜的完整性，最终形成混合胶束（mixed micelles），将磷脂与药物完全释放至溶液中。 Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚，非离子表面活性剂）是最常用的脂质体裂解试剂，其CMC约为247 µM（0.0155% w/v）[5]。在脂质体包封效率测定中，通常使用 1–2% Triton X-100（远高于CMC），在37°C孵育10分钟即可实现完全裂解。RiboGreen荧光定量法即采用此方案，通过比较Triton X-100处理前后荧光信号的变化来计算RNA/核酸的包封率。 2.2 常用表面活性剂及特性 表面活性剂  类型  CMC  使用浓度  主要用途  Triton X-100  非离子型  0.2–0.9 mM  0.5–2%  LNP/脂质体包封率测定（RiboGreen法）  Tween-20 (Polysorbate 20)  非离子型  ~60 µM  0.1–1%  温和裂解；蛋白质相容性好  SDS (十二烷基硫酸钠)  阴离子型  8.2 mM  0.1–1%  强裂解；可使蛋白质变性  CHAPS  两性离子型  6–10 mM  0.5–2%  温和裂解，保持蛋白活性  2.3 操作参数 Triton X-100标准方案：终浓度 1–2%（w/v），37°C孵育 10 min，轻柔混合 缓冲液体系：TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4）保护核酸样品 样品与裂解液比例：通常 1:1 至 1:9（v/v） 孵育后离心：5,000 × g，5 min，去除不溶性残留 注意：Triton X-100在260 nm处有吸收，干扰UV定量，应使用荧光检测或LC-MS分析 2.4 优缺点 优点： 裂解效率高且温和，适合生物大分子（蛋白质、核酸）药物 操作简单，无需大型仪器，适合高通量包封效率测定 Triton X-100为RiboGreen/PicoGreen荧光法的标准配套试剂 非离子表面活性剂（Triton X-100, Tween-20）不带电荷，对样品干扰小 缺点： 部分表面活性剂（尤其SDS）会使蛋白质不可逆变性 Triton X-100对270 nm UV有强吸收，干扰蛋白质/核酸的UV定量 胶束残留可能影响LC-MS分析的离子化效率（需固相萃取净化） 阴离子型SDS与LC-MS不兼容，需在进样前去除 2.5 典型应用案例 RiboGreen荧光法是mRNA-LNP疫苗（如BNT162b2、mRNA-1273）包封效率测定的工业标准方法。具体操作：用TE缓冲液稀释mRNA-LNP样品，分为两份，一份直接与RiboGreen孵育（检测游离RNA），另一份用 2% Triton X-100（在TE中）于37°C裂解10 min后与RiboGreen孵育（检测总RNA），计算包封率 = (总RNA - 游离RNA) / 总RNA × 100%[4]。在阿法替尼脂质体制备研究中，Triton X-100溶解法结合HPLC定量，验证了包封效率的准确性[6]。 3. 超声破坏法 3.1 方法原理 超声破坏法（Sonication）利用高频声波（通常20–80 kHz）在液体介质中产生的空化效应（cavitation）来破坏脂质双分子层。声波在液体中传播时，交替产生压缩波和稀疏波，在稀疏区形成微小气泡；气泡迅速膨胀后剧烈内爆，产生瞬间高温（约5000 K）和高压（约500 atm）以及极强的剪切力，足以撕裂脂质膜、释放包封药物[7]。 超声破坏法分为两种形式：（1）探头超声（Probe Sonication）：将金属探头直接插入样品液面以下，能量集中，效率高，适合少量样品；（2）浴式超声（Bath Sonication）：将样品置于水浴中间接超声，能量较分散，适合多样品批量处理[8]。 