Insulin human (rDNA origin, Novo Nordisk)

6.1 生物制药生产中的细胞6.1 Cells in Biopharmaceutical Production6.1.1 引言：历史与里程碑 细胞培养用于发酵等过程已有数千年历史，但现代意义上的生物制药应用直到近代才出现。20 世纪初开展了首批体外动物细胞培养；当时脊髓灰质炎和风疹等病毒性疾病是全球性威胁，推动科研界开发疫苗生产工艺。1950 年代发现原代猴肾细胞是病毒增殖的优良宿主，奠定了 1955 年 Salk 脊髓灰质炎疫苗和 1962 年 Sabin 疫苗的基础；同期兽用疫苗领域用乳仓鼠肾（BHK）细胞生产口蹄疫（FMD）疫苗。 第一个用于生物制药的人细胞株是 1961 年从胚胎肺组织分离的 WI-38（非转化二倍体、寿命有限），用于开发 1970 年在欧洲首先获批的减毒风疹疫苗；1965 年又建立了人二倍体细胞株 MRC-5。但当时宿主细胞与人患者之间缺乏物种屏障、担忧外源因子潜在转移，被视为重大局限，因此下一阶段更倾向于非人生产系统。 1982 年首个重组蛋白药物 Humulin（礼来/基因泰克合作的重组人胰岛素，大肠杆菌表达）获批是重大突破；Köhler 和 Milstein 发明的杂交瘤技术（获诺贝尔奖）催生了首个获批抗体药物 Orthoclone OKT3（1986 年 FDA 批准的全鼠源抗体，小鼠腹水中生产）。1986 年英国批准的 Wellferon（Namalwa 细胞生产的干扰素 alpha）是首个细胞培养来源的重组蛋白，工艺放大到 10000 L，但因含动物源成分于 1999 年撤市。1987 年 CHO 细胞首次获准生产基因泰克的 Activase（t-PA）；1991 年首个酵母生物药获批（诺和的酿酒酵母人胰岛素）；2009 年 FDA 批准首个昆虫细胞产品 Cervarix（GSK 的 HPV 疫苗）；2014 年首个植物源生物药 Elelyso（taliglucerase alfa，治疗戈谢病，工程化胡萝卜根细胞 + 一次性反应器 ProCellEx 平台）获批。 产量进步与趋势：早期动物细胞培养基昂贵复杂、普遍加血清带来安全担忧、产量低，微生物系统因此主导早期阶段。但 1984–2004 年间，哺乳动物细胞培养的典型细胞密度提高了 5 倍，培养时长提高 3 倍，产物滴度提高 100 倍。2008–2016 年抗体工艺滴度持续增长：商业化工艺提高 63%，晚期临床工艺提高 91%；2015 年商业化生产抗体平均滴度为 3.2 g/L。如今进一步提高细胞密度已非首要目标，焦点转向整体工艺效率、上下游匹配、产品质量控制、减少聚集和蛋白酶解，以及通过缩短生产反应器时间来提高空时产率——上游抗体工艺通常持续约 10–14 天。 动物细胞工艺占比持续上升：2004–2013 年 FDA/EMA 批准产品中 56% 由哺乳动物系统生产（微生物系统 37%，其中 E. coli 24%、酵母 13%）；2014 年美欧累计获批生物药在细胞培养与微生物系统间几乎平分（51% vs 49%），但预计将向哺乳系统倾斜。抗体类产品的增长是重要驱动因素——抗体需要复杂的翻译后修饰，哺乳动物系统是唯一可行的生产选择：1980 年代末抗体仅占生物药的 10%，2010 年至 2014 年 4 月间占全部批准的 27%；2016 年 FDA 批准的 15 个生物药中有 9 个是抗体；2015 年全球哺乳动物细胞培养产能估计 90% 以上用于抗体生产，抗体产品当年总收入约 500 亿美元（占整个生物制药板块的 25%）。