3.2 操作参数 探头超声（Probe Sonication）标准参数： 输出功率：20–40%（通常以额定功率的20–40%运行，避免过热） 探头插入深度：15 mm（最优；过浅导致起沫，过深能量损耗增加） 超声时间：间歇模式，超声5 s / 暂停5 s，总处理时间 10–20 min 冷却措施：冰水浴维持温度≤10°C，防止热降解 探头材质：钛合金（可能脱落微量钛颗粒，污染样品，可离心去除：10,000 × g，5 min） 浴式超声（Bath Sonication）标准参数： 频率：40–80 kHz 温度：高于磷脂相变温度（Tc）5–10°C（DPPC Tc = 41°C；DSPC Tc = 55°C） 时间：30–60 min，间歇操作 适合含热不稳定药物的温和处理 3.3 优缺点 优点： 无需添加任何化学试剂，保持样品化学完整性 可精确控制颗粒粒径（探头超声可将脂质体缩小至 ~70 nm） 效率高，探头超声可在20 min内完全破碎大多数脂质体 同时具有均质化功能，样品分布均一 缺点： 探头超声噪音大，需在通风橱或隔音设备中操作 钛探头脱落微粒可能干扰分析（需后续离心或过滤） 局部高温可能降解热敏感药物（肽类、蛋白质、核酸） 高功率超声可使部分不稳定小分子发生降解 批次间重复性受探头老化、液面高度等因素影响 3.4 典型应用案例 在脂质体粒径优化研究中，大豆卵磷脂脂质体经探头超声处理（40%功率，15 mm插入深度，20 min冰水浴），粒径由初始600–800 nm降至 ~70 nm，PDI降低至0.15以下，并保持优良的包封效率。在脂质体生物分析样品前处理中，探头超声（20%功率，5 min）被用于辅助有机溶剂裂解，提高蛋白结合型脂质体的破乳效率，确保总药量测定的完整性。 4. 冻融循环法 4.1 方法原理 冻融循环法（Freeze-Thaw Cycling）通过反复的低温冷冻与室温融化过程，利用冰晶生长产生的机械力破坏脂质膜。在冷冻过程中，水分子结晶形成冰晶，体积膨胀约9%，对脂质双分子层产生强烈的机械应力，造成膜穿孔甚至膜破裂，使内容物释放或重新包装。解冻时，融化的水分子重新插入磷脂头部，部分膜结构可重新愈合，但不稳定或多板层脂质体结构将被永久破坏。 对于蛋白质载药脂质体，冻融循环还具有特殊意义：适当的冻融处理可使外层膜融合，将原先处于膜外层的蛋白质内化至脂质体腔内，从而提高包封效率。pH > 7的缓冲液可增强冻融循环对包封效率的提升效果。 4.2 操作参数 冷冻温度：液氮（-196°C）快速冻结，或-80°C超低温冰箱 解冻温度：37°C水浴（快速融化）或室温慢速融化 循环次数：通常 3–5 个循环为最优；增加循环次数边际效益递减 缓冲液pH：pH 7–8 缓冲液（如PBS, HEPES）有利于包封效率提升 冷冻保护剂（冻干保护剂）：可加入蔗糖（5–10%）或海藻糖（5–10%）防止脂质体聚集 样品体积：建议 ≤ 1 mL/管，利于快速均匀冻结 4.3 优缺点 优点： 无需化学试剂，对药物化学结构无破坏 特别适合蛋白质、肽类等热敏感大分子的包封效率测定 兼具制备功能（可制备单层脂质体、提高EE）和裂解功能 操作简单，设备普及（-80°C冰箱即可） 缺点： 裂解效率不稳定，受脂质组成（饱和vs不饱和脂肪酸）影响大 处理时间长（每次循环约30–60 min），效率低 对刚性脂质体（如高饱和脂肪酸脂质体，如DPPC）裂解效果有限 不适用于快速批量样品分析；极低温度下液体容积的变化需注意管帽密封 4.4 典型应用案例 在蛋白质脂质体包封效率研究中，将牛血清白蛋白（BSA）脂质体进行 3 次冻融循环（液氮冻结/-80°C，37°C解冻），包封效率从初始的 32% 提升至 58%，并证实pH 7.4 的PBS缓冲液体系相比pH 5.5的效果更佳，冻融后脂质体粒径增大但稳定性增强，活化能升高表明膜流动性降低。 