但微生物系统并未过时：2010 年全球生物制造产能估计为 26.4 公吨原料药（API），其中 68% 来自微生物系统；生长激素、胰岛素和抗体片段等产品仍适合微生物生产。 图：按原文页码 146 提取的插图——2008–2016 年抗体工艺平均产物滴度变化趋势（商业生产与晚期临床生产） 6.1.2 培养物的来源 经过鉴定和质量控制的培养物可从商业细胞库获取，最知名的是 ECACC（欧洲动物细胞培养物收藏中心）和 ATCC（美国典型培养物收藏中心），可提供细胞株、细菌、酵母、真菌和病毒等各类培养物。受许可的细胞株（如 CHO-S、PER.C6、EB.66、CAP、expresSF+）需从持有相应知识产权的公司或实验室获得，这类商业细胞株通常文档完备。从不太成熟的实验室获取培养物时须确保文档齐全、鉴定正确——错误鉴定的细胞培养物是一个现实问题，2012 年为此成立了国际细胞株鉴定委员会（ICLAC）；HeLa 细胞即被发现存在多个污染的谱系。另一个新兴问题是老旧细胞株（如 1960 年代或更早入库、至今仍用于病毒疫苗商业生产的 MDCK、MDBK 和 Vero）在扩充生产细胞库时可能因传代次数增加而产生遗传漂变。6.2 动物细胞培养6.2 Animal Cell Culture6.2.1 培养类型 原代培养（primary culture）来自正常动物组织，可作外植块培养或经酶消化成单细胞悬液；分离的原代细胞分为贴壁细胞（需表面附着生长，多源于器官组织）和悬浮细胞（自由悬浮生长，源于血液/血浆系统）。原代培养传代后称为细胞株（cell line），原代细胞株只能体外维持有限时间，期间保留大部分体内特性；在生物制药中原代细胞株（如鸡胚成纤维细胞）用于病毒疫苗生产，也是细胞治疗、研究和发现领域的重要工具（如角质形成细胞、黑素细胞、成纤维细胞、内皮细胞、间充质干细胞等）。 正常细胞通常只能分裂有限次数；某些细胞经自发或化学/病毒诱导的转化（transformation）获得永生性，成为连续细胞株（continuous cell line）。连续细胞株在转化过程中丧失许多原体内特性，但可长期传代使用。大规模生物制造首选悬浮细胞株（操作便利、易放大），因此生产培养尽可能被驯化为悬浮生长。连续细胞株的生长特性大体反映其来源组织：血液来源的倾向悬浮生长（如小鼠骨髓瘤 NS0），实体组织来源的倾向贴壁生长——最常用的 CHO 和 HEK 293 天性贴壁，但都有商业化无血清悬浮适应版本。6.2.2 非人哺乳动物系统 CHO 是动物细胞重组蛋白生产的绝对主导系统：2015 年 FDA/EMA 批准的动物细胞重组蛋白产品中 55% 以上由 CHO 生产。其主导地位源于早期重组蛋白生产的成功、易操作、法规接受度和高表达水平。首个 CHO 细胞株由 T. Puck 于 1957 年建立用于细胞遗传学研究，此后经多次亚克隆，形成了当今常用的三大母细胞株谱系：CHO-K1、CHO DG44 和 CHO-S（见图 6.4 谱系图）。CHO 以遗传和表型不稳定著称、多样性高，不同培养条件会自然筛选出增殖、聚糖能力和重组蛋白生产力各异的功能属性，因此克隆筛选、技术转移或放大时可能出现意外结果；甚至同一克隆培养物内不同细胞间的表达水平差异可达 70%。CHO 天性贴壁、血清依赖，但较易驯化为无血清悬浮生长；CHO 还被认为是安全的生产平台——人致病病毒（腺病毒、疱疹、肝炎、HIV、麻疹、流感）不能在 CHO 中复制；多轮遗传诱变还产生了缺乏关键代谢酶的亚系，可用于 DHFR 或 GS 选择系统。2011 年 CHO-K1 基因组公布，随后中国仓鼠 C. griseus 基因组及多个 CHO 细胞株基因组相继发表。 CHO 糖型是需要特别关注的领域：糖谱变化可影响产品稳定性与功能，非人糖型可能具有免疫原性。CHO 缺乏人细胞中的某些糖基转移酶（α[2-6] 唾液酸转移酶和 α[1-3/4] 岩藻糖转移酶），不能产生全部人糖型，但可产生鼠型末端 α-Gal（半乳糖-α-1,3-半乳糖）和 NGNA（N-羟乙酰神经氨酸）表位——通常水平极低，这也是 CHO 糖蛋白一般认为安全的原因之一；不过这两种表位均可在人体诱发免疫应答。若产品依赖人糖型，人细胞株可能是比 CHO 更好的选择。CHO-K1 ：源自原始卵巢组织分离株的早期克隆细胞株。2000 年 Lonza 将其驯化为无血清悬浮培养并建立 CHOK1SV 亚系，多与 GS 选择系统联用（目的基因与 GS 基因共导入，无谷氨酰胺培养基中筛选，并可加 GS 抑制剂甲硫氨酸亚砜胺 MSX 提高选择严格性与生产力）；但研究提示 MSX 扩增的生产克隆可能因染色体重排出现克隆不稳定，MTX 扩增的 CHO-DG44 体系也常观察到类似现象。CHO-S ：1960 年代初 Puck 发现 CHO 亚群可非贴壁悬浮生长，约十年后 Thompson 和 Baker 描述了 CHO-S 悬浮培养（CHO pro−5 谱系后代）。CHO 悬浮驯化标志着动物细胞培养技术的范式转变，为最高达 20000 L 搅拌罐的重组蛋白大规模生产铺平道路；cGMP 冻存的悬浮 CHO-S 生产细胞可商业化购买。其主要缺点是悬浮培养中易形成大聚集体。CHO-DXB11 ：CHO 商业化应用始于建立 DHFR 缺陷细胞株。CHO-K1 经伽马辐照诱变产生 DHFR 活性缺失突变体——一个 DHFR 位点物理缺失、另一等位基因携带错义突变（T137R），即为 CHO-DXB11；其甘氨酸、次黄嘌呤、胸苷三营养缺陷，是基因泰克首个获批重组蛋白药物 tPA（Activase）的原始生产宿主。CHO-DG44 ：由于 DXB11 存在 DHFR 活性回复的潜在风险，Urlaub 和 Chasin 对原始 CHO 细胞株再行多轮诱变，获得 DHFR 基因双等位基因物理缺失的 CHO-DG44。此后 DG44 成为全球工业生物制药生产最常用的 CHO 衍生宿主。其巨大优势是可在转染细胞用叶酸类似物甲氨蝶呤（MTX）处理时扩增转基因：MTX 竞争性抑制 DHFR，逐步提高 MTX 浓度使 DHFR 与目的基因（GOI）基因组扩增、转基因拷贝数升高，存活细胞池通常生产力增强；但 MTX 介导的基因扩增伴随重大基因组重排，是克隆不稳定性的驱动因素之一。 骨髓瘤：自 1970 年代杂交瘤技术发展以来一直是抗体生产的主力，在动物细胞系统中使用量仅次于 CHO。其优点包括悬浮生长、易放大、无血清条件下增殖良好、天然倾向于抗体生产。常用细胞株 NS0 和 Sp2/0 均源自 BALB/c 小鼠浆细胞瘤。但小鼠细胞通常含较高水平的内源性逆转录病毒/VLP，使病毒去除/灭活验证负担沉重；骨髓瘤还可产生非人糖结构（α-Gal 和 NGNA）——例如 Sp2/0 生产的 Erbitux（西妥昔单抗）引起患者超敏反应被归因于既存 α-Gal IgE 抗体。NS0 内源 GS 表达极低、非转染细胞为谷氨酰胺营养缺陷型，与 GS 系统天然匹配（所需 MSX 为 10–100 μM，远低于 CHO-GS 的 250–500 μM）；GS-NS0 产乳酸少、氨极低。多数 NS0 为胆固醇营养缺陷型，需外源胆固醇（常经血清或环糊精载体补充，胆固醇常源自羊羊毛等动物来源），已开发胆固醇非依赖型 NS0 克隆但有剪切敏感的报道。