5. pH与温度诱导释放法 5.1 方法原理 pH诱导释放法（pH-Triggered Release）利用脂质体膜对pH变化的响应性。含弱碱性或弱酸性磷脂（如二油酰磷脂酰乙醇胺，DOPE；二油酰磷脂酰甘油，DOPG；磷脂酰丝氨酸，PS）的脂质体，在特定pH条件下发生质子化/去质子化，导致磷脂头部电荷改变，分子结构由双分子层向六角相（HII相）转变，造成膜融合与内容物释放。酸性pH（pH 4–5）常用于溶酶体靶向递送系统，模拟内体/溶酶体环境，促使药物在胞内释放。 温度诱导释放法（Thermosensitive Release）利用磷脂在相变温度（Tc）附近，从凝胶相（Lβ）转变为液晶相（Lα）时膜通透性急剧增加的特性。常用热敏脂质为DPPC（Tc = 41.4°C）和DSPC（Tc = 55.1°C）；在Tc附近（±2°C区间），膜通透性最大，药物释放最快。热敏脂质体（ThermoDox®等）正是基于此原理，结合局部高热治疗实现肿瘤靶向药物释放。 5.2 操作参数 pH诱导释放： 酸性裂解：将样品pH调至 4.5–5.5（醋酸缓冲液），37°C孵育 30–60 min 碱性裂解：pH 9–10（碳酸盐缓冲液），室温10–20 min（适用于阳离子脂质体） 注意：并非所有脂质体对pH敏感；需含DOPE、CHEMS等pH响应性脂质 温度诱导释放： 加热至 Tc + 2–5°C（如DPPC体系加热至 43–45°C） 恒温水浴，孵育 15–30 min 迅速冷却至 4°C 终止释放（获得释放曲线时间点样品） 5.3 优缺点 优点： 可模拟体内真实释放环境（内体酸性，肿瘤局部高热），具有高度生理相关性 无需添加有机溶剂或表面活性剂，适合生物活性药物测定 pH/温度可精确控制，便于建立体外释放模型（药物释放曲线） 缺点： 方法具有脂质组成依赖性，仅适用于特定配方的pH/热敏脂质体 对常规非敏感脂质体（HSPC、DPPC单纯脂质体）效果有限，裂解不完全 测定包封效率时，若裂解不完全，测量结果偏低 高温可能加速热敏感药物降解 5.4 典型应用案例 pH敏感脂质体（DOPE/CHEMS, 6:4摩尔比）在pH 5.5的醋酸缓冲液中，10 min内释放 >85%的包封荧光素（calcein），而在pH 7.4时释放量仅为3%，证明了pH响应性的高选择性，广泛用于溶酶体逃逸递送系统的体外验证[1]。热敏脂质体ThermoDox®（DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86:10:4）在37°C时24小时内释放<10%多柔比星，而在42°C时20秒内可释放>80%，该温度响应特性已在射频消融联合化疗的临床研究中得到验证。 6. 酶解法 6.1 方法原理 酶解法（Enzymatic Degradation）利用磷脂水解酶特异性降解磷脂分子，从而瓦解脂质体膜结构。最常用的酶为磷脂酶A₂（Phospholipase A₂, PLA₂），其催化切割磷脂sn-2位的酯键，将甘油磷脂水解为溶血磷脂和游离脂肪酸。溶血磷脂的单酰基结构具有表面活性，可进一步溶解磷脂双层，协同PLA₂作用加速膜的完全裂解。 此外，磷脂酶C（PLC）水解磷酸酯键释放二酰甘油（DAG），磷脂酶D（PLD）水解磷脂头部基团。PLA₂活性依赖Ca²⁺（0.5–2 mM），受Ca²⁺螯合剂EDTA的抑制，这为终止反应提供了便捷手段。 