某些条件下 NS0 可产出至少 2–3 g/L 的抗体。 BHK：BHK-21 是 1961 年从 1 日龄仓鼠肾建立的细胞株亚克隆，是少数可贴壁与悬浮双模式生长的哺乳动物细胞株之一；生长平缓，最优批培养峰值活细胞密度约 4×106 cells/mL。BHK-21 是多种病毒（口蹄疫、狂犬病毒）生长的实验室标准株，也用于血液因子生产：诺和诺德的 NovoSeven（因子 VIIa）、Aventis Behring 的 Helixate（因子 VIII）以及拜耳的 Kogenate 和 Kovaltry。Kovaltry 工艺中在原 BHK-21 细胞中引入人热激蛋白 70（HSP70）基因——HSP70 是分子伴侣，可通过促进正确折叠和抑制凋亡提高 FVIII 表达。两种工艺均采用灌流方式、反应器体积最高 500 L。现有获批 BHK-21 工艺多在 2000 年前后获批（Kovaltry 为 2016 年获批的例外），新产品开发已更倾向 CHO 或 HEK。 图：按原文页码 149 提取的插图——CHO 细胞谱系：当今生物制造所用各 CHO 亚系的历史沿革 6.2.3 人源细胞 尽管有多种选择，人细胞在生物制造中的使用一直有限——1951 年建立的首个人细胞株 HeLa 来自宫颈癌；1960 年代人二倍体细胞曾用于疫苗生产，但对致瘤病毒的担忧阻碍了人细胞的广泛使用。仅有三株人细胞用于获批重组生物药的生产：Namalwa 淋巴瘤细胞、人胚肾 HEK 293 细胞和纤维肉瘤细胞株 HT-1080。较新的 Per.C6（视网膜来源）和 CAP（羊水细胞）已用于临床试验候选药的生产，但截至成书尚无产品获生物制品许可。HEK 293 ：1977 年用腺病毒 5 型 DNA 剪切片段转化 HEK 细胞建立（首次通过 E1A 和 E1B 基因实现永生化）。HEK 易于无血清悬浮生长，因转染效率高和人源翻译后加工能力而广泛用于研究和临床前材料的瞬时生产，也是病毒载体（腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒）生产的常用宿主。稳定 HEK 转染子自 2001 年起用于生物制药；2015 年已有四款获批治疗蛋白（Alprolix、Eloctate、Nuwiq、Xigris）由 HEK 生产——例如 Xigris 之所以用 HEK 293，是因为 CHO 生产时其功能所需的翻译后修饰不充分。瞬时转染常用化学试剂包括聚乙烯亚胺（PEI）、磷酸钙、Lipofectamine 和 Metafectene；钙沉淀法和 PEI 成本较低，已用于至少 100 L 规模，PEI 瞬时转染 HEK 已报道 g/L 级抗体产量。PER.C6 ：1998 年由非致瘤性人胚视网膜母细胞经 Ad5 E1A/E1B 永生化建立，按良好实验室规范生成、自始充分文档化并清除外源病毒。优点包括无血清悬浮生长、无需基因扩增即获良好产量、人源翻译后修饰能力、以及超过 1 亿 cells/mL 的极高细胞密度。2008 年 Crucell 与 Percivia 宣布用专有 XD 工艺实现创纪录的 27 g/L 抗体滴度（研究规模实验）——此等超高体积生产力在生物制造中通常并不追求，因其可导致蛋白聚集、产物降解等下游问题。PER.C6 生长能力优异，但就比生产力而言许多产品仍以 CHO 系统为标杆；比生产力低意味着同样体积产量需要更多生物量，而大量生物量会给下游去除细胞膜、DNA、宿主细胞蛋白等带来挑战。CAP ：CEVEC 的羊水细胞生产（CAP）细胞株源自羊水，经腺病毒 5 型 E1 基因转化永生化，可在无抗生素选择下表达目的基因、90 代以上保持稳定，表达全糖基化、全唾液酸化蛋白能力达至少 30 pg/cell/day。CAP 细胞 2013 年完成 I 期临床；CAP-T 变异株组成型表达 SV40 大 T 抗原，用于携带 SV40 复制起点的质粒瞬时表达；推测 CAP 细胞的干细胞样来源可能有利于困难蛋白的表达。 人细胞株的主要益处是完整人源蛋白生产机器、正确翻译后修饰和人糖型；但直接比较表明用人细胞株未必得到完全内源形式的产物，且尚未确凿证明重组人源形式比 CHO 来源的对应物更安全有效。 图：按原文页码 148 提取的插图——2014 年美欧上市生物药的宿主生物分布（微生物系统 49%、非人哺乳动物 40%、人细胞系统 9%、昆虫细胞 4%） 6.3 微生物系统6.3 Microbial Systems 微生物生产适用于翻译后修饰非药物功能所必需的较简单生物药。选择考虑因素包括：待产分子、所需产量、产物是否须分泌、内毒素是否构成问题、终产品功能是否需要糖基化等。微生物系统普遍具有生长快、稳健、可预测，培养基简单廉价，克隆快速，潜在极高产量的优势；但产量因产品而异、波动大，常见问题包括低生产力、产物相关杂质、质粒或宿主不稳定。为此公司开发了微生物表达工具箱，可快速组合不同元件筛选最适生产菌株——合理方法下筛选约两个月即可完成。微生物系统中 E. coli 占主导，其次是酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（P. pastoris）；假单胞菌和芽孢杆菌也受到关注； niche 疫苗领域还有霍乱弧菌（Dukoral 疫苗）和百日咳杆菌（Triacelluvax 疫苗）等。6.3.1 细菌 E. coli 自 1982 年 Humulin 获批以来一直是生物技术的一号主力，仍是无需翻译后修饰的小蛋白和多肽的首选（安全、易操作、可放大、高生产力）。常用菌株为 K12 和 B 系——B 系产生的乙酸远少于 K12 系。生产通常不是连续的，而是在预定工艺阶段用糖、IPTG 或营养耗竭等诱导物诱导。E. coli 系统被充分表征和建模，未知数少于动物细胞系统；无糖基化的较小抗体片段（包括双特异性抗体）也已在细菌中成功生产并进入临床。 E. coli 分为细胞质、周质和胞外三个区室，重组蛋白可靶向任一区室，但生物制药生产最常靶向细胞质。高表达时可积累折叠中间体形成包涵体（inclusion bodies）。包涵体变性复亡常是复杂昂贵的多步过程，某些分子最终活性收率极低。但包涵体也有优点：包涵体蛋白可积累至细胞总蛋白的 25% 以上（远高于可溶蛋白）、易于离心分离浓缩从而简化下游、蛋白处于非活性状态有利于毒性产品的生产。周质或胞外生产中宿主源杂分子少，利于下游并降低蛋白酶解风险；周质是氧化环境、可形成二硫键，但 E. coli 分泌能力欠佳，周质尤其胞外产量通常低于胞内。 E. coli 系统因高生长速率、简单营养需求和潜在高产量而极具成本效益：理论细胞密度极限估计约 200 g 干细胞重/L，实践中可超过 100 g/L；最优条件下倍增时间约 20 min。成功发酵的关键是良好控制 pH、温度和溶氧、充分混合、以及最小化副产物生成的补料策略。培养基远比动物细胞的简单：矿物盐培养基仅含碳源、氮源、缓冲液、盐、维生素和微量元素；LB 等高复杂度营养混合物用于研究，但因成分不明确、批间控制和工艺控制困难而通常避免在大规模使用。