6.2 操作参数 酶制剂：猪胰腺PLA₂（sigma，纯度>90%），活性单位 500–1000 U/mL 反应缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）+ 1 mM CaCl₂ + 100 mM NaCl 酶用量：10–50 U/mL（根据脂质浓度调整），脂质浓度通常 1–5 mM 反应温度：37°C（高于DPPC的Tc，确保膜处于液晶相） 反应时间：30–120 min（完全水解需 ≥ 60 min） 终止反应：加入EDTA（终浓度 5 mM）螯合Ca²⁺，即可抑制PLA₂活性 结果验证：薄层色谱（TLC）确认磷脂水解完全（溶血磷脂斑点出现，磷脂斑点消失） 6.3 优缺点 优点： 高度特异性，仅降解磷脂，对大多数药物分子无破坏性 模拟体内磷脂酶环境，具有生理学意义（肿瘤微环境PLA₂活性升高） 可与荧光检测联用，实时监测膜破坏进程 温和条件（37°C，水溶液体系），保护生物活性药物 缺点： 酶试剂成本较高，批次间活性可能存在差异 反应时间长（≥1 h），不适合快速高通量分析 水解产物（溶血磷脂、脂肪酸）可能干扰LC-MS检测，增加基质效应 PLA₂依赖Ca²⁺，需精确控制缓冲液体系 酶的使用范围局限，不适合脂质体包封效率的常规测定 6.4 典型应用案例 PLA₂酶响应型脂质体（含DPPC/DSPE-PEG2000）在肿瘤微环境高PLA₂浓度的模拟条件下（0.5 U/mL PLA₂，37°C, 1 h），包封的紫杉醇释放率达 >90%，而在正常血液PLA₂浓度（<0.05 U/mL）条件下释放率 <5%，验证了酶响应性靶向递送的可行性。在体外释放介质研究中，PLA₂酶解法被用于模拟肠道消化条件，评估口服脂质体制剂在消化道中的药物释放行为。 7. 机械均质法 7.1 方法原理 机械均质法（Mechanical Homogenization）利用高压均质机（High-Pressure Homogenizer, HPH）或微射流仪（Microfluidizer）产生的极高压力梯度（500–1500 bar）和剪切力，使脂质体颗粒在狭窄通道中经历剧烈的碰撞、湍流和空化效应，导致脂质膜破裂、内容物释放[1]。高压均质技术也是脂质体工业化生产（乳化、粒径缩小）的核心技术，在裂解应用中通常单次均质即可实现完全破膜。 7.2 操作参数 均质压力：500–1500 bar（通常 800–1000 bar 适用于大多数脂质体体系） 均质次数：1–3 次循环（增加次数可提高粒径均一性，但边际效益递减 温度控制：冷却夹套维持 <20°C，防止热敏感药物降解 处理体积：适合中等至大体积（5 mL–50 L），工业化可扩展 设备清洁：均质前用空白缓冲液冲洗，防止样品间污染 7.3 优缺点 优点： 处理量大，适合工业规模生产中的在线破乳检测 裂解效率高且重复性好，批次间变异小 可与在线粒径检测联用，实时监控裂解过程 无需添加化学试剂，样品纯净 缺点： 设备昂贵（高压均质机购置成本高），不适合研究实验室少量样品处理 对小样品量操作困难（通常需要 ≥5 mL有效体积） 高压下含气体药物（如吸入脂质体）可能发生特殊降解 设备维护要求高，密封件需定期更换 7.4 典型应用案例 在脂质体注射剂（如脂质体伊立替康MM-398）的大规模生产质控中，高压均质法用于测定批产品的包封效率：取部分样品经高压均质（1000 bar，2次循环）完全裂解后，经LC-MS/MS测定总伊立替康量，结合凝胶色谱法测定游离药物，计算最终包封效率 >95%，符合ICH质量指南要求[2]。微射流仪（Microfluidics M110P，800 bar）已用于含siRNA的稳定核酸脂质颗粒（SNALP）的均质裂解分析，与RiboGreen法联用验证包封效率。 8. 各方法综合比较 表1列出了七种脂质体药物释放方法的主要参数与特性对比，供研究人员根据具体需求选择合适方法。 