E. coli 生产的一般挑战包括：缺乏翻译后修饰能力、质粒不稳定导致生产力下降、蛋白酶解降低收率、内毒素给下游纯化带来挑战、密码子偏好性（许多人蛋白基因含有 E. coli 中的稀有密码子，降低表达量）、包涵体形成、复性不当、难以表达高分子量蛋白、无胞外分泌、以及一次性技术选择有限。对策包括：营养缺陷型选择（删除宿主必需基因并将其置于质粒骨架上）增强质粒稳定性、以及产物基因基因组整合等。 较新的系统是 Pfēnex 表达技术——基于荧光假单胞菌（P. fluorescens）的平台，由陶氏于 2004 年推出。P. fluorescens 是专性需氧菌（不能像 E. coli 那样切换到厌氧生长），可在摇瓶中生长至约 OD 30–50 A595 单位的生物量，小规模即可表达较高量蛋白。表达载体通过组合生物学方法构建：两个质粒、四个以上启动子、三个核糖体结合位点和 25 种以上分泌前导肽，产生 100 多个即用型载体；系统化方法可在约八周内完成菌株构建、筛选和发酵以鉴定高生产力菌株。6.3.2 酵母 酵母用于烘焙酿造数百年，如今也用于生物制药生产，最常用的两个菌株是酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（P. pastoris）。酵母优点包括：生长快、易操作、可胞外生产、无内毒素、能进行正确折叠和翻译后修饰（信号肽蛋白酶切、二硫键形成、亚基组装、酰化和糖基化）。酵母具备基本的糖基化能力，可合成 Man9GlcNAc2 基本结构，但不会进一步加工为复杂聚糖，而是添加甘露糖形成过度甘露糖化（hypermannosylated）聚糖——可含超过 100 个甘露糖残基、在人体引起免疫应答；过度甘露糖化在酿酒酵母中常见，在毕赤酵母中较少见。酵母还缺乏人分子伴侣能力，可能无法生产更复杂的人蛋白。基因工程已被用于赋予酵母更人源化的能力——迄今已有 400 多个酵母基因被人源化，完整通路的人源化也有尝试；工程化酵母株可产生双天线聚糖，还可通过工程减少酵母工艺中的蛋白酶解活性。 酿酒酵母长期作为研究人类生物学的模式生物，已表达 40 多种重组蛋白；主要产品包括胰岛素肽、人血清白蛋白、肝炎疫苗和病毒样颗粒，例如默克的 Gardasil（HPV 疫苗）即用其生产。毕赤酵母以能生长至极高细胞密度、拥有强且严格调控的启动子、可胞内和分泌式生产克级重组蛋白著称。毕赤酵母是甲基营养酵母，能以甲醇为唯一碳源——最广泛使用的系统正是利用这一点，将产物克隆于甲醇利用通路第一个基因醇氧化酶 1（AOX1）的启动子控制下，通过甲醇补料诱导表达；但甲醇是溶剂，大量操作需针对挥发性液体的安全措施。毕赤酵母产品包括人胰岛素（Insugen，Biocon）、人血清白蛋白（Medway，三菱田边）、乙肝疫苗（Shanvac）、微血浆酶（Ocriplasmin）和 α-IL6 受体单域抗体片段（Nanobody ALX-0061）等。另一个受关注的甲基营养酵母是多形汉逊酵母（H. polymorpha），其优势在于可在同一细胞内表达多个蛋白——载体可设计为两个及以上串联表达盒，转化细胞中各基因始终以等摩尔比例存在。6.4 其他生产系统6.4 Other Production Systems 除哺乳动物和微生物系统外，还有成熟的昆虫细胞/杆状病毒系统和植物细胞系统。两者均为真核系统，可进行复杂（但不完全哺乳动物型）的翻译后修饰，且都已有获批上市产品。6.4.1 昆虫细胞 昆虫细胞杆状病毒表达系统于 1990 年代发展起来，作为哺乳动物表达系统的简单安全替代，同时糖基化能力优于酵母和细菌；已成功生产胞浆酶和膜结合蛋白等多种蛋白。昆虫细胞表达在药物发现和早期开发阶段很受欢迎——快速表达 mg 至 g 级候选药用于结构研究、筛选实验等。 最流行的系统是瞬时两元系统：昆虫宿主细胞 + 杆状病毒 Autographa californica 多核多角体病毒（AcMNPV）载体。AcMNPV 只靶向昆虫，对人非常安全。目的基因插入杆状病毒骨架中的强启动子（最常用多角体蛋白 polyhedrin 或 p10）之后；杆状病毒基因组转入细胞后，病毒基因和产物基因同时表达，新病毒颗粒从感染细胞出芽感染新细胞，感染细胞最终裂解——蛋白生产持续至感染后约 48 h 的裂解。最常用的宿主细胞株来自秋粘虫 Spodoptera frugiperda（Sf9、Sf21、expresSF+）和粉纹夜蛾 Trichoplusia ni（High Five），另有基于果蝇的稳定诱导系统（D.Mel-2）。 昆虫细胞 27–28°C 悬浮生长（低于哺乳动物的最适温度，培养箱和反应器可能需附加冷却），倍增时间通常约 24 h，在无血清无蛋白培养基中生长良好，但高生产力常需酵母水解物（yeastolate）等复杂补充物。昆虫细胞比哺乳动物细胞对剪切更敏感，培养基中通常加入 Pluronic F-68 等剪切保护剂。 大规模生产通常包括两条放大链：宿主细胞培养和病毒原液。宿主细胞培养至特定密度后，在预定时间点（感染时间 TOI）以每细胞定义的病毒数（感染复数 MOI）加入杆状病毒：MOI 低时并非所有细胞同时感染、将发生多轮连续感染；MOI ≥ 5 时感染同步、工艺较短，但可能需要非常大的病毒原液。高 MOI 与低 MOI 策略都有成功案例，选择取决于产物稳定性、毒性和病毒原液可用性。无论 MOI 高低，感染都耗能巨大，反映为该阶段的高耗氧。 局限包括：非哺乳动物糖型（许多昆虫种缺乏延伸核心五糖 Man3GlcNAc2 的能力），以及产量难以超过一定水平——产量取决于感染时细胞生理状态、杆状病毒原液质量和培养基等多因素；常见现象是在特定时间点或细胞浓度下生产力突然下降，称为“细胞密度效应”。2015 年市场上有三个获批的昆虫细胞产品：三价流感疫苗 Flublok（expresSF+ 细胞）、二价 HPV 疫苗 Cervarix（T. ni 来源的 Hi-5 Rix4446 细胞）和前列腺癌免疫治疗 sipuleucel-T（Provenge，由 Sf21 细胞生产的重组融合蛋白体外激活自体外周血单个核细胞）——Provenge 是高成本疗法，引发了对生物药合理成本的讨论。6.4.2 植物细胞 植物细胞可进行复杂翻译后修饰，且因不携带已知人类病原体和细菌内毒素而被认为安全。重组产物主要积累在植物液泡中，较小蛋白可穿过细胞壁进入胞外环境。植物细胞具有全能性（totipotent）——每个细胞都有形成完整新植株或所有细胞类型的潜力。植物细胞直径可达 100 μm，远大于细菌（E. coli 直径 2 μm）和动物细胞（约 10–15 μm）。许多植物细胞生长缓慢，倍增时间可达数天；最适生长温度通常 23–29°C，最适 pH 5–6，16:8 h/h 的光暗周期促进生长并提高生产力（文献报道最适光照 0.6–10 lux，因培养物而异）。植物细胞培养基通常包括碳源、无机和有机补充物、植物激素，以及（需要时的）支持基质；与许多动物细胞培养基不同，不含光敏成分。小规模可用常规摇瓶，大规模可采用改造搅拌罐、摇摆式一次性反应器和定制一次性反应器等。首个植物培养产品 Elelyso（taliglucerase alfa，Protalix）于 2012 年 5 月获 FDA 批准，是工程化胡萝卜细胞生产的、用于治疗 1 型戈谢病的酶。