方法  裂解机制  裂解效率  操作难度  适用药物类型  与LC-MS兼容性  主要局限  有机溶剂法  溶剂化磷脂疏水链  ★★★★★  低  小分子化学药  ★★★★★  不适合生物大分子  表面活性剂法  插膜→混合胶束  ★★★★★  低  核酸、蛋白质、小分子  ★★★☆☆  干扰UV/MS检测  超声破坏法  空化效应→剪切力  ★★★★☆  中  小分子、多糖  ★★★★☆  Ti颗粒污染；噪音大  冻融循环法  冰晶机械应力  ★★★☆☆  低  蛋白质、肽类  ★★★★★  刚性膜效果差  pH/温度诱导法  相变/质子化→膜融合  ★★★☆☆  低  响应性脂质体配方  ★★★★☆  依赖特殊脂质组成  酶解法  PLA₂水解磷脂sn-2键  ★★★★☆  高  所有生物活性药物  ★★☆☆☆  成本高；时间长  机械均质法  高压剪切→空化  ★★★★★  高  小分子及大分子  ★★★★☆  设备昂贵；样量限制  ★★★★★=优秀  ★★★★☆=良好  ★★★☆☆=中等  ★★☆☆☆=较差  9. 方法选择指南与推荐流程 9.1 基于药物类型的方法推荐 小分子化学药物（MW < 1000 Da）： 首选：有机溶剂法（甲醇/乙腈沉淀，LC-MS/MS定量） 备选：超声破坏法 + 离心 理由：小分子在有机溶剂中稳定，LC-MS兼容性最佳 生物大分子（蛋白质、肽类）： 首选：冻融循环法（3次，液氮/-80°C）+ 表面活性剂辅助（0.5% Triton X-100） 备选：CHAPS或Tween-20温和裂解（避免SDS变性） 理由：保护蛋白质活性；冻融兼具提高EE的功能 核酸药物（siRNA, mRNA, ASO）： 首选：Triton X-100（1–2%）+ RiboGreen荧光法（工业标准） 备选：超声破坏法（低功率，20%，5 min）+ 荧光定量或LC-MS/MS 理由：RiboGreen法经FDA认可，重复性高；超声对核酸降解风险低 9.2 基于分析目的的方法推荐 包封效率（EE）常规测定：Triton X-100裂解 + 相应检测方法（最高通量） 体外药物释放曲线（Release Profile）：透析/膜扩散法 + 收集不同时间点 + HPLC/LC-MS定量 生物基质中总药量测定：有机溶剂蛋白沉淀（甲醇/乙腈）→ LC-MS/MS  工业化质控（大批量）：机械均质法（可在线集成） pH/热响应性验证：pH/温度诱导法 + 透析膜法组合 9.3 推荐操作流程（以包封效率测定为例） 步骤①：脂质体样品经凝胶色谱（Sephadex G-50）或超滤（MWCO 100 kDa）纯化，去除游离药物，获得纯化脂质体组分。 步骤②：取等量纯化脂质体，分为两份： 组A（总药量）：加入等体积1% Triton X-100（或适量有机溶剂），完全裂解后测定总药 组B（游离药量）：直接测定纯化后样品中剩余游离药物（理想情况下为0） 步骤③：计算包封效率：EE(%) = (总药量 − 游离药量) / 总药量 × 100% 步骤④：用适当的分析方法（LC-MS/MS、UV、荧光）定量测定各组样品的药物浓度。 10. 结语与展望 脂质体药物的释放与提取技术是脂质体制剂研发、质量控制和生物分析的核心方法学基础。本文系统综述了七种主要的脂质体药物释放方法——有机溶剂法、表面活性剂法、超声破坏法、冻融循环法、pH/温度诱导法、酶解法和机械均质法——分别从作用原理、操作参数、优缺点及典型应用案例四个维度进行了深入分析。 在实际工作中，方法的选择应综合考虑药物理化性质（MW、稳定性、溶解度）、脂质体配方特性（脂质组成、粒径、表面修饰）、分析目的（EE测定、体外释放、生物分析）以及下游检测平台（LC-MS、UV、荧光）的兼容性。对于生物分析应用，Triton X-100裂解法（用于核酸）和有机溶剂沉淀法（用于小分子）目前仍是经FDA指导原则认可的主流方案。 展望未来，随着mRNA疫苗、siRNA和基因编辑递送系统的快速发展，对脂质纳米颗粒（LNP）包封效率及体内释放行为的精准表征需求日益迫切。新兴技术如微流控芯片集成检测、单颗粒荧光成像及原位裂解-质谱联用技术，有望突破现有方法在通量、灵敏度和时间分辨率上的限制，推动脂质体药物分析进入新的发展阶段。 参考文献  略 质谱纵横原创，禁止一切转载。