6.5 展望与视角6.5 Outlook and Perspective 理论上任何可维持培养的细胞都可以被改造来表达外源蛋白，但开发新的生物制造宿主绝非易事：首先，宿主必须能够以正确的质量属性和合适的产量合成目标产物；其次，培养必须稳健、可放大且工艺结果一致；第三，系统必须安全，且须彻底证明——需要提供生产生物体从最初开发阶段到生产所用传代的完整历史文档（包括亲本细胞、融合和永生化方法）。除非宿主细胞开发过程本身就是在良好文档化和受控方式下完成的，否则这可能是极具挑战甚至不可能的任务。将新的生产宿主推向市场需要数年乃至数十年和大量资源。 因此，当前的开发努力多集中于改进已证明与商业大规模生产设施兼容的现有平台：可通过基因组定向工程、定向或强制进化产生现有细胞的新变体，或单细胞克隆筛选特定群体中最合适的性状。 目前用于大规模生物制造的生产系统在可预见的未来很可能仍是主力：CHO 将继续主导更复杂生物药的生产，E. coli 仍将是微生物生产的首选。支持 CHO 和 E. coli 持续高使用率的三个主要因素是：其一，大量现成基础设施已经就位；其二，即插即用技术简化并加速新工艺开发；其三，关于 E. coli 和 CHO 的现成知识体量巨大，便于决策和法规审批。此外，生物制药的漫长开发周期也使新技术导入市场的门槛相当高。 但 CHO 和 E. coli 各有弱点，为替代生产生物体留出了空间。CHO 的主要固有弱点包括非人糖型和频繁染色体重排的“可塑性基因组”——遗传更稳定、可预测的宿主可缩短开发、使放大更直接；在关键情形下人细胞株可能是更好的选择。E. coli 的短板（如胞外生产困难）也是主要限制。 新宿主的门槛虽高，但潜在颠覆因素包括一次性技术和新疗法形态：一次性系统前期投入少、便于低成本测试新生产策略，为新型宿主和工艺创造机会——首个获批的植物源生物药 Elelyso（Protalix 的 ProCellEx 平台 + 专为其设计的一次性反应器）就是好例子。基因治疗、溶瘤病毒等全新生物产品类型以及个体化用药趋势，也可能带来范式转变：有时宿主细胞来自患者本人（自体细胞治疗），有时现有系统完全胜任（抗体片段和生物偶联物生产）。附录 I：杂交瘤技术与抗体人源化Appendix I The Hybridoma Technology and Humanization of Antibodies 杂交瘤细胞（hybridoma）通过永生化骨髓瘤细胞（如 Sp2/0 或 NS0）与可 mortality 的产抗体淋巴细胞人工融合而成；融合细胞在 HAT 培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷）中选择——只有融合细胞能够存活。杂交瘤技术在 1970 年代问世时革命性地改变了现代生物技术：在此之前，抗体从免疫动物血清中分离，是多克隆的、特异性低且质量不一；有了杂交瘤技术，可以几乎无限量地生产高度特异性的单克隆抗体。 首批杂交瘤来源的抗体是鼠源的，含有引起安全问题和疗效下降的免疫原性表位，即人抗鼠抗体（HAMA）反应。为改善抗体药物的安全性，先后发展了嵌合和人源化抗体：嵌合抗体将鼠源可变区（VL + VH）融合到人 Fc 骨架上，免疫原性低于鼠源抗体，但鼠源 Fab 仍含可能引起副作用的序列；人源化抗体将小鼠 CDR 移植到人源框架上，免疫原性显著低于鼠源和嵌合抗体，但人源化流程费力耗时。 如今进入临床试验的抗体大多数是人源化或全人的，优选策略是使用全人抗体（通过噬菌体展示等方法开发）和经工程改造可产生人抗体的转基因小鼠——转基因小鼠使杂交瘤技术无需承担 HAMA 反应风险。全人单抗不仅安全性更好，还对其治疗靶点具有高度特异性。